HERRAMIENTAS MOLECULARES

Al estudiar el comportamiento biolgico de las molculas que componen las

clulas vivas, la Biologa molecular roza otras ciencias que abordan temas
similares: as, por ejemplo, juntamente con la Gentica se interesa por la
estructura y funcionamiento de los genes y por la regulacin (induccin y
represin) de la sntesis intracelular de enzimas y de otras protenas. Con
la Citologa, se ocupa de la estructura de los corpsculos subcelulares (ncleo,
nuclolo, mitocondrias, ribosomas, lisosomas, etc.) y sus funciones dentro de la
clula. Con la Bioqumica estudia la composicin y cintica de las enzimas,
interesndose por los tipos de catlisis enzimtica, activaciones, inhibiciones
competitivas o alostricas, etc. Tambin colabora con la Filogentica al estudiar la
composicin detallada de determinadas molculas en las distintas especies de
seres vivos, aportando valiosos datos para el conocimiento de la evolucin.
7.1.1 Sntesis del DNA
La replicacin del DNA es el proceso por el cual la informacin contenida en el
DNA es perpetuada. La replicacin del DNA es semiconservadora. Cada Cadena
de DNA acta como molde para la sntesis de una nueva cadena. El resultado son
dos molculas de DNA nuevas, cada una con una cadena nueva y otra vieja.
Este proceso se denomina replicacin semiconservadora. La sntesis del DNA
progresa invariablemente en direccin 5' 3.Y por lo tanto es semidiscontinua.
La replicacin empieza en un punto de origen y normalmente avanza de forma
bidireccional formando una doble horquilla. La replicacin es muy precisa. La
replicacin tiene lugar con un grado extraordinario de fidelidad. En E. coli se
comete un error cada 1010 nucletidos incorporados.
El DNA es sintetizado por DNA polimerasas. Se conocen numerosos tipos de
Polimerasas tanto en procariotas como en eucariotas, pero su mecanismo de
accin es similar en todos los casos: todas ellas actan sintetizando una doble
cadena complementaria a la doble cadena de
DNA preexistente y todas ellas requieren un cebador inicial, cadena corta de RNA,
para poder proceder a la sntesis de DNA.
Los orgenes de replicacin son los puntos fijos, situados en la doble hlice de
DNA, a partir de los cuales se lleva cabo la replicacin, que avanza de forma
secuencial formando estructuras con forma de horquilla. La cantidad de DNA que
se puede sintetizar a partir de un nico origen de replicacin se denomina replicn
o unidad funcional de replicacin.
El genoma bacteriano es un replicn nico circular. En organismos eucariotas, la
replicacin del ADN se inicia en mltiples orgenes a la vez (hay uno cada 20 kb
aproximadamente), es decir, hay multitud de replicones.

REPARACIN Y MUTAGENESIS DE DNA

Una de las fuentes de variabilidad gentica que han hecho posible la evolucin es
la mutacin o cualquier cambio heredable en la secuencia de nucletidos del
material gentico (ADN) de un organismo. Las mutaciones suponen la alteracin
del genotipo, o constitucin gentica del individuo, y en ocasiones tambin del
fenotipo que son las caractersticas externas del individuo.
Las mutaciones ocurren al azar, esto se descubri en un experimento en el que se
hicieron 10 cultivos de 10 (8) clulas cada uno. A cada cultivo se le aadi el fago
T1, las clulas eran de E. coli. Si las mutaciones no ocurren al azar cabra esperar
que el nmero de colonias resistentes fuera ms o menos igual en cada cultivo, si
la mutacin es al azar se espera gran variabilidad en el nmero de colonias
resistentes en cada tubo. As, se comprob, que la mutacin era al azar.
Las mutaciones pueden afectar a uno (puntuales), unos pocos (pseudopuntuales)
o a un gran nmero de nucletidos de una secuencia de ADN (cromosmicas).
Tipos de mutaciones
Puntuales y pseudopuntuales
Cambios de base

transiciones: Purina por purina y pirimidina por pirimidina

transversiones: Purina por pirimidina y pirimidina por purina

Desfases (cambio en el nmero)

