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INDICE

Pág.
I.

CUIDADOS EN EL LABORATORIO

02

II.

AMINOÁCIDOS Y PROTEINAS

04

01. Titulación potencio métrica de los aminoácidos

04

02. Separación e identificación de aminoácidos por electroforesis

09

03. Separación de aminoácidos por cromatografía

13

04. Determinación del punto izó eléctrico de una proteína

17

05. Proteínas: separación y caracterización

20

06. Dosificación de proteínas de la leche por el método fotocolorimétrico del Biuret

23

07. Ensayos con proteínas

29

III. ENZIMAS

30

08. Enzimas: amilasa salival

30

09. Estudio de la polifenoloxidasa (ppo) extraída de la papa

33

10. Enzimas y su desempeño en los alimentos (CHO)

37

IV. CARBOHIDRATOS

39

11. Identificación de carbohidratos

39

12. Polisacárido - aislamiento e hidrólisis

44

V.

46

LÍPIDOS

13. Química de los lípidos

46

14. Determinación del valor de acidez de una grasa

51

15. Extracción y caracterización de lípidos

54

VI. BIBLIOGRAFÍA

56

I - CUIDADOS EN EL LABORATORIO
1. Ejecución de los trabajos prácticos
- Realizar todas las prácticas con atención, rigor técnico y disciplina.
- La falta de observación de cualquiera de los requisitos técnicos puede llevar a
errores que invalidan, parcial o totalmente, el trabajo realizado, sin llevar en
cuenta el desperdicio de material, reactivos y tiempo.
- Para que el alumno alcance la eficiencia deseada es necesario que el mismo sea
puntual, asista los laboratorios, ordenado, aseado y tenga conocimiento previo
del trabajo a ser ejecutado.
- Será exigido de los estudiantes el máximo de cuidado con su local de trabajo y
con el respectivo material.
- Terminada la práctica, el estudiante deberá proceder a la limpieza de su local y
material, dejándolo completamente limpios y en condiciones de ser nuevamente
utilizado.
- Colocar sobre el mesón solamente el material estrictamente necesario como
lápiz, borrador, lapicero, regla, guía de laboratorio. Dejar los bolsos y otros
objetos fuera del mesón donde será realizado el trabajo práctico.
- No gastar soluciones inútilmente. Retirar solamente la cantidad que va a
necesitar.
- No realizar experiencias "extras" en el laboratorio a título de curiosidad. Los
"juegos" pueden llevar a riesgos inesperados.
2. Prevención de accidentes
Todo laboratorio químico es normalmente sitio de accidentes, la mayoría de
pequeña importancia, pero algunos de graves consecuencias, causados por
descuido o falta de atención en el trabajo. En el sentido de prevención de
accidentes desnecesarios, se recomienda la observación rigurosa de las
precauciones indicadas a seguir:

2

- Trabajar siempre protegido por la bata.
- No fumar dentro del laboratorio.
- Al prender el mechero, tener el cuidado de no abrir la llave del gas antes de que
tenga a la mano la llama que debe prender el gas.
- No trabajar con sustancias inflamables (alcohol, éter) en las proximidades de la
llama.
- Jamás calentar un sistema completamente encerrado.
- Es peligroso calentar o mezclar cualquier especie de reactivos próximo al rostro.
- Mantener el rostro tan lejos posible durante las operaciones de calentamiento o
de mezcla de reactivos.
- Evitar montajes no estables de aparatos, como: soporte de libros, lápiz, caja de
fósforos, etc.
- No degustar nada en el laboratorio, excepto sea especialmente orientado para
hacerlo.
- Al verter un líquido del frasco, evitar que escurra en el respectivo rótulo,
debiendo protegerlo debidamente.
- Los reactivos tóxicos o corrosivos, como álcalis o ácidos, fuertes (cuando muy
concentrados), no deberán ser medidos por pipetas pero medidos en probetas o
en algunos casos, en buretas, o con ayuda de una pera.
- Al transferir o manipular sustancias que desprendan humos tóxicos, hacerlo en
el interior de una campana extractora de gases o entonces en un local con buena
ventilación.
- Ácido sulfúrico concentrado debe ser adicionado al agua y no lo contrario.
- Para calentar soluciones, nunca utilizar, como recipiente, un frasco volumétrico.
- En caso de dudas en la ejecución de cualquier trabajo práctico, buscar siempre
el instructor.

3

II. AMINOACIDOS Y PROTEINAS
1.TITULACION POTENCIOMETRICA DE AMINOACIDOS
I. OBJETIVOS
- Construir con datos experimentales la curva de titulación de un aminoácido.
- Establecer gráficamente el punto ISOELECTRICO de los aminoácidos.
- Interpretar correctamente la curva de titulación de los aminoácidos.
II. INTRODUCCION
Todos los organismos vivos contienen - aminoácidos, los cuales comparten la
misma columna estructural.
Átomo de carbono- 
H3N+ 
Grupo - amino

H

C 


R

COOGrupo - carboxílico

Se puede concluir que este tipo de estructura tiene 3 características comunes:
- Posee un grupo carboxilo . La letra alfa indica que este grupo está unido al
átomo de carbono central o alfa.
- Posee un grupo alfa amino.
- Contiene una cadena lateral o grupo R, que está enlazada con el carbono alfa.
Todos los aminoácidos pueden clasificarse como ácidos, neutros o básicos, según
sea la carga del grupo R a pH = 7.
Los grupos R ácidos son portadores de una carga negativa a pH = 7 porque son
poderosos dadores. Los 2 alfa aminoácidos ácidos son el aspártico y el glutámico.
Los grupos R, básicos llevan una carga positiva a pH = 7 porque reciben protones.
Los 3 alfa aminoácidos básicos comunes son la lisina, arginina e histidina.

4

Los aminoácidos tienen un marcado carácter anfótero debido a la coexistencia en
una misma molécula de grupos ácidos y básicos que se pueden disociar
dependiendo del pH.
En solución ácida, los aminoácidos se encuentran en la forma con carga neta
positiva, y en la solución alcalina en la forma con carga neta negativa según
lo muestra la figura 1.

H

H

C 
COOH

NH2

Forma no disociada

R



H

C  COO
NH3+

OH

Ión doble

R 

OH-

H

C  COO
NH2

Forma ácida
( predomina en medio básico)
H

R  C  COOH

NH3+
Forma básica
( predomina en medio ácido)
Figura 1

A pH comprendido entre los 2 pKa, el aminoácido se encuentra en la forma de
zwitterion o de un ión doble que es la forma en que cristaliza y la que se obtiene al
disolverlo.
Cuando se titulan los aminoácidos con NaOH y HCl puede observarse dos
mesetas cuyos valores corresponden a los pKa de los grupos alfa carboxilo y alfa
amino respectivamente, según figura 2.
El punto de inflexión en esa figura corresponde al punto isoeléctrico del
aminoácido, pH al que las especies no aportan carga neta y por lo tanto, no migra
en un campo eléctrico.

5

Determine el pI del aminoácido representado.Figura 2 pH 14 14 pH 7 7 0 10 0 5 0 meq HCl consumidos 5 10 meq NaOH consumidos Complete la siguiente gráfica.8 pKa2 = 3.1 M 6 . pH 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 pKa3 = 11.9 pKa1 = 2. REACTIVOS L.1 M III.1 M 60 L.ácido aspártico 0.alanina 0.1 10 20 40 Meq de NaOH 0.

VII. medir 50 ml de una solución de aminoácidos (alanina. PROCEDIMIENTO 1. MATERIAL DE PRUEBA Soluciones de aminoácidos VI.L. Medir el pH inicial del aminoácido. 2. Desechar el titulado. hacer figuras en las que el pH se grafique en las ordenadas y en las abcisas.1 M L.glicina 0.1 M. 7 . En el caso del ácido aspártico se debe continuar adicionando NaOH hasta que se hayan consumido más de 20 ml de álcali.arginina 0. hasta que se haya consumido más de 10 ml de ácido. b) Dibujar y determinar el pI del aminoácido.1 M adicionando lentamente y tomando el pH después de cada adición. En un vaso de precipitados. arginina y aspártico). Calibración del potenciómetro Calibrar el potenciómetro con dos soluciones estandarizadas. los miliequivalentes de ácido (hacia la izquierda) y álcali (hacia la derecha) consumidos.1 M Buffers estandarizados pH 3 y pH 9 IV. Determinación de un punto isoeléctrico de un aminoácido. Proceder a titular con HCl 0. CONSULTA a) Registrar en una tabla los resultados obtenidos. Con los datos del pH frente al de los miliequivalentes (2ml = 1 mEq) de ácido o base consumidos. lavar el vaso y medir nuevamente 50 ml del mismo aminoácido y repetir el procedimiento con NaOH 0. MATERIALES Potenciómetro 2 vasos de precipitados (50 y 100 ml) 1 agitador magnético 1 bureta (50 ml) 1 soporte de bureta 1 varilla de vidrio V. A partir de la figura. determinar el pH en el punto isoeléctrico (pI) y los valores de pK del aminoácido con ácido y con base.

