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Uso de enzima como reactivos:

Las enzimas como se mencion en las anteriores presentaciones y clase son


biocatalizadores naturales. En este seminario se ahondar su importancia, pero con otro
punto de vista, el cual se refiere a su uso como reactivo de laboratorio, que se explica
por ciertas caractersticas que poseen estas enzimas, una de ellas es la especificidad,
cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin actuando sobre un solo nico sustrato o
sobre un grupo muy reducido, tenemos la especificidad absoluta donde la enzima
reconoce a nico sustrato y la especificidad relativa, que es ms amplia y actan sobre
muchos compuestos que poseen una caracterstica en comn. Adems poseemos la
eficiencia enzimtica, dada por la gran velocidad con la que convierten un determinado
sustrato en producto, bajando la energa de activacin. Generalmente la reaccin ocurre
de 106 a 1014 veces ms rpido transformando de 100 a 1000 molculas de sustrato por
segundo, se podra decir que logra su objetivo en un tiempo reducido. Gracias a estas
dos propiedades se pueden usar como reactivo de laboratorio, proporcionandonos un
dato certero, debido al alto poder de discriminacin de la enzima (propiedad que no
tienen ciertas sustancias qumicas) y por la rapidez con la que pueden otorgarnos el
resultado.
Obtencin de enzimas por biotecnologa (protenas recombinantes):
Se considera una protena recombinante a una protena cuya sntesis se realiza en un
organismo distinto al organismo nativo. Generalmente se utilizan bacterias, como por
ejemplo la E. Coli debido al conocimiento que se posee sobre su fisiologa y gentica, por
su bajo costo y simple manipulacin. La obtencin de una protena recombinante tiene
diversos pasos dentro de estos tenemos la obtencin del gen de inters, para esto se
utiliza PCR, donde el DNA del gen de inters se amplifica por accin de una polimerasa,
con la utilizacin de enzimas de restriccin y ligasas se obtiene el DNA recombinante.
Posteriormente se incorpora mediante un vector donde figuran plsmidos o fagos, las
clulas que poseen DNA recombinante son llamadas transgnicas o transformadas. La
bacteria entonces comienza a sintetizar la protena leyendo el DNA recombinante con
su maquinaria celular. La protena se asla, se purifica analizando su actividad y calidad.
Para esto se usan diferentes medios de cultivo, cuando ya se obtiene la cantidad
suficiente para la demanda las clulas se centrifugan, y se filtran para obtener la
protena de inters. Ejemplos: Obtencin de insulina (con gran xito debido al gran
nmero de personas con diabetes mellitus y la obtencin de hormona del crecimiento
para messi (no se si es real xd).

Uso de enzimas como reactivo de Laboratorio, variables a considerar y controlar


Las enzimas, adems de estar presentes en los organismos vivos como biocatalizadores,
pueden ser aisladas y ocuparse para catalizar diversas reacciones en laboratorio,pero
debido a su naturaleza qumica se deben tener los mismos cuidados al manipularlas que
con otras protenas.
Temperatura: La T influye en la actividad enzimtica. En general por cada 10C que
aumente la temperatura la velocidad de la reaccin aumenta de 2 a 4 veces. Esto se
cumple hasta que la temperatura alcanza un valor mximo (T ptima) donde la actividad
es mxima. Esto se debe a que al aumentar la T aumenta el movimiento de las molculas
y, por tanto aumenta la probabilidad de encuentro entre el S y la E.
Si la T aumenta por encima de la T ptima, disminuye e incluso cesa la actividad
enzimtica debido a que la enzima se desnaturaliza.
Cada enzima posee una T ptima que depende del organismo del cual proviene, por
ejemplo las enzimas humanas tienen una T ptima de 37C
Importante no congelar las enzimas para su almacenamiento, ya que vienen en solucin
acuosa y la cristalizacin del agua (y aumento de su volumen )puede destruir la enzima.
Esto no significa que no se puedan almacenar a temperaturas bajo 0C ya que las
soluciones en las que vienen pueden ser buffers que contienen detergentes que evitan que
se congele a esa temperatura.

