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ORIGINALES

Alteraciones proteicas de la membrana


eritrocitaria en la esferocitosis hereditaria
y su relacin con la expresividad clnica
y biolgica de la enfermedad
Sonia Ayala, Isabel Besson, Marta Aymerich, Llus Berga
y Joan Llus Vives Corrons
Servei dHematologia Biolgica. Escola Professional dHematologia Farreras Valent.
Hospital Clnic i Provincial. Universitat de Barcelona.
esferocitosis hereditaria, membrana eritrocitaria
F UNDAMENTO: El presente estudio, realizado en 20 pacientes con esferocitosis hereditaria
(EH), ha tenido como principal objetivo aportar una mayor informacin sobre las alteraciones
electroforticas de las protenas de membrana eritrocitaria (ME) y su posible relacin con
los aspectos clnicos, biolgicos y genticos de la enfermedad.
M TODOS: La determinacin de las magnitudes hematolgicas generales, la concentracin
de reticulocitos en sangre, la resistencia osmtica eritrocitaria (ROE) y el anlisis
morfolgico de los eritrocitos en el frotis sanguneo se realizaron mediante los mtodos
habituales. El anlisis electrofortico de las protenas de ME se realiz en gel de
poliacrilamida y dodecilsulfato sdico (SDS-PAGE), de acuerdo con los mtodos Laemmli y
Fairbanks.
RESULTADOS: En 8 casos (40%) se observ un dficit parcial de banda 3, aislado o asociado
a una ligera disminucin de protena 4,2. En todos ellos, junto a la presencia de esferocitos,
se observ tambin una alteracin morfolgica peculiar conocida como eritrocitos pinzados
(pincered cells). De los 12 pacientes restantes, 2 (10%) presentaron disminucin de
protena 4,2 aislada, 2 casos (10%) disminucin de ankirina y 2 casos (10%) disminucin
de espectrina. En 6 casos (30% del total) el patrn electrofortico de las protenas de ME
fue normal. El anlisis de regresin lineal simple mostr una correlacin significativa (r = 0,6; p < 0,01) entre la protena 4,2 (palidina) y la concentracin corpuscular media de
hemoglobina (CCMH). Por otro lado, el anlisis de regresin mltiple evidenci una correlacin (r2 = 0,6; p < 0.0001) entre la cantidad de protena 2,1 (ankirina) y dos parmetros
hemtolgicos bsicos: el volumen corpuscular medio (VCM) y la amplitud de distribucin
eritrocitaria (ADE).
CONCLUSIONES: El dficit de banda 3 es la alteracin proteica ms frecuentemente observada en la EH.

Abnormalities of red blood cell membrane proteins in hereditary spherocytosis


and their relationship with clinical and biological aspects of the disease
BACKGROUND: In the present paper we report a study of 20 patients with hereditary
spherocytosis (HS) performed with the aim of provide further information on the
electrophoretic abnormalities of red blood cell (RBC) membrane proteins and their putative
relationship with the clinical, biological and genetic aspects of the disease.
M ETHODS: General hematological parameters, reticulocyte count, osmotic fragility test and
erythrocyte morphology analysis, were performed by routine procedures. Membrane proteins
of erythrocyte were analyzed by SDS-polyacrylamide gradient gel electrophoresis (SDS-PAGE)
using the Laemmli and Fairbanks methods.
RESULTS: In 8 out of 20 cases (40%) a defect of band 3, alone or associated with a slight
deficiency of protein 4.2, was observed. In addition to the presence of spherocytes, in all
these 8 patients, a peculiar morphologic RBC alteration called pincered RBCs was also
observed. Moreover, 2 cases showed a deficiency of protein 4.2, 2 cases a deficiency of
ankyrin and 2 cases a deficiency of spectrin. In 6 cases (30%) the electrophoretical pattern
of the erythrocyte membrane proteins was normal. A significant (r = -0.6; p < 0.01)
correlation between the protein 4,2 (pallidin) and the mean corpuscular haemoglobin
concentration (MCHC) was found. Also, the multiple regression analysis showed a correlation
(r2 = 0.6; p < 0.0001) between the amount of protein 2.1 (ankyrin) and two hematological
parameters: the mean corpuscular volume (MCV) and the red cell distribution width (RDW).
CONCLUSIONS: The defect of band 3 is the most frequent membrane protein abnormality
associated with HS.
Med Clin (Barc) 19951 105: 45-49

Correspondencia: Prof. J. L. Vives Corrons.


