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UNIVERSIDAD DE TALCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS


ESCUELA DE AGRONOMA

Evaluacin in vitro del control de Bacillus sp. sobre Clavibacter


michiganensis subsp. michiganensis

MEMORIA DE TTULO
FERNANDO E. FLORES ROJAS

TALCA-CHILE
2004

UNIVERSIDAD DE TALCA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
ESCUELA DE AGRONOMA

Evaluacin in vitro del control de Bacillus sp. sobre Clavibacter


michiganensis subsp. michiganensis

Por

FERNANDO ENRIQUE FLORES ROJAS

MEMORIA DE TTULO

Presentada a la
Universidad de Talca como
Parte de los requisitos para optar al ttulo de

INGENIERO AGRNOMO

TALCA CHILE
2004

APROBACIN:

Profesor Gua

Ing. Agr. M.Sc. Ph. D. Mauricio Lolas Caneo


Profesor Escuela de Agronoma
Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad de Talca

Profesor Informante

Ing. Agr. M.Sc. Ph. D. Claudio Sandoval Briones


Profesor Escuela de Agronoma
Facultad de Ciencias Agrarias
Universidad de Talca

Fecha presentacin Defensa Memoria: 23 de Abril de 2004

RESUMEN

El objetivo general del presente trabajo consisti en evaluar el efecto como controlador biolgico de
Bacillus sp. sobre el agente causal de cancro bacteriano en tomate (Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis). Para ello se analiz el efecto de tres cepas nativas de Bacillus sp.
recolectadas de diferentes partes de la regin del Maule; las cepas utilizadas se rotularon con los
siguientes cdigos 40-1A, 102-3 y 115-1.Se realizaron ensayos para determinar el tiempo de
incubacin para tres cepas nativas de Bacillus sp. en la que se logra la mayor actividad
biocontroladora sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Los tiempos de incubacin
probados fueron 3, 6 ,24 y 48 horas. Los resultados de este ensayo arrojaron que la mayor
actividad biocontroladora se present a las 24 horas; la cepa nativa de Bacillus sp. mas destacada
y con mayor inhibicin sobre Clavibacter fue la cepa 102-3.Tambin se elabor una curva de
crecimiento para cada cepa nativa de Bacillus sp. y Clavibacter; para ello se realiz conteos en una
cmara de Neubauer en 5 tiempos diferentes de incubacin a las 3, 6, 24, 48 y 72 horas. Con estos
datos se hizo la curva de crecimiento, donde Clavibacter present una mayor poblacin que las
cepas nativas de Bacillus sp., y entre las cepas nativas de Bacillus sp. la de mayor poblacin fue
102-3. El crecimiento exponencial de todas las poblaciones tanto de Clavibacter como de Bacillus
sp. se present entre las 6 y 24 horas de incubacin. Finalmente se procedi a determinar y
comparar la concentracin mnima inhibitoria (CMI) de las tres cepas nativas de Bacillus sp. y
Serenade sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Al se evaluar las tres cepas
nativas de Bacillus sp. con 24 horas de incubacin y el producto comercial Serenade, la CMI para
7

Serenade se alcanz a la concentracin 10 Bacillus/ml y para el caso de las cepas evaluadas


5

sta fue a la concentracin 10 Bacillus/ml; la cepa mas destacada y que logr una control
significativamente mayor a las dems fue 102-3.Este estudio contribuir a desarrollar nuevas
alternativas de control de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis por medio del uso de
cepas nativas de Bacillus sp., las cuales se perfilan como una buena opcin para el manejo de esta
enfermedad.

Palabras claves: control biolgico Bacillus - Clavibacter - cancro bacteriano

ABSTRACT

The efficacy as biocontrol agent of different native strains of Bacillus sp. on bacterial canker of
tomatoes (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis) was determined under in-vitro
conditions. Therefore, native strains 40-1A, 102-3 and 115-1, isolated from different localities of the
VII Region of Chile, were incubated in nutrient broth for 3, 6, 24 and 48 h, in order to know when
they were most active against the pathogen. So, 50 l of biocontrol agent suspension were
deposited in 5 mm wells made in agar plates grown with the pathogenic bacterium and after 24 h,
the inhibition halo was registered and compared among them. Bacillus sp. native strain 102-3
shown a significantly high activity against C. michiganensis. This excellent activity was
demonstrated again when the minimal inhibitory concentration (MIC) was estimated for each native
5

strain, resulting in only 10 cfu ml

-1

compared to the 10 cfu ml

-1

of the commercial product

Serenade. Then, this study suggests that this native strain of Bacillus could be used in a
preventive programme against C. michiganensis subsp. michiganensis in tomatoes.

NDICE

Pgina

1. INTRODUCCIN

2. REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1 Antecedentes generales del cultivo de tomate

2.2 Enfermedades del tomate

2.2.1 Enfermedades de origen bitico


2.3 Antecedentes generales Cncer bacteriano del tomate causado por Clavibacter

4
5

michiganensis subsp. michiganensis


2.3.1 Organismo Causal

2.3.2 Ciclo y epidemiologa de la enfermedad

2.3.3 Control del cncer bacteriano en tomate

2.4 Control biolgico

2.5 Antecedentes del control de patgenos con Bacillus subtilis

11

2.5.1 Mecanismo de accin

13

3. MATERIALES Y MTODOS

14

3.1 Material bacteriano a utilizar

14

3.2 Determinacin del tiempo de incubacin para tres cepas de Bacillus sp. que logra la

14

mayor actividad biocontroladora sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis


3.2.1 Diseo experimental
3.3 Determinacin de la curva de crecimiento de Bacillus sp. y Clavibacter michiganensis

16
16

subsp. michiganensis
3.4 Determinacin y comparacin de la CMI de tres cepas Bacillus sp. sobre Clavibacter

17

michiganensis subsp. michiganensis


3.4.1 Diseo experimental y anlisis de datos

18

4. RESULTADOS Y DISCUSIN

19

4.1 Determinacin del tiempo de incubacin para tres cepas de Bacillus sp. que logra la

19

mayor actividad biocontroladora sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis


4.2 Determinacin de la curva de crecimiento de Bacillus sp. y Clavibacter michiganensis

21

subsp. michiganensis
4.3 Determinacin y comparacin de la CMI para Bacillus sp. sobre Clavibacter

23

michiganensis subsp. michiganensis


5. CONCLUSIONES

26

6. BIBLIOGRAFA

27

NDICE DE FIGURAS

Pgina
CAPITULO III

Figura 3.1 Esquema del ensayo in vitro para determinar en las cepas de Bacillus sp. el

15

tiempo de incubacin ptimo, en cuanto a inhibicin del crecimiento de Clavibacter


michiganensis subsp. michiganensis.
Figura 3.2 Esquema del ensayo in vitro utilizado para determinar para tres cepas de

18

Bacillus sp. y Serenade la concentracin mnima inhibitoria (CMI) sobre Clavibacter


michiganensis subsp. michiganensis, en medio de cultivo agar nutritivo.

