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PRACTICA N° 02

INTRODUCCIÓN
Desde los inicios de la microscopia, los investigadores vienen desarrollando métodos cada vez más sensibles,
eficaces y con mejor resolución. Al principio ellos debieron enfrentarse a los problemas de aberraciones
ópticas, imágenes borrosas y pobre desarrollo de lentes, los cuales se mantuvieron hasta mediado del siglo
XIX que aparecieron los lentes objetivos que reducían la aberración cromática con una apertura numérica
entre 0.65 y 1.25. Estos avances se iniciaron con los reportes sobre los métodos de iluminación que propuso
el profesor August Kölher, en 1893, y que sentaron las bases de la microfotografía moderna. En las últimas
décadas se ha incrementado la aplicación de la microscopía óptica en los laboratorios de investigación de una
amplia variedad de disciplinas como la biología celular y molecular, microbiología, inmunología y virología. El
rápido desarrollo de diferentes métodos como los de fluorescencia, contraste de fases, confocal y de campo
oscuro entre otros, que sumados a los avances en la digitalización y análisis de imágenes, han permitido a los
microscopistas obtener resultados rápidos, cuantificables y confiables de una gran variedad de especimenes
biológicos. Al margen de estos avances, las bases del funcionamiento de los distintos tipos de microscopios
ópticos siguen siendo los mismos que se presentan en esta práctica y con los cuales el estudiante deberá
familiarizarse.
BREVE HISTORIA DEL MICROSCOPIO
Tres eminentes holandeses, Antón Van Leeuwenhoek, Hans y Zaccharias Janssen, fabricantes de lentes,
contribuyeron al desarrollo de la microscopía. El museo de Middleburg, en Holanda, conserva uno de los
primeros microscopios conocidos, probablemente fabricado por uno de los hermanos Janssen. Estos
aparatos, eran extremadamente simples, por lo que solo permitían el examen de cuerpos opacos. A fines del
siglo XVII el italiano Camping construyó un microscopio que hizo posible la observación de preparaciones
transparentes. Las imágenes obtenidas por estos microscopios eran muy deficientes. En Inglaterra el
científico Robert Hooke, trató de construir lentes más eficaces, pero sus resultados no fueron satisfactorios;
sin embargo, sus observaciones contribuyeron al establecimiento de la microscopía como ciencia. Mientras,
en el siglo XVII Jonh Marshall y otros fabricantes de microscopios, perfeccionaron mucho el diseño mecánico,
pero no la calidad de los lentes. Pero fue, durante el siglo XIX, que se realizaron grandes progresos en los
sistemas ópticos y en la microscopía en general; aún así, fue imposible evitar la dispersión de la luz en sus
colores componentes en la fabricación de microscopios. Este fenómeno conocido como aberración cromática,
producía una imagen borrosa y coloreada. Las primeras lentes adecuadamente corregidas para microscopios,
denominadas acromáticas, hicieron su aparición alrededor de 1830; pero la aberración esférica, también
producía una imagen desenfocada. En 1886, Ernot Abbe y Caol Zeiss en Alemania fabricaron unas lentes
apocromáticas que corrigieron ambas aberraciones. A finales del siglo XIX, los microscopios comenzaron a
adquirir la forma que tienen actualmente, con los aportes de Khöler. Desde el año 1900, los microscopios se
han modificado poco en sus principios fundamentales, pero mucho en sus detalles. Estos perfeccionamientos
incluyen, la incorporación de varios objetivos, cada uno de aumento diferente y roscados a un tambor giratorio
o revolver. En 1935, Frizt Zenique inventó la técnica del contraste de fase que hace posible la observación de
especimenes antes invisibles. El microscopio electrónico, desarrollado en vísperas de la segunda guerra
mundial, ha sido de gran utilidad para el estudio de moléculas químicas, virus y organelas celulares. Existe un
tipo de microscopio electrónico, llamado de barrido, que ha adquirido una extraordinaria utilidad, ya que ofrece
representaciones tridimensionales muy reales de las células y las estructuras celulares.
1.1 OBJETIVOS:
1.1.1 OBJETIVO GENERAL:
• Valorar la importancia del microscopio como instrumento básico para el estudio e investigación.