Servei dHematologia Biolgica. Hospital Clnic i Provincial.
Villarroel, 170. 08036 Barcelona.
Manuscrito aceptado el 20-1-1995

La esferocitosis hereditaria (EH) es la forma ms frecuente de anemia hemoltica


congnita en la poblacin blanca y su incidencia, en el litoral mediterrneo, se ha
estimado en 1 caso por cada 3.000 nacimientos1. La expresividad clnica de la EH
puede variar desde una anemia moderada o leve hasta formas graves con .gran
espienomegalia1,2. En aproximadamente el
80% de los casos, la EH se transmite
hereditariamente con carcter autosmico
dominante y los restantes estn constituidos por formas autosmico recesivas, dominantes con escasa penetrancia gnica
o nuevas mutaciones3. Cabe sealar que,
a diferencia de la forma dominante, caracterizada prcticamente siempre por una
escasa expresividad clnica, la forma
recesiva suele acompaarse de anemia
hemoltica crnica, generalmente intensa4,5. A pesar de los avances en el conocimiento etiolgico y fisiopatolgico de esta
enfermedad, su diagnstico an se basa
en la observacin de esferocitos en sangre perifrica y en la disminucin de la
resistencia osmtica eritrocitaria (ROE). En
la actualidad, se sabe que la EH obedece
a un defecto proteico de la membrana
eritrocitaria (ME) y aunque, en principio,
ste se sita preferentemente en la
espectrina5,6, diversos trabajos recientes
sealan que tanto el dficit de espectrina
como probablemente tambin el de protena 4,2 (palidina) obedecen a alteraciones cualitativas o cuantitativas de la
ankirina7,8. Ms recientemente, se han
descrito algunos casos con disminucin de
la banda 3 9,10. Estos casos pueden
clasificarse en dos grupos, uno relativamente homogneo y con un modelo de
transmisin autosmico dominante y otro
ms heterogneo, especialmente en su
modo de transmisin hereditaria, en el que
el dficit de banda 3 se asocia con una
reduccin parcial de la protena 4,2 como
defecto secundario11. De acuerdo con la
gran variedad de patrones que ofrece el
estudio de las protenas de ME mediante
mtodos electroforticos en soporte de
poliacrilamida (PAGE), los objetivos del
presente estudio han sido: 1) analizar
electroforticamente (SDS-PAGE) las alte45

MEDICINA CLNICA VOL. 105. NM. 2. 1.995

raciones de las protenas de la ME en un


grupo de pacientes de origen espaol con
EH, y 2) estudiar la posible relacin entre
las alteraciones proteicas observadas y el
comportamiento clnico o biolgico de la
enfermedad.
Pacientes y mtodos
Se han estudiado 20 pacientes con EH (9 varones y
11 mujeres) no espienec-tomizados con una media
de edad de 25 19 aos. El estudio familiar se realiz en 17 casos. La seleccin de los pacientes, llegados al Servicio de Hematologa durante un perodo
de 2 aos (1992-1994), se llev a cabo segn los
criterios clnicos y biolgicos convencionales de EH:
1) anemia hemoltica con presencia de esferocitos
circulantes; 2 ) aumento de la concentracin
corpuscular media de hemoglobina (CCMH); 3) disminucin de la ROE, y 4) positividad de la prueba del
glicerol acidificado (PGA). Se ha incluido tambin un
grupo control constituido por 47 donantes del banco
de sangre del Hospital Clnic i Provincial de Barcelona (32 varones y 15 mujeres), cya media de edad
era de 40 12 aos, para determinar los intervalos
de referencia de las cantidades relativas de cada una
de las protenas de membrana eritrocitaria estudiadas electroforticamente.

