Facultad de Ciencias Veterinarias

Universidad Nacional de La Plata

MANUAL DE
INMUNODIAGNSTICO
Inmunobiologa Animal Bsica
FCV, UNLP.

Venturini M.C., Bacigalupe D., Miceli G., Larsen A., Rambeaud M.,
Pardini L., Dellarupe A., Serena S., Campero L. M., Gos M. L.,
Bernstein M.

AO 2013

INMUNODIAGNSTICO
Consideraciones Generales
En medicina veterinaria se utilizan diferentes pruebas de inmunodiagnstico
con el fin de detectar antgenos o anticuerpos in vitro.
La sensibilidad y la especificidad son dos atributos de las pruebas de
inmunodiagnstico. Desde el punto de vista inmunolgico la sensibilidad se
refiere a la capacidad que posee la prueba para detectar pequeas cantidades
de antgeno o de anticuerpo. La especificidad por su parte, se refiere a la
interaccin entre los epitopes de un antgeno y sus anticuerpos especficos.
Desde el punto de vista epidemiolgico la sensibilidad de las pruebas se
refiere a la capacidad de las mismas para detectar a los verdaderos positivos
y la especificidad, a la capacidad para detectar los verdaderos negativos. En
la medida que aumenta la sensibilidad lo hace en detrimento de la especificidad
y viceversa. Ms adelante nos referiremos a estos conceptos con mayor
detalle.
Existen numerosos sistemas de deteccin de antgenos y anticuerpos, siendo
en algunas ocasiones la eleccin de los mismos, dependientes de factores
tales como la disponibilidad, el tiempo que insume la realizacin del mismo, los
requerimientos de bioseguridad, los costos, etc. Por eso en algunos casos, las
pruebas que son empleadas por algunos laboratorios no son necesariamente
las ms sensibles o las ms especficas. Cuando se interpreten los resultados,
por lo tanto, habr que tener en cuenta estas consideraciones.
Para evitar errores en la interpretacin de las pruebas empleadas se debe
considerar que:
- Las pruebas serolgicas miden anticuerpos circulantes
- Estos son de tipo IgM e IgG
- La IgM aparece inicialmente ante el primer contacto con un agente
infeccioso o un antgeno vacunal y declina relativamente rpido. La Ig G
hace su pico posteriormente pero permanece durante ms tiempo Ante
un segundo contacto con el Ag, resulta una respuesta rpida a IgG con
niveles basales de IgM (Respuesta secundaria). Fig 1

No todas las pruebas de diagnstico miden IgM e IgG con igual

eficiencia.
La deteccin de IgM est relacionada con una primo infeccin o primovacunacin reciente. La IgG indica estados crnicos.
Es importante determinar la seroconversin en muestras pareadas con
intervalo de por lo menos 21 das. Fig 2
Semanas

Ttulo Primera
de Ac inoculacin

IgG

256

64
16

IgM

4
7

Infeccin

14

21

1ra
extraccin

28

Das
2da
extraccin

Muestras pareadas

Cuando las muestras de suero de una poblacin deben compararse es

importante tener en cuenta la variacin biolgica en la respuesta inmune
en cada individuo y considerar que las mismas deben realizarse en las
mismas condiciones, en el mismo da, es decir bajo las mismas
variables.
Los resultados positivos
a una prueba indican la deteccin de
anticuerpos especficos y sugieren la exposicin a un agente infeccioso
(previa o actual), una vacunacin previa, una reaccin inespecfica (falso
positivo) o una reaccin cruzada con microorganismos antignicamente
relacionados.
Los resultados negativos a una prueba pueden indicar un titulo de
anticuerpos especficos por debajo de los detectables de acuerdo a la
sensibilidad de la prueba, entonces no siempre un resultado negativo
indica ausencia de infeccin, ya que por ejemplo puede ocurrir que los
animales se hayan infectado recientemente y no den resultados
positivos porque no se produjo la seroconversin.
Algunos animales portadores pueden ser seronegativos, por ejemplo en
el caso de infecciones bacterianas de las mucosas puede no producirse
una respuesta sistmica.
Si se realiza una prueba de inmunodiagnstico es importante determinar
si animales nacidos de madres vacunadas han disminuido los ttulos de
anticuerpos adquiridos pasivamente.
Los animales de una poblacin que presenten signos clnicos deberan
controlarse serolgicamente, pero en otros casos las muestras deben
tomarse al azar y representar significativamente a la poblacin. La
cantidad de muestras depende de la prevalencia estimada para la
enfermedad.
Si se est haciendo el seguimiento de animales vacunados, se debe
considerar que la prueba sea capaz de detectar anticuerpos vacunales
con adecuada sensibilidad.
Finalmente, tener en cuenta que el diagnstico serolgico es una
herramienta que colabora con el diagnstico definitivo.
CLASIFICACIN DE LAS PRUEBAS
DE INMUNODIAGNSTICO

Pruebas primarias:
Inmunoenzimticas:

Pruebas secundarias:
Aglutinacin
Aglutinacin indirecta
Precipitacin
Fijacin de complemento
Pruebas terciarias:
Anafilaxia cutnea pasiva

