PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E
MOLECULAR

PROJETO DE TESE DE DOUTORADO

AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA CERVEJA NA MODULAÇÃO DE INSUFICIÊNCIA
CARDÍACA INDUZIDA POR MONOCROTALINA

Orientador
Dr. Jarbas Rodrigues de Oliveira

Aluno do PPG-BCM
Márcia Keller Alves

Porto Alegre – RS – Brasil
2009

2

APRESENTAÇÃO

O presente Projeto de Pesquisa (PP) faz parte das atividades do Programa de PósGraduação em Biologia Celular e Molecular (PPGBCM) da PUCRS, e será executado no
Laboratório de Biofísica Celular e Inflamação.
Entre as áreas de estudo do laboratório está o estudo de novas drogas com potencial
antiinflamatório, além da linha de Biofísica Celular e Molecular, que estuda mecanismos
celulares de inflamação. Dentre os projetos e trabalhos científicos desenvolvidos encontramse diversos experimentos na área de análise de Fármacos e Medicamentos, incluindo a
frutose-1,6-bisfosfato e o paracetamol, além de estudo de drogas em potencial (extrato de
Capsicum baccatum e extrato de Baccharis trimera).
O PPGBCM tem conceito 4 na avaliação da CAPES e seu objetivo é fornecer
formação avançada e qualificação para a elaboração e a execução de propostas científicas,
tecnológicas e políticas relacionadas ao estudo e à manipulação de mecanismos e estruturas
celulares.

...............7........................................................................................ Patogênese da Insuficiência Cardíaca.........................................................................................................2.......................................................1.......19 7.....................................................13 4............................... Diagnóstico da Insuficiência Cardíaca..................... Ingredientes utilizados na produção da cerveja (de acordo com a Lei de Pureza Alemã de 1516).. JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE.........................................................................................................................................3................................................................................... Tipos de Cerveja..................................................22 ............1................... Objetivos Específicos......................................... METODOLOGIA.................11 1......10 1......................................... Introdução........9 1............................... CRONOGRAMA............................................................................................................................................................... Etapas da Fabricação da Cerveja............................................................................................................Cerveja – Importância Nutricional e Ações Fisiológicas.................4 1...............................................................12 3................................................. Objetivo Geral.................................................4....................................5 1.........................................2.................................................14 5........................................ OBJETIVOS.......... Protocolo Experimental.......................................................................................6 1..................................................................................................................... ORÇAMENTO....................................................3.......................3 SUMÁRIO APRESENTAÇÃO................................................... REFERÊNCIAS........................18 6.............13 4..................................................................5............2 RESUMO........ Materiais............................... ANÁLISE ESTATÍSTICA...................... Tratamento da Insuficiência Cardíaca...............................12 4............. Métodos..........................................................................................................12 3...................................................2..........................11 2...........................................................................................................................................................6........................................................12 3......................................................................1.......................................................................................6 1...................................................5 1.........................................13 4..........20 8............................... .............................................................................................................................................................

encontra-se a cerveja. com uma incidência de 240 mil casos por ano. a presença de substância bioativas como flavonóides e outros compostos fenólicos tem grande importância na proteção do miocárdio – tanto em termos estruturais. o malte e o lúpulo têm se mostrado ricos em flavonóides com atividades biológicas importantes. . quanto à ação dos radicais livres. cuja produção se dá através da transformação de produtos alimentícios naturais em uma bebida de sabor e aroma característicos. Devido à ação dos compostos fenólicos presentes na cerveja. No que diz respeito à insuficiência cardíaca. oxidação. quando comparada a de outros países. quanto em relação à proteção. Entre os ingredientes utilizados. os mecanismos envolvidos no seu desenvolvimento ainda não são bem conhecidos. estudos têm mostrado que o consumo moderado de álcool pode reduzir o risco de doenças cardiovasculares através da redução da inflamação e do aumento do HDL-colesterol. A insuficiência cardíaca é definida como a incapacidade do coração em manter um débito cardíaco adequado às necessidades metabólicas tissulares e caracteriza-se pela elevação das pressões pulmonar e venosa sistêmica. Entre estas bebidas. Embora cerca de 14% a 34% dos casos de insuficiência cardíaca sejam devidos ao desenvolvimento de insuficiência cardíaca direita. Alguns destes compostos podem ser encontrados na cerveja pronta. a prevalência da doença é de 1 a 2% e a mortalidade oscila em torno dos 10%.4 RESUMO A principal causa de mortalidade no Brasil é a doença cardiovascular que apresenta uma das taxas mais elevadas. pode-se sugerir um papel protetor desta bebida frente a doenças cardíacas. e da ação benéfica do consumo moderado de álcool (presente na cerveja). Palavras-chave: cerveja. Segundo dados do Sistema Único de Saúde (SUS) a insuficiência cardíaca acomete 2 milhões de pacientes. uma bebida mundialmente popular há mais de quatro mil anos. parcialmente modificados. Na população mundial. insuficiência cardíaca. compostos fenólicos. Determinados alimentos e bebidas contém compostos que podem oferecer um papel protetor frente às doenças cardiovasculares. Além disso.