CAPITULO IV

Figura 4.1 Halo de inhibicin sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis de

19

tres cepas nativas de Bacillus sp. en diferentes tiempos de incubacin.


Figura 4.2 Comparacin del halo de inhibicin de las cepas nativas de Bacillus sp. con

20

24 horas de crecimiento sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.


Figura 4.3 Curvas de crecimiento de las cepas nativas de Bacillus sp. (40-1A, 102-3 y

21

115-1) y el patgeno (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).


Figura 4.4 Halo de inhibicin de cepas nativas de Bacillus sp. y Serenade a distintas

23

diluciones, sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.


Figura 4.5 Comparacin de la concentracin mnima inhibitoria (CMI) de cepas nativas
de Bacillus sp. sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

24

1.- INTRODUCCIN

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (sin. Corynebacterium michiganense)


agente causal de cncer o cancro bacteriano en tomate (Lycopersicum esculentum), est
presente en muchas partes del mundo y produce prdidas importantes en

produccin y

superficie del cultivo (Agrios, 1993). Esta enfermedad se caracteriza por su severidad de
ataque tanto al aire libre como en invernadero, siendo especfica del tomate, la cual si tiene las
condiciones favorables puede llegar a destruir completamente las plantaciones (Besoain,
1994).

El tomate (Lycopersicum esculentum) es la hortaliza mas importante, en cuanto a


superficie se refiere, cultivada en el pas. Su fruto es utilizado tanto para el consumo en fresco
como industrial. En la temporada 1999-2000 la superficie cultivada de esta especie alcanz las
21.756 hectreas, de las cuales un 45,1% se encuentran en la VII regin (ODEPA 2003).

Las alternativas para el control de enfermedades bacterianas son ms bien reducidas y


la mayora de ellas se basan en prcticas de manejo cultural, al no existir disponibilidad de
productos qumicos en el mercado con el que se logre un buen control. Por otra parte, durante
los ltimos aos se ha observado una tendencia a un manejo mas integrado de enfermedades
bacterianas con lo que ha adquirido mayor importancia el uso de controladores biolgicos.
Uno de estos controladores biolgicos son Bacillus sp. los cuales han sido evaluados
como eficientes controladores de patgenos de importancia agrcola. De acuerdo a esto, podra
constituirse en una alternativa eficiente para reducir la incidencia de enfermedades como
cancro bacteriano en tomate producida por Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,
enfermedad considerada de importancia primaria en el cultivo.

De acuerdo a lo anterior, el presente trabajo de investigacin plantea como objetivo


general, determinar el efecto como controlador biolgico de Bacillus sp. sobre el agente causal
de cancro bacteriano en tomate (Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis).

Como objetivos especficos se sealan:

Determinar el efecto inhibitorio de cepas nativas de Bacillus sp. en el control de


Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

Determinar el tiempo de incubacin para la mayor actividad de Bacillus sp. sobre el


control de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

Determinar la concentracin mnima inhibitoria (CMI) de cepas nativas de Bacillus sp.


sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis y compararlas con la cepa
comercial de Bacillus subtilis (Serenade).

2.- REVISIN BIBLIOGRFICA

2.1 Antecedentes generales del cultivo de tomate

El tomate (Lycopersicum esculentum) es una planta dicotiledonea, perteneciente a la


familia de las solanceas (Nuez ,1995). Es nativo del rea del Ecuador-Bolivia-Per, en los Andes
de Amrica del sur, y su hbitat natural corresponde a una estrecha franja costera que se extiende
desde el Ecuador (0 latitud) hasta el norte de Chile (30 latitud Sur), entre el ocano Pacifico y la
Cordillera de los Andes. El tomate una vez domesticado fue llevado a Europa, Asia y
posteriormente a Amrica del Norte. Esta especie ha sido seleccionada intensivamente y es el
resultado de un largo trabajo humano. Los cultivares de frutos carnosos en su mayora han sido
desarrollados en los ltimos 50 aos en Europa y en los Estados Unidos de

Norteamrica

(Izquierdo et al., 1992).


Los principales pases productores de tomate son China, Estados Unidos, Turqua, Egipto,
India e Italia, de los cuales el mayor productor es China, el cual el ao 2002 alcanz una
produccin de 25.466.211 toneladas (FAO, 2002).
El tomate se ha transformado en el cultivo hortcola de mayor importancia econmica en
Chile. En la actualidad se cultivan casi 23.000 ha al ao, de las cuales casi el 60% se destina a la
agroindustria para pastas y pulpas, jugos, enlatados, salsas y otros productos que son en mayora
destinados a mercados externos. El 40% restante se dedica a la produccin de tomate fresco; se
estima que casi 2.300 ha del total se producen en invernaderos. El cultivo se realiza desde la I a la
XII Regiones pero se concentra en las Regiones V, VI y VII (Krarup y Konar, 2003).

2.2 Enfermedades del tomate

El tomate es muy sensible al ataque de enfermedades y plagas. La incidencia y la


severidad del ataque va a estar en funcin del tipo de patgeno o plaga que est atacando al
cultivo, las condiciones de clima y de suelo de la localidad y principalmente de la susceptibilidad del
cultivar utilizado (Izquierdo et al., 1992).

Las enfermedades del tomate se convierten en el factor limitante de la produccin. Hay


casi 200 enfermedades conocidas de esta especie, con diversas causas y etiologas. El control de
estas enfermedades implica: el uso de cultivares resistentes; evitar que el patgeno entre en
contacto con la planta; la extirpacin que considera la eliminacin del patgeno despus de
establecido en el rea que ocupa el cultivo. As, se busca un control integrado de las enfermedades
(Jones et al., 1993).