1.1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS:
• Identificar las diferentes partes que constituyen el microscopio y reconocer las funciones de cada una de
ellas
• Adquirir habilidad en el uso y manejo correcto del microscopio, siguiendo las indicaciones de las guías de
laboratorio.
1.2 MATERIALES
Microscopios
Porta-objetos y cubre-objetos
Papel limpia lentes
Goteros
Flores con polen
1.3 CLASES DE MICROSCOPIOS:
Existen dos tipos de microscopios: simples y compuestos

d. 12. objetivos de grandes aumentos 40x. se calcula multiplicando el número de aumento del objetivo con el cual se está trabajando por el número de aumento del ocular que se está utilizando. 45x. hacia atrás. Este último tipo de microscopio está formado por una parte mecánica y una parte óptica. cuando es natural (solar) o procede de un foco luminoso situado fuera del microscopio. presenta movimiento giratorio para facilitar el cambio de un objetivo a otro. Su finalidad es aumentar la imagen dada por el objetivo y eventualmente corregir algunos defectos de la misma.5x. Tubo del Ocular: Está colocado en la parte superior del microscopio. Ocular: Están colocados en la parte superior del tubo ocular. circular o rectangular. En algunos microscopios el tubo del ocular es inclinado y se mantiene fijo.Microscopios simples : Consta de un solo sistema de lente Microscopios compuestos: Constan de dos (2) sistemas de lentes: el objetivo y el ocular. 6x. e. Aparato de iluminación: Está conformado por la fuente de luz. El diafragma tiene una palanquita que al moverla hacia delante o hacia atrás agranda o achica el orificio central. Fuente de luz: Puede ser natural o artificial. con ayuda de una cremallera sobre la columna. La mayoría de los microscopios tienen tres o cuatro objetivos. En algunos microscopios la columna es Móvil c. diafragma. dejando pasar mayor o menor cantidad de luz respectivamente. Posee dos tornillos que permiten movimientos horizontales (hacia adelante. es el apoyo de las demás piezas del microscopio. Este aceite también reduce o suprime por completo la refracción de los rayos de luz provenientes de la fuente luminosa. 5x. Platina: Es una placa que puede ser cuadrada. 10x. 4x.1 Tornillo Macrométrico: Acerca o aleja rápidamente el objetivo del preparado a observar. cuya función es sujetar y mover la placa que se va a estudiar. los más usados son: Objetivos de pequeños aumentos 3. Reciben el nombre de objetivos porque son los lentes que están más cerca del objeto. sostiene la platina y el condensador y de ella se agarrará el microscopio cuando se traslada durante los trabajos. su función es lograr un enfoque más o menos claro o aproximado del objeto. su función es darle nitidez al enfoque. el diafragma. El pie debe ser sólido y pesado para asegurar su estabilidad. d. Entre el objetivo y el objeto se produce una pérdida de luz por reflexión que se corrige adicionando al preparado unas gotas de aceite de cedro (aceite de inmersión) cuyo índice de refracción 1. con un orificio central que permite el paso de la luz a través de ella. Durante la observación y enfoque este tornillo debe estarse moviendo permanentemente. oculares y el aparato de iluminación (espejo. permite desplazamientos muy finos de la platina o del tubo del ocular. casi imperceptiblemente. donde están acoplados los oculares.3x. un espejo recoge la luz del medio y la refleja a través del objeto y del sistema de lentes. f. 8x y 10x. b. condensador y filtros). e. Parte óptica: Está integrada por los objetivos. Esta graduación es importante cuando se trabaja con objetivos . hacia la derecha y hacia la izquierda) del portaobjeto. c. 95x y 100x. Cuando la platina carece del anterior dispositivo. a.5x. 6. 9. El aumento de la imagen de un objeto observado a través de un microscopio. que pueden tener movimiento vertical. Reciben dicho nombre porque son las lentes que se encuentran más cerca del ojo. en este caso se mueve la platina. 15x. La luz artificial la constituye generalmente un bombillo ubicado en el microscopio y conectado a un circuito eléctrico de bajo voltaje. 