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Condiciones de cultivo para la produccin de

amilasa termoestable de Bacillus


stearothermophilus
La composicin y concentracin de los medios afectan en gran medida el
crecimiento y la produccin de amilasa extracelular en bacterias (5, 6, 10),
levaduras (9, 12), y Aspergillus sp. (2). Shinke et al. (14) informaron de que la
composicin del medio afecta la produccin de amilasa, as como la
esporulacin en Bacillus cereus. El almidn se considera un inductor para la
produccin de amilasa (4, 8, 16, 18), pero hay informes que indican que el
almidn puede no ser necesaria para la produccin de amilasa (17). La
naturaleza y cantidad de fuente de nitrgeno en el medio de cultivo tambin
afectan el crecimiento y la produccin de amilasa (5, 9). Aparte de carbono y
nitrgeno, sales de sodio y potasio (5, 14, 16), iones metlicos (5, 17), y
detergentes (12) se sabe que afectan la produccin de amilasa y el crecimiento
del organismo. El medio de crecimiento para la produccin de amilasa,
obviamente, sera uno que proporciona un buen rendimiento de la amilasa
extracelular. El B. stearothermophilus cepa utilizada en el presente estudio se
diferenci de la cepa utilizada en estudios previos por Welker y Campbell (18).
La cepa se utiliz tiene una temperatura menor crecimiento ptimo (50 frente a
55 C). La amilasa producida por la cepa utilizada por Welker y Campbell es
una enzima de bajo peso molecular con un rango de temperatura ptima de 55
a 70 C, mientras que la cepa se utiliz produce una amilasa de alto peso
molecular, con una temperatura ptima para la actividad de alrededor de 82
C (16). Por consiguiente, era necesario determinar las condiciones ptimas de
cultivo para el crecimiento y la produccin de amilasa por la cepa se utiliz. Los
resultados de estos estudios se presentan aqu.

MATERIALES Y METODOS
El organismo y su cultivo.
B. stearothermophilus se aisl a partir del suelo (15). A menos que se indique
lo contrario, la bacteria se cultiv en matraces estacionarios a 50 0,5 C en
un medio basal de la siguiente composicin: peptona, 0,4%; (NH4) 2HPO4,
0,4%; licor de maz, 0,4%; KCI, 0,1%; MgSO4 7H2O, 0,05; y almidn (Difco
Laboratories), 0,3%.
El pH del medio se ajust a 7,0. Las porciones (50 ml) del medio basal se
esterilizaron en autoclave en matraces Erlenmeyer de 250 ml y se utilizan para
el cultivo bacteriano. El rendimiento de la amilasa se estim en el fluido
extracelular despus de la eliminacin de las clulas bacterianas del caldo de
cultivo por centrifugacin a 10.000 xg (0 a 4 C) durante 10 min. Las clulas
se lavaron y se suspendieron en agua destilada para la medicin del
crecimiento en cubetas (trayectoria de la luz, 1 cm) a 610 nm en un
espectrofotmetro Beckman DU-2 espectrofotmetro a fondo.

Ensayo de amilasa.
La amilasa en el filtrado del cultivo se ensay mediante los mtodos de
Bernfeld (3). La enzima se precipit a partir del filtrado de cultivo con acetona
previamente enfriado para estudiar la estabilidad del pH, estabilidad trmica, y
el pH y la temperatura ptimos de la enzima. El ensayo de amilasa en cada
caso se realiz por triplicado. Una unidad de actividad de dextrinizacin se
expres como la cantidad de enzima requerida para disminuir el color de
almidn-yodo por unidad de 0,05 densidad ptica a 610 nm por minuto, y 1
unidad de actividad de sacarificacin se expres como la cantidad de enzima
requerida para liberar 1 mg de maltosa por minuto.

La produccin de amilasa en matraces agitados.


Produccin de amilasa se midi en agitacin matraces a diversos pHs y
temperaturas y los ptimos fueron los mismos que en matraces estacionarios,
es decir, 50 + 0,5 C y pH 6,9, respectivamente. Cada matraz Erlenmeyer
esterilizado en autoclave, que contiene 50 ml de medio basal, se ajust en un
agitador recproco a 50 + 0,5 C, y a intervalos de 6 h se registr la actividad
de la amilasa en el filtrado y el crecimiento de la bacteria.

Produccin de amilasa en diversos medios.


(i) medios complejo.
Se utilizaron diversos medios complejos que contienen diferentes
concentraciones de extracto de carne, extracto de levadura, licor de maz
macerado, extracto de carne, peptona, y almidn. Los otros constituyentes
fueron los siguientes: (NH4) 2HPO4, 0,4%; KCl, 0,1%; MgSO4. 7H2O, 0,05%; y
almidn, 0,3%.

(ii) medios semisintticos y sintticos.


