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Agrobiotecnologa

Curso 2014

Las plantas como biorreactores


Dra. Alicia M. Zelada

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular


Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular


Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires

Sumario
Las plantas como biorreactores
- Sistemas de expresin
- Las plantas como sistema alternativo
- Ventajas
- Costos comparativos entre distintos sistemas

Elementos a considerar en una estrategia


de expresin
- Nivel de expresin
- Sistemas de expresin integrativos
y no integrativos
- Optimizacin de costos de purificacin

Aplicaciones

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

- Expresin de antgenos para la produccin de vacunas


- Produccin de anticuerpos
- Produccin de protenas de inters farmacolgico
- Otras aplicaciones

Referencias

Las plantas como biorreactores

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Bioreactores

Expresin de antgenos para la produccin


de vacunas.
Produccin de anticuerpos y antgenos para
diagnstico.

Produccin de polipptidos de uso


farmacolgico.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Produccin de enzimas de inters industrial,


suplementos alimentarios y biopolmeros.

PROCARIOTA

Sistemas de expresin de protenas recombinantes


Bacterias: E. coli
Plataformas
establecidas

Levaduras: Saccharomyces - Metilotrficas

EUCARIOTAS

Clulas animales

Clulas de insectos
Plataformas
emergentes

Animales transgnicos

Plantas

Limitaciones de las plataformas de produccin en


Bacterias, Levaduras y Clulas animales
El plegamiento de protenas de origen eucaritico
sintetizadas en bacterias puede ser incorrecto

Los costos para aumentar la escala de produccin


son altos en los tres casos
Requieren de personal tcnico especializado
Pueden causar grandes prdidas econmicas por
contaminacin en la lnea de produccin
Riesgo biolgico: presencia de contaminantes en
el producto final ENDOTOXINAS / PRIONES VIRUS

Algunas ventajas de la utilizacin de las plantas como


biorreactores
Permiten una alta produccin de biomasa
El aumento en la escala de la produccin es
sencillo y requiere bajos costos de inversin

No requieren de personal tcnico especializado

No implican riesgos de contaminacin con


patgenos animales o toxinas microbianas

Algunas ventajas de la utilizacin de las plantas como


biorreactores
Los mecanismos de sntesis y secrecin de
protenas y las modificaciones posttraduccionales son las clulas eucariotas

Permiten el almacenamiento estable de la


protena recombinante en semillas y tubrculos

Gozan de una mayor aceptacin pblica respecto de la


manipulacin de animales.

Los costos de produccin de protenas recombinantes en


plantas son potencialmente menores que en otros sistemas

Tomado de: Daniell et. al. Trends in Plant Sci., 2001.

Estimacin de los costos de produccin en funcin


del nivel de expresin de IgA en distintos sistemas.

Elementos a considerar
en una estrategia de expresin

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Factores a
considerar en el
diseo de una
estrategia de
expresin en
plantas

La produccin competitiva de protenas


recombinantes en plantas requiere el diseo
de estrategias de expresin que cumplan con
tres premisas fundamentales:
- Obtener altos niveles de expresin.
- Disminuir los costos de purificacin.
- Conseguir un producto de caractersticas
idnticas al sintetizado en el sistema de
. origen.

La expresin de
la protena
recombinante
puede
optimizarse
mediante
diversas
estrategias

Eleccin del sistema de expresin: sistemas


integrativos y no integrativos.
Eleccin de secuencias promotoras de la
transcripcin adecuadas (promotores tejido
especficos, inducibles, constitutivos, etc.).

Utilizacin de secuencias reguladoras y regiones


no traducidas 5 y 3 apropiadas.
Eliminacin de secuencias desestabilizantes del
ARN mensajero.
Optimizacin del uso de codones (vegetalizacin
de la secuencia).

Utilizacin de secuencias seal para la localizacin


en distintos espacios subcelulares o extracelulares.
Co-expresin de chaperonas para facilitar el
plegamiento proteico.

Sistemas de expresin en plantas

Sistemas de expresin en plantas


Integrativos y no integrativos
Plantas
transgnicas
nucleares

Plantas
transplantmicas

Integrativos

(cloroplastos)

Expresin estable heredable a


la progenie

No integrativos
Expresin transitoria

Vectores
virales

Sistemas de expresin integrativos


Plantas transgnicas nucleares

La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresin

Sistemas de expresin integrativos


Plantas transgnicas nucleares
Ventajas
- Expresin estable heredable por la progenie.
- Ausencia de limitaciones importantes en el tamao
de la secuencia a introducir.
- Modificacin postraduccional de protenas propia de clulas
eucariotas (glicosilacin-fosforilacin).

Limitaciones
- Niveles de expresin relativamente bajos.
- Niveles de expresin afectados por silenciamiento gnico
postranscripcional.

El nivel de
expresin
depende
de la utilizacin
adecuada de
las regiones
reguladoras

La acertada eleccin y combinacin de las secuencias


promotoras y reguladoras de la transcripcin y de la
traduccin puede determinar variaciones importantes
en los niveles de expresin de la protena recombinante
Contrucciones utilizadas para transformar
plantas de Arabidopsis thaliana

Nivel de expresin
(% de la protena
total soluble)

Parc

5UTR ar

ss G4 myc

KDEL

3arc

10%

Parc

ss G4 myc

KDEL

3arc

5%

Pphas

5UTR ar

ss G4 myc

KDEL

3arc

36%

P35S

5UTR ar

ss G4 myc

KDEL

3arc

1%

Adaptado de: Geert De Jaeger, Nat. Biotech. 2002.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Parc: promotor de arcelina de Phaseolus vulgaris.