2.2.1 Enfermedades de origen bitico

Son aquellas causadas por bacterias, hongos, virus y nematodos fitopatgenos. Para que
una enfermedad se desarrolle debe haber un husped susceptible, un patgeno virulento, y un
ambiente apropiado para el desarrollo de la enfermedad (Jones et al., 1993).
Entre las bacterias que provocan

enfermedades en tomate estn

Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis agente causal de cancro bacteriano en tomate; Pseudomonas


syringae pv. tomato responsable de la peca bacteriana y Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
agente causal de mancha bacteriana (Blancard, 1990). Dentro de los hongos se encuentran
Alternaria sp. y Botrytis sp., los cuales son los principales agentes causales de problemas
fitosanitarios de tomate en Chile. Tambin se puede nombrar Phytophthora infestans que causa
tizn tardo. El virus ms importante presente en Chile que afecta al cultivo es el Virus del Mosaico
del Tabaco (Tobacco Mosaic Virus - TMV) (Izquierdo et al., 1992).
En cuanto a nematodos el de mayor accin en el cultivo es Meloidogyne spp. que ataca
las races provocando agallas, ndulos o tumores, reduciendo en forma importante la actividad de
stos (Bravo y Aldunate., 1988).

2.3 Antecedentes generales del cncer bacteriano del tomate causado por Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis

Este patgeno fue descrito por primera vez en el ao 1909, por Edwin F. Smith sobre
tomates bajo invernadero en Grand Rapids, en el estado de Michigan, Estados Unidos. La
denomin en una primera instancia como enfermedad de Grand Rapids, pero ms tarde le dio el
nombre de marchitez bacteriana. A esta enfermedad se le dio importancia hacia 1926 cuando
produjo daos importantes en algunas zonas de Estados Unidos, y en los aos siguientes se
extendi por el mundo ocasionando grandes perdidas en produccin (Aguirre, 1965).

2.3.1 Organismo Causal

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis es una bacteria Gram-positiva, aerbica,


perteneciente a los Actinomycetes, que no forma esporas. Los informes sobre motilidad y
encapsulacin son variados, pero en general la bacteria no presenta estas caractersticas. Las
clulas pueden ser de diferentes formas
(pleomorficas, cocoidales, etc.)

dependiendo de las condiciones de crecimiento

La reproduccin es caracterizada por la divisin snapping o

encajarse a presin, la cual da como resultado los arreglos en V y en forma de Y de las clulas.
La taxonoma de este gnero se basa en gran parte en la presencia del cido 2,4-diamino-butrico
en los peptidoglicanos de la pared celular. Adems, los cidos grasos de la clula son en su
mayora saturados de cadenas largas, con 15-17 tomos del carbono. Sin embargo, un compuesto
caracterstico para esta subespecie es que posee un cido graso no saturado, el cido
pentadecenoico. Las colonias en agar son de color amarillo caracterstico y alcanzan un dimetro
de 2-3 mm en 5 das. Estas son lisas y tienen mrgenes enteros y una consistencia butirosa.
(Jones et al., 1993).

2.3.2 Ciclo y epidemiologa de la enfermedad

Las fuentes de inoculo para esta enfermedad incluyen residuos de planta infectadas en el
suelo, malezas, estacas de madera contaminadas, y semillas. Otras vas son por medio de agua,
equipo contaminado, y trabajadores (Jones et al., 1993).
Las bacterias invernan en o sobre las semillas y, en algunas reas, en los restos de las
plantas depositadas en el suelo. Las infecciones primarias pueden deberse a la propagacin de
esas bacterias desde las semillas hasta los cotiledones u hojas, pero la mayora de las veces se
debe a la penetracin de dichas bacterias a travs de heridas en las races, tallos, hojas y frutos.
Las bacterias son llevadas hasta ellos a travs de la manipulacin de estos rganos, la cual tiene
lugar durante el trasplante, aunque tambin son diseminadas por el agua del suelo o la lluvia
acarreada por el viento. Una vez que se encuentran dentro de la planta, las bacterias llegan al
sistema vascular y se desplazan y propagan principalmente en los tejidos del floema. La bacteria
tambin invade los vasos espirales, y se mueven a travs de ellos y llegan al floema, medula y
corteza, donde forman grandes cavidades que originan cancros (Agrios, 1993).
La propagacin puede ser por la lluvia y el riego por aspersin. En cultivos sin suelo esta
se puede transmitir a travs de la solucin nutritiva, pero en especial la propagacin de la
enfermedad se ve favorecida en las labores de poda y deshoje, que da lugar a una distribucin en
lnea bastante caracterstica.
Las condiciones optimas de desarrollo son de 18 24 C con ms de un 80 % de
humedad. Como la mayora de las bacterias se ve favorecida por periodos climticos hmedos.
Las plantas muy vigorosas, despus de un aporte excesivo de nitrgeno, seran mas sensibles
(Blancard, 1990).
Uno de los sntomas mas frecuentes de esta enfermedad es la perdida de turgencia de
porciones internerviales de los foliolos que rpidamente se desecan. En el interior de los tallos se
aprecia un amarillamiento de los tejidos medulares en contacto con los vasos; tejidos que
comienzan a necrosar rpidamente, al tiempo que se forman oquedades en la medula. Estos
sntomas sistmicos pueden no ser nicos. Pequeas pstulas grises o negras sobre hojas, tallos y

frutos pueden hacerse visibles como consecuencia de las penetraciones bacterianas por estomas
y/o heridas (Nuez, 1995).
Las bacterias invaden los tallos resultando en la muerte de foliolos, hojas enteras y ramas
completas. Si el ataque se produce cuando la planta es pequea, ella puede morir. Las heridas
causadas en las races, al trasplantar a raz desnuda favorecen considerablemente la enfermedad
(Bravo y Aldunate, 1988).

2.3.3 Control del cncer bacteriano en tomate

Una vez que la planta de tomate esta infectada en el campo o invernadero, no existe un
tratamiento curativo satisfactorio o efectivo, ya que al expresarse los sntomas la planta por lo
general muere. De ah que todas las medidas o estrategias de control son de carcter preventivo,
es decir se deben tomar previo a la infeccin (Besoain, 1994).
Es fundamental tomar las precauciones para evitar su ataque u ocurrencia, para lo cual se
debe recurrir a un conjunto de medidas de higiene, como el lavado y desinfeccin de las manos y
de los equipos al trabajar con las plantas, en forma habitual; as como efectuar labores en forma
cuidadosa y prolija.
Las principales medidas de control son la utilizacin de semillas sanas, no
trasplantar a raz desnuda sino que utilizando contenedores para no daar la raz, no realizar
plantaciones en reas infectadas, rotar con gramneas y eliminar del cultivo las plantas con
sntomas de la enfermedad (Izquierdo et al., 1992).
Para el control integrado de esta enfermedad se debe partir con una semilla sana y si no
existen antecedentes que aseguren esto, se debe recurrir a la aplicacin de un tratamiento
erradicante a esta (se ha usado fermentacin con la pulpa, agua caliente, cido clorhdrico,
hipoclorito de sodio). Durante esta etapa no es aconsejable el uso de antibiticos, evitando de este
modo desgastarlos o producir problemas de resistencia con aplicaciones posteriores. Igualmente
se debe evitar manipular excesivamente las plantas, como tampoco resulta aconsejable rebajarlas,
ya que este manejo deja tejido vascular expuesto.