20x y 25x. Estos elementos son los que permiten la iluminación. El microscopio compuesto es un instrumento que aumenta considerablemente la imagen de los objetivos que en él se observan.5x. Diafragma: Está ubicado entre la fuente de luz y el condensador. su función es regular la intensidad de luz que atraviesa el objeto. Existe un tornillo manual que permite guardar la altura del condensador. Está formado por dos sistemas de lentes dispuestos de un cilindro. Parte Mecánica: a. Objetivo: Es la pieza más importante del microscopio. es próximo al cristal. 5x. Entre las variedades de éste microscopio encontramos el electrónico y el fotónico u óptico. inmediatamente debajo de la platina. el condensador y los filtros. Mecanismos de Movimiento: Está integrado por el tornillo macrométrico y el micrométrico 9. Revólver o Disco Giratorio: Está debajo del tubo ocular donde están acoplados los objetivos.2 Tornillo Micrométrico: Acerca o aleja el objetivo del preparado. b. Las lentes de inmersión se emplean con aceite de inmersión para conectar la lente frontal (lente inferior del objetivo) al porta-objeto. 50x y objetivos de inmersión 90x. Su función es sostener las placas con los preparados biológicos que se van observar f.515. g. Pie o Base: Generalmente en forma de herradura o rectangular. Condensador: Es un elemento cónico que posee un sistema de dos lentes convergentes que recogen o concretan los rayos luminosos para enviarlos al objetivo por el agujero de la platina. ampliación y la visión aumentada del objetivo. Hay oculares de 3. Las lentes de los objetivos son de aumentos diversos. Columna o Brazo: Este elemento relaciona el tubo del microscopio con el pie. lleva dos soportes para fijar las placas llamadas ganchos o uñas. Carro: es un dispositivo ubicado sobre la platina. Ellos se acoplan mediante roscas estándar al revólver y pueden ser cambiados de posición con sólo rotarlos. pero lentamente.

para hacerlas más duraderas debe cerrarse herméticamente los bordes del cubre objeto. g. Pueden ser convexas o cóncavas en ambas superficies. ya que en la medida que se trabaja con éstos objetivos el condensador debe subirse. la duración de ésta preparación no es indefinida.Lentes Negativas: Hacen divergir los rayos de luz. luego se deposita el objeto sobre la superficie y se deja endurecer la goma. amarillo. pueden ser de color azul. verde. el componente básico es incoloro. la coloración vital o de tejidos vivos y la histoquímica. Otro colorante es la orceína que se extrae de líquenes.000 Km/s en el vacío). la luz blanca se compone de muchos rayos de luz. pues un preparado grueso solo nos permite observar una mancha negra. anaranjado. la mayoría de las lentes modernas están diseñadas para el uso de luz monocromática verde. se hacen para observar objetos secos. Las lentes son de dos tipos: positivas y negativas. 100x). La luz está formada por pequeños corpúsculos que salen de un foco luminoso en forma de ondas. por consiguiente. en caso de que suceda seque cuidadosamente el líquido sobrante usando papel absorbente o papel toalla. Cada color corresponde a una longitud de onda determinada. básicos y neutros. 1. sin formar ninguna imagen real.6 PREPARACIONES MICROSCÓPICAS: Debemos tener en cuenta que a través del microscopio solamente se pueden observar objetos que dejan pasar rayos de luz. El líquido no debe rebosar los bordes del cubre-objeto. Un buen método es guardarlos en alcohol y antes de utilizarlos secarlos con un paño limpio y libre de grasa. Se clasifican en ácidos.7 COLORANTES : Los colorantes son sales compuestas por un ácido y una base. se coloca el cubreobjeto sobre el porta.5 LENTES: Las lentes son el componente más importante del microscopio. amarillo o verde. evitando la formación de burbujas. Una vez endurecida la goma se pone un poco de bálsamo de Canadá sobre el objeto y se coloca el cubreobjeto. Lentes Positivas: Hacen converger los rayos de luz. Los filtros son elementos de cuarzo o de vidrio. en la cual se utilizan las reacciones de los colores para hacer visible los elementos estructurales de las células y de los tejidos. La preparación queda así lista para la observación. por esta razón el preparado debe ser lo más delgado y transparente posible. azul