Pphas: promotor de -faseolina de Phaseolus vulgaris.
W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus.
ss: secuencia seal de envo a retculo endoplsmico.
KDEL: secuencia de retencin en retculo endoplsmico
G4 myc: secuencia que codifica un anticuerpo de simple cadena

Los costos
de purificacin
pueden
reducirse
explotando
caractersticas
propias
de las plantas

Rizosecrecin en cultivos hidropnicos y


secrecin en clulas en cultivo.
Acumulacin en las semillas u otros rganos
de almacenamiento para la co-extraccin con
productos convencionales como almidn o
aceites.
Produccin directa en las partes comestibles
de la planta.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Protenas de fusin que facilitan su purificacin:


oleosinas-liquenasa termoestable

La rizosecrecin
permite reducir
los costos de
purificacin

El gen de inters se fusiona a una secuencia seal de


. transporte al retculo endoplasmtico para direccionar
. el producto correspondiente a la va de secrecin.
Sitio de procesado de la seal
secuencia seal

secuencia de inters

Inicio de la traduccin

La protena recombinante se obtiene por purificacin


a partir de la solucin hidropnica que circula en torno
a la rizsfera.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Tomado de: Finer, J. Nat. Biotech., 1999.

Rizosecresin
de la xilanasa
de Clostridium
thermocellum
en tabaco
transgnico

La expresin de la xilanasa de Clostridium


thermocellum se utiliz como un
modelo de produccin por rizosecrecin.
Construccin utilizada para la
transformacin de plantas de tabaco
p35SCaMV

secuencia seal

Planta no transformada

xilanasa

Planta transgnica
Halo de
degradacin
del sustrato
generado
por la
xilanasa
rizosecretada

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Tomado de: Borisjuk et al. Nat. Biotech., 1999.

Las plantas de tabaco se cultivaron en medio conteniendo


Remazol Brilliant Blue-xilano como sustrato para la xilanasa.

Aumento del rendimiento de rizosecrecin por infeccin


con Agrobacterium rhizogenes

Las fusiones
a oleosinas
permiten
reducir los
costos de
purificacin

La protena de inters se fusiona a una oleosina,


protena que normalmente forma parte de los
cuerpos grasos de las semillas.

Oleosina

Gen de inters

Sitio de reconocimiento
para una proteasa

Cuerpos grasos

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Cuerpos proteicos

Adaptado de: www.sembiosys.com

La purificacin
a partir de los
cuerpos
grasos es
un proceso
sencillo

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Purificacin de la protena recombinante


a partir de los cuerpos grasos

La produccin de hirudina fusionada a oleosinas en plantas


de Brassica napus permite purificar la protena activa
HIRUDINA: pptido presente en la saliva de la sanguijuela= actividad anticoagulante
Promotor de Oleosina

Oleosina

Xa

Actividad anti-trombina de la fase


acuosa luego de la purificacin

Hirudina

Xa: sitio de reconocimiento


para el factor Xa

Localizacin por inmunofluorescencia de la


hirudina expresada en los cuerpos grasos aislados

Control
no transgnico

Cuerpos grasos
transgnicos
sin tratar con proteasas

Xa: tratamiento con factor Xa


NT: planta no transformada
T: planta transgnica

Cuerpos grasos
transgnicos
+ factor Xa
La hirudina presente en
la fase acuosa inhibe
la actividad de la trombina

Luz blanca

Luz UV
Tomado de: Parmenter, et al., Plant Mol. Biol., 1995.

Produccin de protenas fusionada a oleosinas en plantas de crtamo


(Carthamus tinctorius)- Tecnologa patentada por Sembiosys
Porqu crtamo?

CARTAMO: Oleaginosa altamente productiva cuya semilla puede ser almacenada por largos
periodos
CARTAMO es poco cultivada por lo cual es fcilmente separada de otras producciones de
crtamo
CARTAMO se autopoliniza y no tiene malezas emparentadas
Protenas en desarrollo

INSULINA

Diabetes

Ensayos clnicos Fase I


y II

APOLIPROTENA A

Enfermedades
cardiovasculares

Ensayos preclnicos en
modelos animales

OLEOSOMAS

Esttica

Comercializacin

Produccin de insulina humana fusionada a oleosinas en


plantas de crtamo (Carthamus tinctorius)
Izquierda: Separacin en PAGE-SDS de extractos proteicos totales de
plantas transformadas con la fusin oleosina/insulina y de la fraccin de
oleosinas de las mismas plantas. Wt: control no transformados; 4405-4, 15 y 19: distintas fracciones de purificacin de muestras de plantas
transformadas. La flecha seala la posicin del estndar de insulina.

Abajo: Cambios temporales en los niveles de glucosa en ratones


tratados con placebo salino (cuadrados abiertos), extracto de
plantas no transformadas (crculos llenos), insulina humana
estndar (tringulos y crculos abiertos) e insulina derivada de
plantas que producen fusiones oleosina/insulina (cuadrados llenos).

Arriba: Anlisis comparativo por de insulina humana (hIN)


y de insulina fusionada a oleosina (OB-hIN) obtenidas por
separacin en cromatografa lquida de alto rendimiento.

Humanizacin
de las
glicoprotenas
recombinantes

Los patrones de N-glicosilacin en plantas difieren


de los presentes en mamferos.

