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Pontificia Universidad Catlica de Chile

Facultad de Ciencias Biolgicas


Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa
Biologa de Microorganismos
BIO151E-2

Informe N2
Identificacin, gentica molecular
bacteriana y morfologa de hongos

Nombre: Diana Fuentes Castillo


Profesores: Dras. Beatriz Diez y Carolina Serrano
Jefe de Ayudantes: Daniela Ruiz
Ayudante: Gabriela Gmez Lillo
Fecha de entrega: 5 de Noviembre de 2014

Introduccin
La microbiologa es la ciencia que estudia a los organismos microscpicos y
a los virus, de manera de entender su funcionamiento y aplicar esto en beneficio
de la humanidad (1). Para generar este conocimiento, se requiere de instancias
experimentales, las que permitirn obtener informacin sobre el aspecto a
analizar. En las actividades prcticas realizadas, se trabaj con bacterias, virus y
hongos.
Las bacterias son organismos unicelulares, sin organelos, de 1 a 5 um de
longitud en general (2). En vista de la variedad de especies, para su identificacin,
es necesario el uso de pruebas en medios diferenciales, que estarn dirigidas por
un anlisis macroscpico y microscpico previo. La certeza sobre la identidad de
la bacteria se puede lograr a travs de una batera de pruebas bioqumicas o
mediante sistemas de identificacin estandarizados, como API 10S, que tiene un
enfoque ms amplio, pero permite una identificacin ms rpida (3). La batera
bioqumica empleada consiste en 10 medios de cultivo, que en presencia de la
bacteria a identificar permitir detectar una reaccin bioqumica determinada. El
sistema API 10S consta de 11 pruebas bioqumicas con sustratos deshidratados.
Por otro lado, para sobrevivir las bacterias poseen 3 mtodos de
transferencia de genes: transformacin, en donde ADN libre es tomado por la
clula; conjugacin, en donde la transferencia de ADN requiere de interaccin
mediante pili, y transduccin, en donde la transferencia de ADN es mediada por un
virus (4). La transduccin puede ser generalizada, en donde el virin solo posee
ADN del husped, y especializada, en donde una porcin especfica del ADN del
husped se integra en el genoma viral, llegando incluso a eliminar parte de este
(5). Adems, se ha descubierto otra fuente de variabilidad gentica, los
transposones, que son segmentos de ADN que se pueden mover de un lado al
otro (6). Para verificar el proceso de conjugacin, se emplearon medios con
kanamicina, antibitico cuyo objetivo son bacterias Gram (-) (7) y ampicilina, de
amplio espectro (8). Para verificar el proceso de transduccin generalizada, se
utiliz el fago P22, ya que este proceso es tpico de l (9). Adems, se utiliz el
medio agar verde para apreciar el metabolismo bacteriano en presencia de los
fagos P22 y H5, ltico y lisognico respectivamente, debido a que este medio asla
a Salmonella spp. e inhibe el crecimiento de fermentadores de lactosa, como E.
coli (10).
Los hongos son organismos eucariontes que pueden ser unicelulares
(levadura) o multicelulares (micelio), los que a su vez pueden ser septados, de
clulas uninucleadas o coenocticos, de clulas multinucleadas (11). Los hongos
utilizados fueron Cryptococcus, Rhodotorula, Mucor, Penicillium notatum y
Aspergillus niger. Cryptococcus es una levadura, pudiendo formar blastoconidias
(12). Rhodotorula es una levadura del tipo basidiomiceto (13). Mucor, es un hongo

dimrfico que en ausencia de oxgeno se comporta como levadura (14).


Penicillium notatum es un hongo filamentoso septado, junto con Aspergillus niger.
Los trabajos prcticos se han realizado con el objetivo de:
1. Identificar una bacteria Gram (-) mediante el uso de batera bioqumica
convencional y el sistema de identificacin estandarizado API 10S.
2. Verificar los mecanismos de conjugacin, transduccin generalizada y
transposicin en Salmonella typhimurium mediante anlisis macroscpico
de placas de cultivo.
3. Conocer y caracterizar la morfologa macroscpica y microscpica de
colonias de hongos unicelulares y pluricelulares.