xarope de milho com o objetivo de diminuir o custo final do produto4. e o uso de outros ingredientes.99 litros/ano por habitante. fermento e lúpulo3. Uma proporção de carboidrato é convertida em etanol e dióxido de carbono. . Estas substâncias podem ser encontradas na cerveja e apresentam ações medicinais importantes7. fermentação e maturação. Estima-se que existam atualmente mais de 20 mil variedades de cervejas no mundo. cevada e malte . Argentina e China.5 1. De acordo com a Lei de Pureza de 1516. pela adição do fermento ao mosto. como milho. catequinas e proantocianidinas. como diferentes tempos e temperaturas de cozimento. Pequenas mudanças no processo de fabricação. usualmente Saccharomyces cerevisiae2. etc) é transformado em açúcares fermentescíveis1. bem como os diferentes tipos de malte. a primeira regulamentação do processo de fabricação da cerveja. tem se mostrado uma fonte importante de compostos fenólicos na cerveja. as cervejas são classificadas em dois grandes grupos pela fermentação – cervejas tipo Ale e cervejas tipo Lager. vários parâmetros influenciam o tipo e a qualidade da cerveja. na qual o amido derivado de grãos maltados (cevada. trigo. arroz. a variedade de lúpulo utilizada e a levedura de fermentação5. 30 % de complemento de malte ou adjuntos. carboidratos. 1. lúpulo. é uma bebida fermentada.34 bilhões de litros.são responsáveis por uma variedade muito grande de tipos de cerveja9. pois contém principalmente ácidos fenólicos. Basicamente.água. Embora os ingredientes sejam constantes. Tipos de Cerveja De modo geral. No Brasil é permitido o uso de.5 bilhões de litros8. temperatura e pH durante mostagem (cozimento do malte em água). entre eles a variedade do malte e processo de malteação. minerais e compostos fenólicos 6. O lúpulo. O consumo da cerveja no Brasil. no máximo. totalizou 10. A cerveja pode contribuir para a dieta. com uma média de 55. Introdução A cerveja é uma das bebidas mais antigas e mais consumida no mundo. Quanto ao consumo per capita. flavonóides. por ser uma bebida rica em nutrientes – aminoácidos. o país está acima do total registrado por países como França. promulgada pelo príncipe William IV da Bavária. além dos quatro básicos . em 2007. cevada (cereal que sofreu o processo de malteação). estes devem ser os únicos ingredientes usados nas cervejas tradicionais alemãs: água. arroz. A produção no Brasil em 2004 foi de 8.1.