En los primeros meses del cultivo se deben proteger las plantas con bactericidas, rotando
los productos, o combinando productos con distintos modos de accin, realizando aplicaciones
frecuentes, ya que esta es una etapa critica en donde la bacteria se multiplica con facilidad y se
producen infecciones sistmicas. Los sntomas pueden aparecer hasta 90 das despus de
producida la infeccin.
Luego, durante la etapa de mayor intervencin manual del cultivo, se debe evitar realizar
podas y desbrotes en das con alta humedad relativa, y efectuar aplicaciones preventivas
inmediatamente despus de realizada esta labor. En los primeros focos de esta enfermedad, se
tendr que erradicar las plantas infectadas que presenten los primeros sntomas, para disminuir al
mximo las infecciones secundarias. En el caso de los invernaderos, una vez terminado el cultivo
se deben extraer todos los restos de las plantas, evitando de este modo que la bacteria pueda
sobrevivir asociada a restos de l. En plantaciones al aire libre, se recomienda incorporar
debidamente los rastrojos, y en el caso de haber habido un ataque severo, se recomienda realizar
una rotacin de al menos dos aos con cultivos no pertenecientes a la familia de las solanceas
(tomate, papa, pimentn, aj, berenjena, etc.) (Besoain, 1994).
Para el tratamiento qumico existen varios productos, especialmente preventivos, pero con
algn poder curativo segn el grado de ataque y oportunidad de aplicacin. Estos van desde los
derivados de cobre hasta los antibiticos. Los derivados de cobre actan sobre varios puntos del
metabolismo de la bacteria; mientras los antibiticos son especficos en su modo de accin, lo cual
puede conllevar a una resistencia del patgeno a stos. Esta situacin podr variar zonal o
predialmente incluso, segn la virulencia de los ataques o de la presin

de las aplicaciones

qumicas.
Por otra parte, hay que considerar que el uso de los derivados del cobre tiene limitaciones
en el momento de floracin, ya que se pueden presentar problemas de abortos de flores en la
planta. Esto se acenta en el caso de los oxicloruros ms que en los cuprosos (Rev. E y A agrcola,
1993).

2.4 Control biolgico

El control biolgico es el uso de elementos de la naturaleza en la regulacin de


poblaciones de especies dainas al hombre, como son las plagas y enfermedades de la
agricultura, las malezas y los desperdicios. Los fundamentos de este tipo de control son aquellos
que regulan los ciclos naturales de las poblaciones, las relaciones biolgicas y abiticas entre
especies, y las relaciones ecolgicas, donde se trata de promover el restablecimiento del equilibrio
natural de un ecosistema, roto por la intervencin humana.
En la agricultura existe un sin nmero de plagas que interfieren el eficiente
aprovechamiento de los recursos naturales a travs de cultivos anuales, perennes y animales.
Estas plagas son de diferente origen, siendo las principales derivadas de insectos, arcnidos,
pjaros y malezas perjudiciales al hombre. Slo en Chile se estima que existen ms de 400
especies de insectos que son plagas de la agricultura, gran parte de ellas de origen forneo. El
control biolgico es un mtodo de control de plagas insectiles, caros, microorganismos y malezas
que utiliza organismos vivos entomfagos (parasitoides y depredadores), entomopatgenos (virus,
bacterias, hongos, etc.) y fitfagos para controlarlos o regularlos. El uso del control de insectos con
insectos es el ejemplo ms conocido en nuestros das, sin embargo, en pocas recientes se trata
de controlar insectos plaga con microorganismos que les causan enfermedades mortales, por
medio de hongos, virus, bacterias, protozoos y otros. En otros casos los patgenos son utilizados
como bioinsecticidas.
Se han encontrado interesantes perspectivas para el control de nemtodos .El Centro
Internacional de la Papa, ha confirmado la eficacia del hongo Paecylomyces lilacinus como control
biolgico del nematodo del nudo (Meloidogyne spp.) que causa daos a la papa y tomates.
El control biolgico se inicia en Chile en 1903, cuando los agricultores del Valle de Quillota,
con funcionarios del Ministerio de Agricultura introducen enemigos naturales para controlar los
pulgones y la conchuela negra del olivo. Desde 1903 se han introducido a nuestro pas 91 especies
de enemigos naturales; estas especies han sido tradas desde Alemania, Brasil, Canad,
Checoslovaquia, Francia, India, Irn, Israel, Per, Uruguay, Estados Unidos y Sudfrica.

Las perspectivas del control biolgico se basan en que es un mecanismo dinmico


continuo y permanente. Existe un programa activo de largo plazo, que estudia las diferentes plagas
de los cultivos y fruticultura, analizando su biologa y ecologa, buscando mecanismos eficientes de
frenar su desarrollo. Esta metodologa de control de plagas es un elemento natural activo que se
complementa con acciones culturales y de manejo de los cultivos y aplicaciones especficas de
pesticidas selectivos que controlan la plaga, pero no afectan a los enemigos naturales,
conformando lo que se llama control integrado de plagas (Ortiz, 1983).
El control biolgico de enfermedades microbianas de plantas normalmente implica el uso
de microorganismos especficos, antagonistas del patgeno, limitando as la iniciacin y
propagacin de la enfermedad.
Una de las grandes ventajas del control biolgico es que con frecuencia los agentes de
biocontrol estn dotados de propiedades similares al patgeno, entre las que cabe destacar las de
multiplicacin y dispersin. Pueden actuar a varios niveles en el ciclo de la enfermedad,
interfiriendo la supervivencia del patgeno en el ambiente externo, el desarrollo del patgeno sobre
la superficie del hospedador, la entrada del patgeno en el hospedador, y la transmisin del
patgeno entre los hospedadores; incluso el antagonista puede competir con el patgeno dentro
del tejido del hospedador. En realidad se trata de un aprovechamiento de ciertos principios
ecolgicos como la competencia y el antagonismo que rigen los procesos de interaccin entre
seres vivos.
Una desventaja es que debido a que los agentes de control biolgico son seres vivos, su
colonizacin y multiplicacin est interferida por el uso de muchos productos fitosanitarios,
especialmente de los antibacterianos, as como de algunos fungicidas y herbicidas.
Entre los sistemas de control que se han ensayado cabe resaltar los basados en el
antagonismo o en la competencia. Los sistemas basados en el antagonismo se aprovechan de la
capacidad de produccin de bacteriocinas o antibiticos por algunos microorganismos que afectan
negativamente al desarrollo de la bacteria fitopatgena.
Se ha comprobado que la inoculacin de las semillas con el agente antagonista del
patgeno produce efectos beneficiosos sobre el crecimiento de la planta. La poblacin inoculada
que se establece sobre la semilla no deja progresar la invasin del potencial del microorganismo