Materiales y mtodos
Lista de materiales:
-Bacteria problema en medio lquido
-Asa de platino convencional
-Asa de platino adaptada para simular asa en punta
-Mechero Bunsen
-Batera de medios de cultivo
Semitendidos
o TSI
o LIA
Tendidos
o Agar corriente
o Agar manitol
o Agar citrato
Lquidos
o Caldo corriente
o Caldo urea
o Caldo sorbitol
o Caldo glucosado
o Caldo Voges-Proskauer
Semislidos
o MIO
-Galera API 10S
-Cultivos de cepas Salmonella entrica serovar Typhimurium
-Lisados de fago transductor P22 de cepas 14028/Cherry y MST1063
-Placas con medio Agar Luria, Agar Luria Kanamicina-Ampicilina, agar Luria
Ampicilina, agar MacConkey kanamicina.
-Cepa E. coli CC1000 y Salmonella 2C
-Micropipetas
-Puntas de micropipetas
-Placas preparadas con placas de lisis del fago P22 y H5
-Placas de agar verde
-Agar blando
-Muestra con concentracin desconocida de fagos
-Microscopio Olympus CX21
-Aceite de inmersin
-Estufa
-Agar sabouraud
-Cultivos de levaduras (Cryptococcus, Rhodotorula, Candida albicans)

-Cultivos de hongos filamentosos (Aspergillus niger, Mucor, Penicillium notatum)


-Batera para tinciones
Cristal violeta
Lugol
Solucin de alcohol-acetona
Safranina al 1%
Azul de lactofenol
Tinta china
-Portaobjetos
-Cubreobjetos

Procedimientos:
Trabajo prctico N3 (Anexo)
El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo (15),
con la excepcin de que para sembrar los medios semitendidos y semislidos no
se utiliz un asa en punta.
Trabajo prctico N4
El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo (16),
con la excepcin de que la incubacin a temperaturas ms alta que la ambiental
se emple una estufa, en vez de un bao termorregulado, y adems de us
puntas de micropipeta en vez de mondadientes
Trabajo prctico N5
El procedimiento se realiz de acuerdo a lo estipulado en la gua de trabajo (17),
con la excepcin de que se dispuso de un cultivo adicional: Candida albicans.

Resultados
Identificacin de bacteria Gram ()
Se realiz una batera bioqumica convencional, en donde se emplearon 10
medios de cultivo, los que permiten determinar la actividad metablica de la
muestra problema. Los resultados para cada prueba se presentan en la Tabla I.
Estos resultados se contrastan con la actividad metablica previamente
identificada de las bacterias de la familia Enterobacteriaceae (18).
Complementario a esto, se realiz el sistema de identificacin
estandarizado, API 10S, que permite obtener la identidad de la bacteria de manera
ms rpida, mediante anlisis computacional. Los resultados para cada prueba se
presentan en la Tabla II.
Al obtener la identidad mediante la batera bioqumica, se obtuvo que hubo
una compatibilidad de 12 aspectos, de un total de 14. Mediante API 10S, la
compatibilidad que mostr el software fue de 57,2%. La compatibilidad porcentual
de cada mtodo se muestra en la Tabla III.
Tabla I. Batera bioqumica convencional