2. por exemplo. O ideal de água é: não clorada.1 – Água Fator importantíssimo no processo de fabricação da cerveja. subentende-se o uso de malte de cevada. permite-se o uso de complementos de malte (milho. sabor e aroma da cerveja.2. 250 a 500mg/litro de sulfato de cálcio. potável. deve-se indicar o uso de malte de trigo.4 – Lúpulo Lúpulo é o nome dado às flores fêmeas maduras da planta (Humulus lupulus) e é responsável pelo amargor. menos de 100mg/litro de carbonato de cálcio ou magnésio.5 e 7.2. pH entre 6. 1. O processo de fabricação do malte chama-se malteação e envolve o controle do umedecimento com água e posterior germinação sob condições controladas de temperatura com o intuito de obter mudanças físicas e químicas desejadas. arroz e xarope de milho) objetivando diminuir o custo e obter uma cerveja mais clara. sendo parte essencial no impacto sensorial total do produto. Em caso da cerveja com trigo.3 – Fermento Cervejeiro As leveduras mais utilizadas são espécies do gênero Saccharomyces específicas para cada tipo de fermentação4.0.2. 1. Quando não há indicação.6 1. pellets e extrato. menor volume a ser transportado4. portanto. . 1.2 – Malte A escolha da cevada como matéria-prima é devido a suas características químicas e físico-químicas e valor econômico. traços de magnésio na forma de sulfatos. pó. 200 a 300mg/litro de cloreto de sódio e menos de 1mg/litro de ferro4. O lúpulo pode ser comercializado na forma de flores secas. com uma perda mínima de energia pelo processo de respiração10. Ingredientes utilizados na produção da cerveja (de acordo com a Lei de Pureza Alemã de 1516) 1.2. As duas últimas são mais adequadas por proporcionar maior densidade e. No Brasil.

3.7 1. β-amilase e α-amilase) 12.3. Além disso.3. O processo de mosturação inicia com baixa temperatura e vai aquecendo por etapas até 75ºC. . O objetivo desta etapa é tornar o conteúdo do grão acessível a ação enzimática.2 – Moagem do Malte (3): O malte é moído de modo que a moagem não fique muito fina (o que torna lenta a filtragem do mosto) nem muito grossa (o que dificulta a hidrolise do amido). O objetivo é gomificar o amido para facilitar a hidrólise deste por parte das enzimas do malte (protesases. O conteúdo total será transferido para sofrer a mosturação.1 – Recebimento e Armazenagem do Malte: Em grandes empresas o malte é recebido à granel (1) e armazenado em silos (2). que ira afetar o sabor. O conteúdo fibroso servira posteriormente como elemento filtrante 11. propriedades físicas e estabilidade da cerveja13. Etapas da Fabricação da Cerveja 1.3 – Mosturação (4): Nesta fase ocorre a mistura de malte moído com água e é a fase na qual deve ser feita a adição do complemento de malte. 1.3. 1. nesta etapa ocorre degradação das proteínas em peptídeos ou aminoácidos.

5 – Cozimento (7): Esta etapa e responsável pela inativação de amilases e proteases e tem duração aproximada de 1 hora.3.8 – Maturação (10): Durante este período. A principal diferença entre a cerveja e o chope é que este último não passa por processo de pasteurização. O tempo de maturação dependerá do tipo de cerveja que esta sendo produzida. Após.14. O mosto passa para uma tina de cozimento14.8 1. em que a parte sólida e separada por gravidade14. Durante o período de armazenamento são formados ésteres. dando origem ao aroma e sabor da cerveja “madura” ou chope 13.3. as leveduras floculam e começam a decantar. a mistura passa a denominar-se mosto.3.6 – Resfriamento (8): Esta é a fase de precipitação de complexos de proteínas com resinas e taninos ou cold break. No final da fermentação. 1.9 – Segunda Filtração (12) e acabamento (13): nesta segunda filtração. retira-se o fermento é a cerveja entra no processo de maturação. que e responsável pelo amargor (quando adicionado na fase inicial da fervura) e aroma (quando adicionado na fase final da fervura) da cerveja. como a cerveja.3.4 – Filtragem (5): A filtragem é feita em leito filtrante formado pelos sólidos (bagaço com cascas) do malte. acrescenta-se terra diatomácea para remover partículas em suspensão e também adsorver certas substâncias que conferem cor desagradável para a cerveja. 1. adiciona-se o lúpulo (6).3. 1. a cerveja passa por uma fase de acabamento onde irá receber dióxido de carbono (que após de ser obtido da fermentação é armazenado) e outras substâncias (estabilizantes e antioxidantes)13. Depois de filtrada. 1. Durante a fervura. o que se denomina “quebra” 13. A temperatura deve descer de 80ºC para aproximadamente 10ºC13. 1. Como resultado tem-se o consumo de açúcares fermentescíveis pela levedura e a produção de álcool etílico e CO2.3. 1.3. ocorre uma lenta fermentação complementar. e tem por função separar a casca da mistura. Encerrada a fermentação. modificando aroma e sabor. é realizado o trub em um tanque decantador.10 – Engarrafamento (15 e 16) .7 – Fermentação (9): Nesta fase ocorre a inoculação do fermento em equipamento fechado para evitar contaminação e perda de CO2. Na seqüência.