0 10.2 _ 10.4 9.Metionina 8 .9 4.6 d) Determinar el pI de los siguientes aminoácidos: .2 1.7 9.8 9. 1.Valina .c) Determinar el pI de los aminoácidos que aparecen en la tabla No.9 9.3 6.3 2. TABLA 1 Aminoácido pK1 pK2 pk3 Glicina Alanina Glutámico Histidina Treonina Lisina Aspártico 2.2 1.Triptófano .8 2.7 9.6 _ _ 9.6 2.4 2.2 3.

INTRODUCCION La electroforesis es una técnica analítica de separación fundamentada en la migración de partículas cargadas cuando sobre la acción de un campo eléctrico. siendo muy eficiente en la separación de mezclas de aminoácidos. Es una técnica utilizada para la separación de mezclas de compuestos biológicos. Sistema básico de electroforesis soporte + ánodo cátodo - solución tampón solución tampón Fuente de alimentación (Amperagen/Voltagen) 9 . SEPARACION Y IDENTIFICACION DE AMINOACIDOS POR ELECTROFORESIS I. péptidos o proteínas.2.

y por electroósmosis (dependiendo del soporte). por la conexión de dos electrodos a una fuente de alimentación (amperagen/voltagen). en el pH de la solución tampón conocida irán migrar a través del soporte para el cátodo (electrodo negativo). Compuestos cargados positivamente. Tipos de soportes más usados en electroforesis de aminoácidos y proteínas: papel de filtro.Tampón de ácido acético/acetato (pH 4. Estos movimientos pueden ser influenciados por la intensidad de corriente eléctrica. OBJETIVOS . El circuito es completado por una tira de material poroso saturado con solución tampón (soporte) que tiene las extremidades sumergidas en cada cuba.Separar una mezcla de aminoácidos e identificar los componentes de la mezcla por comparación con estándares. arginina y mezcla de estos aminoácidos . El mismo comportamiento es presentado por péptidos y proteínas. MATERIAL . conteniendo solución tampón. por la forma y tamaño de las moléculas. acetato de celulosa. por la carga líquida de las moléculas.Una diferencia de potencial es establecida entre dos cubas. donde todos los grupos ionizables de sus radicales contribuyen para la carga total de la molécula.6) . II. III. compuestos cargados negativamente irán migrar para el ánodo (electrodo positivo) y compuestos eléctricamente neutros permanecerán en el punto de aplicación (origen). ácido aspártico. 10 . PROCEDIMIENTO .Marcar el centro de la tira de papel con una línea sombreada a lápiz.Solución de ninhidrina en acetona - Tiras de papel de filtro (2 x 15 cm) Tubos capilares Nebulizador Estufa Aparato de electroforesis IV. gel de almidón y de policriamida. . En una solución con pH que corresponde al punto isoeléctrico del aminoácido (pH en el cual el numero de cargas positivas se equivalen al numero de cargas negativas) el aminoácido se presenta eléctricamente neutro y no hay migración en campo eléctrico. La carga líquida de un aminoácido en un dado pH es una función de los valores de pK de sus grupos ionizables.Solución de glicina.Comprender sus propiedades iónicas a través del comportamiento electroforético de los aminoácidos.

Prender el aparato manteniendo el voltaje en 300V por hora.A seguir.Escribir el nombre de la muestra a ser aplicada en una de las extremidades del papel.Embeber la tira en solución tampón retirando el exceso con papel higiénico. . . aplicar la muestra (solución de aminoácidos) con ayuda del tubo capilar. .Repetir la aplicación por más dos veces. a lo largo de la línea sombreada.Llevar nuevamente a la estufa. . Ejemplo: tira de papel donde será aplicada una solución de glicina - Gly + línea de aplicación de la muestra Cuidado!! Evite tocar con los dedos el papel. buscando evitar que la solución de aminoácidos se derrame en el papel.Observar el surgimiento de líneas de color violeta evidenciando la migración de los aminoácidos a lo largo de la tira de papel. Ejemplo: área de aplicación de la muestra: máximo 0. 11 .5 cm de cada lado de la línea de cada lado de aplicación según esquema - Gly + línea de aplicación de la muestra .. . . siendo que las extremidades de la tira deben permanecer mergulladas en la solución tampón contenida en las cubas. .Después de la revelación.Retirar el papel y llevar a la estufa hasta que esté seca. .Colocar la tira de papel en el aparato de electroforesis. .Identificar una extremidad como polo + y la otra como polo -. .Dejar secar al aire. identificar los componentes de la mezcla por comparación con los estándares. .Pulverizar con solución de ninhidrina (revelador de aminoácidos) la tira de papel.

Explicar el comportamiento iónico de cada aminoácido en las condiciones establecidas. cuando en 1931 dos otros investigadores. Kuhn y Lederer. SEPARACION DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA I.. desde que haya un revelador. La cromatografía es una técnica de separación de sustancias afines que tuvo sus primeros ensayos hechos por el botánico ruso Tswett en 1900. usando la técnica de Tswett conseguirán aislar el  y -caroteno de otros pigmentos foliares. solamente en 1906 que este investigador consiguió la separación de pigmentos de hojas. Aún. 3. La cromatografía tiene evolucionado desde entonces y hoy contamos con diversas técnicas tales como: Cromatografía en papel Cromatografía en capa delgada Cromatografía de intercambio iónico Cromatografía de exclusión molecular Cromatografía de fase gaseosa y líquida Genéricamente. La técnica iniciada por Tswett para la separación de sustancias coloreadas (cromos color) también es válida para sustancias incoloras.  Intercambio iónico: cuando se forman interacciones iónicas entre la fase estacionaria y el compuesto que se desplaza con el solvente (fase móvil). Este invento quedó 25 años olvidado. podemos decir que los componentes de la mezcla son distribuidos en dos fases. una estacionaria y otra móvil. INTRODUCION La identificación de sustancias orgánicas tiene despertado el interés de los analistas en el sentido de aprimorar técnicas conocidas y desarrollar nuevos métodos de análisis cada vez más rápidos y eficientes. 12 . La separación puede ser efectuada de tres modos:  Adsorción: los componentes son diferencialmente retenidos en la fase estacionaria por fuerza física superficial  Partición: los componentes son distribuidos entre un líquido existente en el soporte sólido (fase estacionaria) y otro en la fase móvil.

. colocándolo nuevamente en una cámara cromatográfica con otro sistema de solvente diferente del primero. El solvente desplaza primero en una dirección. nos da origen a un factor llamado Rf. benceno. El coeficiente de partición () es definido como la relación entre la concentración del soluto en la fase estacionaria y la concentración del soluto en la fase móvil. Podemos también utilizar la corrida bidireccional. CROMATOGRAFIA EN PAPEL Es un tipo de cromatografía que se basa en la partición líquido / líquido. siendo que el mas usado es el Whatman no. El solvente es escogido según su polaridad. El papel debe ser uniforme. Distancia recurrida por la muestra Rf = ----------------------------------------------------------Distancia recurrida por el solvente Rf  1 II. En general se trabaja con un sistema de solventes que están en proporciones definidas. n-butano. n-propano. H 2O y piridina. S E = S M En la cromatografía en papel y en capa delgada la distancia recurrida por la muestra relacionada con la distancia recurrida por el solvente. El papel actúa como soporte para la fase estacionaria líquida (H 2O del papel). que es constante para una sustancia en las mismas condiciones de trabajo. con ausencia de sustancias no celulósicas. se seca el papel. La muestra aplicada se distribuirá de acuerdo su afinidad por el H2O del papel (fase estacionaria) y el sistema de solvente (fase móvil).La separación es fundamentada en el coeficiente de partición entre las dos fases (estacionaria y móvil). ciclo-hexano. o sea. La migración de las sustancias podrá ser ascendente donde verificase actuación de la fuerza de capilaridad. En orden creciente de carácter polar tenemos: éter de petróleo. 13 . La migración en una sola dirección es denominada corrida unidireccional. se da en el mismo un giro de 90. o descendente donde actúa la fuerza de gravedad. sus fibras distribuidas en el mismo sentido. ser puro.