Un medio semisinttico que contiene 0,4% de peptona, 0,4% (NH4) 2HP04
0,4% NH4H2PO4, 0,1% de KCl, 0,05% MgSO4. 7h20, y 0,3% de almidn se
encontr que era la mejor y fue utilizado en el presente estudio. Crecimiento y
produccin de amilasa fueron inferiores en el sinttico que en el medio
semisinttico, pero medio sinttico de la siguiente composicin dieron mayor
actividad de la amilasa: (NH4) 2HP04, 0,4%; NH4H2PO4, 0,4%; almidn, 0,3%,
MgSO4 7h20, 0,05%; KCl, 0,1%; isoleucina, 0,001%; cistena, 0,001%;
fenilalanina, 0.001; cido asprtico, 0,05%; y CaCl2 .2H20, 0,001%.

Efecto de la fuente de carbono y nitrgeno en la produccin de


amilasa.
El efecto de diferentes fuentes de carbono se estudi en el medio basal. Se
utilizaron tres concentraciones (1,0, 2,0, y 4,0%) cada uno de los
monosacridos, disacridos, trisacridos y polisacridos. A excepcin de los
polisacridos, las soluciones de sacridos se esterilizaron por filtracin de
membrana (tamao de poro, 0,45, um; dimetro, 25 mm; Millipore Corp.),
mientras que se esterilizaron en autoclave polisacridos. Todos estos sacridos

se aadieron aspticamente al medio de cultivo para dar la concentracin


deseada. Los efectos de las diferentes fuentes de nitrgeno inorgnico y
concentraciones fueron estudiados en el medio basal. Las fuentes de nitrgeno
inorgnico fueron (NH4) 2S04, (NH4) 2 HPO4, NH4H2PO4, y NH4NO3. Las
fuentes de nitrgeno orgnico eran aminocidos y nucletidos.

Efecto de las sales de sodio y potasio, detergentes, e iones


metlicos.
Se estudiaron varias sales orgnicas de sodio y de potasio por sus efectos
sobre la sntesis y secrecin de amilasas extracelulares. El efecto de un nmero
de cationes divalentes, tales como Ca2, Sr2, Mg2 +, Mn2, Ba2, Zn2, y Cu2 + y
cationes trivalentes tales como Fe3 +, + SB3, se estudiaron Au3 +. Un control
sin la adicin de iones metlicos extraos se mantuvo para la comparacin.

Produccin de amilasa en diversos medios.


Se formul un medio complejo para la produccin mxima de amilasa
extracelular por un termfilo B. stearothermophilus cepa. Entre los diversos
medios complejas juzgados por buen rendimiento amilasa, licor de maz
macerado se encontr que era la mejor, seguido de extracto de carne y
extracto de carne. Crecimiento de extracto de levadura fue comparable al
crecimiento de extracto de carne o de extracto de carne, pero la produccin de
amilasa fue menor. De las diversas concentraciones de licor de maz macerado
y peptona intentado, 0,4% de cada uno se encontr que era ptima para la
produccin de amilasa, pero en ausencia de almidn muy poco amilasa fue
producido (Fig. 1). Sin embargo, el crecimiento de la bacteria en presencia o
ausencia de almidn era buena (Fig. 2).
Cuando se utilizaron diversos medios de comunicacin complejas, el pH del
caldo de cultivo vari entre 6,5 y 7,2 durante el curso de la cultivacin. Desde
licor de maz fermentado contiene muchos ingredientes qumicos, que era
difcil determinar cul de los indujo la produccin de amilasa. Por lo tanto, fue
necesario sustituir licor de maz fermentado con material sinttico de
composicin qumica conocida. En el medio semisinttico, se observ una fase
de retardo prolongada y el crecimiento, as como la produccin de amilasa era
comparativamente ms bajos (Fig. 3).
En el presente estudio, la produccin mxima de amilasa se observ durante la
fase de crecimiento estacionario y postexponential. En B. subtilis var.
amyloliquefaciens 3053 (1), se ha informado de que la composicin y la
concentracin de los medios afectados en gran medida el crecimiento y la
sntesis de amilasas. Un nmero de fuentes de carbono y nitrgeno se han
examinado para la produccin de amilasa en B. subtilis (6). Como en el
presente estudio (Fig. 1), el aumento de la concentracin de almidn estimul
la formacin de amilasa en Bacillus sp. (16) y en Aspergillus niger (2). Fosfato
diamnico de hidrgeno sirve como una buena fuente de nitrgeno y fosfato en