Estudio hematolgico bsico y pruebas de hemlisis.


las magnitudes generales de sangre perifrica se determinaron mediante un autoanalizador Technicon
modelo H*2 (Bayer Diagnostic Systems). El recuento
de reticulocitos, el estudio de la ROE y la PGA se realizaron mediante los mtodos habituales12,13. El estudio morfolgico de los eritrocitos a partir del frotis
sanguneo se complet, en todos los casos, con su
examen ultraestructural mediante un microscopio
electrnico de barrido Jeol (modelo JSM-25SIl)14 .
Anlisis de las protenas de membrana eritrocitaria,
las protenas de ME se estudiaron mediante fraccionamiento electrofortico en geles de poliacrilamida y
condiciones desnaturalizantes con dodecil sulfato
sdico (SDS-PAGE), de acuerdo con los mtodos de
Fairbanks et al15 para cuantificar la y espectrina
(bandas 1 y 2, respectivamente) y ankirina (banda
2,1) y de Laemmli16 para cuantificar todas las dems
(banda 3; banda 4,1; banda 4,2 o palidina; banda
4,9 o desmatina; banda 5 o actina, banda 6 o
gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa y banda 7 o
tropomiosina eritrocitaria). El estudio se realiz a partir
de 10 ml de sangre venosa tratada con EDTA-K3 . Tras
su centrifugacin a 3.000 rpm durante 10 min a 4
C, se separaron los eritrocitos de la capa de leucocitos
y plaquetas y se lavaron tres veces consecutivas con
PBS (tampn fosfato 5 mM, cloruro sdico 150 mM).
Una vez lavados, los eritrocitos se incubaron en un
medio hipotnico constituido por tampn fosfato 5
mM y fenilmetilsulfonil fluoro (PMSF) 0,3 mM durante 10 min y se centrifugaron a 15.000 rpm durante 10 min a 4 C. El proceso de lavado se repiti
varias veces hasta obtener un concentrado de membranas prcticamente desprovisto de hemoglobina o
blanco (CMB) que se conserv a -80 C hasta el anlisis. La concentracin proteico del CMB se determin mediante el mtodo colorimtrico de Lowry et al17
y para el anlisis sta se ajust a 1 mg/ml. Para el
estudio electrofortico de las protenas en SDS-PAGE
se emplearon cubetas Hoefer (modelo SE400). La
muestra (16 l) se hizo migrar en gradiente lineal (5
al 15%) segn Laemmli1 6 a 50V y 35 mA y en
gradiente exponencial (3,5 al 17%) segn Fairbanks
et al15 a 110V. Finalizada la electroforesis, las fracciones proteicas (bandas) se fijaron con isopropanol al
25% y cido actico al 10%, y se tieron con azul de
Coomassie (0,05% en cido actico al 10%) durante
1 h 30 min a 60 C. A continuacin, los geles se decoloraron, en dos fases, la primera con isopropanol
al 25% y cido actico al 10%, y la segunda con
isopropanol al 5% y cido actico al 10% durante 2
horas. Finalmente, la cuantificacin de las fracciones proteicas se realiz mediante un densitmetro
Sebia (modelo Preference, adaptado a los requerimientos de este anlisis por la firma Atom). La inte-

46

TABLA 1
Magnitudes hematolgicas y bioqumicas generales y pruebas de hemlisis
en los 20 pacientes con esferocitosis hereditaria

Eritrocitos(x 1012/l)
Varones
Mujeres
Hemoglobina (g/l)
Varones
Mujeres
Hematcrito (l/l)
Varones
Mujeres
VCM (fl)
CCMH (g/l)
ADE (%)
Reticulocitos (x 109/l)
LDH (U/mol)
Bilirrubina total (mol/l)
Haptoglobina (mol/l)
Ferritina (mol/l)
ROE (g/l NaCl)
Inmediata
Incubada
PGA (s)
Esferocitos (%)

Esferocitosis
hereditaria
(X DE)

Valores de
referencia
(X DE)