pH: El pH es otro factor que influye en la actividad enzimtica, Cada enzima realiza su
accin dentro de un determinado intervalo de pH, dentro de este intervalo habr un pH
ptimo donde la actividad enzimtica ser mxima. Por debajo del pH minimo o por encima
del pH mximo el enzima se inactiva ya que se desnaturaliza. En la mayora de las enzimas
el pH ptimo est prximo a la neutralidad, aunque hay excepciones
Agitacin: Es importante no agitar en exceso las soluciones de enzimas (o protenas en
general) ya que estas forman espuma lo que puede causar problemas en los
procedimientos que se quiera realizar y adems puede denaturar la enzima.
La forma correcta de homogenizarla es mover ligeramente la solucin sin crear espuma, y
succionar con la micropipeta varias veces.

Glucosa Oxidasa
La glucosa oxidasa es una oxidorreductasa que cataliza la oxidacin de la glucosa para
formar perxido de hidrgeno y D-glucono--lactona (Acido glucnico ?). Es ampliamente
utilizada para la determinacin y cuantificacin de glucosa libre en los fluidos biolgicos,
tales como sangre y orina

La glucosa se oxida por accin de la glucosa oxidasa para dar cido glucnico y
perxido de hidrgeno.
El perxido de hidrgeno reacciona en presencia de peroxidasa con fenol y 4aminoantipiridina para dar lugar a un tinte de quinonimina rojo. La intensidad del
color formado es proporcional a la concentracin de glucosa y se puede medir
fotomtricamente entre 460 y 560 nm (mximo de absorcion a los 505 nm)
Es conveniente analizar junto con las muestras sueros controles valorados para
Glucosa por este mtodo
*se obtiene de Aspergillus niger recombinante
Alcohol Desidrogenasa
El etanol se puede oxidar a acetaldehdo por el NAD en presencia de la enzima alcohol
dehidrogenasa (ADH) para producir NADH. El NADH producido se determina
espectrofotomtricamente a 340nm
Etanol + NAD+

Acetaldehdo + NADH + H+

Para asegurar el buen funcionamiento del anlisis se recomienda el uso de controles de


concentraciones conocidas, existen controles de 50 y 300 mg/dl
Este anlisis puede cuantificar de forma precisa concentraciones de etanol dentro de un
rango de 10 mg/dL (0,01%) a 600 mg/dL (0,6%).

Usos de las enzimas en biologa molecular, variables a considerar y controlar:

Taq polimerasa:(PCR y qPCR)


La Taq polimerasa es como se conoce comnmente a la enzima ADN polimerasa de

Thermus aquaticus (termfila gram negativa), una bacteria. En los laboratorios de


biologa molecular es de obligado uso, puesto que es la polimerasa ms frecuente y ms
barata que se puede usar para realizar una PCR. Su caracterstica esencial es su
actividad polimerasa 5 -> 3, aadiendo bases nitrogenadas en ese sentido de la hebra
de ADN. Sintetiza de 35 a 100 nucletidos por segundo teniendo funcin exonucleasa
(de 5a 3 eliminando nucletidos mientras van sintetizndolos).