el presente estudio. Sacudiendo tuvieron poco efecto sobre el crecimiento y la


produccin de amilasa.
Efecto de KCI y sales orgnicas de sodio y potasio.
Debido a que el crecimiento y la produccin de amilasa en el medio sinttico
eran comparativamente ms bajos, se utiliz el medio semisinttico para
estudiar los efectos de diversas sales y detergentes sobre la produccin de
amilasa. La adicin de KCI (0,1%) al medio semisinttico aumento de la
produccin. El papel de K + y Na + sobre la liberacin de amilasa se inform en
B. cereus (14), levaduras (12), y A. oryzae (11). De las diversas sales orgnicas
de sodio y potasio, citrato de potasio, succinato de potasio, fumarato de
potasio, malato de sodio, glutamato de sodio, y aspartato de sodio fueron
encontrados para ser mejor que los dems.
El efecto de los detergentes sobre la liberacin de amilasa en el fluido
extracelular se estudi en el medio semisinttico de una manera similar. En
levaduras, la adicin de detergentes aument la produccin de amilasa
extracelular debido a la liberacin de amilasa pared unida a clula en el fluido
extracelular (12). Sin embargo, en los presentes estudios, con medio
semisinttico que contiene Tween 80 y Triton X-100, el crecimiento se
increment pero la produccin de amilasa fue suprimida.

Efecto de fuentes de carbono y nitrgeno.


La sntesis de la amilasa fue suprimida en gran medida cuando la bacteria se
cultiva bien en glucosa, maltosa, o sacarosa (Tabla 1), pero la produccin de
amilasa era buena cuando la bacteria se cultiva en almidn o otros
polisacridos (Tabla 2). El crecimiento celular no se vio afectada en presencia
de monosacridos. Ensley (7) inform que la produccin tasa de crecimiento
ms lento y amilasa se produjo cuando la fructosa era la fuente de carbono
para Clostridium acetobutylicum. El nivel de crecimiento resultante de la
utilizacin de diversos hidratos de carbono no afect a la formacin de la
amilasa. El nivel de crecimiento fue comparable a la causada por la glucosa y
maltosa. Sin embargo, la produccin de amilasa se redujo en gran medida
cuando se utilizan estas fuentes de carbono. En el presente estudio maltosa
reprimido produccin de amilasa, pero en Pseudomonas Burtonii (7) inducida
maltosa produccin de amilasa. Afunasyeva et al. (1) observado represin de la
sntesis de amilasa por la glucosa, maltosa, sacarosa, y un-metil glucosa en
Endomycopsis fibuligera; esta represin fue revertida por el AMP cclico.
Contrariamente a la mayora de los estudios sobre la sntesis de amilasa por
bacterias, Tobey y Yosten (17) observada en B. thuringiensis que el almidn no
era necesario para la produccin de amilasa y que la glucosa o glicerol sirve
como una buena fuente. Otros polisacridos, tales como glucgeno y dextrina
produccin de amilasa tambin inducida (Tabla 2). Ninguno de los
oligosacridos excepto maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa,

maltohexaosa y se encontraron para inducir la sntesis de amilasa. Resultados


similares se han obtenido con B. licheniformis (13).
De los cuatro compuestos nitrogenados inorgnicos utilizados, hidrgeno
fosfato de dihidrgeno y amonio fosfato diamnico se encontraron a ser mejor
que el sulfato de amonio y nitrato de amonio. Para B. cereus BQ 10-Si Spo (14),
se inform de que el medio que contiene nicamente sulfato de amonio o
acetato de amonio no producir amilasa. De los diversos aminocidos
estudiados, slo siete (Tabla 3) tena algn efecto sobre la produccin de
amilasa. La cistena, isoleucina fenilalanina, cido asprtico y se encontr que
eran indispensables para la produccin de amilasa. Resultados similares se han
obtenido por otros trabajadores (5). De los nucletidos, solamente ATP tuvo un
ligero efecto estimulante sobre la produccin de amilasa.
De los cationes divalentes y trivalentes ensayaron para determinar su efecto
sobre la sntesis o secrecin, o ambos, de la amilasa, Ca- Sr2 +, Mg2 +, y la
produccin de amilasa ligeramente inducida Ba2 +, pero Ag +, Cu2 +, Fe3 ",
SB3 +, As3", y Au3 produccin de amilasa inhibido. Sin embargo, Zn2 + y Mn2
+ no tuvieron ningn efecto sobre el crecimiento o la produccin de amilasa
(datos no mostrados). Desde el filtrado de cultivo, amilasa se precipit con
acetona previamente enfriada, y otros estudios sobre la estabilidad de pH y la
temperatura se realiza con este polvo de enzima despus de fraccionamiento
con sulfato de amonio (0,45 hasta 0,60 saturacin). Se encontr que la amilasa
fue bastante activa a 80 C. La estabilidad del pH se estudi a 4 C para
evitar la contaminacin por los microorganismos transportados por el aire. Se
encontr que la enzima amilasa fue estable en un amplio intervalo de pH (6 a
11) (Fig. 4).
Ca'2 (20 mM) se encontr para proteger la enzima de la inactivacin cuando se
expone a diversas temperaturas altas (Fig. 5). As, la presente enzima podra
ser de mejor uso en la licuefaccin de suspensiones de almidn de espesor a
80 C durante un amplio rango de pH.