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PRACTICA N 11: AISLAMIENTO DEL ADN

INTRODUCCION
ADN es la abreviatura del cido desoxirribonucleico. Constituye el material gentico de los
organismos. Es el componente qumico primario de los cromosomas y el material del que
los genes estn formados. La extraccin de ADN requiere una serie de etapas bsicas. En
primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmtica para poder
acceder al ncleo de la clula. A continuacin debe romperse tambin la membrana
nuclear para dejar libre el ADN. Por ltimo hay que proteger el ADN de enzimas que
puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.
En este informe de laboratorio mostramos, conceptos bsicos del ADN: Definicin,
composicin, estructura, su extraccin en clulas vegetales y/o animales y otros
conocimientos relacionados a esta prctica; tambin contiene el proceso de la prctica
realizada en el laboratorio, los resultados que obtuvimos en los dos tipos de clulas,
algunas conclusiones a las que llegamos y un cuestionario donde hemos resuelto algunas
de nuestras dudas.

MARCO TEORICO
El ADN (cido Desoxirribonucleico), conocido tambin como la molcula de la vida o la
molcula de la herencia, es la molcula que contiene toda la informacin (genes)
necesaria para que se desarrolle un ser vivo y para que funcione como tal. Pero el ADN
no es un mero almacn de informacin, sino que tambin, y gracias al proceso de
replicacin, es capaz de transmitirla de una generacin a la siguiente en el proceso de la
divisin celular.
Fue aislado por primera vez en el invierno de 1869 por Johann Friedrich Miescher, mdico
suizo que estudiaba la composicin qumica de los glbulos blancos que obtena del pus
de vendajes quirrgicos.
En uno de sus experimentos, al utilizar los ncleos aislados de los leucocitos, aisl un
precipitado con propiedades que no correspondan a sustancias lipdicas y que no era
destruido por proteasas (enzimas que degradan las protenas). Esto le indujo a pensar
que se trataba de otro tipo de sustancia, de composicin desconocida hasta la fecha, y la
llam nuclena. Posteriormente, demostr que la nuclena tena carcter cido y aisl la
misma sustancia en otras clulas y en esperma de salmn. Esta nuclena aislada
corresponde al
ADN y a las protenas histnicas sobre las que se enrolla.
Fueron necesarios 70 aos ms para que se dilucidara la composicin qumica exacta y la
estructura del ADN.
Dnde se encuentra el ADN en los seres vivos?
El ADN se encuentra en las clulas. En el caso de las clulas procariotas, como las
bacterias, est en el citoplasma en forma de molcula circular. En las clulas eucariotas
podemos diferenciar dos tipos de ADN segn su localizacin: el ADN del ncleo formado
por varias molculas lineales (dependiendo de la especie), y el ADN mitocondrial, formado
por algunos miles de copias de ADN circular.

Composicin qumica
Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polinucletido, es decir, un polmero de
unidades llamadas nucletidos que se unen las unas a las otras mediante un enlace
qumico fosfodister llamado enlace nucleotdico. Cada nucletido est formado por una
molcula de cido fosfrico, una base nitrogenada (A, T, C y G) y la pentosa
desoxirribosa. Las siguientes imgenes muestran los cuatro nucletidos que componen el
ADN.
Los grupos fosfatos en disolucin, que es como se encuentran en la clula, presentan
carga negativa, por lo que el ADN es una molcula con carga negativa.
Estructura
La estructura secundaria del ADN fue propuesta en 1952 por Watson y Crick basndose
en estudios previos realizados por otros cientficos como Erwin Chargaff, Maurice Wilkins
y Rosalind Franklin. El modelo propuesto recibe el nombre de doble hlice de ADN. Lo
forman dos cadenas de polinucletidos antiparalelas y complementarias. Las bases
nitrogenadas estn situadas hacia el interior de la doble hlice, enfrentadas y unidas por
puentes de hidrgeno y con los grupos fosfatos hacia el exterior, lo que confiere a la
molcula carga negativa. La doble hlice tiene un dimetro de 2nm.
El ADN presenta dos niveles de plegamiento que dan lugar a:
Estructura primaria:
Los polinucletidos se forman entre las bases nitrogenadas de adenina, guanina , citosina
y timina por enlaces covalentes de tipo fosfodister. As se forma un esqueleto de
polidesoxiribosa-fosfato, de forma que queda un extremo con -OH 3 libre y un extremo 5
con un grupo fosfato libre.