Tabla II. API 10S

Prueba bioqumica

Resultad
o
Caldo glucosado
A
Agar manitol
-*
Citrato
Urea
+
Caldo corriente
-*
Voges-ProskauerReac - Resul
Rojo de metilo cin + tado
Agar corriente ONP - +
G
TSI
+
GLU
LIA
- +
ARA - MIO
LDC-;-negativo.
+
Simbologa:
+; positivo.
A; cido. Simbologa: +; positivo. -; negativo.
H2S
ODC
TSI; triple sugar iron.
LIA; Lysine
Iron Agar. Las muestras fueron observadas directamente.
MIO; Motilidad-Indol-Ornitina.
CIT
- H2S; cido
sulfrico. *; no coincidi
con
lo
H2S
- esperado
Las
muestras
fueron
observadas
URF directamente.
Los resultados queTDA
no coincidieron
con lo
esperado se marcaron
con
un
asterisco.
IND
+
NO2
Oxid Tabla III.
Porcentaje de compatibilidad con fenotipo de E. coli
asa
Mtodo de identificacin
Compatibilidad con fenotipo de E. coli
Batera Bioqumica
85,7%
API 10S
57,2%
El porcentaje compatibilidad de la batera bioqumica corresponde a la razn entre pruebas
compatibles y pruebas totales, multiplicado por 100. El porcentaje de API 10S fue entregado por un
software computacional.

Gentica microbiana
Observacin de placas de lisis
Al examinar las muestras preparadas de placas de lisis de distintos fagos,
fue posible identificar las caractersticas presentadas en la Tabla IV.
Tabla IV. Placas de lisis de fagos H5 y P22

Fago
H5
P22

Placas de lisis
1
3

Colonias
S
No

Simbologa: Para cuantificar las placas de lisis, se us una escala que va de 0 a 3, en donde 0 es
nada y 3 es lo mximo observado
Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Metabolismo bacteriano
Al sembrar los fagos H5 y P22, provenientes de sus respectivas placas de
lisis, en placas de agar verde, se obtuvieron los resultados de la Tabla V. Las
placas de agar verde permiten el aislamiento de Salmonella spp.
Tabla V. Caractersticas de cultivos de fagos en agar verde

Fago
H5
P22

Caractersticas
Predominio de colonias negras, con presencia de
algunas colonias blancas
Colonias negras

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Concentracin de fagos
Al sembrar el fago de concentracin desconocida junto con la bacteria
Salmonella typhimurium en agar corriente no hubo placas de lisis. La
concentracin de fagos est dada por PFU (unidades formadoras de placas) (19)
Movilizacin de plasmidios por conjugacin
Al sembrar cepas de E. coli y Salmonella tanto juntas como separadas, en
medio LB Kanamicina-Ampicilina, se obtuvieron los resultados presentes en la
tabla VI. Este medio inhibe el crecimiento de un amplio rango de bacterias, entre
ellas E. coli y Salmonella.
Tabla VI. Placas de lisis de fagos P22

Tipo de siembra
Zig zag
Csped

Bacteria sembrada
E. coli
Salmonella typhimurium
E. coli + Salmonella typhimurium
E. coli + Salmonella typhimurium

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Crecimiento
No
S
S
S

Transduccin de plsmidos
Al agregar el fago P22Cherry junto a Salmonella WT en una placa LB
Ampicilina, medio antibacteriano de amplio espectro, se obtuvo los resultados de
la tabla VII.
Tabla VII.

Tipo de siembra
Zigzag
Csped

Resultados
Colonias de color rosado
Colonias de color rosado

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Mutagnesis usando fagos con transposn


Al sembrar el fago P221063 junto con Salmonella WT en medio
MacConkey-Kanamicina, inhibiendo el crecimiento de bacterias Gram (+) y Gram
(-) respectivamente, se obtuvo los resultados de la Tabla VIII.
Tabla VIII.