delecin
insercin

Cromosmicas

deleciones

duplicaciones
inversiones
translocaciones

Las mutaciones pueden ser espontneas mediante varios mecanismos diferentes,

incluyendo errores de replicacin del DNA y lesiones fortuitas de ste; o mediante
mutgenos. Los mutgenos son agentes que aumentan la frecuencia de
mutagnesis, generalmente alterando el DNA y en este caso son inducidas.
Mutaciones espontneas
Errores en la replicacin del DNA
Durante la sntesis del DNA puede producirse un error en la replicacin porque se
forme un emparejamiento ilegtimo de nucletidos como A-C que da lugar a la
sustitucin de una base por otra.
Cada una de las bases aparece en el DNA en una de varias formas
llamadas tautmeros que son ismeros que se diferencian en las posiciones de
sus tomos y en los puentes que se forman entre ellos. Esas formas estn en
equilibrio. La forma ceto es la que se encuentra normalmente en el DNA mientras
que las formas imino o enol son menos frecuentes. La capacidad del tautmero
menos frecuente de una base de emparejarse errneamente y producir
mutaciones durante la replicacin del DNA fue puesta de manifiesto por primera
vez por Watson y Crick. A estos emparejamientos errneos se les llama cambios
tautomricos.
Tambin pueden ocurrir emparejamientos errneos cuando una de las bases se
ioniza, esto sucede con ms frecuencia que los cambios tautomricos.
Transiciones
Todos los emparejamientos errneos anteriores producen mutaciones por
transicin, en las que una purina es sustituida por otra purina y una pirimidina es
sustituida por otra pirimidina.
Transversiones
No pueden realizarse por emparejamientos errneos como los debidos a cambios
tautomricos.
Pero s pueden realizarse si una base sufre un cambio tautomrico mientras que la
otra base rota sobre su enlace glucosdico y quedan enfrentadas sus cargas.
Desaminacin
Es una de las ms frecuentes debido a la inestabilidad qumica, afectando
gravemente a la replicacin del ADN provocando transiciones. En este caso la
base se modifica antes de la replicacin debido a los radicales que provoca el
metabolismo.

La Desaminacin de citosina produce uracilo, as los resduos de uracilo que no

sean reparados se emparejarn con adenina durante la replicacin produciendo la
conversin de un par GC en uno AT, se produce una transicin.
Cambios de fase
Estas mutaciones pueden ser inserciones o deleciones.
Las inserciones se producen por un deslizamiento o resbaln de la cadena
sintetizada con lo que se forma un lazo de varios pares de bases. En la siguiente
ronda de replicacin se aadirn tantas bases como comprenda el lazo ya que
cuando se produce el resbaln sigue replicndose por donde se qued antes del
resbaln.
Las deleciones se producen por un deslizamiento o resbaln de la cadena
molde, como las que hay que copiar no se pueden no se aaden a la cadena hija.
Despurinizacin
El ADN pierde de alguna manera alguna de sus bases y si hay un hueco la
reparacin introduce una base.
La frecuencia de las mutaciones espontneas es generalmente baja.

MECANISMOS DE REPARACION
El nivel de fidelidad de las copias de DNA es muy alto, debido a:
1. La especificidad enzimtica de la maquinaria replicativa
2. La correccin de errores de las DNA polimerasas mediante prueba de
lectura
Detectan nucletidos incorrectos y los eliminan hacia atrs (actividad
exonucleasa 3 - 5)
3. Los mecanismos de reparacin post-replicativos
a) Reparacin directa. La regin daada se corrige in situ
La DNA fotoliasa utiliza energa de la luz para eliminar los dmeros de pirimidina
formados por radiacin UV
b) Reparacin por escisin de bases
Las bases daadas se retiran y se reemplazan
c) Reparacin por escisin de nucletidos
Se elimina y se reemplaza un fragmento en torno a la zona daada
La escinucleasa urvABC escinde 12 nucletidos en la zona daada
Regeneracin a cargo de la DNA Pol I y la DNA ligasa.

RECOMBINACION DE DNA
La recombinacin gentica es el proceso por el cual una hebra de material
gentico (usualmente ADN, pero tambin puede ser ARN) se corta y luego se une
a una molcula de material gentico diferente.
En eucariotas la recombinacin comnmente se produce durante la meiosis, como
entrecruzamiento cromosmico entre los cromosomas apareados. Este proceso
conduce a que la progenie tenga combinaciones de genes diferentes a las de sus
padres y puede producir alelos quimricos.
En biologa evolutiva se cree que esta mezcla de genes tiene varias ventajas,
incluyendo que permite a los organismos que se reproducen sexualmente y evitar
el trinquete de Muller.
En biologa molecular, "recombinacin" tambin se refiere a la recombinacin
artificial y deliberada de piezas de ADN distintas, a menudo de diferentes
organismos, creando lo que se llama ADN recombinante.
Ciertas enzimas llamadas recombinasas catalizan
las
reacciones
de
recombinacin natural. RecA, la recombinasa encontrada en Escherichia coli, es
responsable de la reparacin de las roturas en el ADN bicatenario.
En levaduras y otros organismos eucariotas se necesitan dos recombinasas para
reparar
esas
roturas.
La
protena RAD51 es
necesaria
para
las
recombinaciones mittica y meitica, mientras que la protena DMC1 es especfica
de la recombinacin meitica.

