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Clase 7

Purificación de proteínas
Veamos entonces purificación de proteínas. Hay técnicas Cromatográficas, Técnicas Electroforéticas,
Técnicas de diálisis, Técnicas de precipitación (que es lo que estamos comenzando ahora), Criterios de
Purificación, que son: a) Pureza y Rendimiento, y b) Actividad Total y Actividad Específica. Y de eso
vamos a hablar ahora.
¿Para qué les puede servir a ustedes la purificación de proteínas, si un médico va a comprar todo en polvo,
en una caja…no tiene que purificar nada? Ésta es mi opinión: para leer papers. Porque cuando lean un
artículo científico y estén trabajando con una proteína (sobretodo si es una proteína nueva), va a aparecer
en metodologías cómo se purificó esa proteína, y ustedes tienen que tener los criterios suficientes para
seguir esa metodología y aceptarla o rechazarla o criticarla. Entonces, principalmente, para seguir la
literatura científica de proteínas que son emergentes o de algún artículo clásico en el cual se indique cómo
se purificó el ¿?. Y ¿para qué también les sirve? Es un pretexto para poner en práctica todo lo que hemos
aprendido desde acá hacia atrás.
Veamos la separación de proteínas. A ver, aquí hay dos elementos que son importantes cuando uno separa
una proteína, ¿y de qué la estamos separando? Imagínense, tenemos una célula, las células tienen miles de
proteínas, y miles de tipos de moléculas, que no son proteínas, no todas son proteínas. Lo que nosotros nos
proponemos es aislar UNA proteína, una sola (y probablemente esté en muy baja concentración) para
hacer estudios de funcionalidad y saber esa proteína en qué tipo de proceso biológico está. Aislar esa
proteína tiene un desafío doble: 1) que ojalá pueda aislar mucha proteína, de tal manera que la pueda
manipular fácilmente, o sea hablar de mg. y g. de proteínas purificadas para hacer estudios con esa
proteína, y 2) ojalá que esa proteína que yo aíslo (y que al final la veo en una consistencia que puede ser el
polvo, por ejemplo), esa proteína, tenga la posibilidad, que tenga el atributo de ser pura, es decir, que no
tenga contaminantes. No me sirve una proteína que esté muy contaminada para un estudio de
funcionalidad. Entonces yo necesito criterios de pureza (que es lo último que dije) y de rendimiento
(que es lo primero que dije). El rendimiento tiene que ver con cuánto estoy obteniendo, y la pureza tiene
que ver con qué estoy obteniendo. Entonces todas las técnicas que vamos a ver ahora siempre tienen un
compromiso entre Rendimiento y Pureza, ¿de acuerdo? Y a veces uno para obtener mucho rendimiento, o
sea para obtener gramos de una proteína, necesito sacrificar la pureza de la proteína. Y otras veces para
obtener mucha pureza, necesito sacrificar el rendimiento porque supone hacerla pasar a través líneas
sucesivas de purificación, que hacen que yo vaya perdiendo proteína en el camino, pero me estoy
asegurando que esa proteína va a terminar siendo pura. Por lo tanto, son dos conceptos que a veces se
contraponen y por lo tanto la purificación de la proteína supone un compromiso entre purificación y
rendimiento. Entonces, vamos a ver distintas técnicas, y muchas de estas técnicas se utilizan una a
continuación de la otra, de tal manera que me asegure que el producto está puro. Pero probablemente hay
un orden obligado de algunas técnicas y por ejemplo una de las técnicas que primero se aplica en un
compuesto, en un extracto del cual yo quiero purificar una proteína es la Precipitación Salina y les voy a
explicar por qué.
Precipitación Salina

para que la sal se interponga en la interacción entre las proteínas. [pregunta ké es solubilidad y la maca responde bien] La solubilidad por lo tanto depende de la pareja solvente-soluto. y es una enzima proteolítica. sacar la pulpa. lo que uno hace es aplicar sal. para variar la solubilidad de las proteínas. Una de las primera técnicas que se ocupa (y en el caso de la alcayota que se ocupaba). Tendría yo que homogeneizar el tejido vegetal de la alcayota. esta concentración de sal es la máxima [q disuelve]. había una enzima que rompía proteína (que era la enzima proteolítica de la alcayota). Es una enzima ¿ya?. es decir. se abrazan. Y veamos la proteína B en este gráfico: Fig. todo feliz. tengo la cochina’ no más…¿qué hago? Filtro. sacamos el juguito a la alcayota. Si es intracelular hay que romper toda la célula para que la enzima salga. la proteína A y C van a responder de manera distinta. suceden dos cosas. sí.Solubilización por salado.Precipitación por salado. por eso hago el alcance. Por ejemplo a ésta concentración. hay dos efectos sobre la solubilidad de una proteína: . 1. ésta es extracelular y es fácil. Aquí tenemos que tomar una decisión. Colamos. ¿qué significa que sean poco soluble? ¿cómo están entre sí? ¿se quieren o se odian? Se quieren. Porque significa que si yo agrego una oncentración de sal determinada va a haber proteínas más solubles que otras. Así que. así que les diré que purifiqué una vez la proteína de la alcayota. Recientemente se está hablando que hay RNA que tienen actividad enzimática. . y había que purificarla. hidroliza el enlace peptídico. las enzimas son proteínas. de tal manera que me asegure que están todos los citoplasmas expuestos digamos y la proteína por tanto la puedo obtener en el exudado de la alcayota. ¿Qué hacemos? Tengo pedazos de alcayota.¿Qué es lo que hay que hacer primero si yo quiero obtener una proteína? Vamos a poner un ejemplo verídico del que no me debo avergonzar porque forma parte de mi historia personal. salting-out = precipitación por salado) agrego más sal. hasta aquí no más con esa concentración de sal. porque voy a llegar a un máximo de solubilidad con la proteína B. la mayoría de las enzimas son proteínas. de acuerdo. Y esto es solubilidad versus concentración de sal. Sacamos el jugo de la alcayota. y por lo tanto no interactúan tanto con el agua. ¿la enzima es intracelular o extracelular? Porque si es extracelular. Y después tengo un jugo que yo supongo que es relativamente “puro”. pero cuando (y a esto se le llama salting-in =solubilización por saldo [cuando la curva sube] y a éste [cuando la curva baja]. Ahora. la proteína B. y ESE es el secreto para purificar. capaz de romper proteínas. necesito agregar sal. Si son hidrofóbicas están juntas porque los demás las rechazan ¿cierto? Si son hidrofílicas están juntas porque tienen afinidad mutua. El problema es cuando agrego más sal. Entonces. Cuando se agrega una sal. entonces las proteínas se sienten rechazadas y precipitan. diríamos que tienen poca solubilidad. ¿Por qué? ¿De qué modo aumenta? Primero. esto es espicífico para una proteína. vienen de poco soluble. Y hasta aquí no más disuelve la proteína del agua. Y cuando agregamos sal. Exacto. Primero. pero realmente. es decir. ¿Qué harían? Romper la alcayota ¿cierto?. así que ya tenemos un primer problema. y como la sal es soluble. ¿por qué empiezan a precipitar las proteínas? [un niño responde algo de que le kitan el lugar…disminuyen las interacciones con las proteínas]. no hay ningún problema en sacarle el juguito. Primero aumenta la solubilidad y después disminuye la solubilidad. Y lo que pasa es que para interferir con la afinidad que hay entre moléculas de las proteínas que hacen que se vayan al fondo y no interactúen con el agua. la soluble va a ser la C y las insolubles la B y la . filtramos. de tal manera que las cargas de la proteína interactúen más bien con la sal que con la misma proteína. Entonces. y en general. pensemos. ¿qué debía hacer yo para purificar la enzima de la alcayota? (la enzima proteolítica). Si fuese así. la alcayota.