4,0 0,4
3,6 0,3

4,9 0,3
4,6 0,3

116 20
109 9

156 9
142 8

0,33 0,05
0,31 0,03
84 5
350 11
18,3 2,5
237 81
510 189
43,6 17,3
3,17 3,36
1516 7,8

0,45 0,03
0,41 0,02
90 3
343 1
13,7 0,2
55 15
350 50
9,4 3,8
15,84 5,54
18,0 4,5

4,7 0,3
6,5 0,5
< 1.800
1,55 1,74

4,3 0,1
5,3 0,1
> 1.800
0

VCM: volumen corpuscular medio; CCMH: concentracin corpuscular media de hemoglobina; ADE: amplitud de la curva de
distribucin eritrocitaria (RDW); LDH: lacticodeshidrogenasa; ROE: resistencia osmtica eritrocitaria; PGA: prueba del glicerol
acidificado.

gracin del rea de cada pico se utiliz para calcular


el contenido o cantidad de cada protena como el
porcentaje del total de protenas.

Estudio familiar. El patrn de herencia de los casos


ndice estudiados se consider autosmico dominante
(AD) cuando uno de los progenitores presentaba la
enfermedad. Cuando en ninguno de ellos pudo demostrarse expresividad clnica o biolgica de la enfermedad se consider un patrn autosmico recesivo
(AR). El estudio familiar permiti realizar un anlisis
comparativo de cada una de las magnitudes
hematolgicas generales entre ambos grupos para lo
cual se utiliz la prueba t de Student.
Anlisis estadstico. El contenido relativo (CR) de cada
una de las protenas de ME, obtenidas en el grupo
de pacientes con EH, se compar con los intervalos
de normalidad (X 2 DE) determinados a partir de
los 47 individuos del grupo control. El valor de la
media aritmtica de las protenas deficitarias se compar con las medias aritmticas del grupo control mediante la prueba t de Student. En el grupo de pacientes con EH se realiz un anlisis de regresin lineal simple entre todas las magnitudes hematolgicas
generales (datos del hemograma) y el CR de las protenas de ME estudiadas. Para todos estos anlisis se
emple el programa estadstico Statgraphics, versin
4,0. El nivel de significacin estadstica se fij en p
inferior a 0,05.

Resultados

Estudio hematolgico bsico y pruebas de


hemlisis. El valor medio de las magnitudes hematolgicas y bioqumicas generales y de las pruebas de hemlisis practicadas en los 20 pacientes con EH se resume en la tabla 1. El estudio de la morfologa eritrocitaria a partir del frotis de sangre mostr en todos los casos una proporcin variable de esferocitos (0 al 6%) y en
7 de ellos (35% de los casos) una altera-

cin morfoigica peculiar caracterizada por


una imagen de constriccin o pinzamiento
de los eritrocitos que, de acuerdo con la
terminologa anglosajona (pincered red
blood cells), se ha denominado eritrocitos
pinzados (fig. 1).

Anlisis de las protenas de membrana


eritrocitaria. Una vez determinados los intervalos de referencia del CR de cada una
de las protenas de membrana eritrocitaria
a partir del grupo control (X 2 DE) se
compararon con los resultados, expresados como la media aritmtica de tres determinaciones diferentes, obtenidos en el
grupo de pacientes (tabla 2). Los valores
que se hallaron fuera del intervalo de normalidad se indican con un asterisco. El
perfil electrofortico de las diferentes protenas de la ME obtenidas por SDS-PAGE
segn los mtodos de Laemmli y Fairbanks
se representa en la figura 2. El anlisis
densitomtrico de los geles (fig. 3) permiti determinar el CR de cada una de las
fracciones proteicas estudia das y demostrar la existencia de diferen cias significativas entre el grupo de pa cientes con EH
y el grupo control. De acuerdo con ello,
los patrones electrofo rticos observados
fueron los siguientes 1) disminucin (1020%) del CR de banda 3 en 6 casos (30%
del total), 5 de lo cuales presentaban un
patrn de herencia AD (en el otro caso no
pudo realizars el estudio familiar, ND); 2)
disminucin (10-15%) del CR de banda 3
asociada disminucin (20-25%) del CR de
protena 4,2 en 2 casos, ambos con patrn AD; 3) disminucin (20-25%) del CR