Esto puede alterar la inmugenicidad, resistencia a la


degradacin proteoltica y actividad biolgica de la
protena expresada, particularmente en anticuerpos.
Asn

Asn

a -1,3
Fuc

NAcGlc
NAcGlc

NAcGlc

Man

Man

Man
NAcGlc

Xyl

Las plantas como


biorreactores

Fuc

Glicanos complejos
en mamferos
Man

Man

Man

NAcGlc

NAcGlc

NAcGlc

NAcGlc

Gal

Gal

Gal

AcNeu

AcNeu

AcNeu

Glicanos complejos
en plantas

Agrobiotecnologa

a-1,6

NAcGlc

Se estn ensayando diversas estrategias para humanizar


las glicoprotenas recombinantes expresadas en plantas:
- Expresin de la (1,4)-galactosiltransferasa humana en plantas
transgnicas.
- Retencin de la protena en el retculo endoplsmatico.
- Inactivacin de la a(1,3)-fucosiltransferasa y la (1,2)-xilosiltransferasa
de plantas.

La especie a
utilizar debe
seleccionarse
de acuerdo
con las
necesidades
de produccin
de la protena
a sintetizar

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Tabaco
Sistema de transformacin bien establecido.
Produccin de abundante biomasa.

Papa
Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en tubrculos.
Procesamiento industrial de los tubrculos bien establecido.
Contenido proteico en tubrculos relativamente bajo.
Tomate
Consumo de los frutos crudos.
Disponibilidad de promotores especficos para la expresin en frutos.
Cultivo en invernaderos a escala industrial bien establecido.
Contenido proteico en frutos relativamente bajo.
Cereales
Tecnologa de produccin ampliamente establecida.
Almacenamiento estable de la protena recombinante en las semillas.
Procesamiento industrial de las semillas bien establecido.
Alfalfa
Alto contenido proteico en hojas.
Produccin de biomasa abundante.
Lemna
Alta eficiencia de proliferacin clonal.
Alta tasa de duplicacin de la biomasa.
Rizosecresin muy eficiente.

Sistemas de expresin integrativos


Sistema de expresin en Lemna
Planta acutica comestible (Lemnaceae)
Rpido y flexible
Alta productividad debido alta tasa de crecimiento y altos niveles de
expresin (35-40% peso seco)
Bajos costos
Bioseguridad se realiza en confinamiento y no hay riesgo de
contaminacin con patgenos humanos

Sistemas de expresin integrativos


Sistema de expresin en Lemna
Lemna Gene TM Tecnologa de producin basada en Lemna

Protenas recombinantes para industria veterinaria y


farmaceutica
Vacunas recombinantes humanas y animales
Anticuerpos monoclonales
Aditivos como enzimas y probiticos
IFN-alpha2b
BLX-301, anti-CD20 non-Hodgkin's B-cell linfoma humanizado
BLX-155, a tromboltico
Los productos puede ser producidos:

Puro: el ingrediente activo puede ser purificado


Seco: las plantas pueden ser deshidratadas y presentadas
como cpsulas, tabletas o polvo
Fresco: puede ser utilizadas directamente para alimentacin

Sistemas de expresin integrativos


Plantas transplantmicas

La estrategia
a elegir debe
considerar
las ventajas y
limitaciones de
cada sistema
de expresin

Sistemas de expresin integrativos


Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Ventajas
- Niveles de expresin potencialmente altos.
- Expresin estable heredable por la progenie.
- Ausencia de limitaciones importantes en el tamao
de la secuencia a introducir.
- No hay efectos de posicin (transformacin por
recombinacin homloga).
- Ausencia de silenciamiento gnico.
- Introduccin de policistrones.
- Transferencia horizontal del transgn escasa o nula.
- Formacin de puentes disulfuro y menor complejidad de
proteasas

Limitaciones
- No existen mecanismos de glicosilacin.

Sistemas de expresin integrativos


Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Protenas terapeuticas y antibiticos producidas en cloroplastos 2008-2011

Sistemas de expresin integrativos


Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Antgenos producidos en cloroplastos 2008-2011

Sistemas de expresin integrativos


Plantas transplastmicas (cloroplastos)
Limitacin: altos costos de purificacin de las protenas a partir de
extractos de plantas

Sistemas de expresin no integrativos


Vectores virales

Sistemas de expresin no integrativos


Vectores virales

Ventajas
- Niveles de expresin potencialmente altos
- No se integran al genoma- No tienen efecto de posicionamiento
- Corto tiempo de desarrollo y produccin
- Permite el direccionamiento de protenas a compartimiento
subcelulares o al espacio apoplstico.
- Permite la modificacin postraduccional de protenas
Limitaciones
- Limitaciones en el tamao de la secuencia introducida
- Inestabilidad gentica de la secuencia introducida.
- Silenciamiento gnico

Sistemas de expresin no integrativos


Vectores virales
PVX

1. Infeccin inicial

2. Movilizacin viral clula a clula

3. Movilizacin sistmica

TMV

Potexvirus. Potato virus X

Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor T7


Genoma viral

ARN
Obtencin del ADNc del
genoma viral completo

ADNc del
genoma viral

ADNc
Clonado del ADNc en un
plsmido. Introduccin de
un sitio de clonado mltiple

Vector viral

T7

ADNc
SCM
Clonado del gen de inters

Vector viral
recombinante

T7

Gen X

Transcripcin in vitro

Infeccin mecnica
con transcriptos de ARN

Expresin transitoria

Vectores virales derivados de virus a ARN. Promotor para


expresin en plantas
Genoma viral

ARN
Obtencin del ADNc del
genoma viral completo

ADNc del
genoma viral

ADNc

Amplicn viral

35SCaMV

Clonado del ADNc en un


vector binario para expresin
en plantas. Introduccin de
un sitio de clonado mltiple
ADNc
t-nos
SCM
Clonado del gen de inters