sonamos con la purificación…es difícil renaturar las proteínas. todos felices. porque si la denatura. Uds. asi que. soluble de C y me quedo con esa proteina.soluto . para interferir con la afinidad que hay entre las moléculas de la proteína. ¿porque empiezan a precipitar estas proteínas? Porque ahí la sal empieza a interactuar con el agua. Entonces la solubilidad aumenta porque al agregar sal. si se poco de la proteina? Ensayo y error. por lo tanto depende de la pareja solvente. a eso se le llama salting in. voy a obtener precipitado de A y B. se dice “Renaturar” ¿Cómo puedo ver una proteína que es microscópica? ¿Cómo puedo saber que la proteína está presente? Viendo la funcionalidad de la proteína. Se hacen los 2 tipos de mediciones proteina total y funcionalidad de la proteina. La sal esta disuelta asi que todo bien para que las proteínas tambien esten disueltas. la proteina A y C van a reaccionar de manera distinta. si es la primera etapa de purificación. ¿Qué es la solubilidad? (una vez más) cantidad máxima de soluto que se puede disolver en un solvente determinado. Por ejemplo a esta concentración X. Ojalá no la denature. y como la sal es soluble. y así me quedo con la proteína C. para saber con cuanta proteína te estas quedando. la soluble va a ser la C y las insolubles van a ser la A y B. y a este proceso que viene salting out. ¿Como veo una proteína que es microscópica? Viendo la funcionalidad de la proteina. [Señala en el gráfico. y precipitación por salado) Entonces salting in le denominamos a esta primera fase. es disminuir las interacciones entre las proteínas. porque voy a llegar a un máximo de solubilidad con la proteina B.A. dirán: “pero si esto no precipita completamente”. necesito agregar sal. para que la sal se interponga en la interacción entre las proteínas. y significa que si yo centrifugo ese compuesto a esa concentración de sal. el primer efecto al haber pocas concentraciones de sal. sino no se si la tengo o no la tengo. va a haber proteinas más solubles que otras. voy a obtener precipitado de Ay B. Eso se llama ensayo biológico. hasta aquí no mas con esta concentración de sal. Y lo mismo podría pasar si agrego poquita sal. no permite que las proteinas lo hagan. y por lo tanto a las proteínas no les queda mas que interactuar entre si. porque la sal compite. por que si lo hace no se puede purificar. y te vas dando cuenta cuando tienes mucha mas pura la proteina que te interesa. . y soluble de C. y cuando agregamos mas sal. pero indudablemente enriquecí la proteina C si agrego sal. así que hasta aquí no mas disuelve la proteína del agua . para saber si la tengo los extractos de la proteína se los inyecto en la pata de una rata. Y lo que pasa es que. que hace que se vayan al fondo y no interactúen con el agua. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteinas y eso fue empleado como una etapa primaria de purificación Ojala no la denature. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteínas y eso es empleado como una etapa primera de purificación de proteínas. cuando la curva C está arriba y las de A y B abajo]Lo que significa que si yo centrifugo este compuesto a esa concentración de sal. tenemos ensayos quimico. El problema es cuando agrego mas sal. Pregunta: ¿como saber hasta que punto agregar sal. voy a tener más soluble la A que la B y la C. hasta aquí no mas esta concentración de sal es la máxima. bioquimicos y biológicos del extracto que estas obteneniendo y saber si la tienes en mayor o menor concentración. por ejemplo si tengo una proteína que es inflamatoria. que la B y C. Y lo mismo pasa si agrego poquita sal. no se van al fondo. bueno obvio ¬¬. Si no precipita completamente es porque es la primera etapa de purificación. voy a obtener mas oluble la A. porque significa que si yo agrego una concentración de sal determinada. No se dice “redenaturar”. porque es difícil renaturar. Ahora esto es especifico para la proteina B. y ese es el secreto para purificar. y veo si se inflama o no midiendo el diámetro de la pata. de tal manera que las cargas de las proteínas interactúen mas bien con la sal que con la misma proteína. es necesario poder observar la proteina de alguna manera. que significaria (solubilidad por salado. se sienten rechazadas y luego precipitan. pero indudablemente enriquecí la proteína C. y al mismo tiempo mides proteína total.