Estructura secundaria
Tiene un empaquetamiento espacial pero no se altera.
Dentro de la estructura secundaria hay 3 modelos:
.El modelo de la estructura secundaria del ADN en forma de doble hlice dextrgira
(forma B). Las dos hebras son antiparalelas es decir si una presenta la direccin 5->3,
la otra posee la direccin 3->5.
El conjunto se pliega sobre s mismo obligado por los puentes de hidrgeno entre
diferentes regiones de la molcula, hasta adoptar la conformacin ms estable, que es la
de doble hlice. Este enrollamiento entre las 2 hebras de la doble hlice es dextrgiro es
decir gira a derechas y de tipo plectonmico, como si estuvieran trenzadas.
Las secuencias de bases son complementarias, pues hay una correspondencia entre las
bases de ambas cadenas .La adenina slo puede estar frente a la timina y la guanina
frente a la citosina. As las bases pricas estn enfrentadas a las bases pirimidnicas y la
unin se realiza por puentes de hidrgeno en los pares A=T y tres en los pares G-C
La correspondencia entre las bases es la causa de que las dos cadenas de la doble hlice
de ADN posean secuencias complementarias.
Adems los pares de bases estn horizontales y el eje los atraviesa por el centro.
Modelo hlice A: En este modelo los pares de bases nitrogenadas estn inclinados hacia
el exterior pero la hlice al igual que la del ADN B es dextrgiro
Modelo hlice z: En este modelo las cadenas de ADN no se enrollan en forma de doble
hlice sino en forma de zig-zag.
Extraccin del ADN
El primer paso en cualquier protocolo de separacin es el rompimiento del material inicial,
ya sea de origen viral, bacteriano, vegetal o animal. El mtodo utilizado para romper la
clula debe ser tan leve como sea posible con el fin de causar el menor dao posible al
ADN. La lisis celular se puede hacer por accin mecnica, pulverizando el tejido con hielo
seco o nitrgeno lquido, tambin se puede utilizar la degradacin enzimtica de la pared
celular (si est presente) y lisis con detergentes de las membranas celulares. Seguido al
rompimiento celular la mayora de mtodos involucran una desproteinizacin, lo cual se
lleva a cabo con un solvente orgnico, seguido de una precipitacin con isopropanol o
etanol y posterior solubilizacin con agua o tampn.
Existen diferentes tcnicas para la extraccin del ADN, aunque todas conservan el uso de
los mismos principios y fundamentos.
Para obtener ADN a partir de leucocitos totales (obtenidos de sangre perifrica), clulas
en cultivo, tejidos animales, vegetales, levaduras y bacterias; se usa generalmente una
tcnica de cuatro pasos secuenciales:

El primer paso consiste en la lisis de las clulas y los ncleos.

Luego, la separacin del ADN a partir de sangre total involucra la lisis de


eritrocitos, seguida por una lisis de leucocitos y de sus ncleos.
Las protenas celulares son entonces removidas por un paso de precipitacin
salina, y
Finalmente el ADN genmico es concentrado por precipitacin con isopropanol.

El ADN purificado por medio de este proceso, est listo para ser utilizado en diferentes
aplicaciones, las cuales involucran: amplificaciones (PCR), digestin con endonucleasas
de restriccin, Southern blot y Dot blot.
Existen otras tcnicas que permiten la obtencin de ADN genmico a partir de muestras
slidas y lquidas, que permiten la separacin simple, rpida, segura y eficiente del ADN.
Esta separacin se basa en la utilizacin del isotiocianato de guanidina, como solucin de
lisis celular, lo cual permite una precipitacin selectiva del ADN con etanol y solubilizacin
en agua o en 8 mM de NaOH. Este procedimiento se puede realizar en 30 minutos,
recobrando un 70% a un 100% del ADN.
Extraccin del ADN en las plantas
El ADN genmico de las plantas es ms difcil de extraer a causa de la pared celular de la
planta, que se elimina por homogeneizacin o mediante la adicin de celulasa para
degradar la celulosa que forma la pared celular. Adems, los metabolitos presentes en la
clula vegetal pueden interferir con la extraccin de ADN genmico por la contaminacin
de la muestra de ADN durante el proceso de precipitacin.
Extraccin de ADN animal
Los leucocitos de sangre perifricos son una fuente principal de ADN genmico en
animales, pero la recogida de muestras es difcil ya que la sangre debe ser retirada del
animal. La sangre contiene una serie de compuestos como protenas, lpidos, glbulos
blancos, glbulos rojos, plaquetas y plasma, que pueden contaminar la muestra de ADN.
El contaminante principal del ADN de animal extrado por muestras de sangre es hemo, el
componente no proteco de la hemoglobina.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
Silvia Quesada Mora. 2007. Manual de experimentos de laboratorio para
bioqumica. Costa Rica. Editorial Universidad Nacional A Distancia.
Ghislain, M., Zhang, D.P., Herrera, M.R. 1998. Protocolos de Laboratorio de
Biologa Molecular: Tipificacin gentica. Per. Centro Internacional de la Papa
(CIP).
Dora Fonseca Mendoza, Heidi Mateus Arbelez, Nora Contreras Bravo. 2010.
Prcticas de Laboratorio de Biologa Molecular: Su Aplicacin en Gentica Bsica.
Colombia. Editorial Universidad Del Rosario.