Amplicn viral
recombinante

35SCaMV

Gen X

Bombardeo del ADN infectivo


Agroinfiltracin
Agrospray

Expresin transitoria

t-nos

Los vectores y
los amplicones
virales
amplifican la
expresin de
los genes
forneos

Esquema
de la expresin
de un gen forneo
a partir de un
vector y de un
amplicn viral
de un virus
a ARN en
comparacin
con la expresin
de un gen forneo
por expresin
nuclear.

Se pueden utilizar diferentes estrategias para expresar


genes forneos en vectores virales
Virus representativo
Reemplazo gnico
Insercin gnica
Presentacin de epitopes

*
B

Complementacin
A: Fusin traduccional de una pequea secuencia dentro del gen de la protena de la cpside.
B: Translectura traduccional de un codn de terminacin mbar (*) en el extremo 3

Genes virales

Reemplazo gnico

Genes forneos

Bromovirus
Caulimovirus

Complementacin

Furovirus

Alfamovirus

Geminivirus

Caulimovirus

Insercin gnica

Hordeivirus

Dianthovirus

Caulimovirus

Geminivirus

Geminivirus

Presentacin de epitopes

Potexvirus

Potexvirus

Potexvirus

Comovirus

Tobamovirus

Tobamovirus

Potyvirus

Tobamovirus

Tobravirus

Tombusvirus

Tobamovirus

Tombusvirus

Tombusvirus

Vectores virales de 1era y 2da generacin


Vectores de 1era generacin o Virus completo
Infecta sistmicamente
Agroinfiltracin o Agrospray
Bioseguridad baja

Agroinfiltracin por jeringa

Rpida: la protena recombinante puede


obtenerse en aproximadamente una
semana.
Simple: slo se requiere equipamiento
bsico.
Flexible: puede utilizarse para producir
protenas de membrana, enzimas o virus
quimricos.
Laborioso: no compatible con una
produccin a gran escala

Vectores virales de 1era y 2da generacin


Vectores de 2da generacin o Virus desarmado
No infectan sistmicamente
Mtodo de inoculacin: Magnifection
Permite expresar transgenes de mayor tamao
Mayor estabilidad de los transgenes

Bioseguridad alta

Magnifection. Agroinfiltracin por vaco.

Rpida
6-10 das.
Eficiente:
1-5 g protena/kg hoja

Escalable
Complejo Se requiere
equipamiento especfico y
standard
Flexible: puede utilizarse
para producir protenas de
membrana, enzimas o
virus quimricos.

Companias de base biotecnolgica para la produccin de


protenas en plantas
Icon Genetics. Alemania.

Vector TMV 2da generacin


Magnifection

Companias de base biotecnolgica para la produccin de


protenas en plantas
Large Scale Biology Corp. EEUU. 2006 / KBP 2008
Vector TMV 1era generacin
Inoculacin mecnica

NUCLEAR

CLOROPLASTOS

VECTORES
VIRALES

Bajos niveles de
expresin (0,01-0,1 %
TPS)

Altos niveles de expresin


(1-10%)

Altos niveles de
expresin (1-10%)

Largo
6-24 meses

Mediano
3-12 meses

Corto
1-2 semanas

Efecto
posicionamiento
gnico

Si

No

No

Estabilidad de las
secuencias

Alta

Alta

Baja

Plantas en que se
puede expresar

Limitado a la
disponibilidad de
protocolos de
transformacin

Muy limitado a la
disponibilidad de protocolos
de transformacin

Limitado al rango
de hospedante

Si, PTGS

No

Si, VIGS

Si

No

Si

Media

Alta

Baja

Niveles de
expresin
Tiempo de
evaluacin de
construcciones

Silenciamiento
post-transcripcional
Modificaciones
posttransduccionales
Bioseguridad

Expresin de antgenos para la


produccin de vacunas

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Las plantas
constituyen
un sistema
alternativo
para la
produccin
de vacunas a
subunidad

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Vacunas a subunidades:
Seguras
Poco inmunognicas
Inyeccin

Ventajas de las vacunas en plantas:


Bajo costo de produccin.
Eliminacin de la cadena de fro durante el transporte.
Expresin de mltiples antgenos y adjuvantes en un
mismo sistema.
Posibilidad de inmunizacin oral por produccin de
antgenos en plantas comestibles

Vacunas orales en plantas


VENTAJAS

Menores requerimientos de asistencia


mdica para su administracin.
Menor riesgo de transmisin de
enfermedades asociadas a la indebida
reutilizacin de jeringas y agujas.
Induccin de respuesta inmune a
nivel sistmico y de mucosas.

DESVENTAJAS
Supervivencia del antgeno en el
tracto digestivo
Induccin de una respuesta inmune
Promocin de una proteccin
adecuada
Ausencia de efectos de tolerancia
Ausencia de inmunogenicidad del
vehculo vegetal

Aunque originariamente se pens en emplear el tejido vegetal sin


procesar, actualmente se considera utilizar el tejido liofilizado. Esto
permitira controlar mejor la dosis ingerida y evitar efectos de tolerancia

Vacunas basadas en vectores virales

Partculas virales quimricas son potentes inmungenos


(humoral y celular)

Los agregados de protenas virales son buenos adjuvantes

La expresin de epitopes como fusiones a las protenas de


cpside permite una abundante produccin.