y lo que esta en verde seria la proteína. probablemente esa molécula en ese paso salga y la pierda. y probablemente haya algún factor que sea importante para la actividad de la enzima. Si tengo distintas moléculas. me quede con el precipitado. se debe estar atento a todos los resultados y tratar de interpretarlos. ¿Por qué se retrasa? La molécula comparte su tiempo entre la fase movil y la estacionaria. se aplican otras técnicas más gruesas. hay fuerzas que la une a la glucosa. pero no permita que salgan la proteína. así que puede que suceda y puede que no. no con el soluble. Ahora piensen que tal vez esa proteína tenía una molécula que siempre la acompaña y que la inhibía o bajaba su actividad. Ahora yo tomo los extractos que obtengo acá. que es pura celulosa (que a su vez esta formada por glucosa).Hay otro método de purificación: La diálisis. con butanol. agua con etanol. Y si pongo una membrana de celofán o semipermeable. y a la celulosa (afinidad por el solvente y la fase estacionaria). entonces lo que esta rojo seria la sal. no van migrar de la misma forma. Y la redisuelvo. como ser alcohol) a través del papel y el soluto que estaba en la línea de partida con línea segmentada. tiende a subir el liquido porque se están encaramando las moléculas del solvente sobre la celulosa. B 1-4 para establecer las cargas. la celulosa tiene enlaces glucosidicos. y va a estar contaminada con sal. Pero esa celulosa tiene afinidad por el agua. se va retrasando. Ahí aparece Rf: que es un . a una fase móvil que puede ser una muestra de distintos solventes. que es agua y una componente hidrofobica. Hay un tipo de cromatografía que es la de partición. y el solvente sube por capilaridad. es cuando a través de la solubilidad se separa un soluto que se distribuye en forma diferente en fase sólida como un papel. Entonces si tengo un aminoácido muy polar. que ese constituye el papel en este caso. distintos alcoholes para dar la polaridad apropiada. eso es al azar. Imagínense que precipite la enzima proteolitica de la alcayota. voy a eliminar contaminantes de bajo peso molecular a través de la diálisis. por lo tanto empieza a interactuar con la glucosa y tiende a subir. porque ama al solvente. Consistía en una cámara con un solvente o mezcla de solventes con una polaridad determinada. y que a lo mejor encendía o apagaba la actividad de la enzima y lo voy a perder si era de bajo peso molecular. y los ocupo en técnicas que voy mostrando a continuación. puede ser con componentes mas apolar. va a seguir el frente del solvente como pueda. la glucosa tiene polaridad. se sienta a descansar o avanza con el solvente. Esa era una segunda etapa de purificación. que tienen distinta afinidad relativa entre fase movil y estacionaria. Cuando agregamos una muestra. Entonces este aminoácido no sigue al frente. y si la fase movil. y es bastante gruesa. porque tiene afinidad. al agua que hidrata a la celulosa. va a tener atracción por la fase estacionaria que es glucosa y agua. entonces sube el solvente (no solo es agua. Si son moléculas de alto peso molecular. porque el método anterior que utilice fue precipitación salina. por lo tanto esta hidratada. Cuando uno trabaja con una proteína que no se conoce. y se va afinando con otras mas especificas. ¿Por qué sube por capilaridad? El solvente tiene polaridad. Cuando tienen estos enlaces en la celulosa se establece un polimero. va a tener menor afinidad por el aminoácido. porque estoy introduciendo modificaciones en la muestra. Entonces tengo que tener conciencia del proceso que estoy aplicando. con un diámetro de poro que permita que salgan los iones de sal. entonces a través de difusión simple yo veo que sal empieza a migrar hacia el espacio del compartimento que esta a fuera que es pura agua. y si hay mucha glucosa arriba en al celulosa. pero pasa más tiempo con quien tiene más afinidad. son puros polimeros de enlaces B 1-4. y lo que obtuve. y voy a quedar con la proteína mucho mas pura. esta sube por cuanto tiene afinidad por el solvente. algunas llegaran más lejos y otras se quedaran mas cerca de la línea de partida. y ponían un fase sólida que podía ser un papel.

porque después los rocío con un colorante para aminoácidos ( hay uno que interactúa con el grupo alpha amino. y normalmente lo que obtenemos acá es una absorbancia de 280nm. o sea ultravioleta. Cuando cae un ml estoy midiendo que el tubo de ensayo que tiene 1 ml. qué se yo (O_o)…. primero sale la proteína A. interactúa diferencialmente con las moléculas dependiendo de su son mas grandes o mas chicas. ahí esta mi extracto. una gota que se resuelve en 3 manchas. Esto interactua y dependiendo como interactúa. Pero estas técnicas ya no se usan.coeficiente dado entre lo que migro el soluto. y como en general todas las proteínas tienen aminoácidos aromáticos. son 3 aminoácidos distintos que estoy separando. por ejemplo. y pondré en paralelo los mismos pero comprados y comparo los Rf. pero son técnicas caras. porque tiene muchas variantes tecnológicas. y lo que migro la fase estacionaria. tengo algo medianamente puro. y consiste en que agregan la muestra arriba. o si tiene afinidad por algún anticuerpo. mas hidrofobicas o menos. hice diálisis. Eluir: es salir a través de un colector inferior de la columna. de tal manera que al final puedo diferencialmente aislar la proteina C de la B y la A. Uno va colectando en distintos tubos. al punto que este tan puro que cristalice. voy a ver si se va resolviéndola muestra en distintos componentes. asi como se ve en la figura artificialmente en distintos colores. y ese colorante cuando se rocía sobre el papel marca y establece marquitas de color violeta) y paralelamente sospecho que era por ejemplo aspartico. ¿Pero cómo sé que la proteína A es A y la B es B?. significa que cada color es una proteina distinta. glutámico y fenilalanina. técnicas de cromatografía de alta presión. mas cargadas o menos. mientras mas a la derecha tengo un goteo posterior o mas tardio que hacia la izquierda. entonces van a absorber a 280nm. el método de Bradford. Entonces aquí tenemos el volumen. resuspendi. La concentración total de proteínas la pueden medir a través de métodos químicos o bioquímicos. ya que el DNA absorbe más o menos en el mismo rango. así que esto es genérico. la proteína está relativamente . Ustedes calculan ese Rf y lo pueden utilizar en casos para propositos de comparación. imagínense que purifique a través de precipitación por saldo. pero quiero algo mas puro. gotear. si el que pienso es aspartico. versus volumen de elusión. y migra igual que el aspartico es porque debe serlo. Entonces los identifico.. estas son todas las variantes que pueden tener una cromatografia. y si cristaliza puedo hacer difracción de rayos X para que pueda conocer la estructura. actualmente se usan identificadores para aminoácidos. se hizo diálisis. que se llama ninhidrina. y para lo que hago veo la concentracion de proteina versus volumen de elusión. unos se basan en el enlace peptídico. Entonces agrego la muestra arriba. Entonces aquí agregamos una muestra. y esta es una columna que tiene un relleno que interactúa con la muestra. pero uno podría pensar que a esa altura en que ya se ha precipitado. después sale la proteína B. como el método de Lowry. La cromatografía en columna se ocupa siempre. y si uno migra igual que el otro debe ser el que sospecho. Si hay DNA estamos mal. Pero uno puede medir proteínas aprovechando la propiedad de que los aminoácidos aromáticos absorben a 280nm. Podría tener una separación mas dramatica. porque se esta separando. lo que escurre de la columna. y asi vamos avanzando en el conocimiento de lo que estoy buscando. pero sirven para procesar y aplicar lo que sabe. por que lo único que estoy midiendo es concentración total de proteínas.