IFI
ELISA
IHQ
WB

g protena /ml
0.0005
0.0005

0.05
0.01
30
0.05
0.02

Son necesarios para realizar las pruebas de

inmunodiagnstico:
Antgenos de diagnstico producidos en Laboratorios
(se adquieren)

Sueros provenientes de animales de los que se sospecha una

determinada enfermedad

Antgenos presentes en muestras (rganos, lquidos, etc) provenientes

de animales de los que se
sospecha una determinada enfermedad

Sueros hiperinmunes producidos en

diferentes especies utilizados para el diagnstico

Inmunizar con:
1- Inmunoglobulina de una especie
(conejo)
Determinar
Acs. anti- Ig

2- Obtener anti-Ig anti especie

(en caballo)
Purificar

Por ejemplo:

Inmunizar con
Ig G, Ig M, etc
de 1 especie

Day M. y Schultz R. (modificado)

Anti IgG de conejo

Preparado en caballo
1

Suero del animal sospechoso de padecer

la enfermedad: diluciones

8 l

100l

100l

100l

100l

100l

100 l

100 l

100 l

100 l

1/50

1/100

Suero
Buffer
(PBS)
DILUCIN

192 l

1/25

1/200

1/400

100 l

1/800

PRUEBAS PRIMARIAS
INMUNOFLUORESCENCIA
Fundamento:
Ciertas sustancias llamadas fluorocromos (Isotiocianato de fluorescena y
rodamina), al ser excitadas por luz ultravioleta, emiten un haz de luz de mayor
longitud de onda, que se visualizan con un microscopio de fluorescencia.
Cuando estas sustancias se conjugan con inmunoglobulinas (anticuerpos)
permiten detectar la presencia de antgenos o anticuerpos en una muestra
problema.
Conjugado o anticuerpo marcado: denominamos conjugado, anticuerpo
marcado o anticuerpo secundario a la inmunoglobulina (puede ser contra la
fraccin gamma total, anti-IgG, anti-IgM, anti-IgA, etc.) unida con la sustancia
fluorescente. Este anticuerpo se produce en una especie distinta (por ejemplo
cabra, oveja, conejo) a la que pertenece el suero problema.

Microscopio de inmunofluorescencia

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA: permite la deteccin de antgenos,

usando anticuerpos conocidos conjugados con sustancias fluorescentes.
1- Muestra Problema (adecuadamente procesada)
2- Fijar
3- Aadir conjugado especfico
4- Incubar

5- Lavar con buffer de fosfatos (PBS) o SF

6- Secar
7- Montar el preparado
8- Observar en el microscopio de Fluorescencia
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
Permite la deteccin de anticuerpos, utilizando antgenos conocidos y
conjugados especficos anti - especie .
1 - Portaobjetos con antgeno conocido
2 - Suero problema diluido en PBS o SF
3 - Colocar las diluciones del suero en los pocillos del portaobjetos
4 - Incubar
5 - Lavar con PBS o SF
6 - Agregar el conjugado anti-especie y anti-isotipo de anticuerpo a detectar
7- Incubar
8 - Lavar con PBS o SF
9 - Secar
10 - Montar el preparado
11- Realizar la lectura en microscopio de fluorescencia
Lectura: se relaciona con la observacin de fluorescencia (color verde
manzana por el isotiocianato de fluorescena) y con la morfologa que debe
corresponderse con lo investigado (morfologa bacteriana, parasitaria, cuerpos
de inclusin, etc.).
IF Directa
IF Indirecta
~ Antgeno
problema

~Conjugado

~Conjugado

~ Antgeno
conocido

~ Anticuerpo
especifico
en suero
problema

~ Portaobjeto

PRUEBAS INMUNOENZIMTICAS
ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA).
OBJETIVO:
Conocer, realizar e interpretar las pruebas inmunoenzimticas aplicadas al
diagnstico.
FUNDAMENTO
La prueba de ELISA permite detectar la unin antgeno-anticuerpo en su fase
primaria. El revelado de esa reaccin tiene lugar por que los anticuerpos se han
conjugado (unido) a una enzima que al reaccionar con su sustrato especfico,
en presencia de un cromgeno, da una reaccin coloreada. Como es una
prueba de alta sensibilidad cuantitativa, permite la deteccin de cantidades
pequeas de complejos antgeno-anticuerpo. La lectura de la reaccin se hace
con un espectrofotmetro (lector de ELISA).
MATERIALES:
Fase slida: Necesaria para la fijacin de los reactantes, pueden utilizarse
tubos, perlas de ltex o especialmente para las reacciones serolgicas,
policubetas.