Existen varios tipos de recombinacin gentica en las clulas eucariotas:

Recombinacin homloga
La recombinacin homloga (tambin llamada recombinacin general) sucede
durante la profase I de la meiosis y tiene lugar entre las largas regiones de ADN
cuyas secuencias son homlogas, es decir altamente similares aunque no
idnticas.

Entrecruzamiento cromosmico
Se denomina as a la recombinacin entre los cromosomas apareados,
generalmente durante la meiosis. Durante la profase I, en la sub-fase de
paquitene, las cuatro cromtidas disponibles estn estrechamente posicionadas
una con respecto a la otra. En esta disposicin los sitios homlogos en las dos
cromtidas pueden coincidir entre s, y pueden intercambiar informacin gentica.

Como la recombinacin puede producirse en cualquier lugar del cromosoma,

la frecuencia de recombinacinentre dos puntos depende de la distancia entre
ambos. Por lo tanto, para genes suficientemente distantes en el mismo

cromosoma la frecuencia de recombinacin es lo suficientemente alta para destruir

la correlacin entrealelos recombinantes.

En clulas B
Las clulas B del sistema inmunitario realizan una recombinacin gentica
llamada cambio de clase de inmunoglobulinas. Es un mecanismo biolgico que
cambia un anticuerpo de una clase a otra, por ejemplo, de un isotipo llamado IgM
a otro llamado IgG.

Conversin gnica
En la conversin gnica, una seccin de material gentico se copia de un
cromosoma a otro, pero deja el cromosoma donante sin cambios.

7.2.1 La recombinacin gentica

La recombinacin gentica es el proceso por el cual una hebra de material
gentico (usualmente ADN, pero tambin puede ser ARN) se corta y luego se une
a una molcula de material gentico diferente. En eucariotas la recombinacin
comnmente se produce durante la meiosis, como entrecruzamiento cromosmico
entre los cromosomas apareados. Este proceso conduce a que la progenie tenga
combinaciones de genes diferentes a las de sus padres y puede producir alelos
quimricos. En biologa evolutiva se cree que esta mezcla de genes tiene varias
ventajas, incluyendo que permite a los organismos que se reproducen
sexualmente y evitar el trinquete de Muller.
En biologa molecular, "recombinacin" tambin se refiere a la recombinacin
artificial y deliberada de piezas de ADN distintas, a menudo de diferentes
organismos, creando lo que se llama ADN recombinante.
Ciertas enzimas llamadas recombinasas catalizan
las
reacciones
de
recombinacin natural. RecA, la recombinasa encontrada en Escherichia coli, es
responsable de la reparacin de las roturas en el ADN bicatenario. En levaduras y
otros organismos eucariotas se necesitan dos recombinasas para reparar esas
roturas.
La protena RAD51 es necesaria para las recombinaciones mittica y meitica,
mientras que la protena DMC1 es especfica de la recombinacin meitica.

7.2.2 La expresin gnica

La expresin gnica es el proceso por medio del cual todos los
organismos procariotas y clulas eucariotas transforman la informacin codificada
por los cidos nucleicos en las protenas necesarias para su desarrollo y
funcionamiento.
En todos los organismos el contenido del ADN de todas sus clulas es idntico.
Esto quiere decir que contienen toda la informacin necesaria para la sntesis de
todas las protenas. Pero no todos los genes se expresan al mismo tiempo ni en
todas las clulas.
Exceptuando a los genes constitutivos (genes que se expresan en todas las
clulas del organismo y codifican protenas que son esenciales para su
funcionamiento general) todos los dems genes se expresan o no dependiendo de
la funcin de la clula en un tejido particular. Por ejemplo, genes que codifican
protenas responsables del transporte axonal se expresan en neuronas pero no
en linfocitos en donde se expresan genes responsables de la respuesta inmune.
Tambin existe especificidad temporal, esto quiere decir que los diferentes genes
en una clula se encienden o se apagan en diferentes momentos de la vida de un
organismo. Adems, la regulacin de los genes vara segn las funciones de
stos.