. V.Revelar con ninhidrina al 0. .Con auxilio de una grapadora dar la forma cilíndrica al papel.Tubos capilares .Soluciones estándar de aminoácidos (0.Cortar el papel con las dimensiones 15 x 15 cm.5 cm de las bordas.Cámara cromatográfica . PROCEDIMIENTO: . IV.1% en acetona . OBJETIVO .Solvente: mezclar en volúmenes 100 partes de n-butanol. interpretar el cromatograma e identificar las muestras. 30 partes de ácido fórmico y 25 partes de agua.Marcar puntos distintos con distancias adecuadas a lo largo de la raya para aplicación de la muestra y de los estándares. teniendo el cuidado de no dejar el solvente tocar en las manchas formadas en los puntos de aplicación de las muestras.Trazar con lápiz al largo de una de las extremidades a 2.Nebulizador Nota: Evite tocar el papel con la mano.Estufa a 100C . . .Identificar los aminoácidos de la muestra por comparación con los estándares y calcular los Rfs.Conclusión e interpretación.Calcular el Rf. . 14 . .5 cm de diámetro usando tubos capilares.Revelador: solución de ninhidrina al 0.1% en acetona y secar. .Retirar el cilindro de papel y marcar con lápiz la altura alcanzada por el solvente (frontera del solvente). 1) . .Dejar secar en estufa . .La presente técnica tiene como objetivo capacitar al alumno a ejecutar una corrida cromatográfica en papel.Aplicar círculos de solución de aminoácidos de  0. .III. . MATERIAL . .Papel de filtro (Whatman no.Muestra (solución de aminoácidos) . Después de secado aparecerán las manchas que señalan la presencia de los aminoácidos.Introducir el cilindro de papel en la cámara cromatográfica.1 M) . .Sellar la cámara y dejar que el solvente se desarrolle hasta  1 hora o hasta alcanzar 1 cm de la extremidad superior del papel.

Vaso de precipitado de 100 ml. 4. y este valor se le llama punto isoeléctrico o pH isoeléctrico.NaOH 1N . Existe un pH en el cual los aminoácidos y las proteínas forman especies sin carga. Dependiendo del pH de la solución.25 g de caseína . . II. por lo tanto tienen propiedades ácidas y básicas. TEORIA Las unidades fundamentales de una proteína son los aminoácidos. no como moléculas ionizadas. REACTIVOS . Los aminoácidos de las proteínas se pueden obtener por hidrólisis ácida o enzimática. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE UNA PROTEÍNA I. OBJETIVO Hallar el punto isoeléctrico de la caseína. los cuales contienen en sus moléculas grupo amino y grupo carboxilo.Nota: Evitar que la ninhidrina toque en su piel. Estos aminoácidos son fácilmente solubles en agua y existen como iones bipolares conocidos como zwitterion. en este valor de acidez estas moléculas no migran en un campo eléctrico. negativa o neutra.0. PROCEDIMIENTO 15 . los aminoácidos pueden tener carga positiva. III. presión osmótica y la menor viscosidad.9 tubos de ensayo . MATERIALES . En el pH isoeléctrico las proteínas tienen la menor solubilidad.4 buretas V. conductividad. igual comportamiento tiene las proteínas.CH3COOH IV.

acético 0.25 5. Cual fue el pI hallado por usted en el laboratorio para la caseína ? 16 . Agua destilada Ac.Bureta No.75 0. agua destilada .1 8 1 8 3.9 2 7. Pasar el contenido del beaker a un balón volumétrico de 50ml. La solución deberá quedar clara y limpia.5 0.6 3 8.5 5 5 8 1 4. ácido acético 1 N Las soluciones 2 y 3 se preparan por dilución a partir de la solución 1N. pesar 0.En un vaso de 100ml limpio y seco. lavando las paredes del beaker con suficiente agua destilada y llevando el volumen hasta la marca. VI. PREGUNTAS 1. Usando la escala de cruces. Determinar el punto isoeléctrico de una proteína.4 1. es el más cercano al pI de la caseína. 2. 1.01 N .Bureta No. 3. Agregar luego con exactitud 20ml de agua y 5 ml de NaOH 1N.75 1. Preparar cuatro buretas de 25 ml y rotularlas así: . ácido acético 0. 4.7 6 7 2 4. Adicionar 5ml de ácido acético 1N.6 3.1 N .Bureta No.Bureta No. agitar hasta obtener una disolución total.3 4 8. Colocar en la gradilla los tubos de ensayo y preparar las siguientes soluciones: Tubo No.5 Agregar a cada tubo 1ml de la solución de caseína.25g de caseína.62 5.4 7 5 4 4. Este pH en el cual se dio la mayor precipitación.1 N Ac. agitar el tubo inmediatamente y dejar reposar 20 minutos.25 5. Mezclar muy bien.acético . anotar el grado de turbidez de cada tubo. acético 1 N pH resultante 1 8.01 N Ac.4 0. mirar el grado de precipitación de cada tubo y anotar el pH al que presenta mayor precipitación. ácido acético 0.8 9 7. de lo contrario debe filtrarse o repetir el procedimiento.

17 Señale si las informaciones son falsas o verdaderas. el aminoácido se desplazará a cátodo El pI de la arginina debe ser: ( tenga en cuenta su estructura ) . Cuál es el pI para la caseína y en qué alimento(s) se encuentra en forma abundante? 3. e. f.a. Un a. b.59 El aminoácido es ácido A un pH de 5.muy por encima de 7 17 .2. según lo anterior: a. El aminoácido es básico El pI del aminoácido es 3. d.82 6 9.91 El pI del aminoácido es 7.muy por debajo de 7 .cerca de 7 . c. tiene los siguientes pK de acidez: 1.

La estructura primaria se mantienen inalterada siendo rotas los enlaces débiles que estabilizan la estructura terciaria nativa de una proteína globular (puentes de H. d) Glutelinas: proteínas insolubles en agua y etanol. 18 . fraccionamiento por solventes. carga eléctrica. por ejemplo. INTRODUCCION Diversas propiedades características de las proteínas globulares en solución pueden ser utilizadas para separar mezclas de proteínas tales como peso molecular. centrifugación. solubilidad. cromatografía de intercambio iónico. pasando a una cadena doblada al acaso. siendo por lo tanto utilizado como criterio de separación. solubles en soluciones salinas diluidas. En el rango de 40 a 50C la mayoría de las proteínas se tornan inestables y empiezan a desnaturalizar con pérdida de la solubilidad. e) Escleroproteínas: proteínas insolubles en solventes acuosos. Entre 60 a 70C las proteínas presentan desnaturalización. se puede obtener informaciones preliminares sobre las características de las proteínas de un material biológico. Según esos criterios de solubilidad. electroforesis. diálisis. atracciones electrostáticas. pero solubles en etanol 70-80%. de acuerdo con su solubilidad en diversos solventes. PROTEÍNAS: SEPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN I. En temperaturas de 0 a 40C. La desnaturalización consiste en el desenrollamiento de la estructura nativa característica de las proteínas globulares. diferencias en las características de adsorción y afinidad biológica por otras moléculas. en: a) Albúminas: proteínas solubles en agua y soluciones salinas.5. varios métodos de separación han sido desarrollados como. En ese sentido. b) Globulinas: proteínas ligeramente solubles en agua. precipitación isoeléctrica. Las proteínas pueden ser clasificadas. mas solubles en ácidos y bases. c) Prolaminas: proteínas insolubles en agua. El efecto de la temperatura también se puede observar en relación a la solubilidad de proteínas. filtración gélica y otros. la solubilidad de las proteínas globulares aumenta progresivamente.

En medio alcalino la coloración amarilla se intensifica debido al comportamiento como indicador de los nitroderivados formados. reacción xantoprotéica. urea. MATERIAL - Clara de huevo Erlenmeyer de 250 ml Probeta de 250 ml Embudo - 19 Papel filtro Beacker de 250 ml Bastón de vidrio Pipetas de 2 ml . solventes orgánicos. etc. En las proteínas tenemos aminoácidos con anillo bencénico sustituido como la tirosina. III. numero de cadenas peptídicas. radiaciones. como. y la secuencia de aminoácidos en la cadena. cloruro de guanidina. ella puede ser caracterizada por una secuencia de métodos para evaluar sus propiedades. Entre los diversos agentes desnaturalizantes se pueden citar variaciones bruscas del pH. como la reacción del Biureto. el triptófano y la fenilalanina. sencillamente. De esta manera. etc. formando compuestos amarillos. El ácido nítrico reacciona con los compuestos bencénicos formando nitroderivados de color amarillo. II. temperaturas elevadas. La albúmina de la clara del huevo es la ovomucina. Agitándose la clara del huevo con agua se consigue separar la ovalbumina (soluble en agua) de la ovomucina (poco soluble en agua). sulfato de amonio. se puede hacer el reconocimiento de la porción proteica de un material biológico. La reacción ocurre. La ocurrencia de estos fenómenos causa cambios en las propiedades de las proteínas como disminución de la solubilidad y pérdida de la actividad biológica. identificación de proteínas por la reacción xantoprotéica. por lo tanto. composición aminoacídica. TRABAJO PRÁCTICO Separación de las proteínas de la clara del huevo por la solubilidad en agua. La reacción xantoprotéica ocurre cuando las proteínas son calentadas con ácido nítrico concentrado. etc. a nivel de los radicales de aminoácidos que contiene anillos aromáticos y que hacen parte de las cadenas peptídicas de la mayoría de las proteínas. peso molecular. La clara del huevo esta constituida principalmente por proteínas (albúminas y globulinas). La caracterización o el reconocimiento de la porción protéica en un material biológico puede ser hecha.interacciones hidrófobas). Una vez aislada la proteína. a través de reacciones colorimétricas. a través de la reacción xantoprotéica.