Conjugado: Se denomina as a la unin de la inmunoglobulina (anti IgG, anti

IgM o anti Ig total) y la enzima seleccionada.
Existen dos mtodos de conjugacin: a) Qumica y b) Inmunolgica.
Enzimas: Para ser utilizadas deben reunir una serie de requisitos, a saber
Solubles
Estables
Especficas con relacin al sustrato
Elevada pureza
Bajo costo
Las ms utilizadas son: peroxidasa, fosfatasa alcalina, galactosidasa y ureasa.
Sustrato: Est en directa relacin con la enzima seleccionada, debe reunir
ciertas condiciones:
soluble
incoloro antes de la accin de la enzima

producir cromgenos estables despus de la degradacin

no txico
no mutagnico

Inmunoglobulinas: Se conjugan con la enzima, dependen del tipo de ensayo a

ejecutar, por ejemplo, si deseamos detectar un antgeno en una muestra,
conjugaremos un suero anti antgeno especfico. Si por el contrario queremos
titular anticuerpos, conjugaremos un suero anti inmunoglobulina.
Muestras:
Antgenos: muestras de materia fecal, extractos tisulares, alimentos, etc
Anticuerpos: muestras de suero, leche, secreciones corporales, lquido
cefalorraqudeo.
Lectura: Puede realizarse en forma
cuantitativamente por espectrofotometra.

Enzima

cualitativa,

Obtencin

ojo

desnudo

Sustrato cromgeno

Fosfatasa alcalina
NPP)

intestino bovino

para-nitrofenilfosfato(p-

Peroxidasa

rbano picante

H2O2 / ABTS

Ureasa

juda

urea (lectura a ojo desnudo)

Bloqueantes: Albmina bovina o leche descremada.

Solucin de lavado: Solucin buffer de fosfatos (PBS) con tween 20.
Clasificacin
ELISA directo
ELISA indirecto
ELISA de Captura
ELISA de Competicin

10

ELISA Directo

ELISA Indirecto
Cromgeno
incoloro

Cromgeno
incoloro

Cromgeno
coloreado

Cromgeno
coloreado

O2+H2O
H2O2
E

Conjugado

O2+H2O
E

H2O2

Ac especfico en
Suero problema

Ag conocido

Muestra con Ag
desconocido

Bloqueo
Conjugado

11

ELISA de
competicin
2)
1
3)

4)

Cromgeno
coloreado

Cromgeno
O2+H2O
incoloro

5)

H 2O 2

1. Antgeno que se adsorbe a la placa

2. Protena bloqueante que cubre espacios libres sin recubrir por el antgeno
3. Incubacin de una mezcla de suero problema y Acs monoclonales anti-epitope
especfico. En esta etapa el Ac problema compite con el Ac monoclonal para
unirse al antgeno,
4. Incubacin con conjugado anti-Ac monoclonal
5. Revelado.
6. Lectura. Resultado positivo: el Ac problema se une con el antgeno. No se
observa color.
Resultado negativo: al no haber Ac problema, el Ac monoclonal se une con el
antgeno. Se observa color.

12

INMUNOHISTOQUMICA
Las tcnicas de inmunohistoqumica (IHQ) permiten detectar antgenos en
tejidos, clulas o estructuras subcelulares. Se fundamenta en el uso de sueros
primarios monoclonales o policlonales conocidos, dirigidos contra el agente o
estructura a identificar. Los anticuerpos (Ac) secundarios (anti-especie del Ac
primario) estn conjugados con enzimas que reaccionan con un sustrato, en
presencia de un cromgeno, dando como resultado una reaccin coloreada
persistente que permite la identificacin del antgeno. Las enzimas que se
utilizan con mayor frecuencia son la peroxidasa (horseradish preoxidase) y la
fosfatasa alcalina.
Para la identificacin de antgenos (protozoarios, hongos, bacterias, virus,
enzimas, hormonas, protenas etc.) se pueden utilizar extendidos y cultivos
celulares tratados con acetona en fro y conservados a 20 C hasta su
utilizacin, cortes por congelacin o bien de tejidos fijados en formol neutro al
10% e incluidos en parafina.
Las tcnicas de IHQ se utilizan con frecuencia sobre muestras de tejidos como
complemento del estudio histopatolgico, con la finalidad de un diagnstico
ms preciso (relacin agente etiolgico-lesin).
Si se conserva material exclusivamente para IHQ, pueden compararse distintos
fijadores hasta encontrar el ms adecuado. Sin embargo, siendo el formol
neutro el fijador que se utiliza comnmente para las muestras de
histopatologa, ste es el de uso ms frecuente. Se considera que el formol
puede enmascarar o alterar antgenos, ya que se une a protenas (aminocido
lisina). Es conveniente no extender la fijacin en formol si se conoce que un
tejido ser usado para IHQ. En algunos casos para desenmascarar el material
antignico se utilizan enzimas (tripsina, pepsina, etc), debiendo evaluarse el
dao que pudieran producir al tejido. Con el mismo fin tambin se utilizan el
horno a microondas y el ultrasonido.
En la tcnica de IHQ, los cortes fijados al portaobjeto se pasan por un tren de
xiloles y alcoholes hasta hidratar el tejido.
Se bloquea la peroxidasa endgena y luego se inicia la tcnica inmunolgica
sobre el corte.
Existen mtodos directos e indirectos. Con el fin de lograr una mayor
sensibilidad de la prueba, se emplean tcnicas que amplifican la reaccin como
el PAP (peroxidasa anti peroxidasa) y la de ABC (complejo de avidina-biotina).
En este ejemplo se indican los pasos de la tcnica de ABC.
1- Bloquear la peroxidasa endgena sumergiendo los portaobjetos con las
muestras fijadas, en una solucin de agua oxigenada.
2- Tratar con enzimas, microondas o ultrasonido (si corresponde).
3- Bloquear con un suero de la misma especie en la que se produjo el
anticuerpo secundario (por ej: cabra).
4- Colocar el anticuerpo primario (contenido en un suero hiperinmune
contra el Ag problema, por ej: hecho en conejo). Incubar. Lavar.
5- Colocar el anticuerpo secundario, biotinilado, anti-conejo preparado en
cabra.
6- Agregar la avidina peroxidizada. Amplificar.