Primero se us la polimerasa de la E. coli, El problema es que las hebras una vez copiadas
tenan que separarse ponindolas a ms de 90C para poder permitir que volvieran a
copiarse y la enzima se desnaturaliza. Posteriormente se aisl la Taq polimerasa que
resiste altas temperaturas, sin embargo se utiliza la AmpliTaq que es la polimerasa de la
E. coli, es recombinante, ya que contiene el gen de la Taq y logra ser ms pura, y fcil de
cultivar.
PCR:
La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica in vitro utilizada para amplificar
enzimticamente una regin determinada de ADN situada entre dos regiones de ADN
cuya secuencia se conoce. Se basa en el proceso de replicacin (DNA polimerasa).
el ADN bicatenario se desenrolla y pasa a ADN monocatenario, se duplica y se vuelve a
enrollar. Esta tcnica consiste en ciclos repetitivos de:
desnaturalizacin del ADN por fusin a temperatura elevada, a fin de convertir el
ADN bicatenario en ADN monocatenario; se utilizan de 93 a 96C. La temperatura
depende del tipo de disolvente, de la concentracin salina , del pH utilizado y de la
concentracin de G-C respecto de T-A.
unin (anillamiento) de dos oligonucletidos, utilizados como cebadores, al ADN diana;
extensin de la cadena de ADN por adicin de nucletidos a partir de los cebadores
utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones Mg2+.
Los oligonucletidos consisten normalmente en secuencias relativamente cortas, que son
diferentes entre s y complementarias de los sitios de reconocimiento que flanquean el
segmento de ADN diana que debe amplificarse.
Las mismas cadenas producidas luego pueden ocuparse como molde.
qPCR:
La sensibilidad de la tcnica de PCR es muy alta pero presenta algunos inconvenientes,
como son que no es una tcnica cuantitativa, para solventar el problema de la
cuantificacin se han generado unas variaciones sobre el esquema inicial de la PCR,
dando lugar a lo que se conoce como PCR cuantitativa o PCR en tiempo real.
La clave en la PCR cuantitativa es la posibilidad de detectar en tiempo real la
amplificacin de nuestro genoma de inters. Para llevar a cabo esta deteccin existen

varios mtodos pero casi todos basados en la utilizacin de otro fragmento de ADN
(sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar. Esta
sonda lleva adherida una molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta
fluorescencia ("quencher"), de tal forma que slo cuando la sonda es desplazada de su
sitio por accin de la ADN polimerasa la molcula fluorescente se libera de la accin del
"quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un lser. La cuantificacin de la
fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR ser proporcional a la cantidad de
ADN que se est amplificando.
Transcriptasa reversa: La funcin de la enzima es convertir el mRNA en DNAc. La
transcriptasa inversa procede de retrovirus y usa como molde una cadena sencilla de
ARN para dar lugar a una cadena sencilla de ADNc. La transcriptasa inversa emplea
ARNm maduro como molde y por tanto el ADNc no contiene los intrones que poseen los
genes eucariotas. As la secuencias de ADNc corresponden nicamente secuencias
codificadoras de protenas.
Endonucleasas de restriccin: Son protenas bacterianas que cortan fragmentos de la
molcula de DNA reconociendo una secuencia especfica de nucletidos, cortando el
DNA donde esta combinacin ocurra.
Es una tcnica muy frecuentemente utilizada en los estudios moleculares, y consiste en
la combinacin de dos mtodos bsicos en el trabajo molecular. En primer lugar se
realiza una amplificacin por PCR del gen que queremos estudiar, y posteriormente se
realiza la digestin (o corte en fragmentos) del producto amplificado con enzimas de
restriccin, para ver los fragmentos resultantes o fragmentos de restriccin de ese
gen. Este mtodo es til para detectar pequeas inserciones o deleciones en
determinados fragmentos de restriccin de un gen, ya que el tamao de los mismos se
ver aumentado o disminuido, respectivamente. En otros casos, ciertas mutaciones
puntuales en un gen, que alteran la secuencia de nucletidos del mismo, pueden crear
nuevos sitios de restriccin o hacer desaparecer aquellos presentes en el gen normal, lo
que alterar el patrn de los fragmentos de restriccin observables en electroforesis.
Cuando las secuencias son polimrficas dan el mismo resultado en la electroforesis.
DNAsas:
Los sistemas reconocen pequeas secuencias especficas de DNA y quiebran, ya sea
dentro o a una determinada distancia pequea de la secuencia de reconocimiento,
produciendo fragmentos especficos de cadena doble con 5 fosfatos terminales.
Si tratamos de obtener RNA, el DNA se elimina por las DNAsas, que produce pequeos
segmentos dializables, susceptibles de ser separados por dilisis.
Inmunoblot
Western Blot es una tcnica analtica, ampliamente utilizada, para el estudio de
protenas. Este mtodo permite la deteccin de una sola protena dentro de una muestra