7.2.3 El procesamiento del ARN

La transcripcin de genes que codifican protenas crea un transcrito primario de
ARN en el lugar donde se encuentra el gen. Este discurso puede ser alterado
antes de ser traducido, esto es particularmente comn en las clulas eucariotas. El
procesamiento del ARN ms comn es el empalme para eliminar los intrones. Los
intrones son segmentos de ARN que no se encuentran en el ARN maduro, a pesar
de que pueden funcionar como precursores, por ejemplo, para snoARNs, que son
ARN que realizan la modificacin directa de los nucletidos en otro ARNs. Los
intrones son comunes en los genes eucariotas, pero rara en los procariotas. El
procesamiento del ARN, tambin conocido como modificacin post-transcripcional,
puede comenzar durante la transcripcin, como es el caso para el empalme, en
donde el espliceosoma elimina los intrones del ARN recin formado. El
procesamiento del ARN extenso puede ser una ventaja evolutiva posible por el
ncleo de los eucariotas. En los procariotas la transcripcin y la traduccin (ver
abajo) suceden al mismo tiempo, mientras que en los eucariotas la membrana
nuclear separa los dos procesos que dan tiempo para que el procesamiento del
ARN se produzca.
Maduracin del ARN no codificante
En la mayora de los organismos los genes no codificantes (ncARN) se transcriben
como precursores que someterse a una transformacin posterior. En el caso de
ARN ribosmico (rARN), a menudo se transcribe como un pre-rARN que contiene
uno o ms rARN, la pre-rARN se rompe, con modificaciones (2'-O-metilacin y la
formacin de pseudouridina) a sitios especficos de nucleolo, aproximadamente
150 diferentes especies restringidas pequeas de ARN, llamadas ARN pequeo
nucleolar (snoARNs), que, como ARNsn's, snoARNs estn asociados con
protenas, formando snoPRNs. En los eucariotas, en particular, un snoPRN,
llamado RNasa MRP rompe el pre-45S rRNA en el 28S, 5,8 S, y 18S rARN. El
rARN y los factores de procesamiento del ARN son agregados de forma grande
llamado elnucleolo. En el caso de ARN de transferencia (tARN), por ejemplo, la
secuencia 5 'se elimina por la RNasa P, mientras que el extremo 3' se elimina por
la enzima Z tRNase. En el caso de micro ARN (miARN), los miARNs se
transcriben primero como transcripciones de primaria o pri-miARN con una gorra y
cola poli-A y procesados cortamente como, 70-madre de nucletidos, estructuras
de bucle conocidas como pre-miARN en el ncleo celular por las enzimas Drosha
y Pasha, luego de ser exportados, es luego procesada para madurar los miRNAs
en el citoplasma por la interaccin con la endonucleasa Dicer, que tambin se
inicia la formacin del RNA-inducido silenciando el complejo (RISC), integrada por
la protena Argonauta.
La exportacin de ARN
En los eucariotas ms maduros el ARN debe ser exportado al citoplasma del
ncleo. Si bien algunas funciones de ARN en el ncleo, muchas molculas de
ARN son transportados a travs de los poros nucleares y en el citosol. En
particular, esto incluye todos los tipos de ARN que participan en la sntesis de

protenas. En algunos casos el ARN es adems transportado a una parte

especfica del citoplasma, como la sinapsis, que son luego arrastrados por las
protenas motoras a travs de protenas que se unen a secuencias especficas de
vinculador ( llamados "cdigos postales") en el ARN.
Traduccion del ARN
La traduccin es el paso de la informacin transportada por el ARN-m a protena.
La especificidad funcional de los polipptidos reside en su secuencia lineal de
aminocidos que determina su estructura primaria, secundaria y terciaria. De
manera, que los aminocidos libres que hay en el citoplasma tienen que unirse
para formar los polipptidos y la secuencia lineal de aminocidos de un polipptido
depende de la secuencia lineal de ribonucletidos en el ARN que a su vez est
determinada por la secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN.
Los elementos que intervienen en el proceso de traduccin son
fundamentalmente: los aminocidos, los ARN-t (ARN transferentes), los
ribosomas, ARN-r (ARN ribosmico y protenas ribosomales), el ARN-m (ARN
mensajero), enzimas, factores proteicos y nucletidos trifosfato (ATP, GTP).
El primer paso que tiene que producirse es la activacin de los aminocidos y
formacin de los complejos de transferencia. Los aminocidos por s solos no son
capaces de reconocer los tripletes del ARN-m de manera que necesitan unirse a
un ARN de pequeo tamao (constante de sedimentacin 4S) llamado ARN
adaptador, ARN soluble oARN transferente. Crick (1958) postul la necesidad de
la existencia de un adaptador que acoplar cada aminocido a su correspondiente
codn.