13

7- Se utiliza como cromgeno DAB (diaminobenzidina) en presencia de

agua oxigenada.
8- Se realiza una coloracin de contraste con hematoxilina.
9- Se deshidrata, se monta y se observa.
10- La coloracin marrn indica la presencia del antgeno. Se debe tener en
cuenta la morfologa ya que puede haber coloraciones inespecficas.

D AB

6.Solucin reveladora (H2O2 + DAB)

5.Colocar avidina biotina + peroxidasa .

4. Lavar y agregar anticuerpo 2 biotinilado (anti
especie)
I
b
l
3.Agregar anticuerpo primario(suero hiperinmune).
2.Inactivar la peroxidasa
1.Portaobjeto con corte

Fig1: Tcnica ABC

IMMUNOBLOTTING O INMUNOTRANSFERENCIA
Fundamento: Una vez realizada la corrida electrofortica, en gel de
poliacrilamida (PAGE), es posible transferir las protenas de la muestra a
una membrana de nitrocelulosa. Este procedimiento se hace utilizando
un aparato para inmunotransferencia.
Las diferentes porciones antignicas de la muestra, se enfrentan luego
con los sueros problema. Si stos reaccionan con una o varias porciones
podremos observarlo al revelar la reaccin. Para eso se utiliza un suero
conjugado con peroxidasa, anti-especie, en presencia de un cromgeno
y de un sustrato. Este procedimiento es similar a una prueba de ELISA
indirecta, pero realizado sobre la membrana que recibi las protenas.
De esta manera es posible identificar contra qu porcin del antgeno
reacciona el suero, identificndolo de acuero a su peso molecular.

14

Westernblot o inmunotransferencia (Fig.3)

Regueiro Gonzlez

Fig.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida e Inmunotrasferencia. Si en el

suero problema hay anticuerpos especficos para alguna de las fracciones
antignicas, se unirn a estas ltimas. Esta unin se pondr en evidencia con
un conjugado anti- especie marcado con una enzima, que acta sobre un
sustrato, en presencia de un cromgeno, dando como resultado bandas
coloreadas.

15

PRUEBAS SECUNDARIAS
AGLUTINACIN
Objetivos:
- Conocer el fundamento y los diferentes tipos de pruebas de aglutinacin
- Identificar los materiales y reactivos
- Interpretar los resultados
Fundamento
La aglutinacin es una prueba secundaria que se produce cuando el antgeno
particulado o forme (bacterias, glbulos rojos, etc) interacta con el anticuerpo
especfico, con la consiguiente formacin de un grumo o aglutinado, que
representa la segunda fase de la unin Ag-Ac (enrejado de Marrack).
Clasificacin
- Aglutinacin directa: el antgeno es naturalmente particulado.
- Aglutinacin indirecta o pasiva: el antgeno, originalmente soluble, est
unido a un soporte (orgnico o inorgnico) para hacerlo particulado.
Otra clasificacin
- Cualitativas: cuando el resultado se expresa como positivo o negativo.
- Cuantitativas: cuando el resultado de la prueba se expresa como ttulo de
anticuerpos.
- Lectura rpida
- Lectura lenta
- Macromtodos: se realizan en tubos
- Micromtodos: se realizan en microplacas
Las denominadas pruebas tamiz: son pruebas de alta sensibilidad,
econmicas, rpidas. Debido a su alta sensibilidad y baja especificidad, estas
pruebas pueden dar resultados falsos positivos. Por eso los animales positivos
se deben re-evaluar con otras pruebas ms especficas (pruebas
complementarias).
Ejemplos:
Aglutinacin directa: para el diagnstico de micoplasmosis, pullorosis,
salmonelosis, brucelosis , bordetelosis, pleuroneumonas producidas por
Haemophilus, toxoplasmosis, leptospirosis, serotipificacin bacteriana, etc.
Aglutinacin indirecta: para el diagnstico de toxoplasmosis, pasteurelosis,
tripanosomiasis, leishmaniasis, sarcocistosis, trichinelosis, etc.
Ejemplos de pruebas de aglutinacin directas, rpidas en placa. Cualitativas
Prueba de Angus y Barton (BPA) para brucelosis bovina