biolgica. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilizacin de un


anticuerpo que reconoce y se une a un eptopo nico de la protena de inters. Con la
tcnica de Western Blot se puede estimar el tamao de una protena, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilacin, y ser utilizado
para comparar cuantitativamente los niveles de protena entre muestras.
a. Preparacin de la muestra Extraccin de las protenas de las muestras biolgicas
mediante disrupcin mecnica o qumica
b. Electroforesis en gel de Acrilamida Las protenas en el extracto se separan de
acuerdo a su tamao mediante electroforesis. Se prepara un gel de acrilamida,
bisacrilamida. El dodecilsulfato de sodio (SDS) aadido al gel se une a las protenas y
confiere, de forma proporcional a la masa de cada protena, una carga negativa a cada
una de ellas
c. Transferencia electrofortica a una membrana Las protenas son transferidas
electroforticamente a un soporte rgido o membrana, dnde quedan inmovilizadas.
a. Hibridacin del Anticuerpo La membrana con las prote- nas inmovilizadas debe
tratarse para bloquear las zonas con ausencia de protenas y as evitar la unin no
especfica de los anticuerpos. A continuacin se incuba con un anticuerpo primario
dirigido contra el eptopo especfico de la protena diana. Tras varios lavados de la
membrana, se adiciona un anticuerpo secundario marcado que se unir de forma
especfica al anticuerpo primario, proporcionando una forma de deteccin.
e. Deteccin de las Bandas Despus de un lavado de la membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se procede a detectar la localizacin de la banda en la membrana.
Para la deteccin de quimioluminiscencia, se utiliza un anticuerpo secundario conjugado
con el enzima peroxidasa (HRP); la adicin de un sustrato de HRP provoca una reaccin
enzimtica que da como resultado final la emisin de luz. Dicha luz puede ser detectada
en una pel- cula de rayos X, o de forma digital, mediante un sistema de captacin de
imgenes. La deteccin de fluorescencia se basa en la captacin de luz emitid por
sustancias fluorforas conjugadas con el anticuerpo secundario.

ELISA
La tcnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) es utilizada para la deteccin
de muy diversas molculas biolgicas, basndose en la especificidad del reconocimiento
antgeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimticas.
En el caso del antgeno unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo antiantgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un
secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la

amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada


anticuerpo primario.
Elisa directo
Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se
sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que
sern muestras del mismo tipo que las analizadas (sangre, orina...), pero en las que se
tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles
positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado).

Elisa indirecto
(voy a explicarlo con la pura imagen ) C:

Inmunohistoqumica :D
Esta tcnica sirve para detectar la presencia de una protena especfica en una clula de un
tejido. La especificidad se da mediante la relacin antgeno anticuerpo y la la deteccin se
realiza mediante un anticuerpo unido a enzima que puede catalizar una reaccin con un
sustrato cromgeno.
Primero se toma la muestra del tejido y se fija con formalina, parafinna y todas esas cosas
msticas que hacen los morfo.
Luego se agregan anticuerpos espcificos para marcar la protena de inters y
posteriormente anticuerpos secundarios que van a estar conjugados con enzima, al agregar
posteriormente el sustrato, ste reaccionar con la enzima generando las manchas cafs
que se ven en la imagen lo cual nos da informacin sobre la cantidad de protena presente
en la celula
*lo que no recuerdo con exactitud es si se poda hacer solo con un anticuerpo con enzima o
era como lo escrib (primer anticuerpo de marcacin y luego el secundario con enzima)