cuidadosamente.Hidróxido de sodio al 20% . Observar y explicar los cambios (reacción xantoprotéica). Agitar con el bastón de vidrio.Solución de tirosina 1. Adicionar aproximadamente 200 ml de agua destilada. 4. Tomar una clara de huevo en un beacker.Goteros . Filtrar un poco del sobrenadante. 20 . 6. Tomar un beaker con un poco de agua. Enfriar el material y. 2. Observar y explicar lo que ocurre. 5.Tubos de ensayo . En un tubo de ensayo adicionar 2 ml de la solución de ovoalbúmina y en seguida 5 gotas de HNO3 concentrado (cuidado: no pipetear el ácido nítrico). Colocar el tubo en baño maría y dejar hervir por 2 minutos. Apuntar y explicar los cambios observados. Dejar en reposo por algunos minutos. Repetir el mismo test (a partir del ítem 3) utilizando 2 ml de solución de tirosina. 3. PROCEDIMIENTO .Ácido nítrico concentrado IV. adicionar hidróxido de sodio en exceso.. recoger el filtrado en un erlenmeyer (solución de ovoalbúmina). Observar y explicar los cambios cuando se le adiciona ácido a la proteína.

El color formado es debido a la reacción de la proteína con el cobre alcalino del reactivo y a la reducción de las sales fosfomolibdato-fosfotungstato en el reactivo por los aminoácidos aromáticos de la proteína (Tyr y Trp). se puede estimar la concentración de 21 . INTRODUCCON La determinación cuantitativa de proteínas puede ser hecha a través de varios métodos. o sea. la eficiencia y sensibilidad del método. El color producido es medido en el foto colorímetro siendo proporcional a la cantidad de proteína en la muestra. La escogencia del método dependerá de varios factores tales como: la naturaleza de la proteína y de otros componentes en la muestra proteica. se puede calcular la cantidad de proteína presente. el amonio es liberado y se puede estimar por varios medios. DOSIFICACION DE PROTEINAS DE LA LECHE POR EL METODO FOTOCOLORIMETRICO DEL BIURET I. Es también usado para estimar nitrógeno no proteico de una muestra después de la precipitación de proteínas. sob condiciones donde compuestos de nitrógeno son convertidos a sulfato de amonio. b) Método de Lowry Puede ser aplicado en material seco o en solución. Es muy sensible.25 mg de proteína. por la cantidad de amonio formado de una conocida cantidad de muestra. Como la cantidad de esos dos aminoácidos es generalmente constante en muchas proteínas. Entre los diversos métodos se puede citar: a) Método micro-kjeldahl Escogido para dosificar proteínas en alimentos y muestras clínicas y agriculturas.6. la rapidez. La muestra es digerida con ácido sulfúrico concentrado en presencia de catalizador. Así. c) Método de la Absorción en el Ultravioleta Muchas proteínas absorben en el ultravioleta en la región de 280 m debido a la presencia de tirosina y triptófano. 1 mg de nitrógeno corresponde a 6. dosifica 5 g de proteína. En general case todas las proteínas posee 16% de nitrógeno en su composición. Por destilación a vapor en presencia de una base fuerte (NaOH).

.. El método es llamado método del "Biuret".. porque el Biuret resulta reacción positiva semejante a la proteína cuando colocada en presencia de sal de cobre en medio alcalino..O..NH .....C ....COO ..COO ...    R R R El procedimiento de este método es simples y rápido... ofrece una buena estimativa de la cantidad de proteínas en muestra analizada...COO .C ..76 ..CO ..NH ..C . de ahí la recomendación de utilizarse muestras desengrasadas...las proteínas como siendo proporcional a la absorbancia a 280 m. además de eso.COO .C .280 .. que enmascara la absorción por la proteína..260 d) Método del Biuret Está basado en el hecho de que compuestos conteniendo dos o mas enlaces peptídicos forman un complejo con sal de cobre en soluciones alcalinas.CO . El color desarrollado es debido a un complejo de coordinación entre el Ion cuprico y cuatro grupos NH de dos cadenas peptídicas según lo observado abajo: .0.. NH .COO . No hay prácticamente ninguna otra sustancia presente en materiales biológicos y que pueda interferir en esto método.. D.NH ..NH2.NH . Soluciones puras de proteínas conteniendo 1 mg de proteína/ml presentan absorbancia en 280 m igual a 1.O. 22 ......... La estructura del Biuret es la siguiente: H2N .0 cuando en cubetas de diámetro de 1 cm... Una fórmula es usada para solucionar el problema: Concentración de proteína (mg/ml) = 1... Ácidos nucleicos son contaminantes en extractos proteicos y presentan fuerte absorción en 260 m.    R R R Cu++ ... Además el desarrollo del color no es el mismo con todas las proteínas y los resultados pueden ser afectados por la presencia de lípidos.C ...NH .. D.NH .....55 ..... NH ....C .COO ..NH ....

TRABAJO PRÁCTICO En este experimento será hecho.). ellas irán repelar una con las otras. Alcanzándose el punto isoeléctrico de la caseína (pH 4. todas las moléculas poseen una carga efectiva de misma señal. Absorbancia de la muestra Conc. Como las proteínas presentan punto isoeléctrico diferente. evitando la coalescencia de las moléculas aisladas en agregados insolubles.El método puede ser usado para varios tipos de alimentos. definido como el pH en que la molécula no presenta carga eléctrica efectiva y es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico. cuya proporción en la leche es considerablemente menor relacionado con la caseína. ellas pueden ser separadas unas de las otras por precipitación isoeléctrica. será hecha la dosificación cuantitativa de las proteínas basándose en la ley de Lambert Beer: "la concentración" es directamente proporcional a la absorbancia (A) o densidad óptica (D. La solubilidad de la mayoría de las proteínas globulares esta influenciada por el pH del medio en que se encuentran. en valores de pH arriba o debajo de su pH isoeléctrico la solubilidad de las proteínas se eleva acentuadamente. la separación de la caseína (principal proteína de la leche). carnes y cereales. no existe repulsión electrostática entre las moléculas proteicas vecinas y ellas tienden a coalescer y precipitar. en valores de pH arriba o abajo del punto isoeléctrico. entre ellos. El pH en que la proteína tiene su menor solubilidad es en su pH isoeléctrico.6). la intensidad del color desarrollado es medida en el fotocolorímetro con una intensidad de onda de 540 m y comparada con patrones de proteínas tratadas de la misma manera. Entretanto. Después de la separación de las proteínas de la leche. II. 23 . a través de precipitación isoeléctrica. Después la reacción del reactivo de Biuret con la proteína.O. usándose los datos en la formula a seguir para determinar la concentración de proteína en la muestra. restando en solución la lactoalbúmina y lactoglobulina. En esas condiciones. observándose algunos cambios y adaptaciones. además de la leche. De ese manera. Como consecuencia. del patrón Absorbancia del patrón Al efectuarse estos cálculos se hace las debidas correcciones debido a las diluciones de las muestras. esta se precipita. inicialmente. de la muestra = x conc.

Ácido clorhídrico al 2% . no deben ser analizadas por este método. con agitación constante. hasta que la leche coagule.En un erlenmeyer adicionar 25 ml de leche y 25 ml de agua destilada. PROCEDIMIENTO En esa práctica hay necesidad de preparar dos muestras de leche. pues este dato será utilizado en los cálculos finales.Filtrar (papel de filtro) y usar el filtrado posteriormente para la dosificación. acrecentar HCl. 24 .Solución estándar de (concentración 1 mg/ml) . En esta muestra I tenemos entonces la lactoalbúmina y lactoglobulina ya que la caseína fue separada por precipitación isoeléctrica. III.Fotocolorímetro .Reactivo de Biuret: *    . . MATERIAL - Erlenmeyer Bureta Pipetas Probeta Embudo Tubos de ensayo . . Anotar en volumen de ácido gastado.Leche descremada caseína Sulfato de cobre cristalizado Tartarto doble de sodio y potasio Agua destilada Hidróxido de sodio al 10% IV.Papel de filtro . por lo tanto muestras que contengan concentraciones de proteínas debajo de ese rango.0 a 5.Homogenizar. gota a gota.0 mg/ml. muestras de concentración arriba de ese rango deben ser diluidas adecuadamente. pués el resultado no será real. utilizándose una bureta. a) Preparo de muestra I: .Debe considerarse aún en este método que su sensibilidad está alrededor de concentración de 1.