Tipo de siembra
Zig zag
Csped

Color agar
Rojo oscuro
Caf

Cantidad de colonias
1
3

Simbologa: Para cuantificar las cantidad de colonias, se us una escala que va de 0 a 3, en donde
0 es nada y 3 es lo mximo observado
Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Morfologa de levaduras
En cuanto a la morfologa de levaduras, se realiz un examen
macroscpico de 3 cultivos, cuyas caractersticas se presentan en la Tabla IX.
Tabla IX. Caractersticas macroscpicas de levaduras

Especie

Forma

Color

Superficie

Borde Elevacin Brillo

Rhodotorula

Colonias
circulares

Salmn

Lisa

Liso

Cryptococcus Colonias
circulares

Crema

Lisa

Liso

Poco

Candida
albicans

Blanco

Lisa

Liso

No

Colonias
circulares

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Por otro lado, para realizar el examen microscpico, se emple tincin


Gram, examen al fresco, y examen al fresco de cpsula. La tincin Gram permite
mayor claridad en el examen de las levaduras. Los resultados de la tincin Gram
se presentan en la Tabla X, los de examen al fresco en la Tabla XI, y los de
examen al fresco de cpsula en la Tabla XII.
Tabla X. Tincin Gram

Especie
Cryptococcus
Rhodotorula
Candida albicans

Afinidad tintorial
Safranina
Cristal violeta
Cristal violeta

Forma
Redonda
Ovoide
Ovoide

Las muestras fueron


observadas mediante
microscopa de luz, con
un aumento de 40x.

Tabla XI. Examen al fresco

Especie
Cryptococcus

Caractersticas
Clulas de forma redonda

Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 40x.
Tabla XII. Examen al fresco de cpsula

Especie
Cryptococcus

Caractersticas
Esporas azules oscuras, en distintos planos

Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 100x.

Morfologa de hongos filamentosos


Para determinar la morfologa de los hongos filamentosos, se realiz un
examen macroscpico, cuyos resultados se presentan la Tabla XIII.
Tabla XIII. Caractersticas macroscpicas de hongos filamentosos

Especie

Color
Color
ansverso reverso

Superficie

Aspergillus niger

Negro

Blanquecino Pulverulenta

Penicillium notatum

Verde

Amarillo

Aterciopelada (ansverso corrugado)

Mucor

Blanco

Crema

Algodonosa

Las muestras fueron observadas directamente, sin aumento.

Para poder tener una aproximacin a la identidad del hongo mediante las
estructuras que contienen las esporas, se realiz un examen microscpico, cuyos
resultados se presentan en la Tabla XIV.
Tabla XIV. Examen al fresco de hongo filamentoso

Especie
Penicillium notatum

Caractersticas
Presencia de conidias, conidiforos y
filides

Las muestras fueron observadas mediante microscopa de luz, con un aumento de 100x.

Discusin
Los resultados obtenidos en cuanto a la identificacin de bacterias Gram (-),
dan cuenta de una mayor precisin en la obtencin de la identidad por parte de la
batera bioqumica (Tabla III), en comparacin con el sistema API 10S, lo que era
de esperar, ya que API 10S tiene un enfoque ms amplio (3), lo que implica que al
identificar una mayor cantidad de bacterias, existe una mayor probabilidad de que
se usen pruebas que no sean tan atingentes a enterobacterias, lo que llevara a
que puedan haber errores en alguna prueba que no sean tan importantes, pero
que disminuyan de igual manera la compatibilidad. Adems, al emplear el mtodo
API 10S, se ha reportado error de identificacin en 2 de 28 cepas de E. coli
probadas (20). En cuanto a los dos resultados divergentes que hubo en el mtodo
de batera bioqumica (Tabla I), que correspondieron a agar manitol y caldo
corriente con reactivo de Kovacs, lo que se puede deber a una mala ejecucin de
las pruebas.
En la seccin de gentica microbiana, con respecto a la observacin de
placas de lisis (Tabla IV), se tiene que los resultados coinciden con lo esperado, ya
que en la muestra de placas de lisis de H5, fago lisognico, se encuentran
colonias y una baja cantidad de placas de lisis, lo que implicara que la muerte
bacteriana no es responsabilidad directa del virus, ya que hay colonias, mientras
que en la muestra de P22, fago ltico (21), no se encuentran colonias y hay
abundantes placas de lisis, lo que permite inferir que el virus est destruyendo las
bacterias.
En la seccin de metabolismo bacteriano (Tabla V), se tiene que existe una
predominancia de colonias oscuras, que son signo de que hubo lisis, ya que sta
acidifica el medio, provocando la oscuridad de las colonias (22). Sin embargo,
hubo una pequea cantidad de colonias claras, en la placa con el fago H5, lo que
implica que no existe lisis en esas colonias. Aunque se esperara que en la placa
del fago H5 hubiese habido predominancia de colonias claras, esto se puede
explicar por el tiempo que pas, en el que pudo haber ocurrido una lisis celular
que no fue causada por los fagos.
Con respecto a la determinacin de la concentracin de fagos, esta no se
pudo determinar, ya que no se formaron placas de lisis, lo que se puede deber a
que la concentracin del fago haya sido muy baja, a que haya habido muerte de la
bacteria debido a que no se disminuy lo suficiente la temperatura del agar
blando, o a un error en las diluciones.
En cuanto a la movilizacin de plsmidos por conjugacin (Tabla VI), se
obtuvo crecimiento cuando se sembraron ambas bacterias juntas, lo que es de
esperar en el caso de que exista conjugacin, ya que ambas bacterias se
transferirn los genes de resistencia que necesitan recprocamente. Sin embargo,
hubo crecimiento de Salmonella typhimurium sola, lo que se podra deber a que