El proceso de purificacin de las partculas virales quimricas es


un proceso simple y de alto rendimiento.

Los viriones purificados pueden ser establemente almacenados.

Vacunas en
fase clnica:
hepatitis B

Importancia epidemilogica de la hepatitis B


Es una viremia persistente con 300 millones
de portadores en el mundo.
La vacuna actual se produce en levaduras que expresan
el antgeno de superficie HBsAg. Es efectiva, pero
costosa, por lo que se distribuye poco en los pases
subdesarrollados.
Se ha reportado la expresin de HBsAg en plantas de
tabaco, papa, lechuga y se encuentra en estudio su
expresin en tomates y bananas.

Expresin de HBsAg
en tubrculos de papa.
El antgeno recombinante forma
estructuras vesiculares similares
a las observadas en el suero de
pacientes infectados con HBV.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Tomado de: Kong et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.

Expresin
de HBsAg
en plantas
transgnicas
de Solanum
tuberosum

Se compararon los niveles de expresin de HBsAg


del virus humano de hepatitis B en tubrculos de papa
utilizando distintas construcciones genticas.
HBsAg en tubrculos

HB103

P35S

TEV

0,33 g/g

NOS 3

HBsAg

SEKDEL

HB105

P35S

TEV

HBsAg

NOS 3

1,25 g/g

NOS 3

0,80 g/g

VspaS

HB106

P35S

TEV

HBsAg

VspaL

HBsAg

2,40 g/g

NOS 3

HB107

P35S

TEV

HB104

P35S

TEV

HBsAg

VSP 3

6,50 g/g

HB114

P35S

TEV

HBsAg

Pin2 3

16,00 g/g

HB111

P35S

HBsAg

NOS 3

0,33 g/g

Tomado de: Richter et al., Nat. Biotech., 2000.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

TEV:secuencia enhancer traduccional de Tobacco etch virus.


W: secuencia enhancer traduccional de Tobacco mosaic virus.
vspaS: pptido seal de la protena VSP de soja.
vspaL: seal de transporte vacuolar de la proteina VSP de soja.
NOS 3: terminador de nopalina sintetasa.
VSP 3: terminador de la protena VSP de soja.
Pin2 3: terminador del inhibidor de proteinasa II de papa.
SEKDEL : seal de retencin en RE.

La inmunizacin oral con tubrculos HB114-16 es comparable


la obtenida con la vacuna producida en levaduras
Imnunizacin oral con rHBsAg
purificado de levaduras

Se suministraron 2 dosis de 150 mg de


rHBsAg cada una, en las semanas 0 y 1, y
una dosis de 0,5 mg en la sexta semana
(dosis subinmunognica).
CT: adyuvante, toxina del clera
Se seala el ttulo del antisuero obtenido.
Lnea anaranjada: control de ratones no
inmunizados

Inmunizacin oral con HBsAg


Imnunizacin oral con HBsAg expresado en tubrculos previamente
expresado en tubrculos de papa inmunizados con rHBsAg purificado
de levaduras

Se suministraron tres dosis orales de 5 g de tubrculos de papa transgnica (HB114-16),


conteniendo un promedio de 42 mg de HBsAg cada una, antes o despus de una
inmunizacin con 0,5 mg de antgeno purificado de levaduras (rHBsAg). Se sealan los ttulos
de los antisueros obtenidos en cada caso. Lnea anaranjada: controles de ratones
alimentados con papas no transgnicas.

Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.

La respuesta
inmune
disminuye con
la eliminacin
del adyuvante o
la coccin de
los tubrculos

La eliminacin del
adjuvante (CT: toxina
colrica) en los
esquemas de
inmunizacin lleva a
una fuerte disminucin
de la respuesta inmune

La coccin previa de
los tubrculos
disminuye pero no
elimina la respuesta
inmune.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Tomado de: Kong, Q. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2001.

Inmunizacin
oral de
humanos
con lechuga
transgnica
que produce
HBsAg

En 2 de los 3 voluntarios inmunizados con hojas de


lechuga transgnica se detect un ttulo de anticuerpos
anti-HBsAg protectivo luego de la segunda dosis
Esquema de
inmunizacin:
Primera dosis:
200 g de hojas
Segunda dosis
(a las 8 semanas):
150 g de hojas
Concentracin del
HBsAg en tejido de
lechuga: 1 a 5 ng/g
tejido fresco

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Tomado de: Kapusta et al., FASEB J., 1999.

Para conferir proteccin en humanos deben


registrarse en sangre niveles de anticuerpos
anti-HBsAg de al menos 10 mUI/ml

Comovirus. Cowpea mosaic virus

Presentacin de epitopes de Human Rhinovirus (HRV) en Cowpea mosaic


virus

Potexvirus. Potato virus X

PVX. Produccin de vacunas contra la tuberculosis

Vacuna terapeutica: Produccin de anticuerpos scFV para el


tratamiento del linfoma non-Hodgkins-TMV vector

TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors

Pathogen or Disease

Antigens

References

Human immunodeficiency virus-1


Human immunodeficiency virus-1
Dengue virus
Mycobacterium bovis

VP1 protein
Hypervariable region I
Glicoprotein D
Ga733-2 antigen
Tat protein
p24 protein
Domain III of E protein
ESAT6-Ag85 antigens