y violeta. El brillo de la luz es proporcional a la altura o amplitud de la onda y su color depende de la longitud de ésta. se fabrican de vidrio u otros materiales transparentes. El carmín es producido por la conchinilla (Coccus cacti). es el componente ácido. Lo contrario sucede con los colorantes básicos. Los detalles solo se observan si la preparación es lo suficientemente delgada para que sea transparente con la luz que recibe. Ellos interceptan el haz de rayos luminosos antes de entrar al condensador. esto se hace con el objeto de seleccionar un tipo de luz determinada para una experiencia dada. La luz blanca está constituida por una gama de colores del espectro visible. Las preparaciones acuosas son las más simples y fáciles usadas para examinar cualquier objeto fluido. Si bien se utilizan casi solo microscopios de luz blanca. como agua de estanque o sangre. 10x). En los colorantes ácidos el grupo cromóforo.de gran aumento (40x. Los bordes se pueden cerrar con vaselina o esmalte. 1. La mayoría de los colorantes son sintéticos. la cual se extiende sobre el porta. La hematoxilina y el carmín son los colorantes naturales más importantes para la tinción de tejidos. es decir. 1. Los colorantes neutros tienen coloreado el componente ácido y el básico. aunque se emplean todavía algunos naturales. Las preparaciones microscópicas pueden ser acuosas o en seco. forme con las dos láminas un ángulo de 45 grados y luego deje caer suavemente la laminilla cubreobjeto sobre el preparado. Se deposita una gotita del líquido que se desea observar en el centro del porta-objeto. Un cierre más hermético se consigue cerrando con bálsamo de Canadá (Euparal). el palo Campeche. tales como alas de insectos. Las preparaciones en seco como lo índica su nombre. todos vibrando con diferentes longitudes de onda La luz de una sola longitud de onda se llama monocromática. los concentra para formar una imagen real. 1. según la parte de los mismos que imparta el color. Una reacción . La hematoxilina se extrae de la madera de un árbol de México. el que imparte el color. Aquí se utiliza goma arábiga. planas en una cara o tener cualquier combinación de éstas dos formas en su superficie. Los cubre-objetos deben limpiarse con mucho cuidado porque son frágiles. Estas preparaciones son de corta duración porque se secan rápidamente. Para realizar preparaciones microscópicas los porta y cubre-objetos deben limpiarse antes de usarse. Existen tres técnicas de tinción de uso general: la coloración seca o de tejidos muertos. Lo contrario sucede cuando se trabaja con objetivos de menor aumento (4x. Filtros: Entre la fuente de luz y el condensador de algunos microscopios existe un portafiltros en el cual se puede colocar filtros a voluntad del observador. .4 LA LUZ: La luz es una forma de energía transportada continuamente por el espacio a velocidades muy elevadas (330.éstos colores son: rojo.

debe mantenerse siempre cubierto con una funda. si el objeto está bien centrado aparecerá su imagen en el campo visual. Esquematice sus observaciones 2. ya que disuelve el cemento utilizado en la fabricación de los lentes. Use siempre cubre-objetos cuando observe en agua u otros líquidos 6. ubique el cubre-objetos y observe con menor y mayor aumento. 3.9 RECOMENDACIONES QUE DEBEN OBSERVARSE PARA EL BUEN USO Y CUIDADO DEL MICROSCOPIO: 1. La limpieza final es más efectiva usando un poco de agua destilada. Mueva el carro en diferentes direcciones para seleccionar el mejor campo posible. Haga un esquema de lo observado. Mire por el ocular. o sea que quede alineado con los oculares. 4. ya que el sudor las daña. 4. . Si el campo visual no queda uniformemente iluminado. Gire el revólver hasta que el objetivo de menor aumento quede en posición de trabajo. Si su Microscopio presenta algún defecto.2 Dejar el microscopio con el objetivo de menor aumento en la posición de enfoque y la platina en su máxima posición superior. Dele nitidez al enfoque accionando el tornillo micrométrico. Los sedimentos de grasa. Cuando no se esté usando el microscopio. 6. 