esa cepa se haya contaminado con una bacteria que tuviera resistencia, y por
conjugacin, esta bacteria le hubiese transferido genes de resistencia.
En cuanto a la transduccin de plsmidos (Tabla VII), se apreci tincin
rosa en las colonias, lo que es signo de que hubo transduccin del fago
P22Cherry.
En la seccin de mutagnesis (Tabla VIII) se not crecimiento bacteriano, lo
que sugiere que hubo una gran tasa de transposicin de genes, que
eventualmente otorgaron a Salmonella typhimurium resistencia a kanamicina.
Adems, el menor crecimiento al sembrar en zigzag, se puede deber a que en ese
mtodo, las concentraciones son muy bajas, disminuyendo la cantidad, y por
tanto, actividad de los fagos (23).
Por ltimo, con respecto a la morfologa de hongos, todos los resultados
coincidieron con lo esperado, y la existencia de conidiforos, conidias y filides
confirmaron que el hongo que se examin al fresco fue Penicillium (Tabla XIV). Sin
embargo, se not un marcado aumento en la claridad de la tincin Gram en
levaduras, lo que se debe a su alto contenido de glicoprotenas, en comparacin
con hongos filamentosos (24).

Conclusin
En funcin de los resultados obtenidos, se puede afirmar que la
identificacin de una bacteria se puede realizar tanto por medio de la batera
bioqumica convencional, como de sistemas estandarizados como API 10S, pero
dentro de estos dos, es ms precisa la batera bioqumica, con el costo de realizar
un proceso ms engorroso en comparacin con API 10S.
Adems, se puede concluir que en Salmonella typhimurium, bajo las
condiciones adecuadas, pueden ocurrir los procesos de variabilidad genmica de
conjugacin, transduccin generalizada y transposicin de genes.
En cuanto a la morfologa de los hongos, se tiene que un examen
macroscpico permite distinguir levaduras de hongos filamentosos, mientras que
el examen microscpico permite identificar la especie fngica.
A modo de resumen, a partir de las experiencias realizadas se pudo
verificar la utilidad e importancia de los procedimientos prcticos realizados en
microbiologa, teniendo como ejemplo de esto a la identificacin de bacterias u
hongos, en cuanto al diagnstico de una enfermedad, o a la variabilidad del
genoma bacteriano, a fin de entender la progresin de enfermedades infecciosas,
en donde estos mecanismos incrementan la resistencia del microorganismo.

Bibliografa
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Typhimurium, Hund, A.R, 1a edicin, University of Illinois at UrbanaChampaign, 1996, p. 16.
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