S. AYALA ET AL.- ALTERACIONES PROTEICAS DE LA MEMBRANA ERITROCITARIA EN LA ESFEOCITOSIS HEREDITARIA Y SU RELACIN


CON LA EXPRESIVIDAD CLNICA Y BIOLGICA DE LA ENFERMEDAD

Fig. 1. Eritrocito con amplias constricciones laterales que sugieren un procesoj de pinzamiento (sealado con una flecha). Sangre perifrica de uno de los pacientes
con esferocitosis hereditaria. a) microscopio ptico (MO x 800) y b) microscopio electrnico de barrrido (MEB x 7.400).

de protena 4,2 aislada en 2 casos, ambos


con patrn AR; 4) disminucin (30-35%)
del CR de ankirina en 2 casos, ambos AR,
y 5) disminucin (10-20%) del CR de
espectrina en 2 casos, ambos AR. En 6 de

los 20 casos de EH aqu estudiados (30%


del total) el patrn electrofortico y
densitomtrico de las protenas de ME fue
normal. De ellos, 3 casos eran AD y un
caso, AR; en los 2 casos restantes no pudo

TABLA 2
Contenido relativo de las protenas de la membrana eritrocitaria obtenidas
mediante anlisis electrofortico en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato sdico
(SDS-PAGE)
Paciente

B1

B2

B 2,1

B3

B 4,2

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20

18,7
19,0
18,7
18,1
18,7
17,6
18,7
19,5
16,7
17,8
17,4
16,9
17,3
17,2
17,3
17,0
18,5
19,6
14,7a
16,2a

7,0
17,4
16,8
16,4
17,5
16,2
17,2
17,9
15,5
16,3
15,9
15,2
15,9
15,9
16,0
16,4
17,7
18,3
14,6
16,2

5,8
6,9
5,5
5,9
5,9
7,2
5,8
6,8
6,8
4,3
5,3
3,5a
3,4a
5,3
4,6
6,3
5,7
5,7
6,8
4,7

24,63
23,6a
24,5a
26,7
24,6a
24,9a
24,Oa
25,Oa
28,6
27,9
29,1
24,7a
26,3
26,8
26,6
28,8
25,5
22,7a
27,9
25,5

3,8
3,8
4,1
3,7a
3,6a
3,7a
4,1
4,3
4,5
4,3
4,1
4,2
4,9
3,7a
3,8
4,5
4,9
4,1
4,3
4,9

Controles (X DE)

18,6 1,0

16,8 1,1

5,3 0,5

27,7 1,3

4,4 0,3

B l: -espectrina; B 2: -espectrina; B 2,1: ankirina; B 3: banda 3; B 4,2: palidina. Resultados expresados en tanto por ciento.
a
Valores fuera del intervalo de normalidad.

TABLA 3
Alteraciones proteicas de la membrana eritrocitaria observadas en los 20
pacientes con esferocitosis hereditaria
Patrn electrofrico

Disminucin de B 3
Disminucin de B 3 y B 4,2
Disminucin de B 4,2
Disminucin de B 1
Disminucin de B 2,1
Normal

Intensidad
de la disminucin
(%)

Total

AD

AR

ND

10-20
10-15 y 20-15
20-25
10-20
30-35
-

6
2
2
2
2
6

5
2
3

2
2
2
1

1
2

realizarse el estudio familiar (tabla 3).