patgeno que llega a la planta. Un ejemplo claro es el de algunas cepas de Pseudomonas


fluorescens y Pseudomonas putida que se inoculan en semillas de girasol para protegerlas frente a
la marchitez producida por Sclerotinia sclerotium.
Adems, se puede enfocar el control biolgico no slo sobre las plantas en crecimiento
como en el caso anterior, sino tambin en la produccin vegetal almacenada para evitar
enfermedades postcosecha.
El avance en los estudios de biocontrol, no slo permite usar en campo las cepas
bacterianas que tienen la capacidad de dificultar el desarrollo del patgeno y as disminuir la
incidencia de enfermedades. En la actualidad se tiende a emplear como agentes de biocontrol
productos secundarios del metabolismo microbiano (toxinas, antibiticos, bacteriocinas), como en
el caso de algunas especies de Pseudomonas que producen metabolitos antifngicos, tales como
la pirrolnitrina, 2,4-diacetilfloroglucinol, piocianina y el cido fenacn-1-carboxlico. Se ha
demostrado que algunos de estos productos, no slo tienen actividad antifngica y antibacteriana,
sino tambin actividad herbicida y antivrica.
A diferencia del control qumico, en el control biolgico, los efectos sobre el patgeno son
ms especficos y adems, sus repercusiones sobre el medioambiente son menores por la
biodegradabilidad de estas molculas. En este sentido, las bacterias productoras de toxinas se han
revelado tambin como un agente de gran potencial en el biocontrol de microorganismos
fitopatgenos (hongos y bacterias) (Durn y Cazorla, 2003).

2.5 Antecedentes del control de patgenos con Bacillus subtilis

Con el objetivo de determinar si las aplicaciones al suelo de Bacillus subtilis mejoran el


control de Fusarium oxysporum en arveja china y determinar la rentabilidad de estas prcticas, se
realiz un ensayo en el verano de 1995-96, en Guatemala. El trabajo se efectu en un terreno con
antecedentes de la presencia de este patgeno. Se evaluaron 3 dosis (1.7, 2.5, y 3.4 kg/ha de
Kodiac, producto comercial a base de B. subtilis) en 1 y 2 aplicaciones del suelo. Adems un
tratamiento de Kodiac a la semilla (1 libra/100 libras de semilla). Se evalu incidencia de Fusarium
oxysporum; rendimiento experimental, costos de produccin y rentabilidad.

Los tratamientos con menor porcentaje de incidencia de Fusarium oxysporum fueron el de


3.4 kg/ha de Bacillus subtilis aplicado al suelo en 2 ocasiones con 9.6% de incidencia y el de
Bacillus subtilis aplicado a la semilla con 11.2% de incidencia. Ambos fueron estadsticamente
iguales y superiores al resto.
Con la aplicacin de 3.4 kg/ha de B. subtilis en 2 aplicaciones se obtuvo el mejor
rendimiento (6.56 tm/ha), seguido de los tratamientos con 2 aplicaciones de B. subtilis (1.7 kg/ha y
2.5 kg/ha de B. subtilis al suelo) con 6.7 tm/ha y 5.42 tm/ha respectivamente.
El tratamiento ms rentable fue el de 1.7 kg/ha de B. subtilis en 2 aplicaciones con 17.42%
de rentabilidad seguido del tratamiento con 3.4 kg/ha de B. subtilis al suelo (2 aplicaciones) con
16.60%. El resto de los tratamientos presentaron rentabilidades sumamente bajas de 9.14% a 7.76%.
Se concluye que las aplicaciones de Bacillus subtilis al suelo mejoran el control de
Fusarium oxysporum, pero incrementan fuertemente los costos de produccin. Se recomienda su
uso aplicado al suelo, en suelos muy infestados por el patgeno (Sols, 1996).
Virgen y Garca (1990) obtuvieron una reduccin en la incidencia de Fusarium oxysporum f.
sp. niveum, en plantas de sanda (Citrullus vulgaris), mediante el tratamiento de la semilla con
4

-1

Bacillus subtilis (1.6 x 10 bacterias g de semilla). Virgen-Calleros et al. (1996) lograron en papa
(Solanum tuberosum) cierto control de Rhizoctonia solani con la aplicacin de Bacillus subtilis
(Zabaleta-Meja, 2000).
Tambin hay antecedentes donde se determin el efecto de Bacillus spp sobre la
germinacin y el desarrollo de semillas de tomate infectadas con Fusarium oxysporium var.
cubensis (Brada et al., 1995).
Su efecto benfico cuando se aplica junto a las semillas o en forma individual no se debe
exclusivamente al antagonismo con los patgenos sino que influye positivamente en la
germinacin, desarrollo y rendimiento del cultivo debido a la produccin de sustancias promotoras
del crecimiento y al mejoramiento de la nutricin de las plantas.
Con respecto a B.subtilis, se ha estudiado la liberacin de compuestos con propiedades
antifngicas como la subtilina y otros antibiticos de la familia de las Iturinas (Fernndez, O., 2001).