Wigdorovitz et la. 1999


Nemchinov et al. 2000
Perez Filgueira et al. 2003
Verch et al. 2004
Karasev et al. 2005
Perez Filgueira et al. 2004
Saejung et al. 2007
Dorokhov et al. 2007

Replacement vectors
Human papilloma virus
Yersinia pestis
Bacillus anthracis
Influenza

E7 protein
F1 and V proteins
PA and LF domains
Hemoagglutinin

Massa et al. 2007


Mett et al. 2007
Chichester et al. 2007, 2009
Shoji et al. 2008, 2009

Modular vectors
Yersinia pestis
Smallpox virus

F1 and V proteins
pBS antigen domain

Santi et al. 2006


Golovkin et al. 2007

Glicoprotein 41
HA epitope
Several epitopes
F protein epitopes
L2 protein
p15-Trp2 epitopes
ESAT6-Ag85 antigens
F protein epitopes

Durrani et al. 1998


Sugiyama et al. 1995
Turpen et al. 1995
Staczek et al. 2000
Smith et al. 2006
Mc Cormick et al. 2006a, 2006b
Dorokhov et al. 2007
Gilleland et al. 2000

Vectores

basados en
TMV

Agrobiotecnologa
Vectores basados
en virus vegetales

Insertion vectors
Foot and mouth disease virus
Hepatitis C virus

Bovine herpes virus


Colorectal cancer

Peptide display vectors


Human immunodeficiency virus-1
Influenza virus
Plasmodium falciparum
Pseudomonas aeruginosa
Canine oral papilloma virus
Melanoma

Mycobacterium bovis
Pseudomonas aeruginosa

TABLE I Antigens expressed from Tobacco mosaic virus based vectors

Vectores

basados en

Pathogen or Disease

PVX

Insertion vectors
Human papilloma virus
Avian Influenza A virus
Toxoplasma gondii
Toxoplasma gondii
Hepatitis B virus
Transmissible gastroenteritis virus

Antigens or Antibodies

References

E7 protein
M2 protein ectodomain
SAG1 protein
Gra4 peptide
nucleocapsid protein
derivate antibody

Franconi et al. 2002


Nemchinov and Natilla 2007
Clemente et al. 2005
Ferraro et al. 2008
Mechtcheriakova et al. 2006
Monger et al. 2006

capside epitopes
Several epitopes
E7 protein
E2 glicoprotein peptides
ESAT6 antigen
E7 and L2 epitopes
F protein epitope
VP6 protein

Marusic et al. 2001


Turpen et al. 1995
Franconi et al. 2002
Marconi et al. 2006
Zelada et al. 2006
Cerovsk et al. 2008
Natilla et al. 2006
O' Brien et al. 2000

Peptide display vectors

Agrobiotecnologa
Vectores basados
en virus vegetales

Human immunodeficiency virus-1


Plasmodium falciparum
Human papilloma virus
Classical Swine Fever virus
Mycobacterium tuberculosis
Human papilloma virus-16
Newcastle disease virus
Murine rotavirus

Ejemplos de antgenos expresados en plantas transgnicas

Produccin de anticuerpos

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

La produccin
de anticuerpos
en plantas
transgnicas
permite
ensamblar
molculas de
Ig complejas

Los genes que codifican los cuatro polipptidos de las


inmunoglobulinas secretorias se acumulan en una misma
planta por cruzamientos sucesivos entre plantas
transgnicas individuales y sus descendientes recombinantes
PLANTIBODIES

Cadena liviana
()

Cadena J
(J)

Cadena pesada
(a)

Ig monomrica
(Ig)

Ig dimrica
(dIg)

Componente
Secretorio (SC)

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Ig secretoria
(sIg)

Expresin
del
anticuerpo
monoclonal
anti-AgI/II en
plantas de
tabaco

La bacteria Streptococcus mutans es uno de los principales


agentes causales de la caries dental. El antgeno de superficie
AgI/II participara en la interaccin hidrofbica entre S. mutans
y un complejo de glicoprotenas de alto peso molecular
presente en la superficie dental.
Estrategia:
Expresar el anticuerpo monoclonal murino anti-AgI/II en
Nicotiana tabacum con el fin de obtener grandes cantidades
del mismo.

N. tabacum que expresa las


cadenas pesadas y livianas
del anticuerpo monoclonal
anti AgI/II

N. tabacum que expresa la


cadena J murina

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

N. tabacum que expresa el


componente secretorio de
conejo
Adaptado de: Ma et al., Science, 1995.

Cruzamientos

Se obtuvieron plantas
de N. Tabacum que
expresan las cuatro
protenas juntas.
Estas cadenas se
ensamblan para dar
lugar a una
inmunoglobulina
secretoria funcional
que reconoce al
antgeno nativo AgI/II

El anticuerpo
anti Agl/II
actuara
alterando la
dinmica de
repoblacin
de la superficie
dental

Luego del tratamiento con un agente antisptico, la presencia


del anticuerpo anti AgI/II evitara la recolonizacin de los
nichos en la superficie dental por Streptococcus mutans.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Adaptado de: www.planetbiotechnology.com

CaroRxTM
Planet Biotechnology

La inmunizacin pasiva local de humanos con anti-AgI/II


producido en plantas otorga proteccin contra S. mutants
Recolonizacin de Streptococcus mutants en la cavidad oral de voluntarios humanos
previamente tratados con gluconato de clorohexidina (CHX) para eliminar la flora oral