Estudio familiar. El estudio comparativo de


cada una de las magnitudes hematolgicas
entre el grupo de pacientes con patrn de
herencia AD (10 casos) y el grupo con patrn AR (7 casos) mostr diferencias significativas en la hemoglobina (Hb, en g/I)
(AD 119,3 13,1 frente a AR 103,3 +
14,9; p < 0,03) y la CCMH (en g/l) (AD
354,5 6,2 frente a AR 341,1 13,0; p <
0,01).
Anlisis estadstico. Los resultados obtenidos del anlisis de regresin lineal simple entre el CR de las protenas de ME y
las magnitudes del hemograma se muestra en la tabla 4. Debido a la existencia de
correlacin entre la ankirina y diferentes
parmetros hematolgicos se realiz un
anlisis de regresin mltiple (stepwise
regression) para eliminar las posibles
interrelaciones entre dichos parmetros.
Este anlisis demostr que el contenido de
ankirina (ANK) estaba relacionado con el
volumen corpuscular medio (VCM) y la
.amplitud de distribucin eritrocitaria
(ADE), a travs de la recta definida por
ANK = 4,9 + 0,07VCM - 27,3ADE (r2 =
0,6; p < 0,0001), lo cual demuestra que
la correlacin entre la ankirina y la hemoglobina y hematcrito estaba influenciada
por el VCM y la ADE. Por ltimo, el anlisis de correlacin entre todas las protenas de la ME estudiadas y el tanto por ciento de eritrocitos pinzados, mostr un valor
de r = -0,61, estadsticamente significativo (p < 0,01) entre este tanto por ciento y
el contenido de banda 3.

N. de casos

B l: -espectrina; B 2,1: ankirina; B 3: banda 3; B 4,2: palidina; AD: autosmico dominante; AR: autosmico recesivo; ND: no
determinado.

Discusin
La esferocitosis hereditaria (EH) se considera un sndrome clnico relativamente
heterogneo, tanto desde el punto de vista clnico como gentico y molecular2-4. Su
forma ms habitual, caracterizada por un
sndrome hemoltico moderado o leve, se
47

MEDICINA CLNICA VOL. 105. NM. 2. 1.995

TABLA 4
Anlisis de la correlacin entre el
contenido relativo (CR) de protenas
de la membrana eritrocitaria y las
magnitudes hematolgicas generales
Protenas
(CR)

Magnitudes
hematolgicas

Palidina (4,2)
Banda 3
Ankirina (2,1)

CCMH (g/l)
EP (%)
ADE (%)
VCM (fl)
Hematcrito (l/l)
Hemoglobina (g/l)

-0,6
-0,6
-0,7
0,5
0,6
0,7

< 0,01
< 0,01
< 0,01
0,02
< 0,01
< 0,01

CCMH: concentracin corpuscular media de hemoglobina;


EP: eritrocitos pinzados; ADE: amplitud de la curva de
distribucin eritrocitaria; VCM: volumen corpuscular medio.

Fig. 2. Patrn electrofortico de las fracciones correspondientes a las protenas de la membrana eritrocitaria
obtenidas mediante SDS-PAGE segn los mtodos de Laemmli y Fairbanks. Carril 1: dficit de banda 3 y
protena 4,2; carril 2: dficit de protena 4,2; carril C: control (Laemmli); carril C': control (Fairbanks); carril
3: dficit de -espectrina; carril 4: dficit de ankirina.

corresponde casi siempre con el carcter


de transmisin hereditario AD, mientras
que las formas ms graves suelen seguir
un patrn AR18. Actualmente se considera que la EH obedece a un defecto de las
interacciones verticales existentes entre
diferentes protenas de la ME con ulterior
desestabilizacin de la bicapa lipdica, prdida de material y disminucin de la relacin entre la superficie y el volumen

eritrocitarios18,19. Aunque la alteracin


proteica ms frecuentemente descrita es
el dficit parcial de espectrina6, otros trabajos demuestran que el fenotipo de EH
no se halla necesariamente ligado al gen
de la espectrina20 sino que puede hacerlo
al de la ankirina21 o incluso al de la banda
310. Tambin se han descrito casos de EH
relacionados con una unin deficiente de
la protena 4,2 a la banda 311. En el 20%

Fig. 3. Anlisis desitomtrico


de un gel Laemmli (A) y
Fairbanks (B). C: control
(Laemmli); 1: dficit de banda 3 y protena 4,2; 2: dficit de protena 4,2; C': control (Fairbanks); 3: dficit de
-espectrina; 4: dficit de
ankirina. Las protenas de
ME deficientes estn sealadas con una flecha.