¿Qué usa la cromatografía en gel? Tamaño y forma de la proteína. la ionización. salvo que sea hemoglobina que sea coloreada o que quieras purificar un pigmento como la clorofila. asi que tiene esa propiedad de purificar el medio. pero en la realidad no se ve absolutamente nada. La última cromatografía que vamos a ver es la cromatografía de adsorción (adherencia. La cromatografía de afinidad. que utiliza la propiedad de adsorberse. por ejemplo. así que uno tiene que elegir muy bien el buffer cuando está haciendo el ensayo. veamos primero la cromatografía de intercambio iónico. ¿Cómo la retiene? Por que el anticuerpo estaría pegado a la columna y cuando haces fluir la proteína se queda pegada en el anticuerpo. es capaz de depurar el solvente porque se adsorben las moléculas que son tóxicas. Es un gel hidratado. se podría ver. ¿Cuál es la fase de relleno de la columna. el solvente usualmente es agua. Un ejemplo de adsorción. por eso las pastillas para evitar la intoxicación intestinal son pastillas de carbón.. ¿Realmente cuando uno hace el experimento (cromatografía en columna) cambia de color?: no. si fuera un veneno de serpiente y tiene un componente que es capaz de hidrolizar tejidos como la hialuronidasa. entonces haré un test biológico del efecto de la insulina en un ratón y mediré el efecto de la insulina en el ratón. Filtración en gel. Entonces. y probablemente no lo tenga. o sea veo cuánta actividad enzimática para romper proteínas tiene versus volumen de elusión. puede ser un anticuerpo por ejemplo que se va a unir a la proteína. ¿Cuál es el solvente? Un buffer. La fase sólida absorbente es usualmente material inorgánico y el solvente sería no polar. está anclada a una fase sólida. uno solamente ve agua. otra técnica. o sea capaz de romper proteínas. grupos ionizados. es el espectrofotómetro el que dice cuál tiene mas proteína que otro y en qué tubo está la proteína que te interesa. no se ve nada. como baja la glicemia lo que estoy inyectando en el ratón.pura y tengo pura proteína. uno podría hacer un test para ver si tengo DNA o no. y que va a retener a la proteína cuando esté próxima a ella. lo carbonizan y se lo comen. Distintos tipos de cromatografía en columna Esta la cromatografía de intercambio iónico que utiliza una propiedad del soluto que es la capacidad de adquirir ciertas cargas. ¿Entonces qué deberíamos hacer?: ver actividad biológica. entonces lo que yo veo abajo es un test de actividad proteolítica. y la concentración de sal también y todo eso. ¿Por qué es importante usar un buffer a un pH determinado?: para que no se desnaturalice la proteína. y que es verde. depende de lo que quiera observar lo que quiero determinar. que no es proteína. y si la enzima era proteolítica.. entonces yo haría test para la hiarulonidasa. denominada fase sólida. la matriz que contiene moléculas que están cargadas. adhesión). estoy aislando insulina. que sería el mismo que ustedes obtendrían si hacen un pan tostado. esto sería un test biológico. el soluto sería la proteína. si yo quiero medir insulina. . ¿Eso sería el ligando?: sí. el carbono es capaz de adsorber un sinnúmero de partículas en suspensión. se basa en la afinidad por una molécula.