Tomado de: Ma. et al., Nat. Med. 1998 y www.planrtbiotechnology.com

Protocolo de inmunizacin:
Aplicacin directa en los dientes del anticuerpo secretorio producido en plantas de
tabaco (SIgA/G, lnea roja) durante 3 semanas con 2 tratamientos por semana. Se
realizaron controles con solucin salina (lnea verde claro), con un anticuerpo bovino no
relacionado producido en plantas (lnea azul) y con el anticuerpos murino (Guys 13,
lnea verde oscuro). n: nmero de voluntarios

RinoRxTM

= Fusin ICAM-q a IgA

Tratamiento preventivo de la gripe causada por Rhinovirus

DoroRxTM

IgA monoclonal contra dorocina

Tratamiento de efectos secundarios de la quimioterapia con dorocina

Expresin de protenas heterooligomricas por coexpresin de


vectores no competitivos
Expresin de anticuerpo moconoclonal A5
por coexpresin TMV y PVX
Expresin de HC y LC del A5 mAB

Purificacin de mAb por A-Sefarosa

PAGE
TMV-LC

No desnaturalizante

PVX-HC

SDS-PAGE
TMV-HC
+
PVX-LC
Westen blot

Produccin de protenas de inters


farmacolgico y medicinal

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Produccin de Galactosidasa A humana- Enfermedad de Fabry


TMV vector-Geneware system
Enfermedad de Fabry = deficiencia de la
enzima alfa-galactosidasa A
1: 60000 hombres-ligada a cromosoma
X

Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system

Rpida optimizacin de la expresin del


gen que codifica la GalA

Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system

Control de calidad del la enzima GalA


producida

Pureza por SDS-PAGE


Determinacion del amino-terminal y la
secuencia completa por Madi-tof
Esterilidad
Endotoxina
ADN residual
Impurezas residuales de la planta
Concentracin proteica
Actividad especfica

Produccin de Galactosidasa A humana- TMV vector-Geneware system

Medicin de la eficacia de la
enzima GalA producida

Medicin de la acumulacin
de GB3 en ratones wt y en
ratones knockout GalA
Clearance plasmtico
Organo blanco

Produccin
de factor de
crecimiento
epidrmico
humano en
plantas
de tabaco

Construcciones usadas para transformar Nicotiana tabacum:


Versiones
citoplasmticas

P 35S CaMV

hEGF

tNOS

P 35S (L) CaMV W

hEGF

tNOS p35(L)EGF

hEGF

tNOS p35(L)APEGF

Versin
P 35S (L) CaMV W
apoplstica

ss

p35EGF

Cuantificacin por ELISA de los niveles


de hEGF expresado en plantas transgnicas

104

0,11% protena
total soluble
(33 g/g de hoja)

103

102

10

Agrobiotecnologa
1

Las plantas como


biorreactores

Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004.

El hEGF producido en tabaco es biolgicamente activo


Ensayo de expansin de clulas del
cumulus de ovocitos bovinos

Control

hEGF st10ng

Planta no tranformada

Extracto 35S (L) AP EGF


(10ng por ELISA)

Extracto planta infectada


PVX control

Extracto planta infectada con


PVXAPEGF

Ensayo de unin a radioreceptor

Tomado de: Wirth et al. Mol.Breed., 2004.

Protenas
terapeuticas
producidas en
plantas en el
mercado o fase
clnica

Otras aplicaciones:
produccin de enzimas de inters
industrial, suplementos alimenticios y
biopolmeros
Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

La avidina de
pollo fue la
primera
protena
recombinante
comercializada
obtenida
en plantas

Construccin usada para transformar plantas de maz:


Pr Ubiquitina Intron Ubi a-amilasa ss

avidina

Pin II 3

El uso de codones de la secuencia seal de la a-amilasa de cebada y de la


secuencia codificante de la avidina de pollo se optimiz para su expresin en
plantas de maz.

El nivel de expresin de la avidina extrada de


semillas de maz fue 2,3% de la protena total
extrada (230 mg/Kg de semillas)
Grano de maz transgnico
incubado con un anticuerpo antiavidina. La interaccin se
evidencia por una reaccin
colorimtrica.
Notar la alta concentracin de
avidina en el embrin (E).
En: endosperma

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Hood et al, Mol. Breed. 1997.

Caractersticas
de la avidina
producida
en maz

Efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la


estabilidad de la avidina expresada en semillas de maz

Caractersticas fsicas de la avidina


recombinante producida en maz

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Tomado de : Hood et al, Mol. Breed. 1997.

Produccin
de brazzena
en plantas
de maz

Las protenas
edulcorantes tienen gran
demanda para productos
dietticos y para enfermos
de diabetes.
La brazzeina es una
protena producida por la
planta africana
Pentadiplandra brazzeana
que posee un poder
edulcorante 1.200 veces
ms alto que el azcar.
Su produccin en la
planta nativa es
imprctica debido a los
altos volmenes de
produccin requeridos.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Se transformaron plantas
de maz con dos
variantes de la secuencia
de brazzena y se la
expres en las semillas a
nivel del embrin y del
endosperma.
Se obtuvieron niveles de
acumulacin en semilla de
hasta 4% de la PST.

Tomado de: Lamphear et al.,


Plant Biotechnology Journal 2005.