c) Dosificación de las muestras y estándar Enumerar 4 tubos de ensayo y distribuir las soluciones según el cuadro abajo: Tubo 1 (blanco) 2 3 4 H2O (ml) Proteína Muestra I estándar (ml) (ml) Muestra II (ml) 3 3 3 3 Reactivo de Biuret (ml) 12 12 12 12 .9 y al adicionarle HCl el pH va bajando hasta llegar a 4. En esta muestra no será separada ninguna de las 3 proteínas teniéndose por lo tanto en ella las proteínas totales. haciéndose por lo tanto una dilución 1/20. 25 .Reportar los resultados en g de proteína por 100 ml de leche y calcular el porcentaje de caseína por diferencia entre la muestra I y II.6 (punto isoeléctrico de la caseína) y en ese pH la caseína precipita separándose de la lactoalbúmina y lactoglobulina.El pH de la leche es aproximadamente 6.Mezclar el contenido de los tubos por inversión y dejar en reposo por 15 min para que ocurra la reacción de complejación del ion cúprico con las cadenas peptídicas de las proteínas.Hacer los cálculos usando la fórmula citada anteriormente hacer las correcciones necesarias debido a las diluciones hechas en las muestras. . . Homogenizar. . b) Preparo de la muestra II Diluir 1 ml de leche con 19 ml de agua destilada.Hacer la lectura de las soluciones en el fotocolorímetro a 540 m usando el contenido del tubo 1 (blanco) para cerrar el equipo.

.Batir una clara de huevo y acrecentar 6 veces su volumen de agua. III. adicionar 3 ml solución albúmina. Las unidades fundamentales de las proteínas son los aminoácidos que son compuestos orgánicos que contienen grupos amino y carboxilos. II. determinando así la estructura primaria. Las propiedades fisicoquímicas de las proteínas están determinadas por la secuencia de aminoácidos. OBJETIVO Identificar algunas reacciones de las proteínas. por lo tanto poseen propiedades ácidas básicas. su configuración. oligopéptidos y polipéptidos. nitrógeno y con frecuencia azufre. * CADA GRUPO DEBE TRAER UN HUEVO. las fuerzas interiónicas. Las proteínas se consideran que están formadas por polipéptidos que adquieren diferentes configuraciones espaciales. 1.7. TEORÍA Las proteínas son moléculas de alto peso molecular. tetrapéptidos.A 3 tubos de ensayo (A. puentes de hidrógeno. ENSAYOS CON PROTEINAS I. al tubo B adicione 1 gota de HCl concentrado y al tubo C adicione 1 gota de NaOH. hidrógeno.Desnaturalización . que contienen carbono. B Y C). Los aminoácidos se unen por enlaces peptídicos para formar dipéptidos. secundaria.Anotar observaciones. .Al tubo A caliente hasta coagulación. etc. PARTE EXPERIMENTAL Preparación de la muestra*: . oxígeno. 26 . terciaria y cuaternaria de las proteínas.

Observar lo ocurrido.Reacción de precipitación de cationes .Reacción de Biuret .Anotar observaciones.2 . .En un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solución de albúmina y 3ml CuSO 4 al 10%. 3.Anotar observaciones. 1 ml de NaOH al 10% y 1 gota de CuSO4. .A un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solución de albúmina y 5 ml de etanol.Solubilidad en Etanol .al 1%. 27 .En un tubo de ensayo adicionar 3 ml de solución de albúmina. 4. .

Analizar los factores que afectan la velocidad de reacción de las enzimas. ENZIMAS 8. Este cofactor.Comprobar la acción de la amilasa con reactivos de Fehling y de Lugol.Tomar 3 tubos de ensayo y marcarlos: A.Filtrar la solución obtenida b) . en cuanto a sustrato.Al tubo C. y repetir el proceso 2 veces. Al ser catalizador. TEORIA Las enzimas son proteínas conjugadas. es generalmente un compuesto orgánico: un nucleótido libre. y tomar un poco en la boca. PARTE EXPERIMENTAL a) . ENZIMAS: AMILASA SALIVAL I. Otro aspecto importante de las enzimas es su especificidad. II. Las enzimas necesitan una coenzima o cofactor. hervir por 5 minutos y enfriar . .Enjuagar muy bien. no interviene en el producto final. . Las enzimas poseen un sitio activo en forma de hendidura donde reacciona con el sustrato por medio de enlaces covalentes.Recoger el enjuagado. Cada enzima tiene condiciones óptimas para su funcionamiento. acrecentar 2 ml de HCl 1M.El tubo B. 28 .Comprobar la acción de la amilasa salival sobre el almidón. no se le echará nada.Al tubo A. generalmente de estructura globular. .Agregar a cada uno 5 ml de solución de saliva . Su principal propiedad es ser catalizadores biológicos. . OBJETIVOS .Calentar agua a 40 C en un beaker. .III. aunque puede ser un mineral. temperatura y pH. . III. B y C .

29 . Realizar pruebas de Lugol y de Fehling a cada 10 minutos hasta observar cambio. NOTA: Realizar las pruebas de lugol en vidrio de reloj. Agitar cada 5 minutos. Realizar pruebas de Fehling y Lugol a los 3 tubos.- Mezclar bien el contenido de todos los tubos. Colocar los tres tubos a 40  C. Adicionar 5 ml almidón 2% a cada tubo.

Testar la influencia de la temperatura sobre su actividad. llevando estos sustratos a quinonas correspondientes con surgimiento de color. . . Algunos alimentos por 30 . que son los catalizadores biológicos. ESTUDIO DE LA POLIFENOLOXIDASA (PPO) EXTRAIDA DE LA PAPA I.Verificar su especificidad en lo relacionado a diversos compuestos. presentando su mayor actividad enzimática a 37C. Tales reacciones comúnmente ocurren en vegetales promoviendo el oscurecimiento enzimático de ciertos frutos y hojas como: pera. OBJETIVOS . manzana. durazno. que catalizan o aceleran una reacción química. estos componentes son los cofactores que pueden ser: grupos prostéticos. Estas transformaciones se deben a las proteínas llamadas enzimas.9. Esta enzima cataliza la reacción de varios difenoles. Las enzimas están sujetas a influencia de varios factores como: pH. en la posición orto y para. cuando su tejido es magullado (herido). Estos oscurecimientos poden alterar el sabor. apariencia y hasta mismo el valor nutricional. pudiendo perder su actividad biológica "desnaturalizándose". Cu++. Una de las características principales de la célula es su capacidad de hacer con que las reacciones complejas se procesen rápidamente a la temperatura del medio circundante. hojas de tabaco y café. INTRODUCION Las enzimas son proteínas sintetizadas en la célula viva. calor. coenzimas y activadores metálicos. H +. Muchas veces una enzima exige un componente adicional para que pueda ejercer su función.Extraer la PPO de la papa. ácidos y bases fuertes. II. La PPO es una enzima cúprica con un pH óptimo alrededor de 6 a 7. se destacan por la notada especificidad a los sustratos debido a su compleja estructura protéica. Las enzimas comparadas a los catalizadores no protéicos tales como Pt. Se evalúa la actividad de una enzima rutinariamente por el surgimiento de los productos o por el desaparecimiento del sustrato. que todos los factores arriba mencionados sean bien definidos. Para su perfecto funcionamiento es necesario.

Los meta difenoles raramente son sustratos para las fenolasas y en algunos casos otros sustratos deberán antes seren hidroxilados para transformaren en las quinonas correspondientes.4 benzoquinonilanina Dentro de los sustratos recomendados los difenoles en posición orto presentan oscurecimiento enzimático más rápido y acentuado. a pesar de traer ciertos inconvenientes el uso de algunos de estos (SO2. glucosa.C -COOH H2N  CH2  + ½  CH2   + ½ O2 PPO OH Tirosina . serán testados para nuestra observación. o aún. alterando el pH y la temperatura. que podrá ser observada con el aparecimiento del color oscuro. La formación de estas quinonas es dependiente de la enzima y del oxígeno. hidroquinona. SO2.tradición son deseados el oscurecimiento como: café. siendo que la intensidad de la reacción es verdaderamente evaluada por el consumo de oxígeno. CH3OH.C -COOH OH O2 PPO O O OH 3. CH3OH). té.C -COOH H2N  CH2  . ácido gálico. (CH3)2SO4. MATERIAL Y REACTIVOS - Ácido caféico Ácido clorogénico Ácido quinico Glucosa - 31 Floroglucinol Resorcinol Ácido gálico Catecol . En esta práctica varios compuestos serán tratados con el extracto conteniendo PPO. clorogénico. etc. ácido ascórbico.4 dihidroxifenilalanina 3. La industria busca prevenir estos oscurecimientos adicionando productos como: CH3I. con la finalidad de verificar la especificidad de esta enzima con varios sustratos. III. cervezas. H2N . "Sustratos" como: tirosina. ácido quínico.