Cuando agrego eso y veo cómo migra. Si yo cambio el pH cambio el estado de ionización de los grupos ionizables. ¿Cómo es la matriz de intercambio iónico?. observo que las primeras que salen son muy negativas.¿Y como funciona? Ustedes tienen una columna que tiene partículas. estas partículas son microscópicas y tienen una carga pegada. el que se llama punto isoeléctrico. sino simplemente negativa) van a salir después de las que tenían la mayor carga neta negativa. lo puedo hacer pasar de neutro a negativo en los aminoácidos ácidos. Y. para afectar la unión entre la proteína y la columna y se despega.. puede ser de poliestireno entrecruzada con divinilbenceno. y si pH es igual a pK es mitad y mitad. ¿Qué pasa si yo cambio el pH y tengo un pK?: cambio el estado de ionización del grupo ácido. y aquí lo que queremos hacer es que las moléculas menos positivas dejen de serlo. con sal. la que es de carga negativa. Ahora las que se quedaron pegadas no van a salir simplemente. y ahí viene el problema. van a salir las positivas y las muy positivas. Las moléculas con carga neta negativa (no las de mayor carga negativa. o lo puedo hacer pasar de positivo a neutro en los aminoácidos básicos. Se agrega de todo a la columna. se ocupa. ¿Qué pasa si el pH es mayor que los dos puntos isoeléctricos?: ambas son negativas porque estoy aumentando el pH del medio por sobre los puntos isoeléctricos y por lo tanto las cargas son negativas porque perdieron protones. Se queda pegada la molécula muy positiva. y si el pH es menor. entonces si el pH es menor que todos los puntos isoeléctricos. por que hay cadenas laterales de aminoácidos que están positivos. si la subo más se despegan las más resistentes. supongan que las que quedan pegadas. Esta técnica. lo que yo obtengo en los tubos sucesivos. como en el caso de estas partículas que tienen carga negativa y por lo tanto ¿Qué tipo de moléculas se van a quedar pegadas en la columna?: las de carga positiva que se representan en rojo. así al aumentar gradualmente el pH la menos positiva se vuelve negativa y se desprende de la columna. de mucha carga positiva y mucha carga negativa. ¿Entonces qué vamos a hacer?: vamos a cambiar los pH de tal manera que primero se vea afectado un grupo ionizable o un conjunto de grupos ionizables de una molécula y después los de la otra molécula. ¿Qué pasa si el pH está entre los dos puntos isoeléctricos?: una molécula es positiva y la otra es negativa. ¿Cuáles son los básicos?: histidina. las moléculas que eran más afín. quedan ahí porque son positivas. moléculas positivas. de carga neta negativa. por que con cada valor de pH igual al punto isoeléctrico están neutras. No se puede subir el pH por sobre los dos puntos isoeléctricos por que las obtendría juntas. ¿Las menos positivas van a tener un punto isoeléctrico mayor o menor?: menor. ¿Cuáles son los ácidos?: glutámico y aspártico. y eso ustedes DEBERIAN saberlo o habérselo cuestionado. Y. si pH es mayor que pK este grupo se disoció.. por que esos tubos automáticamente se van cambiando. . de tal manera que subo la concentración de NaCl u otra sal. está vigente. lisina y arginina. Esto se puede hacer en vez de pH. ya que tienen poca afinidad con la columna. es situación de buffer.. ¿Cómo están ambas moléculas?: positivas. Variamos el pH. pero se van a quedar pegadas todas las positivas. tienen un protón que las saca de la neutralidad. En buenas cuentas cada molécula va a tener un valor de pH al cual va a tener carga neta 0. así que se sube gradualmente. que aquí están exageradas. por lo que están positivas. Pero también se hace con pH. y en la guía ustedes van a ver problemas con pH. ¿Cómo hago para sacar todas aquellas que se quedaron pegadas pero que tienen afinidad diferenciada? No se puede cambiar la carga de la columna por que pierde la afinidad por todas. Así que si yo jugara. y eso va a depender del pH y del pK. si pH es menor que pK el protón está en el grupo. Cuando sigue escurriendo el buffer.

5 y el pH es 7. quiero tal columna y se compra.Lo importante es que estas matrices tienen pegadas cargas. estos pasan a estado neutro. Y tienen nombre. Así que ustedes tendrán columnas.5 ¿qué carga va a tener la columna? Esta es la columna: aquí está positiva protonada. pero hay que saber cómo funciona. dependiendo de la columna y ese ión se va a intercambiar por la molécula (…). la otra es la dietilaminoetilcelulosa que se abrevia DEAE-celulosa y que el pKa es 9. Se compra. Y esta columna.5. sería un intercambiador aniónico. Estos pasan a configuración negativa. entre cruzadas con dimetilbenceno que es lo que tienen ahí. estas moléculas que están acá. como les decía. grupos carboxílicos que se pueden deprotonar. Por lo tanto. ¿A qué pH esta ionizada la carboximetil si el pK es 3. El pKa es 9. La matriz de este cambio iónico. que se abrevia DEAEcelulosa. Entonces ustedes tienen columnas que pueden ser de resinas diferentes a las que les dije anteriormente de un material fibroso como la celulosa y sobre ella pueden unirse algunos grupos ionizables. y estas tienen cargas netas negativas.5. para que se queden tranquilos: uno se gana un proyecto. cuando paso una proteína positiva. estos pasan a estado neutro. grupos amino que se pueden deprotonar. y por lo tanto es un intercambiador de cargas negativas. Y la otra es la dietilaminoetilcelulosa. Esta cromatografía separa por tamaño. Ya . cloruro es solvente. que es natural. puede ser de poliestireno. por que uno prepara la columna a un pH tal que este ionizada. de un material fibroso como la celulosa y sobre ella pueden unirse algunos grupos ionizables. Estos pasan a configuración negativa. hasta ahora no habíamos pensado en el tamaño. porque uno prepara la columna a un pH tal que sea ionizada.5.5?: mayor que 3. por ejemplo: la dietilaminoetil tiene grupos aminos positivos. la que tiene grupo carboxílico y es de celulosa se llama carboximetilcelulosa.0 ¿qué carga tiene esta columna? Positiva. va a costar obtenerlas en tubos separados porque son muy parecidas. el sodio se va a intercambiar por la proteína positiva: es un intercambiador catiónico. Veamos otro tipo de cromatografía. que es la cromatografía de exclusión. ustedes tienen columnas que pueden ser una resina diferente a las que les dije anteriormente. como la dietilaminoetil. neutra deprotonada. ahí va a estar ionizada. y que el pK es 9. Lo importante es que esas matrices tienen pegadas cargas. a qué pH está ionizada la carboximetil si el pKa es 3.5: mayor que 3. así que esa columna debe estar preparada a un pH mayor que 3. grupos amino que se pueden deprotonar. habrá intercambiadores aniónicos e intercambiadores catiónicos. sodio.5. está disuelto en el solvente ¿qué va a suceder? Cuando agregue una proteína negativa. Y la otra: 9. cómo cuáles: grupos carboxílicos que se pueden deprotonar. que son positivas y ahí intercambian aniones… porque tiene su ión anulando la carga. se llama carboximetilcelulosa y estas tienen cargas netas negativas. sólo habíamos pensado en la carga de las proteínas. los que están neutralizados por sodio que está disuelto en el solvente.5… mayor o menor que 3. Cómo es la matriz.5. entonces miro otra propiedad: el tamaño. que es positiva. intercambio un cloruro por una proteína negativa. va a desplazar al cloruro y se va a unir a la dietilaminoetil. es negativa por los grupos carboxílicos. puede ser cloruro. Ejercicio.5 si es menor que 9. así que esta columna tiene que estar preparada a un pH mayor que 3. de positivo a neutro… y tienen nombre: la que tienen el grupo carboxílico y es de celulosa. agarra un catálogo. Entonces imagínense que hay proteínas que tienen la misma carga y siempre van a salir en la cromatografía de intercambio iónico próxima. La carboximetil. pero puede tener cloruro contraponiendo sus cargas.5. intercambio iónico. de positivo a neutro. Entonces.