10

2.5.1 Mecanismo de accin

Las bacterias como Bacillus subtilis al ser habitantes comunes en el suelo se establecen
por s solas en la rizosfera del cultivo tratado y colonizan el sistema radical, compitiendo con los
organismos que la atacan y por lo tanto suprimen enfermedades causadas por patgenos como
Fusarium spp. y Rhizoctonia spp.; es decir su mecanismo de accin en este caso es por
competencia. Bacillus subtilis tambin es una bacteria eficaz contra varios hongos patgenos, ya
que es capaz de producir un antibitico, llamado iturin, el cual es particularmente activo contra el
hongo,

Sclerotina fruticola, y

tambin se ha probado para el control del hongo patgeno,

Verticillium (Annimo, 2002).

11

3.- MATERIALES Y MTODOS

3.1 Material bacteriano utilizado

El aislado utilizado de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (C.m.m.) fue


proporcionado por el Laboratorio de Fitopatologa de la Facultad de Agronoma de la Universidad
Catlica de Valparaso. Este organismo fue inicialmente aislado desde plantas de tomate
(Lycopersicum esculentum) infectadas con este patgeno. Tambin para este estudio se utilizaron
diferentes cepas nativas de aislados de Bacillus sp. que se obtuvieron de muestras de suelo
recolectado de distintas zonas de la VII Regin, en la cordillera, valle central y costa. Las cepas
utilizadas se les asign un nmero para su mejor reconocimiento en el ensayo, donde la cepa
40-1A proviene del sector del muelle de Constitucin; la cepa 102-3 del sector de Laguna Torca y
la cepa 115-1 del sector de Vilches alto (Enladrillado).
Todas las cepas estudiadas pertenecen a la coleccin realizada a travs del proyecto FIA
PI-C-2002-1-A-84: Evaluacin de cepas nativas de la bacteria Bacillus subtilis en el biocontrol de
enfermedades bacterianas de cultivos hortofrutcolas de importancia regional.

3.2

Determinacin del tiempo de incubacin para tres cepas de Bacillus sp. que logra la

mayor actividad biocontroladora sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

Para realizar este experimento, cada cepa nativa de Bacillus sp., se inocul en un tubo con
6 ml de caldo nutritivo (CN). Luego estos fueron colocados en agitacin permanente a 20C,
obtenindose posteriormente de ellos una alcuota en cuatro tiempos diferentes de incubacin
(3, 6, 24 y 48 horas).
El patgeno Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis se sembr en un matraz
conteniendo 200 ml de medio de cultivo lquido, dejndose crecer en agitacin constante por 24
horas a 20C. Una vez cumplido este tiempo, sobre placas Petri con 30 ml de agar nutriente, se
agreg 1 ml del cultivo de la bacteria patgena (Clavibacter), el que fue esparcido
homogneamente sobre la placa. Despus de 30 minutos se retir el sobrenadante y se procedi a

realizar orificios en el agar con un sacabocado de 5 mm, en un nmero de tres por placa Petri
(Figura 3.1). En cada uno de stos, se agreg 50 l del cultivo de las cepas de Bacillus sp.
incubados por 3, 6, 24 y 48 horas. Luego las placas, fueron colocadas a 4C por 2 horas
Posteriormente todas las placas se incubaron en una estufa a una temperatura constante de 25C,
midiendo el halo de inhibicin a las 48 horas despus de la inoculacin, cabe destacar que los
halos de inhibicin no presentaron un dimetro uniforme, por lo que se debi sacar un promedio de
cada uno de ellos.
Con este ensayo se logr determinar el tiempo de crecimiento en el que las diferentes
cepas de Bacillus sp. eran ms activas sobre el patgeno.

Cepa
102-3
Clavibacter

michiganensis

Subsp. michiganensis
Cepa
40-1A

Cepa
115-1

Figura 3.1 Esquema del ensayo in vitro para determinar en las cepas de Bacillus sp. el tiempo de
incubacin ptimo, en cuanto a inhibicin del crecimiento de Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis.

3.2.1

Diseo experimental

Los tratamientos en este ensayo se ordenaron en un diseo completamente al azar (DCA),


donde cada unidad experimental correspondi a cada uno de los orificios (tres por placa petri)
realizados en la placa petri con agar nutritivo. El ensayo const de tres tratamientos cada uno con
12 repeticiones.
Los datos obtenidos de las distintas mediciones en cada tiempo de incubacin por
separado, fueron sometidos a un anlisis de varianza (ANDEVA), y posteriormente se procedi
a separar sus medias por medio del test LSD (p 0,05).

3.3

Determinacin de

la

curva de

crecimiento de Bacillus sp. y

Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis

La determinacin fue llevada a cabo en tubos con 6 ml de caldo nutritivo, los cuales se
sembraron tanto con las cepas 40-1A, 102-3 y 115-1, como con el patgeno, en tubos de ensayo
independientes. Posteriormente estos tubos fueron colocados en agitacin permanente a 20C.
Luego se procedi a sacar una alcuota de cada tubo a las 3, 6, 24, 48 y 72 horas de incubacin,
y con la ayuda de una cmara de Neubauer se procedi a hacer el conteo bacterial. Los valores
obtenidos a partir del conteo realizado con la cmara, fueron ingresados a la siguiente formula para
estimar el nmero de bacterias/ml:

Formula 1
N Bacterias
Bacterias / ml

0,0025 mm *0,1*1000

Con los resultados obtenidos desde la formula se elaboraron las curvas de crecimiento
para cada una de las cepas nativas de Bacillus sp. y Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis.

3.4

Determinacin y comparacin de la CMI de tres cepas Bacillus sp. sobre Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis

La actividad antimicrobiana se puede medir y comparar determinando la cantidad mas


pequea del agente que se necesita para inhibir el crecimiento del organismo a controlar. A este
valor se le conoce con el nombre de concentracin mnima inhibitoria (CMI) (Brock, et al., 1999). El
procedimiento utilizado en este ensayo para determinar la CMI fue el mtodo de difusin en agar.
De esta forma, el patgeno fue inoculado en un matraz con 200 ml de medio de cultivo
lquido, dejndose crecer en agitacin constante por 24 horas a 20C. Luego se sembr en forma
uniforme 1 ml de este cultivo en una placa petri conteniendo 30 ml de agar nutritivo. Despus de
30 minutos se elimin el excedente y se procedi a realizar seis orificios de 5 mm de dimetro con
un sacabocado. En estos se aadi cantidades conocidas del agente antimicrobiano (50 l), que
en este experimento correspondi a tres diferentes cepas de

Bacillus sp., mas un producto

comercial en base a la cepa QST 713 de Bacillus subtilis (Serenade, Moviagro). Adems se
incluy un testigo con solo agua destilada. En el caso del producto comercial Serenade su
9

concentracin inicial fue de 5 x10 Bacillus/ml la cual debi ser ajustada a una concentracin de 10