as antocianinas (pelargonidina. a pasteurização costuma ser realizada a temperaturas por volta de 70ºC. primeiramente para preservação da cerveja17. flavonóides de três tipos: flavanóis (catequinas e epicatequinas). A bebida é uma das principais fontes dietéticas destes flavonóides. O humuleno tem sido usado como agente antimicrobiano. mircetina). . kampferol. particularmente o humuleno (35-70% do total de α-ácidos). 1. O xantohumol e seu isômero isoxantohumol têm exibido efeitos quimiopreventivo.8-prenil-naringenina) e os flavonols (quercitina. xantogalenol.3. leucocianidinas e leucopelargonidina) e seus produtos derivados de oxidação (chalconas – xantohumol. o cohumuleno (20-65%). Os α-ácidos. Cerca de 20% a 30% dos polifenóis encontrados na cerveja são provenientes do lúpulo.11 – Pasteurização (17): O objetivo da pasteurização é eliminar microorganismos que irão prejudicar as características originais da cerveja. O xantogalenol foi descrito recentemente 21 e não há relatos de ações fisiológicas.4. malvidina.9 1. devido a sua influência na estabilidade coloidal. sendo responsável pela turbidez originada pela interação com as proteínas da cerveja15. de modo que essa seja a temperatura letal dos microorganismos em questão13. aroma e sabor) e nutricionais da cerveja. e o adhumuleno (10-15%) são considerados como os mais importantes componentes para determinar a qualidade do lúpulo16. A atividade antioxidante da cerveja é similar a do vinho embora seus antioxidantes específicos presentes no lúpulo e na cevada sejam diferentes dos compostos antioxidantes . Outros compostos importantes são os α-ácidos e os β-ácidos. Assim. e se encontra em formulação de medicamento de uso tópico para dores musculares. antiproliferativo e citotóxico19. Também aparecem compostos mais complexos como os taninos sendo os mais importantes as proantocianidinas de diversos graus de polimerização15. incluindo xantohumol e xantogalenol.Cerveja – Importância Nutricional e Ações Fisiológicas Os compostos fenólicos desempenham um papel importante nas características sensoriais (cor. Os principais polifenóis presentes na cerveja são ácidos fenólicos. e flavonas . O α-humuleno é o princípio ativo antiinflamatório encontrado na erva baleeira.20. especialmente os flavonóides prenilados18. ácidos amargos presentes no lúpulo (5% e 20% do peso do lúpulo maduro).

os compostos fenólicos inibem as reações de oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (LDL-c) e a formação da LDL-oxidada. Para o homem. B12) e polifenóis. minerais e algumas vitaminas 8. Patogênese da Insuficiência Cardíaca A insuficiência cardíaca é definida como a incapacidade do coração em manter um débito cardíaco adequado às necessidades metabólicas tissulares e caracteriza-se principalmente pela elevação das pressões pulmonar e venosa sistêmica. resultantes de uma disfunção (hipertrofia) ventricular.10 presentes na uva22. A bebida contém. ainda. distúrbios da contratilidade ventricular. fadiga.5. além de alterações na musculatura esquelética30. disfunção sistólica. A cerveja contém componentes. igualmente importante é o efeito que os flavonóides exercem sobre a hipertensão arterial26. intolerância ao esforço. palidez. o consumo de cerveja deve ficar em até 720ml/dia e para mulheres. 1. hepatomegalia e. Nesta patologia. Além disso. ocorre importante estimulação neurohumoral. infarto do miocárdio. A doença pode ser causada por diversos fatores como hipertensão. Fica evidente a necessidade de estudos utilizando esta bebida para obtermos conhecimento dos prováveis mecanismos de ação e de potenciais aplicações à saúde humana. a gravidade dos sintomas é difícil de ser avaliada devido a sua subjetividade31. altamente aterogênica. a composição da cerveja inclui carboidratos. Estudos em animais têm contribuído para o esclarecimento dos mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento da insuficiência cardíaca. No que diz respeito à redução de riscos de doenças cardiovasculares. por edema de membros inferiores. . ácido fólico. diastólica ou ambas32. álcool proveniente da fermentação e estudos tem mostrado que o consumo moderado de álcool tem ação protetora contra doença cardiovascular oclusiva23 e aterosclerose carotídica24. É uma síndrome clínica complexa. freqüentemente. cianose. B2. Embora o grau dessa disfunção possa ser quantificado através de métodos diagnósticos invasivos e não invasivos. proteínas e aminoácidos. que são os elementos antioxidantes naturais presentes na bebida e nas matérias primas utilizadas na sua elaboração (casca do malte e lúpulo)15. entre eles. fibras. Além dos compostos fenólicos derivados a partir de seus ingredientes. 360ml/dia25. mostrando um potencial antioxidante importante27-29. cujos sinais e sintomas incluem: dispnéia de repouso. como ativação do sistema nervoso simpático e do sistema renina-angiotensina-aldosterona. vitaminas do complexo B (B1.