48

de los casos, no obstante, el patrn


electrofortico es normal18. A excepcin del
dficit de protena 4,2, muy raro y descrito slo en formas AR, los restantes defectos proteicos pueden observarse tanto en
formas AD como AR. Con todo, el dficit
aislado de espectrina parece ser ms frecuente en las formas AR y su manifestacin, slo en sujetos homozigotos, explicara la mayor expresividad clnica5. Algo
ms frecuente y de expresividad clnica
similar es la asociacin del dficit de
espectrina y ankirina que algunos autores8
atribuyen a una mutacin en el gen de la
ankirina situado en el cromosoma 8. Finalmente, el dficit parcial de la banda 3,
presente en un elevado nmero de pacientes con EH autosmica dominante, reviste
un especial inters ya que se acompaa
de formas eritrocitarias peculiares, slo
presentes
en
sujetos
no
espienectomizados, que se conocen con
el nombre de eritrocitos pinzados18.
En el presente estudio, realizado en 20
pacientes con EH (17 familias), los resultados obtenidos a partir de la cuantificacin
densitomtrica de las diferentes protenas
de ME separadas electroforticamente
muestran una heterogeneidad que est de
acuerdo con lo descrito por otros autores2,3,9 con anterioridad. As, en 14 de los
20 pacientes estudiados (70% del total)
pudo apreciarse una de las siguientes alteraciones proteicas: 1) dficit parcial de
banda 3, asociado o no a un dficit parcial de protena 4,2 (8 casos, 57%); 2)
dficit parcial de protena 4,2 (2 casos,
14%), 3) dficit aislado de espectrina (2
casos, 14%), y 4) dficit aislado de
ankirina (2 casos, 14%). En seis pacientes (30%) no pudo objetivarse ninguna
alteracin cualitativa o cuantitativa de las
protenas de ME.
Con el objeto de analizar mejor los casos
pertenecientes al primer y segundo grupo
(dficit de banda 3 y/o protena 4,2), se
compararon estadsticamente las medias
aritmticas del contenido de la protena
encontrada deficitario en pacientes (P) y
controles (C) y se obtuvieron resultados
significativamente diferentes (p < 0,001)
tanto en aquellos casos que presentaban

S. AYALA ET AL.- ALTERACIONES PROTEICAS DE LA MEMBRANA ERITROCITARIA EN LA ESFEOCITOSIS HEREDITARIA Y SU RELACIN


CON LA EXPRESIVIDAD CLNICA Y BIOLGICA DE LA ENFERMEDAD

una reduccin de la banda 3 (C 27,7


1,8 frente a P 24,3 0,6) como los que
presentaban una disminucin de protena
4,2 (C 4,3 0,1 frente a 1 3,7 0,01).
Ello sugiere que, en est, grupo de pacientes, el dficit de banda es la causa de la
EH y aunque su intens dad es slo del 1020%, su expresividad clnica podra explicarse a travs del papel de la banda 3 en
la estabilizacin de la bicapa lipdica. La
conocida relacin entre la banda 3 y la
protena 4,2 explicara el que en algunos
casos el dficit de banda 3 pueda asociarse con un ligero descenso de esta protena. En cualquier caso, el dficit de banda
3 puede, por s solo, explicar la prdida
de importantes zonas de fosfolpidos y
otros componentes de la ME que disminuiran la estabilidad de la membrana y
facilitaran la aparicin de esferocitos y
eritrocitos pinzados18.
Debe sealarse que todos los pacientes
con un.dficit de banda 3 aislado (6 casos) tenan un porcentaje variable, pero
siempre superior al 0,5%, de eritrocitos
pinzados. Por otro lado, en las formas de
EH con dficit de espectrina, ankirina o
protena 4,2, la presencia de algn eritrocito pinzado fue siempre una observacin
espordica. Estos resultados corroboran la
afirmacin de Palek y Jarolim18 segn la
cual la presencia de eritrocitos pinzados
es caracterstica de las formas de EH
asociadasa un dficit de banda 3.
El estudio familiar de los casos con deficiencia de banda 3 demostr que, excepto uno de ellos, en que no pudo realizarse, todos presentaban un patrn de herencia AD. Por el contrario, los pacientes
con dficit de ankirina y de a-espectrina
mostraron un patrn AR. En los dos pacientes con dficit aislado de protena 4,2
el estudio familiar demostr tambin en
ambos un patrn de herencia AR. De las
formas sin expresividad electrofortica tres
de ellas presentaron un patrn dominante, una un patrn recesivo y en las dos
restantes no pudo realizarse el estulo familiar.
Otro aspecto a sealar es que en los dos
pacientes con dficit intenso (35%) de
ankirina no pudo demostrarse la presencia de dficit asociado de espectrina, tal y
como ha sido descrito por algunos autores6,7. Dado que ambos casos presentaban un sndrome hemoltico intenso con
marcada reticulocitosis, es probable que
sta pudiera enmascarar el dficit asociado de espectrina, siempre mucho menos
extenso que el de ankirina. Debe mencionarse, no obstante, que en uno de ellos se
apreci una ligera disminucin de banda
3, hecho que podra explicarse por
interaccin de la ankirina con el dominio
citoplasmtico de dicha protena integral
que garantiza el anclaje del esqueleto
membranoso a la bicapa lipdica. Para
confirmar si la ankirina era la protena
deficitaria en este grupo de pacientes se
compararon los valores de la media arit-