.Tome cerca de 3 ml del extracto conteniendo PPO y le de un ligero calentamiento.- Fenol Tirosina Hidroquinona Buffer fosfato 0. .5 Tubos de ensayo Baño maría Pipetas - Licuadora Tela de lino o gaza Papa Termómetro Vasos Erlenmeyer IV. homogeneice.A seguir. y en cada tubo adicione 1 ml del extracto de PPO. durante 5 minutos. colocando en baño maría a 37C.1 M pH 6. retire el sobrenadante que es la fuente de PPO. coloque en un tubo de ensayo 1 ml de este extracto y 1 ml del sustrato que mejor reacciono con PPO en la prueba anterior. 37C.Comente su observación y justifique. deje decantar (5 minutos). 1 ml de sustrato. . b) Influencia de la temperatura .El tubo 1 será el blanco y contendrá a penas 1 ml de agua y 1 ml del extracto de PPO. Deje descansar por 5 minutos en baño de hielo. . .Comente su observación y justifique. Adicione 1 ml del mismo sustrato también mantenido a 0C. .El extracto de PPO es preparado licuando una porción de papa con 150 ml de buffer fosfato 0.En cuál temperatura (0C.1 M pH 6. Homogeneice. calentamiento) la enzima presento mayor actividad? 32 . Deje por 5 minutos a 37C. PROCEDIMIENTO a) Especificidad .5. . . .En otro tubo de ensayo coloque 1 ml del extracto de PPO y deje en baño de hielo por 5 minutos.Enumere los tubos de 1 a 12. A mayor especificidad será observada en los tubos donde aparezca el color más oscuro el que demuestra la especificidad de la enzima por el sustrato resultando en las quinonas correspondientes.Comente su observación y justifique.Filtre en tela de lino o gasa.

La saliva contiene un 99% de agua. . * 1 ml de saliva en 9 ml de agua destilada.1 M. INTRODUCION La saliva es producida por las glándulas parótidas submaxilares y sublinguales. colesterol. etc. incluye ptialina (amilasa salivaria). 1 ml de cloruro de sodio al 0. calcio. PROCEDIMIENTO . garganta y esófago.4.2.8. PARTE A Determinación del pH óptimo en la acción de la ptialina. 7. 5. PROCEDIMIENTO .Añada a cada tubo 5 ml de la solución amortiguadora de su respectivo pH.0. potasio. 7.10. El pH promedio es de 6.Coloque en una gradilla 5 tubos de ensayo y márquelos pH 8.8. . ácido úrico. A continuación añada a cada tubo 2 ml de almidón al 1%.Coloque todos los tubos numerados. 6. fosfato. El material sólido que contiene. II.Tome 4 tubos de ensayo y repártalos así: 33 . ENZIMAS Y SU DESEMPEÑO EN LOS ALIMENTOS (CHO) I. PREGUNTAS a) Cuál es el pH óptimo para la Ptialina? b) Cómo explica la acción incontinua de la Ptialina en el estómago? c) Qué ocurre cuando se alcanza el punto acrómico? PARTE B Influencia de la temperatura sobre la acción de la Ptialina. sodio. varias proteínas y otras sustancias como urea. II. así como también por las glándulas bucales y membranas mucosas de la boca. III. 1 ml de saliva diluida* y 3 gotas de lugol. en un baño de agua a 38 C y determine cual tubo alcanza el punto acrómico ( sin color ).

Añada a cada uno de los 3 primeros tubos. saque una muestra de cada tubo y pruebe con 2 gotas de yodo 0. .01M y note la velocidad de digestión en cada tubo.El primero No. III. Al cuarto tubo añada 2 gotas de saliva diluida que haya sido calentada en agua hervida por 5 minutos. 1. en mezcla de agua-hielo El segundo No.A intervalos de 5 minutos. temperatura ambiente El tercero No. mas los 2 ml del almidón al 1%. 3. . se da por terminada la reacción. 5 gotas de saliva diluida ( 1:9 ) y 2 ml de solución de almidón al 1% y mezcle bien. en baño maría a 38 C. 2. cuando no haya color. PREGUNTAS a) Cuál tubo alcanza primero el punto acrómico? c) Qué significa que los otros tubos permanezcan iguales? 34 .

TEORIA Los hidratos de carbono son compuestos que contienen además de carbono. OBJETIVOS Al finalizar esta práctica. hidrógeno y oxígeno en proporción de 2 a 1. Este nombre también se usa para algunos de sus derivados en los que la definición dada no se cumple estrictamente. IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS I. en presencia del reactivo de Fehling.Glucosa 5% .Sacarosa 5% .Fructosa 5% . Benedict o Tollens. el estudiante estará en capacidad de: . CARBOHIDRATOS 11.IV. II.Clorhidrato de fenilhidrazona II. utilizando reactivos de Molisch Antrona. MATERIAL Y EQUIPO - Tubos de ensayo Espátula Beaker Baño de María Antrona Molisch Acido sulfúrico concentrado Hielo Agua HCl concentrado Fehling - Lugol Tollens Seliwanoff Acetado de sodio HCl 10% . de acuerdo a la formación de un precipitado de color amarillo o rojo ladrillo. 35 .NaOH 10% . .Diferenciar un carbohidrato reductor de otro no reductor.Almidón en polvo .Reconocer la presencia de carbohidratos en una sustancia orgánica.

son consumidos por el hombre y los animales para su alimento. etc. o es almacenada temporalmente como glicógeno en el hígado y los músculos. desempeñando papeles tanto estructurales como funcionales. la cual es luego oxidada a CO 2 y H2O. S y/o N. generan entre 2 y 10 unidades de monosacáridos. que en algunos casos. se clasifican como aldosas y cetosas. H. que no pueden realizar fotosíntesis. Oligosacáridos: son los carbohidratos que por hidrólisis. d. celulosa. En el hombre más del 60% de los requerimientos totales de energía proviene de la oxidación de los hidratos de carbono. para sintetizar hidratos de carbono a partir de bióxido atmosférico y agua. CO2 + H2O Energía solar CO2 + H2O CO2 + H2O Energía Cx(H2O)y Cx(H2O)y 36 . Cx(H2O)y Han sido definidos como polihidroxialdehidos o polixidroxicetonas. Ej: rafinasa. dando glucosa. la molécula se rompe en el estómago e intestinos. En esta forma los animales. Polisacáridos: al hidrolizarlos se obtiene más de 10 unidades de monosacáridos. Estos compuestos son de importancia fundamental en la biosfera y se elaboran durante la fotosíntesis. c. estaquiosa.Los carbohidratos más simples contienen C. Según el grupo carbonílico que presenten. Disacáridos: un carbohidrato que por hidrólisis da dos moléculas de monosacáridos. Se dividen en 4 grandes grupos: a. Monosacáridos: aquellos carbohidratos que no son hidrolizables a compuestos más simples. Ej: sacarosa. Por fotosíntesis las plantas verdes y las algas pueden usar la energía solar. Los carbohidratos y sus derivados se encuentran en casi todas las partes de la célula. Después de que los carbohidratos complejos han sido ingeridos. maltosa. Ej: glucosa b. Ej: Almidón. Muchas plantas almacenan grandes cantidades de hidratos de carbono. pueden aprovechar la energía solar. O pero muchas de las que existen en la naturaleza contienen también P.

hidroliza enlaces glicosídicos para dar monosacáridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus derivados. 1. excepto que el furfural se combina con . Reacción de Molisch El fundamento es similar al de la reacción de antrona.naftol a 2 ml de la sustancia problema. Reacción de la Antrona El H 2SO4 concentrado. Estos productos se combinan con antrona dando un complejo azul-verdoso.2. Añada cuidadosamente por las paredes del tubo aproximadamente 1 ml de H2SO4 concentrado hasta que se formen dos capas . observe cuidadosamente cualquier cambio de color en la interfase de los dos líquidos.1. originando un complejo púrpura. Repita el procedimiento para cada una de las muestras problemas disponibles.naftol sulfonado. agite lentamente y observe el cambio de color. PARTE EXPERIMENTAL 1. El procedimiento es el siguiente: agregue 2 gotas de la solución de . y también con el agua en vez de la muestra problema. agregue 5 gotas del reactivo de Antrona. que contiene OH alcohólico bajo estas condiciones. El procedimiento es el siguiente: en tubos de ensayo a aproximadamente 2 ml de las soluciones problemas. Reacciones Genéricas de los Carbohidratos 1.Plantas verdes Animales O2 O2 Ciclo del carbono en la biosfera IV. Reacciones de los Azúcares Reductores En la práctica se usa una solución alcalina de una sal de cobre y un compuesto orgánico. el 37 . 1.3.