no está fluida. que obligarlas a interactuar con una matriz porque las moléculas de agua van a estar más quietas. pero sucede. Lo que tiene que hacer el bioquímico es seleccionar otro gel con un rango de poro determinado para separar estas proteínas que salen juntas. Y las que son grandes y no entran. y las chicas se distraen. Entonces vamos a separar por tamaño. Yo haría casi una apuesta de. que son las partículas de gel que están ahí. entre sí. porque las chicas se van a meter al interior de la matriz. Así que exageramos las partículas. el agua es el gel junto con la resina que tiene. y se encuentran que obtienen. D. por lo tanto las chicas deberían llegar rápido. D. se atrapa y descansa. pero qué va a suceder ¿cuáles creen que llegan primero abajo? Antes les digo una cosa: las partículas de gel. no tienen diferencia con las que son más grandes y no entran también. igual que antes. deben fluir como si no hubiera resina: lo que sucede es que las chicas se meten al entramado de las partículas y ahí hay gel y ahí fluye más lento. hay espacio por donde puede fluir el solvente libremente. entonces van a salir juntas. que son los espacios que habría entre las pelotas de ping pong. pero eso nunca a mí me cuadró. Hay una absorción de luz de 280 nm versus los tubos de ensayo que vamos colectando: 0 mL. habrá algunas partículas que como que entran y no entran y esas son las que salen entre las últimas y las primeras. pero al interior de la partícula que aquí está exagerada. uno agrega una mezcla de proteínas de distinto tamaño y va viendo la elusión de las proteínas conectándola a distintos tubos. de ser el que obtiene una proteína por primera vez. Significa que la grande es capaz de sortear todas las bolitas de ping pong y es capaz de pasar a través de los espacios. va a decir que las chicas se demoran porque se distraen porque tienen más espacio. Así que salen primero las grandes. no tiene diferencia con las que son más chicas y también entran. y ver dónde les sale. . salen después las chicas. porque si las chicas tienen acceso a todos los lugares. B. en realidad es fascinante el hecho de que ustedes se están enfrentando a algo que nunca nadie ha hecho. ¿Cuáles llegan primero? Y si me dicen cuáles. así que saldrían antes… y si es una más grande que la A. imagínense que la F es más chica que la C ¿dónde va a salir la F? cae junto con la C. la más chica es la C y después sale la B y la D. la B. Imagínense la sensación de estar haciendo este experimento. no deberían ver columnas. Vamos a mirar actividad y concentración de proteínas. porque el agua está gelificada. pasan por los intersticios. Si son más garbees ¿no deberían también ser atrapadas por esta porosidad? Es que las grandes no entran a los poros de la partícula. por ejemplo la C. como tienen acceso por tamaño a todos los lugares. B. pierden su libertad. 50 mL si ustedes quieren. así es que como que ahí se sienta a descansar: la partícula entra. C. así que salen juntas. Así que aquí veamos concentración de proteínas. a quien le preguntasen de cromatografía de exclusión. Entonces. como bolitas de ping pong. Y si yo les dijera que las chicas. y estas partículas están entrelazadas y son hidratadas y ahí el agua está como en pañal de guagua: está quieta  el agua hidrata el gel del pañal de guagua. establecen ciertos espacios de solvente porque hay lugares en los que las partículas no se tocan. porque son más grandes que el diámetro de poro que ustedes eligieron: ensayo y error. y la A no cabe en los poros. Se sienta más veces en la silla que la grande porque tiene acceso a la silla. porque la C es más chica y que entre. hay gel. díganme por qué ¿las grandes o las chicas llegan primero abajo? Grandes ¿por qué? Las grandes se distraen menos. Hay algunas que entran en algún porcentaje. es decir. está como en un estado de gelatina. que tengan la misma carga y el mismo tamaño. Si ustedes quieren obtener la proteína y están midiendo actividad biológica en estos de ensayo. pero no de actividad biológica sino que de concentraciones solamente: A. Si hay una que cabe completamente en el poro. porque tienen acceso a todos los lugares: es como que para ellas no hay resina. por lo tanto no hay movimiento browniano como si estuviera líquida. porque hay tantas moléculas que hidratar que el agua está más quieta que en medio acuoso ¿me entienden? Hay demasiado estorbo molecular: no es lo mismo tener moléculas de agua fluyendo entre sí. A. C ¿cuál es más grande? ¿la A. Ahora.que. es como mucha la mala suerte. aquí tenemos un estado de gel y esta es una partícula en la cromatografía de exlusión. la D o la C? la A es más grande porque sale primero.