mtica entre el grupo control y el de pacientes (C 5,3 0,2 frente a P 3,4 0,07)
y se obtuvieron resultados significativamente diferentes (p < 0,0001).
Finalmente, otro de lo objetivos al estudiar
las protenas de ME en la EH ha sido investigar la posible existencia de correlacin entre la intensidad de los defectos
proteicos observados y las manifestaciones clnicas o biolgicas de la enfermedad. Para ello, se realiz un anlisis de
regresin lineal simple entre el CR de las
protenas halladas deficientes y las magnitudes hematolgicas presentes en el
hemograma. Este estudio permiti obtener una correlacin negativa (r = -0,6; p <
0,01) entre la protena 4,2 y la CCMH, lo
que sugiere que la disminucin de esta
protena podra estar relacionada con el
caracterstico aumento de la CCMH en la
EH. Asimismo, el hallazo de una correlacin mltiple (r2 = 0,6; p < 0,01) entre la
ankirina y diversas magnitudes
hematolgicas, como el VCM y la ADE, sugiere tambin una posible relacin entre
la intensidad de este defecto proteico y la
expresividad clnica de la enfermedad. En
cualquier caso, estos resultados contribuyen a corroborar el hecho, ya conocido,
de que las alteraciones proteicas de ME
con mayor incidencia clnica son el dficit
de ankirina y espectrina.
Por ltimo, el estudio comparativo de las
magnitudes hematolgicas generales entre las formas de EH con patrn AD y AR
pone de manifiesto la existencia de diferencias significativas (p < 0,03) en la concentracin de hemoglobina y de la CCMH
entre ambos grupos, con una media inferior para las formas AR. Ello corrobora la
idea de que las formas recesivas de EH
presentan un mayor grado de anemia que
las dominantes y que stas, junto con la
presencia de eritrocitos pinzados, se caracterizan por una disminucin parcial de
banda 3.
Aunque el anlisis electrofortico de las
protenas de ME constituye un buen procedimiento para caracterizar las formas clnicas de EH, slo el estudio del ADN permitir confirmar la hiptesis sobre la implicacin de diversas protenas en este tipo
de patologa. Mientras no se llegue a este
punto, la minuciosa observacin del frotis
sanguneo contina siendo una exploracin indispensable no slo para el diagnstico de la enfermedad, sino tambin
para detectar algunas de sus formas
moleculares ms frecuentes en nuestro
medio, tales como, por ejemplo, el dficit
de banda 3.
Agradecimiento
Este trabajo ha sido parcialmente subvencionado por la Ayuda a la Investigacin del FIS 93/
0561. Queremos expresar nuestro agradecimiento a la labor tcnica de las ATS Elena
Manrubia e Isabel Gonzlez.

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