Bacillus/ml para igualarla con las concentraciones iniciales de las cepas nativas de Bacillus sp..
Cada cepa nativa de Bacillus sp. se inocul en un tubo con 10 ml de caldo nutritivo (CN) y
fueron colocados en agitacin permanente a 20C por 24 horas. Una vez que las cepas nativas
cumplieron 24 horas de crecimiento se procedi a preparar las diferentes diluciones. Tanto las
cepas de Bacillus sp., como Serenade, en las distintas concentraciones fueron colocadas en
cantidad de 50 l en los orificios hechos en el agar nutritivo. Se ocuparon placas separadas para
cada cepa, al igual que para Serenade, cada una con seis orificios en que se evaluaron cinco
diferentes diluciones ms un testigo. El ensayo const de doce repeticiones para cada tratamiento
(Figura 3.2).
Una vez que las placas fueron inoculadas con las diferentes diluciones de las cepas de
Bacillus sp. y del producto comercial Serenade, estas fueron colocadas a 4C por 2 horas
Posteriormente todas las placas se incubaron en una estufa a una temperatura constante de 25C,
midiendo el halo de inhibicin a las 48 horas despus de la inoculacin, cabe destacar que los

halos de inhibicin no presentaron un dimetro uniforme, por lo que se debi sacar un promedio de
cada uno de ellos.

Bacillus sp. 10
(sin diluir)

Agua estril
(testigo)
Clavibacter

Bacillus sp. 10

michiganensis

Bacillus sp. 10

Subsp. michiganensis

Bacillus sp. 106

Bacillus sp. 10

Figura 3.2 Esquema del ensayo in vitro utilizado para determinar para tres cepas de Bacillus sp. y
Serenade la concentracin mnima inhibitoria (CMI) sobre Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis, en medio de cultivo agar nutritivo.

3.4.1 Diseo experimental y anlisis de datos

Los tratamientos a evaluar en este ensayo se ordenaron en un diseo completamente al


azar (DCA), donde cada unidad experimental correspondi a cada uno de los orificios (seis por
placa petri). El ensayo consto de cuatro tratamientos ms un testigo, cada uno con 12 repeticiones.

Los datos obtenidos de las distintas mediciones fueron sometidos a un anlisis de


varianza (ANDEVA), y posteriormente se procedi a la separacin de medias por
medio del test de LSD (p0.05).

4.- RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1

Determinacin del tiempo de incubacin para tres cepas de Bacillus sp. que logra la

mayor actividad biocontroladora sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

Los resultados de este ensayo son fundamentales dentro del estudio ya que a partir de
ellos se pudo determinar el tiempo en el cual las diferentes cepas nativas de Bacillus sp.
alcanzaron su mayor control sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis.

Halo inhibicin (mm)

50

40

30

20

10

0
3

24

48

Tiempo de incubacin (horas)


40-1A

102-3

115-1

Figura 4.1 Halo de inhibicin sobre Clavibacter michiganensis subsp.


michiganensis de tres cepas nativas de Bacillus sp. en diferentes
tiempos de incubacin.

Las cepas nativas de Bacillus sp. utilizadas demostraron tener un efecto en el control de
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Figura 4.1). Todas ellas luego de seis horas de
crecimiento, mostraron ya inhibicin sobre el patgeno. A las 24 horas de incubacin se alcanz el
mximo halo de inhibicin sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, siendo la cepa
mas destacada la 102-3, logrando un halo inhibitorio de 44,3 mm, seguida de la cepa 115-1 con 34
mm. La que mostr el menor efecto fue 40-1A con 29,2 mm de halo inhibitorio. A las 48 horas las
tres cepas redujeron su control y las diferencias entre ellas se hicieron menores.

En estudios realizados por Casanova (2002) en el control in vitro de Clavibacter


michiganensis subsp. michiganensis con diferentes cepas de Pseudomonas spp. se obtuvieron
resultados positivos, logrando halos inhibitorios en varias de las cepas analizadas, sin embargo al
comparar estos resultados con los obtenidos en este ensayo en Bacillus sp. presenta un efecto
controlador mas importante, con lo que se puede concluir que estas cepas nativas podran
constituir una buena alternativa para el control biolgico de Clavibacter.
Con los resultados anteriores se efectu una separacin de medias de los halos obtenidos
a las 24 horas, con las tres cepas evaluadas. En este anlisis estadstico se encontraron
diferencias altamente significativas entre ellas, donde la cepa 102-3 es la que logr
significativamente el mejor control sobre el patgeno, seguida de 115-1 y luego 40-1A. (Figura 4.2).

50

Halo inhibicin (mm)

b
40

30
20
10
0
24
Tiempo de incubacin (horas)
102-3

115-1

40.1A

Figura 4.2 Comparacin del halo de inhibicin de las cepas nativas de


Bacillus sp. con 24 horas de crecimiento sobre Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis.

4.2

Determinacin de

la

curva de

crecimiento de Bacillus sp. y

Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis

Al realizar el conteo de Bacillus sp. y el patgeno en cinco diferentes tiempos de


incubacin, se elabor una curva que coincidi con la curva de crecimiento bacteriano descrita
tanto para las cepas nativas de Bacillus sp. como para el patgeno Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis. La poblacin del patgeno fue siempre mayor que la de las tres cepas
nativas de Bacillus sp.. En el caso de estos ltimos la que present una mayor poblacin fue la
102-3, mientras

que en las cepas 40-1A y 115-1, sus poblaciones fueron bastante similares

(Figura 4.3).

108 Bacterias / ml

6
5
4
3
2
1
3

24

48

72

Tiempo de incubacin (horas)


40-1A

102-3

115-1

Cmm

Figura 4.3 Curvas de crecimiento de las cepas nativas de Bacillus sp.


(40-1A, 102-3 y 115-1) y el patgeno (Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis).