con agua. el gel abajo.¿Cuál es la cromatografía de afinidad? La misma técnica: un tubo. porque hice puré el tejido neuronal y va todo ahí. carga eléctrica. la muestra arriba. Por ejemplo: imagínense que es la enzima acetilcolinesterasa. Utiliza la carga de la molécula a separar y muchas veces la carga en relación con el tamaño. pero e también está agregado a la partícula de resina que tienen ahí. en la placa neuromotora ¿cierto? Y yo quiero aislarla. la enzima se va a pegar al sustrato y por lo tanto agrego la muestra que tiene de todo. agrego la proteína medianamente pura sobre la columna y se me pega mucho más que las demás proteínas que son contaminantes y tengo la proteína ya no medianamente pura. si ustedes quieren obtener la proteína de interés que está en rojo. pero con un agente que se llama SDS. por la enzima. tamaño y carga. La otra técnica que es importante. alguien ya lo hizo y lo vende). útil en la sinapsis neuromotora. con el sustrato unido a la resina. unos moldes especiales. La movilidad electroforética de una molécula es la razón que hay entre la velocidad que ésta logra en el gel y la diferencia de potencial que hubo que aplicar. esa es la movilidad electroforética. Esa es una tesis de doctorado por lo menos. que la van a hacer en el laboratorio: ustedes agregan en el gel. pero así de simple el protocolo. . sino que muy pura. que no es enzima y necesito de alguna manera tenerla más pura y la tengo medianamente pura: la tomo. la muestra con la micropipeta y pueden ver como migra cuando someten a un campo eléctrico esa muestra. no he dicho nada. está la resina con el sustrato. un buffer. ese agente lo que hace es denaturar la proteína. la última. agregan un ligando. que es la que vamos a ver al final. espero que el conejo genere anticuerpos. no se confundan con el nombre. que no utiliza el tamaño de la proteína… no. pero la acetilcolinesterasa se va a pegar sobre la acetilcolina que está unida a la resina. generalmente se utiliza para separar DNA. que está rellenando la columna. Y se puede demostrar teóricamente que es la carga partido por un coeficiente propio de la molécula: coeficiente de roce. pego los anticuerpos del conejo a la resina. se utiliza para separar proteínas. en unos bolsillitos que forman. Si quiero una proteína rara. y acá el polo negativo que se llama cátodo. Y cuáles son las fases sólidas: tres soportes inertes. Entonces. La electroforesis. por lo tanto. aíslo los anticuerpos del conejo. la inyecto a un conejo. porque uno atrae aniones y el otro cationes. Y hay una electroforesis muy elegante que se llama desfocalización isoeléctrica. la acetilcolinesterasa se a distraer uniéndose a ese sustrato y va a fluir con este sustrato y ya no va a estar pegada a la resina. la electroforesis en gel de poliacrilamida. ¿Cómo la despego inteligentemente? Agregas sustrato: agrego sustrato suelto para que compita. Entonces. en el caso de las tres primeras tiene una cierta porosidad y el solvente siempre es un amortiguador. requiere de mucho trabajo. si agrego acetilcolina. La electroforesis se puede realizar en gel de agarosa. porque hay una relación carga-tamaño. ¿Cuáles son las propiedades que tiene el soluto para cada una de ellas? Las vamos a ir viendo a medida que veamos las técnicas una a una: una es carga eléctrica. entonces agarro el ssutrato y lo pego covalentemente a la resina (se compra. pero se hace. es la técnica de electroforesis. Acá tenemos el polo positivo que se llama ánodo. electroforesis en poliacrilamida.

otra y las dos asociadas. porque el SDS no se va a pegar al DNA. porque todas tienen el barniz de SDS que les confiere la misma carga: algunas más negativas porque eran más grandes y otras menos negativas porque son moléculas más chicas. y si la porción hidrofóbica va hacia adentro. además. ¿Qué podemos decir? Bendita técnica. Esta cola hidrofóbica se va a insertar en la porción hidrofóbica de las proteínas y todas las proteínas tienen aminoácidos hidrofóbicos en alguna parte. como les decía en la tabla. van a llegar más lejos. la mayoría. lo que permite que se separen es el tamaño y el gel de poliacrilamida es entrecruzado. Estas proteínas están todas desnaturalizadas. por gel de agarosa separo DNA. para separar sólo por tamaño. lo que es natural. si se dan cuenta. quiero separar sólo por tamaño. y este que está acá para los amigos: SDS. las más chicas son las de acá. la carga ya no es motivo para la separación porque todas tienen el mismo atributo: muchas cargas negativas. una RNApolimerasa ¿qué hace la RNApolimerasa? Sintetiza RNA a partir de DNA. Todas van a tener la misma relación carga-tamaño. migran más rápido. ¿Puedo separar DNA a través de esta técnica? no se usa. otra banda: dos bandas y es que esta RNApolimerasa tiene subunidades: una. sino que separa solamente por tamaño. . admiten menos moléculas de SDS. es así. como quien mete la mano a un calcetín y lo tira para afuera: va a desnaturalizar la proteína.Ahí tienen un ejemplo de un gel que ya fue revelado y sostiene las marcas de proteinas que ustedes pueden teñir con […] que puede marcar aminoácidos y no al gel. por lo tanto. va a dar vuelta la proteína. en una segunda todas estas. esto es en general. estas y las de acá. los que tengan mayor movilidad electroforética en relación a los positivos. así que ya no separa más por movilidad electroforética en el sentido de carga-tamaño. así que ¿cuáles van a llegar más lejos. en una primera etapa de purificación ustedes obtienen todas estas muestras. van a estar todas estar cargas negativas de sulfato mirando hacia el solvente. Fíjense que tiene una carga. en el ejemplo que tenemos ahí? Ya. al final. o sea. Y caben tantas moléculas de SDS en la proteína por igual que en distintas proteínas por centímetro cuadrado. las más grandes se quedan. aquí tenemos una trama de gel que es el gel de poliacrilamida que es un entrecruzado covalente y las más chicas pasan. entonces voy a pintar de cargas negativas a todas las proteínas. Y acá. porque abajo está el positivos y arriba está el negativo. Entonces se va a incrustar en la porción hidrofóbica. pero si yo. porque permite separar de una manera con mucha resolución proteínas que normalmente no eran separadas por otra técnica. y la carga negativa queda mirando hacia el solvente. Entonces cuando tienen SDS las moléculas. seguimos la próxima clase. Ustedes ven. No hay contradicción porque aquí no hay partículas hidratadas ni con intersticios entre partículas hidratadas. estas. en este caso. déjame ver si te respondo la pregunta con lo que voy a decir: cuando uno pone una muestra arriba y las partículas tienen carga positiva. y ese compuesto. es decir. Entonces aquí al final obtenemos una banda. una cabeza cargada y una cola hidrofóbica porque aquí tenemos once carbonos. las chicas o las grandes? Las chicas. cuando está proteína pura. las más grandes son las que están acá arriba… ¿te contesto con eso la duda? Las más chicas son las que llegan más abajo. en relación a los negativos. Y la manera de pintarlas con carga neta negativa es agregar un compuesto que es el SDS. [pregunta de la Aguayo] A ver. la cromatografía en gel de poliacrilamida. de la abreviación al castellano: dodecil sulfato de sodio. ¿Qué sucede. significa. estas. ahora. y en la cromatografía de exclusión ¿cuáles llegaban más lejos? Las grandes.