16

Es una prueba tamiz, cuyo antgeno es producido con la cepa 1119/3 de

Brucella abortus. Se lee rotando la placa para ver la presencia o no de grumos.
Lectura
Positivo: Presencia de grumos
Negativo: ausencia de grumos
Pruebas de aglutinacin directa lentas en tubo. Cuantitativas: Son pruebas
complementarias, con las que se evalan los sueros que dieron positivos por la
prueba tamiz de BPA.
-Prueba de Wright para el diagnstico de la Brucelosis
- Prueba de 2 Mercaptoetanol para Brucelosis.
Ejemplo de prueba de aglutinacin indirecta. Cuantitativa. Micromtodo
Prueba para el diagnstico de la toxoplasmosis animal
El antgeno de T. gondii, que es soluble (taquizotos fragmentados), se
adsorbe a partculas de Ltex, conviertindose as en un antgeno particulado.
Se considera que el suero es positivo, cuando en el fondo del pocillo se ve un
entramado, que es el enrejado de Marrack, que indica la reaccin Ag-Ac. Se
considera negativo (sin anticuerpos especficos) cuando se ve un botn, que es
el antgeno sin aglutinar, que sediment en el fondo del pocillo.
POSITIVO:
NEGATIVO:

17

PRECIPITACIN
OBJETIVOS :
- Conocer el fundamento de las pruebas de precipitacin.
- Interpretar resultados.
Fundamento: Es una prueba de fijacin secundaria en la cual el antgeno se
encuentra en estado soluble y al unirse al anticuerpo especfico se forma un
precipitado que se observa como una banda en los medios semislidos.
Clasificacin de las pruebas de precipitacin segn el soporte
1.Precipitacin en medios lquidos:
1.1. Cualitativos: Prueba de Ascoli-Valente.
1.2. Cuantitativos: Titulacin de sueros.
2.Precipitacin en medios
Inmunodifusin en agar gel

semislidos

gelificados:

Pruebas

de

2. 1. Cualitativos:
En Tubo: Prueba de OUDIN o Monodireccional.
Prueba de OAKLEY-FULLTHORPPE o Bidireccional.
En placa: Prueba de OUCHTERLONY o Doble Difusin Bidireccional.
Prueba de COGGINS- NORCROSS.

2.2. Cuantitativa:
En placa: Prueba de MANCINI- CARBONARA o Inmunodifusin radial
en placa.

INMUNODIFUSION EN AGAR GEL

Las diferentes pruebas de Precipitacin en medios gelificados, o pruebas de
inmunodifusin se fundamentan en las caractersticas de los reactantes, el
soporte y las leyes que rigen este fenmeno.
Reactantes:
Anticuerpos: la Ig ms activa en esta prueba es la IgG.
Antgenos: deben ser solubles, con un PM capaz de permitir la migracin por
el medio semislido. Ejemplos protenas (toxinas, protenas sricas, protenas
crnicas, protenas citoplasmticas bacterianas, protenas virales estructurales
y no estructurales, etc.), polisacridos, polmeros de cidos nucleicos.

18

Soporte: el medio semislido se logra utilizando medios gelificados. Los

soportes ms usados son geles de agar altamente purificado o agarosa, y para
pruebas ms especficas, poliacrilamida, tiras de acetato de celulosa
gelificados, etc.
En todos los casos el antgeno y el anticuerpo difunden en la matriz gelificada,
el uno hacia el otro y se unen formando inmunocomplejos Ag.-Ac, que en la
zona de equivalencia producen un precipitado que se visualiza como una
simple lnea blanca o banda de precipitado.
Este fenmeno se encuentra regido por las leyes generales de la
inmunodifusin:
-La difusin se produce de gradientes de mayor concentracin a los de menor
concentracin.
-La velocidad de difusin es directamente proporcional a la cantidad del
reactante e inversamente proporcional al tamao del mismo.
-La velocidad de difusin est condicionada por el tamao de las molculas del
medio de soporte y por la concentracin del mismo. La velocidad de difusin es
inversamente proporcional a la concentracin del gel.
Interpretacin de resultados en la prueba de OUCHTERLONY o
Difusin Bidireccional:
Ag A

Ag A
Ac
anti A

1) IDENTIDAD TOTAL

Ag A

Ag B

Ac
anti A
2) NO IDENTIDAD

Doble
Ag A y
Ag B

Ag A

Ac
anti A
3) IDENTIDAD
PARCIAL

1) coalescencia de los arcos: significa identidad inmunolgica entre las

muestras.
2) arcos que se cruzan: falta total de identidad entre las muestras.
3) espoln: significa identidad parcial entre las muestras.
Ejemplo de pruebas de inmunodifusin: Test de Coggins. Prueba de
inmunodifusin doble bidireccional en placa para diagnstico de Anemia
infecciosa equina.
Se realiza en placas de Petri de plstico o vidrio, en las que se coloca el
soporte (agar). Se perfora el agar con el sacabocado. Se llenan con el antgeno
el pocillo central y con los sueros problemas y controles los pocillos de la
periferia. Se incuba a temperatura ambiente en cmara hmeda por un perodo
de 24-48hs.
Se realiza la lectura e interpretacin de las bandas de precipitacin

19

C+
Ag

Ejemplos de enfermedades diagnosticadas por esta prueba:

Titulacin de sueros hiperinmunes.
Diagnstico de Brucelosis ovina y canina
Leucosis bovina
Aftosa (VIAA)
Gumboro
Marek
Identificacin antignica (alimentos, tipificacin de virus).