9.0 EJERCICIO DE APLICACIÓN: Con las siguientes prácticas se ejercitará inicialmente al estudiante en el uso y manejo del microscopio. el aceite de inmersión y los residuos de éstos productos deben eliminarse inmediatamente con un poco de disolvente como éter o xilol. Puede controlar la intensidad de la luz. Este enfoque se refina accionando el tornillo micrométrico. 2 y 3. tenga en cuenta lo siguiente: 9. Mantenga las lentes limpias. Observación del cabello: Coloca un cabello entre lámina y laminilla cubreobjetos a diferentes aumentos. 3. 9. Usted sentirá un golpecito (como un clic) cuando el objetivo llegue a su posición de uso. Una vez lograda una correcta iluminación coloque el preparado sobre la platina. según sea el modelo del microscopio. 2. 9. No toque las lentes con los dedos. en la que se emplea el reactivo incoloro de Schiff para teñir el DNA en tonos rojizos purpúreos 1. 5. 1. debemos darle el mejor cuido posible. por lo tanto. Cuando el microscopio es monocular debe acostumbrarse a mantener también abierto el ojo que no utilice en la observación microscópica. mediante el diafragma o el regulador de la intensidad de la luz de la bombilla. Para hacer un enfoque con mayor aumento debe seguir las indicaciones anteriores. Conecte el cable del microscopio al transformador y luego accione el botón de éste para que encienda la bombilla. Si su microscopio es eléctrico siga los pasos 1.1 Antes de apagar la fuente de luz. No permita que líquidos.3 Desenchufar el microscopio y colocarle la funda protectora. con ayuda de un gotero ponga una gota de agua. Mire a través del ocular o gire el espejo hacia la fuente de luz hasta obtener un máximo de iluminación. 1. especialmente ácidos o alcoholes. Esta operación se hace llegar hasta un punto de parada (tope). 2. esto le evita cansancio. Una vez obtenido el enfoque correcto con menor aumento. Enchufe el cable del transformador a la fuente de energía.histoquímica muy conocida es la de Feulgen. llevar el dispositivo que regula la intensidad luminosa hasta O (cero). Granos de polen: Coloque granos de polen del estigma de una flor en un porta-objetos. 4. Las lentes del microscopio cuestan casi tanto como todas las demás partes juntas. mueva el revólver y coloque en posición de trabajo el objetivo de mayor aumento. consulte con su profesor. Localice siempre el objeto con el objetivo de menor aumento 7. Lleve el condensador a su posición más alta. se pongan en contacto con su microscopio. baje lentamente el condensador hasta obtener una iluminación uniforme. 8. Accione el tornillo macrométrico hasta que el objetivo de menor aumento descienda lo máximo posible o hasta que la mesa ascienda lo máximo posible. Nunca limpie las lentes con otra cosa que no sea papel especial para lentes. El microscopio es un instrumento costoso y de precisión. 2. Nunca se debe emplear alcohol. Al finalizar sus actividades de laboratorio. No trate de arreglarlo Usted. con muchas partes delicadas.8 MANEJO DEL MICROSCOPIO: Antes de iniciar una observación microscópica se debe iluminar completamente el campo visual. Si su microscopio está bien calibrado debe aparecer enfocada la imagen del objeto. Mirando a través del ocular mueva suavemente el tornillo macrométrico. para lo cual se procede de la siguiente manera: 1. 5. asegúrese que el objeto a observar esté centrado justo debajo del objetivo de menor aumento. Mirando de lado.

2. e investigue las funciones de cada una de ellas. Describa las principales técnicas de preparación de muestras empleadas en microscopía óptica. ¿Qué son objetivos de inmersión? 5. ¿Qué importancia tiene utilizar la parte plana del espejo? 8. cuando usamos el objetivo de inmersión? Cuando se utiliza un microscopio de espejo: 6.0 CUESTIONARIO: 1. ¿Qué son objetivos secos? 4. Investigue sobre el funcionamiento de los diferentes microscopios electrónicos y establezca diferencias entre ellos. ¿Qué importancia tiene utilizar la parte cóncava del espejo? 7. . ¿Qué otros tipos de microscopios se utilizan en la investigación biológica? 3. 10.3. ¿Qué son los colores complementarios y que utilidad tendrían en microscopía óptica. Para qué se utiliza el aceite de cedro. Coloque los nombres a las diferentes partes del microscopio numeradas en la Fig. 9.