5. Preparación de Ozasonas En un tubo de ensayo. éste complejo en presencia de sustancias reductoras y calor se precipita a óxido cuproso de coloración parda. 1. Reacción de Fehling En tubos de ensayo mezcle 2 ml de la solución A de Fehling con 2 ml de la solución B de Fehling. es indicativo de que la prueba es positiva. Hidrólisis de la Sacarosa 38 . Caliente como máximo 25 minutos. para presencia de cetosas. Mida el tiempo de formación de cada osazona. continúe el calentamiento. Reacción de Tollens Coloque en un tubo de ensayo 1 ml de reactivo de Tollens. 1. así: 2 Cu(OH)2  CU2O + H2O Los carbohidratos que poseen un aldehído libre o potencialmente libre o un grupo cetónico. Reacción de Seliwanoff Mezcle 1 ml del reactivo con 1 ml de la solución problema al 5%. 1. agregue 1 ml de la solución problema.3.cobre forma un complejo soluble y el reactivo es estable. enfríe y observe.3. caliente en baño María 10 ó 15 minutos.6.3 g de acetato de sodio disueltos en 3 ml de agua. el desarrollo de un color rojo en 2 minutos. Caliente la mezcla a ebullición. 1.2 g de clorhidrato de fenilhidrazona y 0. Observe si hay formación de espejo de plata. agregar 2 ml de la solución problema. Caliente por 20 minutos.2. registre el tiempo necesario para la aparición de un precipitado rojizo. tienen propiedades reductoras en solución alcalina. coloque 0.1.4. 1. Introduzca los tubos en baño María previamente calentado. añada 2 ml de la solución problema.

39 . previo enfriamiento con baño de hielo. la prueba del lugol. Hidrólisis del Almidón Mezcle 1 g de almidón molido con 10 ml de agua fría. conteniendo cada uno 4 ml de solución acuosa de sacarosa al 50%. y agregue 4 gotas de lugol. Al resto de la solución añada 10 ml de HCl concentrado y lleve a ebullición. y al tercero de NaOH al 10%.Tres tubos de ensayo. A cada 5 minutos. al segundo HCl al 10%.7. Qué grado de hidrólisis observó en cada caso? 1. Enfrie 5 ml de esta solución. y vierta esta suspensión en 200 ml de agua hirviendo. se colocan en baño María y se les agrega igual volumen de agua al primero. Se calientan y después se ensaya una porción de cada uno de ellos con el reactivo de Fehling. tome 2 porciones de 3 ml cada una y haga la prueba de Fehling en una y en la otra.

MATERIAL Y EQUIPO .AISLAMIENTO E HIDROLISIS I. POLISACARIDO . A menudo se le designa como almidón animal.Ácido tricloroacético (TCA) 10% en agua . Aislamiento 40 . mediante las pruebas características de carbohidratos.Etanol al 95% - Éter etílico Ácido clorhídrico Hidróxido de sodio Hielo III. PARTE EXPERIMENTAL 1.glucopiranosas.Etanol absoluto . El glicógeno no es reductor y con el yodo toma un color rojo. IV. tiene una estructura ramificada con unidades de cadena lineal de 11 a 18 -D. TEORIA El glicógeno es un polisacárido de almacenamiento en las células animales. OBJETIVO Al finalizar la práctica. mediante uniones glucosídicas en  (1-6).Hígado . las cuales presentan una unión glucosídica en  (1-4) con ramificación. el estudiante estará en capacidad de : . II.12.Identificar monosacáridos a partir de una hidrólisis de polisacáridos.

2 N. adicione luego 2 volúmenes de etanol al 95%. lo mismo haga con el tubo 3 . al cabo de 10 min neutralice el ácido en el tubo 3 con 1 ml de NaOH 1. Determine la glucosa liberada mediante algún método conocido (antrona-Molisch). Descarte el sobrenadante. al resto de los tubos coloque 0. pase el sobrenadante a un tubo de ensayo. si esto no ocurre agregue una pizca de sal y caliente de nuevo el tubo hasta que el precipitado flocule. el precipitado es el glicógeno. Centrifugue el homogeneizado por 5 minutos. tome un volumen de 5 ml. Deje el tubo 1 con 0.El hígado frío deberá ser pesado. centrifugue. mezcle bien y deje decantar el precipitado. se agrega lentamente 2 volúmenes de etanol 95%. Luego. 41 . Hidrólisis ácida de glicógeno Haga una solución de glicógeno de 8 mg/ml.6 ml de HCl 2 N. y luego neutralice con 1 ml de NaOH 1. Determine por el método de lugol. rotule 4 tubos de ensayo. 2. macere el hígado en un mortero preenfriado con TCA 10% (1ml de TCA por gramo de hígado). centrifugue después por 3 minutos. Disolver el precipitado en 5 ml de agua. Saque la preparación en un vidrio de reloj y pese el glicógeno. la presencia de glicógeno. lavar el precipitado con 3 ml de etanol 95%. el tubo 4 déjelo 25 minutos.4 ml de la solución de glicógeno y añada 0.2 N. colóquelos en un baño de agua hirviendo. a los tubos 1 y 2 agregue 1 ml de NaOH 1.2 N.4 ml de agua como blanco.

V. por ejemplo (benceno.Aceite de oliva III. II. según que por hidrólisis alcalina generan o no sales de ácidos grasos (jabones).Ácido oleico . Los lípidos pueden clasificarse en complejos y simples. MATERIAL Y EQUIPO - Tubos de ensayo Beacker Agua destilada Cloroformo Éter Alcohol Aceite de algodón Sales biliares . solubles en solventes orgánicos no polares. LIPIDOS 13. mediante la comprobación de diferentes propiedades físicas. TEORIA Los lípidos son un grupo grande y heterogéneo de biomoléculas orgánicas.Ácido esteárico 5% . éter. presentes en las células. Los lípidos simples como esteres de ácidos grasos son diversos alcoholes (grasas y ceras).Solución saponificada (grasa y KOH etanólico al 20%) . OBJETIVO Al finalizar esta práctica. el estudiante estará en capacidad de identificar la presencia de lípidos en un compuesto orgánico o alimento.Cloruro de calcio 10% . 42 . cloroformo. QUIMICA DE LOS LIPIDOS I.Ácido nítrico concentrado . tetracloruro de carbono) y son insolubles en agua.

Acilglicérido Son esteres de los ácidos grasos y del alcohol glicerol.O .CH R2 OH CH2 . los aceites. carbohidrato y componentes más complejos.O .C ) pueden ser iguales o diferentes y los R forman R1 parte de ácidos grasos de cadena lineal larga. inositol. esteroides y prostaglandinas.X La X constituye grupos de cabeza polar. glicerol. sobre todo los de reserva en los seres vivos.O . Los esfingolípidos se dividen en esfingomielina y glucoesfingolípidos. son los más abundantes dentro de los lípidos.C R3 O Los grupos acilo ( R .P O .Tenemos como ejemplo derivados de lípidos como terpenos.O .C O  R1 C . Fosfoglicéridos Son componentes esenciales de las membranas biológicas.O . Se encuentran principalmente en las membranas celulares del tejido nervioso. 2. estas cadenas completamente saturadas constituyen las grasas y con insaturaciones. porque contienen el grupo fosfato en la molécula. provenientes de amino alcoholes.H R2  O CH2 . la estructura se representa así: O CH2 . Los fosfoglicéridos y las esfingomielinas se consideran fosfolípidos o fosfátidos.O . OCH2 .C O R1 C .C . 43 . 1.

Esteroles Son derivados del ciclopentano perhidrofenantreno.4. E. alcanfor.( CH2)29 . y la coenzima Q. Terpenos Son compuestos lineales o cíclicos constituidos por dos o más unidades de isopreno. pigmentos. K. CH2 = C . con alcoholes monohidroxílicos o con esteroles y son insolubles en el agua: el principal constituyente de la cera de abejas es el palmitato de miricilo. Ceras Son esteres de ácidos grasos saturados superiores.C O . eucaliptol.CH3 Las ceras forman películas protectoras en la superficie de las hojas. caucho. frutos. pelo y plumas.CH = CH  CH3 Los terpenos y terpenoides se encuentran en las plantas en la forma de aceites esenciales. etc. resinas. piel. carotenóides. Ej: geraniol.(CH2)14 . O CH3 . 44 . 6. vitaminas A. limoneno. 5.

ml agua destilada ml cloroformo ml éter ml alcohol Gotas de aceite de algodón Agitar los tubos y observar los resultados. Prostaglandinas Son derivados cíclicos de ácidos grasos. Emulsión de los lípidos. no saturados de 20 átomos de carbono que actúan en la regulación metabólica. Saponificación de las grasas Preparar 3 tubos de acuerdo al siguiente esquema: 45 1 7 3 2 5 2 3 . 7. ml de agua destilada ml sales biliares Gotas de aceite de algodón Agitar los tubos y observar los resultados. IV. otros ejemplos de esteroides son los ácidos biliares. 1 2 5 2 2 5 3 2 5 4 2 5 2. Preparar 2 tubos de acuerdo al siguiente esquema: TUBOS No. Solubilidad de los lípidos Preparar 4 tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema: TUBOS No. el cual se encuentra normalmente esterificado con los ácidos grasos. 3. hormona corticales y sexuales y la vitamina D. PARTE EXPERIMENTAL 1.Los esteroles son alcoholes esteroides cuyo miembro representativo es el colesterol.