PRUEBA DE FIJACIN DE COMPLEMENTO

Definicin:
La prueba de Fijacin de Complemento (FC) es la prueba secundaria de mayor
sensibilidad.
La prueba se fundamenta en dos propiedades del complemento: 1) la
capacidad del complemento para unirse a complejos antgeno-anticuerpo,
independientemente de su especificidad, 2) la lisis de los eritrocitos
sensibilizados del sistema hemoltico revelador.
La reaccin puede utilizarse tanto para detectar antgenos como anticuerpos
problema.

Reactivos
Complemento: Es una mezcla de suero de cobayos sanos. Luego de obtener el
suero, la cantidad de complemento debe ser titulada. La dosis de complemento
se especifica en trminos unidad fijadora de complemento UFC50%, que se
define como la cantidad de complemento necesaria para lisar el 50% de los
eritrocitos sensibilizados.
Sistema Hemoltico:

20

-Glbulos rojos: se obtiene en forma asptica de carneros. Se resuspenden

entre el 2 y el 5% segn protocolo, de este modo se conservan a 4C entre 5
das a 6 semanas.
-Anticuerpos anti-glbulos rojos de carnero, o Hemolisina: se denomina
hemolisina a un suero que contiene un alto ttulo de anticuerpos contra los
glbulos rojos de carnero. La hemolisina suele prepararse en conejo con un
protocolo de hiperinmunizacin (sensibilizacin e inmunizacin).
El Sistema hemoltico se logra combinando los glbulos rojos de carnero con la
hemolisina, como resultado obtenemos hemates sensibilizados. Tanto la
hemolisina como el sistema hemoltico deben ser perfectamente titulados. La
unidad de medida del sistema hemoltico son las Unidades Hemolticas 50%,
UH50%, que es la mxima dilucin del suero hemoltico a partir de la cual se
obtiene una hemlisis constante aumentando la concentracin del mismo.
Antgeno conocido: en esta prueba se pueden emplear tanto antgenos
solubles como particulados. Ejemplo de antgeno soluble es el que se usa en
FC para Aftosa, un ejemplo de antgeno particulado es la prueba de FC para
brucelosis. El antgeno debe estar debidamente titulado.
Sueros controles: para toda prueba se deben emplear sueros controles
positivos y negativos.
Soporte: como soporte se pueden utilizar microplacas de 96 pocillos o tubos,
segn protocolo.
Diluyentes: se utilizan soluciones amortiguadas.
Muestras: sueros problemas.
Actividad anticomplementaria: los sueros con actividad anticomplementaria son
aqullos con la capacidad de fijar el complemento an en ausencia de
antgeno. Ciertas condiciones, en particular la contaminacin bacteriana, puede
aumentar la actividad anticomplementaria natural del suero.
Los sueros deben descomplementarse a 56C durante 30 minutos.
Lector: espectrofotmetro, determina densidades pticas (DO) de hemoglobina
libre en el sistema.

Reaccin de Fijacin de Complemento

La reaccin se lleva a cabo en dos etapas
1era Etapa
El suero problema se enfrenta con el antgeno conocido en presencia de
complemento. Incubar.
2da Etapa
Se agrega el sistema hemoltico. Incubar.

21

Lectura: se realiza por medio de espectrofotmetro. Determina las DO de

hemoglobina libre estableciendo la presencia o no de hemlisis.
Interpretacin:
NO HAY HEMOLISIS, indica presencia de anticuerpos especficos, prueba
POSITIVA
HAY HEMOLISIS, indica ausencia de anticuerpos especficos, prueba
NEGATIVA
Grfico: C: complemento, SH: sistema hemoltico, GR: glbulos rojos, H:
hemolisina

POSITIVO

Ag

Ac

NEGATIVO
GR

Ag

Ac

No hay HEMOLISIS

GR

HEMOLISIS

Ejemplos de enfermedades que se pueden diagnosticar por fijacin de

complemento:
Aftosa
Estomatitis vesicular
Pleuroneumona contagiosa bovina
Brucelosis bovina, ovina y caprina
Anaplasmosis bovina
Pleuroneumona contagiosa caprina
Piroplasmosis equina
Encefalitis equina venezolana
Mixomatosis

HEMOAGLUTINACIN INHIBICIN DE LA HEMOAGLUTINACIN

Objetivos:
- Conocer el fundamento de la prueba de HA y de HI
- Establecer la diferencia entre ambas pruebas
- Interpretar resultados
Introduccin:

22

Se denomina hemoaglutinacin a la capacidad que presentan algunas

familias de virus de aglutinar los glbulos rojos de diversas especies de
animales formando en suspensin un enrejado de glbulos rojos-virus. Por lo
tanto, la hemoaglutinacin (HA) NO es una prueba inmunoserolgica.
La hemoaglutinacin se produce debido a la presencia de glicoprotenas de
superficie con capacidad de aglutinar glbulos rojos denominadas
hemoaglutininas (HA). Estas glicoprotenas pueden estar presentes en las
espculas del envelope (Familia Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae), en
proyecciones de la cpside (Familia Adenoviridae) o constituir una fraccin
lipoproteica soluble, separable de la partcula viral, que se forma durante la
replicacin (Poxviridae).
Las molculas de HA se unen a receptores glicoproteicos de los glbulos rojos
que contienen cido silico con residuos terminales de cido N-acetilneuramnico (NANA). Estos receptores tambin se encuentran en otros tipos
celulares como las clulas del tracto respiratorio y son los que permiten la
adsorcin de los Orthomyxovirus y Paramyxovirus para su posterior
penetracin.
Las hemoaglutininas participan en la adsorcin y penetracin del virus a la
clula hospedadora, estimulan la fusin entre la membrana celular y la
envoltura viral, aglutinan glbulos rojos, son las responsables del fenmeno de
hemoadsorcin e inducen la formacin de anticuerpos.
Al enfrentar al virus hemoaglutinante con los anticuerpos especficos, se
produce una inhibicin de la capacidad hemoaglutinante del mismo. Este
fenmeno es el fundamento de la prueba de inhibicin de la
hemoaglutinacin (HI).
Algunos grupos de virus (Orthomyxovirus y Paramyxovirus) poseen una enzima
denominada neuraminidasa (NA) que se encuentra como protena estructural y
acta separando al virus del glbulo rojo, clivando al NANA. Este fenmeno se
denomina elucin. La funcin principal de la NA es facilitar la movilidad del
virus hacia y desde el sitio de infeccin. Permite el pasaje del virus a travs del
mucus, destruye el receptor para la HA sobre la clula hospedadora
permitiendo la elucin de la progenie viral de la clula infectada. En los
Orthomyxovirus la NA se encuentra en espculas independientes de las HA,
mientras que los Paramyxovirus poseen espculas con actividad de HA y NA.
Hay grupos de virus hemoaglutinantes que carecen de neuraminidasa
(Adenoviridae), en estos casos la hemoaglutinacin es irreversible.

23

Virus Hemoaglutinantes
Familia Orthomyxoviridae
Gnero Influenza, tipo A (humana, equina, porcina, aviar)
tipo B, C (humanos)
Familia Paramyxoviridae
Gnero: Paramyxovirus
Especie: Virus Parainfluenza (bovina, canina)
Virus de New Castle
Virus de la Parotiditis humana
Gnero: Morbilivirus
Especie Virus de Distemper
Virus del Sarampin
Virus de la Peste bovina
Familia Adenoviridae
Gnero: Adenovirus
Especie: Virus del Sndrome de cada de postura
Familia Parvoviridae
Gnero: Parovirus (canino, porcino)
Familia Togaviridae
Gnero: Alfavirus
Especie: Virus de la encefalomielitis equina
Familia Reoviridae
Gnero: Reovirus, Rotavirus

VIRUS
Influenza

Glbulos rojos que son aglutinados

Pollo, Bovino, Cobayo
24

Paramyxovirus
Parainfluenza
Parvovirus
Adenovirus (SCP)

Pollo, Cobayo
Bovino
Cerdo, Cobayo
Pollo, Pato

Tcnica de HA para titulacin viral

Objetivo:
Determinar el ttulo de la suspensin viral para la posterior realizacin de la
prueba de HI
1- Colocar 50 l de PBS en cada pocillo
2- Agregar 50 l de virus puro y efectuar las diluciones en base 2
3- Agregar l de GR lavados al 1%
4- Efectuar la lectura a los 30-60 minutos a temperatura ambiente
5- Determinar las unidades de HA (UHA)
Interpretacin del resultado:

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64
8UHA

1/128
4UHA

1/256 1/512
2UHA

1/1024 1/2048 1/4096

1/512 es la ltima dilucin de virus capaz

de producir hemoaglutinacin completa.
Se considera que esta dilucin corresponde a
1 Unidad Hemoaglutinante
1 UHA

Prueba de HI para titulacin de un suero problema

Objetivo: determinar el ttulo de anticuerpos sricos para un virus
hemaglutinante, por ejemplo el virus de New Castle
Para la prueba de Inhibicin de hemoaglutinacin se usa como antgeno una
concentracin viral que vara entre 4 y 8 UHA, segn el protocolo diseado
para cada virus. En el ejemplo anterior, si utilizramos 8 UHA, una vez
realizada la titulacin viral debemos hacer una dilucin 1/64 de la suspensin
viral original.
1- Colocar 50 l de la dilucin viral correspondiente a 8 UHA en cada pocillo de
la microplaca
2- Colocar 50 l de suero problema en el primer pocillo y efectuar diluciones en
base 2
3- Incubar 30-60 minutos a temperatura ambiente.
4- Colocar 25 l de glbulos rojos lavados al 1 % en cada pocillo
5- Incubar 30-60 minutos a temperatura ambiente

25

6- Efectuar la lectura.
Interpretacin del resultado

1/2

1/4

1/8

16

1/32

1/64 1/128

1/256

1/512

1/1024 1/2048 1/4096

1/64 es la ltima dilucin del suero capaz de inhibir el

fenmeno de HA.
La inversa de la dilucin corresponde a 64 Unidades
de inhibicin de la hemoaglutinacin o 64 UHI