Constitutive w/ intron: promotor de tipo poliubiquitina


Embryo-preferred: promotor de globulina 1 de maz
Endosperm-preferred: promotor de a-zena de 22kD
BAASS: secuencia seal de la a-amilasa de cebada
Pin II: Terminador del inhibidor de proteasas II de Solanum tuberosum
TEV y MDMV: enhancers traduccionales de Tobacco etch virus y Maize
dwarf mosaic virus

Niveles de
expresin de
brazzana en
semillas T1
para los
mejores
transformantes
obtenidos con
las
construcciones
1-8 detalladas
en la
transparencia
anterior

PST)
Brazze na (%
(% PST)

Produccin
de brazzena
en plantas
de maz

Las plantas como


biorreactores

g (

Agrobiotecnologa

Brazzena
(g/g de peso seco)

Construccin gentica

Maz
entero
Grano entero

Grano
molido

endosperma

embrin

Germen

pericarpio

Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005.

Contenido de
brazzena en
fracciones
obtenidas por
molienda seca
de las semillas
de la lnea 5
(promotor para
embrin).

Produccin
de brazzena
en plantas
de maz

Extraccin a pH 4

Tratamiento de calor

Esquema de los pasos de


purificacin seguidos para el
aislamiento de brazzena expresada
en maz (maz transformado con la
construccin 5).

Intercambio catinico

Filtracin en geles

Desalado

Freeze Drying

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

Muestras tomadas en los distintos pasos de


purificacin analizadas por PAGE-SDS. Las
protenas fueron visualizadas por tincin con
Comassie Blue. Se embraron 5 g en todos
los casos.
1: extracto crudo; 2: extracto calentado y
filtrado; 3: fraccin pico de la cromatografa
de intercambio catinico; 4: fraccin pico de
la cromatografa de tamao de exclusin.
Tomado de: Lamphear et al., Plant Biotechnology Journal 2005.

Sntesis de plsticos biodegradables en plantas

Envases de shamp hechos de un copolmero de polihidroxibutirato


y polihidroxivalerato a 0, 3 y 9 meses de permanecer en compost.

Produccin
de PHB en
plantas por
transferencia
de la va
metablica
bacteriana

El polihidroxibutirato o PHB constituye una fuente


. renovable de material termoplstico biodegradable.
En Alcaligenes eutrophus la sntesis a partir de acetil CoA
. ocurre en tres pasos catalizados por distintas enzimas.
O

Acetil-CoA

H3C

H3C

CoA

3-cetotiolasa (phbA)
S

CH2

OH

CoA

Acetoacetil-CoA-reductasa
(phbB)
S

CH2

H3C

Ruta bioqumica de la sntesis


de PHB en bacterias

CoA

PHB sintasa (phbC)

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

CH2

CH3

CH3

CH

CH

CH2
n

PHB

Las plantas
de A. thaliana
transformadas
con los genes
phbA, phbB y
phbC
acumulan
grnulos de
PHB en los
cloroplastos

La va completa de sntesis de PHB en Arabidopsis thaliana se


obtuvo por transformacin con los genes phbA, phbB y phbC de
Ralstonia eutropha.
Las tres enzimas se fusionaron a pptidos de trnsito a
cloroplastos para lograr su acumulacin en estas organelas. Esto se
hizo porque los niveles de acetil-CoA son mucho ms altos en los
plstidos que en el citoplasma.
p35S TPSS

phbB

NOS 3

p35S TPSS

phbA

NOS 3 p35S TPSS phbC NOS 3

phbABC
Microscopia electrnica de una
clula del mesfilo de una hoja
madura de una lnea de A.
thaliana que expresa las enzimas
responsables de la sntesis de
PHB. Se muestra un cloroplasto
conteniendo grnulos de PHB.

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores
Tomado de: Bohmert et al, Planta, 2000.

Enzimas industriales
Avidina: kit de diagnstico
-glucuronidasa: kit de diagnstico
Trypsin: wound care
Cellulasa: produccin de etanol
Xylanasa: procesamiento de biomasa
Fitasa: procesamiento de alimentos
(1-3)(1-4)-glucanasa: Brewing
Lignin peroxidasa: Paper manufacture
Biopolmeros
protenas de la seda de araa
polipptidos tipo elastina
colgeno

Companias que utilizan tecnologas para la produccin de


protenas en plantas

Tomado de: Biotecnologa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010

Tomado de: Biotecnologa y mejoramiento vegetal II, Cap. 16 2010

Aspectos de
bioseguridad

Bioseguridad:
En el caso de produccin de protenas teraputicas o con
actividad biolgica, se deben establecer condiciones de
bioseguridad an ms estrictas que las adoptadas para
otros OGMs, ya que stas no deben ingresar bajo ningn
punto de vista a la cadena alimentaria humana.

Recomendaciones:

Agrobiotecnologa
Las plantas como
biorreactores

- Utilizar cultivos que no participen de las cadenas


alimentarias humana o animal.
- Utilizar cultivos de estructura floral cerrada
(autopolinizacin).
- Tener en cuenta el aislamiento temporal
(poca de polinizacin diferente en cultivos
relacionados) y espacial (barreras de cultivos
no transgnicos).
- Si la expresin es en hojas, cosechar las
plantas antes de la floracin.

- dispersin de los transgenes por polen, semilla o


frutos
riesgo de contaminacin de la cadena
alimentaria;
- impacto en especies no blanco: pjaros,
mariposas, insectos etc.
Reproducibilidad
Uso inapropiado de plant by-products
Regulatory issues

Referencias

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platforms for recombinant proteins. Biotechnol Adv. 30(5):1171-84. 2012.
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Las plantas como
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