¿Dónde van a detenerse las proteínas? Cuando la carga neta sea cero: cuando la carga neta es cero. pero como ahora hago una electroforesis con SDS. La migración relativa es porque uno divide la migración de la más grande. separo por tamaño y por lo tanto. como aparece ahí. tiene 200. hay programas computacionales que lo interpretan y que les pueden decir la anomalía en una o dos manchitas y detectan una patología en el laboratorio clínico. y por qué el logaritmo: porque varía tanto. pero para el caso. qué proteínas se están expresando en ese tejido . es que llegan primero estas y las otras se van quedando atrasadas. Pero uno puede hacer esto y lo que estás determinando es la proteómica: es decir. y lo que ven ustedes es que la miosina. o sea que deberíamos pensar que aquí está de un mayor pH a un menor pH. por eso. Entonces. lo que permitiría. que es mejor trabajar con el exponente. yo grafico la migración. Esto es proteómica. la que migra más lejos es ésta. Grafican ustedes esto y da una línea recta. Así que la banda de allá es con carga neta cero. que es la proteína del músculo. es decir.Vamos a ver un detalle: cómo depende el tamaño de la proteína. Ahí ustedes tienen un gel de cromatografía de electroforesis con poliacrilamida que es con SDS. lo das vuelta y haces una electroforesis convencional y tiñes. establezco el campo eléctrico: voy a obtenerlas separas. para obtener una relación entre 0 y 1. si yo tengo una molécula desconocida y sé la migración. se queda arriba porque es muy grande.000 daltons ¿cuántos aminoácidos tiene? Dos mil. Pero lo que deberíamos pensar acá es que la muestra está a un pH determinado. Entre pH 9 y 3 tú no vas a tener desnaturalización de las proteínas. ahora uno puede hacer la proteómica también identificando algunos RNAm con unos chips especiales y veís cuánto RNAm estay sintetizando. Estas las compro y trabajo con la desconocida. Entonces uno podría interpolar en este caso. como ya lo vieron. había muchas proteínas con el mismo punto isoeléctrico y que estaban saliendo juntas. pero la verdad es que el gel tiene un gradiente de pH. Si yo agrego esas proteínas en un gel y realizo una electroforesis a un pH determinado. Entonces lo que podemos ver. separé por tamaño. agrego la proteína. Veámoslo al tiro. Entonces. y esta electroforesis es con SDS y separas por tamaño ¿qué obtuve? Fíjense que toda esta banda se me resuelve en todas estas manchas. hay otra técnica. esta banda se separó en todas estas manchas. interpolo y obtengo el peso molecular de la proteína. hasta ahí no más llegó la migración. Después tú tomas el gel que tiene todas las proteínas en banda. si no queda nada. la usa para dividir las migraciones de las otras. separo las de menor tamaño con las de mayor tamaño y me queda arriba y lo que obtengo es esto. que es la que utiliza el punto isoeléctrico de las proteínas y ustedes ven que hay proteínas que tienen cada un punto isoeléctrico diferente. tú haces el estudio previo. Y esto. lo que podríamos hacer es graficar la migración de estas moléculas respecto del logaritmo del peso molecular. cómo depende la migración respecto del tamaño de la proteína… y nos queda esta diapositiva y quizás este gráfico… o lo vemos ahora. intercepto.

porque de 100. en las etapas sucesivas. significa que está más puro ahí. En cambio al pasar del extracto puro a la precipitación por sulfato ¿cuántas veces se purificó? 3. invéntese.000 por gramo… dividan: 1. en el transcurso de la purificación.2 veces simplemente. Así que ustedes tienen tablas como estas. pero a veces es inevitable. combinada con la electroforesis de SDS. etcétera. después del intercambio iónico. cuánto volumen mantiene. nos interesan las bolitas rojas ¿dónde hay más bolitas rojas? Acá ¿dónde están más puras las bolitas rojas? Allá. o sea que está más pura. lo ideal es tenerla pura. por ejemplo: teníamos diez mil miligramos. esta es la muestra definitiva. de la proteína. en eso estamos. y eso es importante que ustedes lo puedan entender. después. la que sea. La genómica. pero para estudiarla es fabuloso. qué obtengo: actividad específica de 32. obtenemos mayor actividad específica. En el caso de la alcayota. cromatografía. Por lo tanto. Aquí habría un caso donde sacrificamos rendimiento por purificación. y a ambas juntas se le llama “electroforesis bidimensional”. y la etapa más eficiente de la purificación es la de focalización isoeléctrica. y eso es lo que no queremos.000 unidades y teníamos 100. cuánta proteína total mantiene. así que nosotros vamos a obtener. y eso se los voy a explicar. obtuve 45 unidades de actividad… la que sea. En todo proceso de purificación interesa el grado de purificación y rendimiento. y el rendimiento cuál sería si tenemos 45. Mientras más actividad tenga. Pero cuál es la purificación si tenía 10 por gramo y ahora tengo 15 por gramo. cuánta actividad: cien mil unidades. cuánta actividad: 96 mil unidades de actividad. Qué es la actividad específica: unidades dividido por miligramos. pero con un rendimiento que se ha sacrificado en cuanto a la proteína. y cómo los estimamos: esta es la muestra inicial.y saber si hay alguna que está ausente o alguna presente que no debería estar. Así que allá tenemos purificación lograda. cuánta actividad mantiene y cuál es la actividad específica. en la genómica. donde aparece la etapa de purificación. 15.500 veces más pura. tengo 3000 miligramos. precipito en el sulfato de amonio. les dije que era la Edad de Piedra. .000 ¿cuál sería el rendimiento? Un 45%. eso significa deshacernos. Así que una cosa es cuántas veces se purificó y otra es el rendimiento. lo que nosotros queremos es que la proteína esté rodeada de proteínas iguales y saquemos las impurezas. que ustedes vieron denante.