El ttulo de anticuerpos de un suero se expresa multiplicando las UHI por las

UHA utilizadas.
En este ejemplo es:
Ttulo: 64 UHI x 8 UHA = 512

26

PRUEBAS TERCIARIAS
Definicin:
Pruebas que detectan la unin antgeno anticuerpo en un sistema vivo, ya sea
animales de laboratorio o cultivos celulares.
SERONEUTRALIZACIN
La prueba se fundamenta
en la prdida de la infectividad de un
microorganismo (virus o bacterias) o de la toxicidad (toxinas), por la accin de
anticuerpos especficos presentes en el suero, que los neutralizan.
Metodologa:
Existen dos tcnicas:
a) suero constante- antgeno variable
b) suero variable- antgeno constante: ms utilizada, donde se diluye el suero
problema y se enfrenta a una cantidad constante de antgeno.
En ambas pruebas siempre deben incluirse sueros controles positivos y
negativos. Los sueros deben descomplementarse a 56C durante 30 minutos.
Tcnica, por ejemplo para seroneutralizacin de virus:
Se realizan diluciones del suero problema con solucin salina tamponada. Se le
agrega a cada tubo una solucin constante de virus, para que se produzca la
reaccin antgeno anticuerpo se lleva a una hora a 37C, esta mezcla se
inocula en un sistema sensible que puede ser: un animal de laboratorio, (ratn,
hmster), o un cultivo celular (primario o de lnea).
La lectura se realiza por observacin al microscopio de los cultivos celulares,
teniendo en cuenta el efecto citopatognico producido por el virus o si se
realizan en animales, se evalan los que sobreviven y los que mueren,
indicando en el primer caso que el virus fue neutralizado y en el segundo no,
produciendo la muerte de los animales susceptibles. Los clculos de los ttulos
se efectan por el mtodo de Reed-Muench o Sperman Karber.
Los efectos citopatognicos (ECP) se deben a cambios morfolgicos inducidos
por ciertos virus, alteraciones que se manifiestan en la capa de clulas
adheridas al soporte de la prueba. Estos cambios morfolgicos van desde
cambios sutiles en la estructura de la clula a la destruccin total de la
monocapa celular. Estos cambios no son reacciones inmunolgicas, la
inhibicin de los ECP por anticuerpos especficos s es una reaccin
inmunolgica.
Los tipos de ECP bsicos son:
1- Efecto ltico
2- Cuerpos de inclusin
3- Sincitios
4- Vacuolizacin
5- Bridas

27

SEROPROTECCIN
Es similar a la prueba de seroneutralizacin, pero la diferencia la marca el
hecho de que los animales a utilizar estn previamente inoculados con el
anticuerpo y luego se los desafa con el agente infeccioso. El clculo se realiza
tambin teniendo en cuenta los animales que sobreviven y los que mueren y se
determinan los ttulos por los mismos mtodos de Reed-Muench o Sperman
Karber.
ANAFILAXIA CUTNEA PASIVA (APC)
Es una prueba que se utiliza para determinar si un individuo es alrgico a
determinado antgeno, por lo que posee anticuerpos especficos de isotipo Ig E
en el suero.
El suero del individuo problema es inoculado en una rata por va intradrmica,
la IgE del suero se une a los mastocitos, a los que sensibiliza; 48 hs ms tarde
se inocula por va endovenosa el antgeno y un colorante: Azul de Evans. El
antgeno desencadena la degranulacin de los mastocitos sensibilizados,
liberando mediadores en el lugar de la inoculacin primaria y causando
aumento local de la permeabilidad vascular, por lo que el colorante inoculado
se extravasa. El rea coloreada de la piel determina la presencia de IgE
especfica para el antgeno inoculado.
La IgE tiene una muy baja concentracin en suero, por lo que se puede
cuantificar slo por pruebas de alta sensibilidad, como el radioinmunoanlisis,.

28

Bibliografa:
-

Introduccin a la Inmunologa Veterinaria. Tizard, I. 8va ed. Mc Graw-HillInteramericana. 2009.

Introduccin a la Inmunologa humana. Fainboim L., Geffner J. Editorial Panamericana.

6ta Ed. 2011.

Inmunologa. Fundamentos. Roitt I. 11a ed. 2008.

Inmunobiology. Janeway C, Travers P, Walpor M, Shlomchik M. 7th. ed. 2008.

Manual de Inmunologa Veterinaria. Ctedra de Inmunologa Veterinaria. Mdulo I y

II. 187 p. FCV.UNLP. 2006

Introduccin a la Inmunobiologa. Pennimpede E, Gomez C, Stanchi N. (1ra ed.)

Editorial EDULP. 2004

Inmunobiologa. El sistema inmunitario en condiciones de salud y enfermedad.

Janeway C, Travers P, Walpor M, Shlomchik M. 2da. ed. Ediciones Masson S.A,
Barcelona. Espaa 2003.

Inmunologa. Fundamentos. Roitt I. 11 ed. 2008.

Cellular and Molecular Immunology. Abbas A., Lichtman A. 6 ed. Saunders. 2008.

Veterinary Immunology. Principles and practice. Day M., Schultz R.D. Manson
Publishing. 2011.

Inmunologa, biologa y patologa del sistema inmune. Regueiro Gonzalez J.P. y

col. 3ra. ed. 2003.

Versin electrnica de acceso gratuito. Inmunobiology. Janeway C. Biblioteca

electrnica
SECYT.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=imm.TOC&
depth=2

29