gota a gota. Consultar: a) b) c) d) e) Qué es índice de Yodo? Qué es índice de saponificación? Qué es ácido graso? Qué es glicolípido? Qué es lipoproteína? 46 . 4. colóquelo por 1 hora en baño de María. añada 30 ml de KOH etanólico (20%).TUBOS No. ml cloroformo Gotas de ácido esteárico al 5% Gotas de ácido oléico Gotas de aceite de oliva 1 5 - 2 5 2 - 3 5 2 - 4 5 2 A cada tubo añada solución de HUBL. hasta reproducir el color desarrollado en el tubo No. 5. ml solución saponificada ml cloruro de calcio al 10% ml ácido nítrico (gota a gota) Agitar los tubos y observar los resultados. agregue luego 30 ml de agua destilada. comparar las cantidades de solución de HUBL gastadas en cada caso. con agitación. 1 5 - 2 5 1 - 3 5 1 Solución saponificada: Tome 10 g de grasa en un erlenmeyer. 1. Índice de Yodo Preparar 4 tubos de ensayo según es siguiente esquema: TUBOS No. Explicar los resultados.

Compare sus resultados con los obtenidos por otros grupos para diferentes lípidos. un índice de la frescura y la calidad de la grasa. y. mantequilla y margarina (usar una muestra fresca y otra que se ha dejado al aire por varios días. II. 2. KOH (0. III. Fenolftaleína (10 g/l en alcohol). Buretas (5 ml y 25 ml). 5. Aceite de oliva. El valor de acidez es el numero de miligramos de KOH requerido para neutralizar los ácidos grasos libres presentes en 1g de grasa. La cantidad de ácidos grasos da. Solvente de grasa (volúmenes iguales de 95% v/v de alcohol y éter) neutralizado a la fenolftaleína. 3.Una muestra seca. Se sugiere que cada par de estudiantes escoja un lípido y haga un ensayo de: . a su hidrólisis por microorganismos. METODOLOGIA 47 .1 mol/l).14. MATERIALES 1. FUNDAMENTO Las grasas almacenadas pueden enranciarse debido a la oxidación de los dobles enlaces. con liberación de ácidos grasos. DETERMINACIÓN DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA GRASA I. para formar peróxidos. 4.Una que haya sido expuesta al aire por un tiempo. . por tanto.

después de derretirla. Agregar 1 ml de solución de fenolftaleína. Colocar los tubos sumergidos en un baño de hielo dentro de una nevera. Prueba del frío Utilizar aceite de girasol. Determinación de la acidez Pesar cuidadosamente 10 g de la sustancia problema. y calcular el valor de acidez de la grasa. Nota: 0. mezclar cuidadosamente y titular con KOH 0. y suspenderla. agitar y observar si no hay 48 . a) Prueba de adición de yodo . 3.Agregar 3 gotas de solución de yodo o lugol a la muestra de aceite. 2. .6 mg/ml. agitar con vigor y observar el color rojizo de la mezcla.Enfriar.1 mol/l KOH contiene 5. agregar 5 gotas de solución de almidón.1. en 50 ml de un solvente de grasa. Pruebas de insaturación Esas pruebas son aplicadas en la caracterización y el control del procesamiento de tales productos para transfórmalos en mantecas vegetales. hasta que el color rosado pálido permanezca por más de 20-30 s. Rotular 3 tubos de ensayo y poner 5 ml de cada aceite en cada tubo según la rotulación.6 g/l o 5. a intervalos vayan observando para determinar si se produce enturbiamiento del aceite por cristalización de sus glicéridos y anoten el tiempo en que ella se produce. oliva y manteca de cerdo. Anotar el número de ml de álcali que necesita. algodón.Calentar con suavidad y observar si el color va cambiando hasta desaparecer por completo. .1 mol/l. .Colocar 1 ml de cada aceite por ensayar en un tubo de ensayo rotulado.

yodo libre en la mezcla. . lo cual indica que ya hay yodo libre en la prueba. . 49 . con ayuda de una pipeta graduada. Trate de explicar los resultados obtenidos. con inclusión de las correspondientes reacciones. Prueba de adición de bromo . pero agregando lugol hasta que su coloración rojiza persista en la mezcla y observen la coloración azul que se produce con el almidón.Repetir la prueba con otra muestra del mismo aceite. vaya agregando solución de bromo a cada muestra de aceite.Disuelve 2 ml de bromo en 50 ml de tetracloruro de carbono. .Colocar 1 ml de cada aceite por ensayar en un tubo de ensayo rotulado. hasta cuando el bromo se decolore por completo. b. con el fin de comparar entre los aceites ensayados.Gota a gota. .Anotar el volumen o el numero de gotas de solución de bromo requeridas para que el reactivo deje de decolorarse. con agitación después de cada gota de reactivo.

.KOH 10% etanólico .15. .Acetato de plomo .Bastón de vidrio III. .Acetona .Ácido sulfúrico concentrado .Acetato de cadmio o zinc . . colesterol.Solución de cloruro de calcio saturada . I.Pase por el papel de filtro en uso 10 ml de etanol y recoja 2 ml en un tubo de ensayo. II. reservando el filtrado para las siguientes etapas. fosfolípidos. OBJETIVOS .Retire el sobrenadante para un vaso de 100 ml y abandone el precipitado. a) Prueba para Fosfolípido .Adicione 20 ml de propanona sobre el sobrenadante. agitando con un bastón durante 5 minutos.Extraer e identificar los lípidos de la yema de huevo: triacilglicéridos. EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LIPIDOS. MATERIAL - Yema de huevo Beacker Erlenmeyer Pipetas Condensador de reflujo Plancha de calentamiento Papel de filtro Éter sulfúrico Éter etílico Cloroformo . PROCEDIMIENTO .Deje reposar hasta que se forme buen volumen de sobrenadante.Tome una yema de huevo en un beacker de 200 ml juntamente con 50 ml de éter etílico.Filtre en papel de filtro. 50 .

COOPER. . Bogotá: Addison-Wesley Iberoamericana. 1991.Retire 2 ml para un tubo de ensayo y con este inclinado adicione a lo largo de la pared 1 ml de H2SO4 concentrado. Bioquímica.. en un balón acoplado a un condensador de reflujo y calentado con la plancha. la formación de un precipitado blanco confirma la presencia de fosfolípido. observe lo que ocurrió. M. . . y FONT. BOHINSKI.Recoja un poco (3 ml) de la fase etérea del embudo de separación en un beacker y. agitando con un bastón de vidrio. c) Prueba para Colesterol . 1983. BIBLIOGRAFIA ALEMANY. C.Al filtrado reservado adicione 20 ml de KOH etanólico al 10%.Agite cuidadosamente dejando en reposo sobre el soporte para la separación. España: Reverté.Repita el mismo ensayo para la solución de acetato de plomo. . Pruebas para confirmación del jabón .Cuando el beacker estuviere frío adicione 2 ml de cloroformo.Recoja 2 ml en otro tubo y adicione algunas gotas de solución saturada de cloruro de calcio. . T. 1984. . R. Prácticas de Bioquímica. 51 .Adicione algunas gotas de acetato de cadmio. Instrumentos y Técnicas de Bioquímica. España: Alhambra. S.Mantenga el calentamiento (ebullición) por 15 minutos. póngalo en una plancha de calentamiento para que todo el éter se evapore hasta que se seque (cuidado con esta operación).Transfiera todo el material del balón para el embudo de separación con 30 ml de éter de petróleo y 30 ml de agua.Recoja de la fase inferior (fase acuosa) 2 ml en un tubo de ensayo con 3 ml de agua y agite obstruyendo la boca del tubo con el dedo.A. a seguir. b) Reacción de Saponificación .El aparecimiento de un anillo rojo confirma la presencia de colesterol. C. . S. . 16. Observe lo que ocurrió.

y MARIÑO. M. A. España: Reverté. 1988. UNIVERSIDAD DE CORDOBA FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS PROGRAMA DE INGENERIA DE ALIMENTOS BIOQUIMICA GENERAL GUIAS DE LABORATORIO PROF. Problemas de Bioquímica. J. M. Bioquímica cuantitativa.GONZALEZ.Sc.A. MACARULLA. J. CLAUDIA DENISE DE PAULA M. et alli. España: Alhambra. S. 1979. CIENCIA DE LOS ALIMENTOS 52 .

2000 53 .MONTERIA.