La curva de crecimiento bacteriano puede dividirse en distintas fases: fase lag o latencia,
fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. La fase de latencia en este caso abarc entre
las 3 y 6 horas desde inicio de incubacin. Entre las 6 y 24 horas se observ la fase de mayor
crecimiento, llamada fase de crecimiento exponencial, alcanzando a las 24 horas su mxima

capacidad de crecimiento. Segn los autores Brock y Madigan (1991), lo anterior es una
consecuencia del hecho de que cada clula se divide para formar dos clulas, cada unas de las
cuales tambin se divide para formar dos clulas ms y as sucesivamente. En general, las
bacterias tienen una mayor rapidez de crecimiento comparada con otros microorganismos. Esta
fase de crecimiento exponencial se ve afectada por la composicin del medio de cultivo, la
temperatura, entre otros. La fase de muerte de la poblacin bacteriana se empez a producir
posterior a las 24 horas de incubacin, la fase estacionaria no se ve representada en el grafico.
Brock y Madigan (1991) afirman que en la fase estacionaria no existe crecimiento, generalmente
debido al agotamiento de nutrientes indispensables o tambin por algn producto de desecho del
metabolismo bacteriano liberado al medio, el cual llega a un nivel en que es inhibidor, cesando el
crecimiento exponencial. Aunque no hay crecimiento en la fase estacionaria, muchas de las
funciones pueden continuar, incluyendo el metabolismo energtico y algunos procesos
biosintticos. S la incubacin contina despus de que una poblacin alcanza la fase estacionaria,
las clulas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo ms probable es que mueran. Si
esto ltimo ocurre, la poblacin se encuentra en la fase de muerte.

Finalmente cabe sealar que el tiempo de incubacin con el que se logr el mayor control
de Bacillus sp. sobre Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, fue tambin 24 horas,
pudiendo a partir de esto concluir que existe una directa relacin entre mximo crecimiento
bacterial de Bacillus sp. y el nivel de control que logr este sobre el patgeno. Esto se corrobora si
comparamos el control logrado a las 6 y 48 horas de incubacin donde el biocontrolador logr una
menor inhibicin del crecimiento del patgeno, lo que se asociara a que su poblacin a las 6 horas
es an muy baja y a las 48 horas esta va decreciendo.

4.3

Determinacin y comparacin de la CMI para Bacillus sp. sobre Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis

Al determinar la concentracin mnima inhibitoria (CMI), que es la cantidad mas pequea


del agente antimicrobiano que se necesita para inhibir el crecimiento del organismo a controlar, los
resultados obtenidos al probar cinco diluciones diferentes, mas un testigo con agua destilada
estril, fue que los mayores halos inhibitorios se obtuvieron con la concentracin mayor de 10

bacterias/ml para las tres cepas de Bacillus sp., lo que era esperable ya que correspondi a la
concentracin sin diluir. La CMI para las tres cepas nativas de Bacillus sp. se alcanz a la
5

concentracin 10 Bacillus/ml, mientras que para el producto Serenade esta estuvo muy por
7

encima y se logr a la concentracin de 10 Bacillus/ml, Con estos resultados de CMI se hace


evidente que las cepas nativas de de Bacillus sp. a bajas concentraciones fueron mas eficaces en
el control de Clavibacter que el producto comercial Serenade. En el caso del testigo con agua
destilada estril no presento halo inhibitorio. Para todos los agentes testeados su accin a la
concentracin menor de 104 Bacillus/ml fue cero (Figura 4.4).

Halo inhibicin (mm)

50

40

30

20

10

108

107

106

105

104

Bacillus sp./ml
102-3

115-1

40.1A

Serenade

Figura 4.4 Halo de inhibicin de cepas nativas de Bacillus sp. y


Serenade a distintas diluciones, sobre Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis.

Cabe destacar que a la concentracin en la cual el producto comercial Serenade alcanz


su CMI, su halo de inhibicin fue menor a cualquiera de las cepas nativas de Bacillus sp., de lo cual
se puede deducir que a bajas concentraciones las cepas nativas de Bacillus sp.. se comportan de
mejor manera ante el patgeno a controlar.

Con los datos obtenidos se procedi a comparar los halos de inhibicin para las tres cepas,
5

a la concentracin 10 bacterias/ml, para lo que se realiz una separacin de medias. De acuerdo


a estos, existen diferencias altamente significativas entre ellas. La cepa que tuvo estadsticamente
el mejor comportamiento para esta concentracin fue la 102-3, la cual obtuvo un halo inhibitorio de
28,2 mm. siendo superior a las otras dos cepas, 40-1A fue la que presento una menor inhibicin
sobre el patgeno (Figura 4.5).

35

a
Halo inhibicin (mm)

30

b
c

25
20
15
10
5
0
5
10E+5
10

Bacillus sp./ml
102-3

115-1

40-1A

Figura 4.5 Comparacin de la concentracin mnima inhibitoria (CMI) de


cepas nativas de Bacillus sp. sobre Clavibacter michiganensis subsp.
michiganensis.

Como ya se mencion, a bajas concentraciones las cepas nativas de Bacillus sp. se


mostraron como un mejor controlador de Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis que el
producto comercial Serenade.

El obtener resultados positivos en cuanto al control de Clavibacter abre una ventana


alentadora para continuar con estos estudios. Adems, como menciona Ortega (1998), en general
los costos y el tiempo involucrados en la formulacin de agentes biocontroladores son mucho
menores que los empleados en la obtencin de pesticidas qumicos, aspecto muy positivo que
motiva y que permite visualizar como una alternativa el control biolgico de patgenos vegetales.

Finalmente, es conveniente destacar la poca existencia de literatura mundial respecto a


investigaciones de esta naturaleza, en las que se emplea Bacillus subtilis para el control de
enfermedades causadas por bacterias fitopatgenas. Lo contrario ocurre en el caso de
enfermedades que son causadas por hongos fitopatgenos en donde existe abundante informacin
respecto a control biolgico.
Este estudio contribuir a desarrollar nuevas alternativas de control de Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis por medio del uso de cepas nativas de Bacillus sp., las cuales
se perfilan como una buena opcin para el manejo de esta enfermedad.

5.-CONCLUSIONES

En los diferentes ensayos realizados se logr concluir que las cepas nativas de Bacillus
sp. 102-3, 115-1 y 40-1A son capaces de inhibir el crecimiento de Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis.
El tiempo de incubacin en el cual las cepas de Bacillus sp. se encuentran ms activas
sobre el patgeno es de 24 horas, tiempo en el cual tanto las cepas como el patgeno se
encuentran en el mximo de su crecimiento exponencial (fase exponencial).
La concentracin mnima inhibitoria (CMI) revel que las cepas nativas de Bacillus sp.
fueron capaces de controlar a Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis a una menor
concentracin que el producto comercial Serenade. De las tres cepas analizadas la de mejor
accin controladora fue la 102-3, la cual se destac en todos los ensayos practicados.

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