eletrocardiograma. creatinina. Dentro de .7. 1. AO = antioxidante. Tratamento da Insuficiência Cardíaca O tratamento visa à estabilização clínica e hemodinâmica do paciente e será guiado pelos sintomas (pressão. O esquema abaixo representa os diversos indutores de insuficiência cardíaca em modelos animais e sua relação com o estresse oxidativo. glicemia. alteração de função renal. sódio. EAO = espécies ativas de oxigênio36. uréia.6. Diagnóstico da Insuficiência Cardíaca O diagnóstico de insuficiência cardíaca (em humanos) pode ser feito através de: avaliação laboratorial (hemograma. estudo hemodinâmico. ecodopplercardiograma. potássio.11 Estudos experimentais têm demonstrado o aumento na formação de radicais livres e a associação do estresse oxidativo com o déficit na reserva antioxidante endógena na insuficiência cardíaca33. Recentemente. holter. biópsia endomiocárdica e/ou angiotomografia32. raio X.35. evidências substanciais têm apontado o estresse oxidativo como uma das vias importantes no remodelamento cardíaco (adaptação do miocárdio à sobrecarga de pressão) e no processo de transição da hipertrofia cardíaca compensada para a insuficiência cardíaca34. etc). estudo eletrofisiológico. peptídio natriurético tipo B). perfusão periférica. medicina nuclear. 1.

pretende-se verificar a eficiência dos compostos fenólicos na cerveja no que diz respeito à modulação de insuficiência cardíaca.5. OBJETIVOS 3. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3.3. Avaliar as medidas hemodinâmicas e morfométricas de coração.2. Determinar a capacidade antioxidante da cerveja in vitro e em tecido biológico (fígado). 3. Determinar a concentração de compostos fenólicos totais na cerveja. JUSTIFICATIVA E HIPÓTESE Os compostos fenólicos fazem parte de um amplo grupo de metabólitos encontrado na maioria das plantas.1 – Avaliar a ação da cerveja na modulação de insuficiência cardíaca induzida por monocrotalina. digitálicos. O presente estudo foi elaborado com a intenção de testar a hipótese de que animais submetidos à ingestão de cerveja melhoram o quadro de insuficiência cardíaca induzida por monocrotalina através da modulação do dano oxidativo e/ou de outros possíveis mecanismos que serão analisados.4.2.12 otimização terapêutica usa-se: diuréticos. 3. após injeção de monocrotalina. vasodilatadores.1. pulmões e fígado. como o câncer.2. Estes compostos apresentam atividades antioxidantes. 3.2. aumentando o interesse por efeitos protetores contra diversas doenças.2. OBJETIVO GERAL 3. .2. 2.1. Observar a aparência geral (sinais clínicos) e quantificar o índice de mortalidade dos animais tratados. inibidores da ECA. 3. os distúrbios cardiovasculares e as inflamações. 3. betabloqueadores. antiarrítmicos e anticoagulantes32. 3.1. antiinflamatória e anticarcinogênica.2. antagonistas de aldosterona. Avaliar as alterações hepática e cardíaca nos animais insuficientes cardíacos. Levando-se em consideração que substâncias bioativas como flavonóides e outros compostos fenólicos têm grande importância na proteção do miocárdio – tanto em termos estruturais quanto de estresse oxidativo.

Os animais tratados com carvedilol receberão a droga via oral (gavagem) na dose de 1mg/kg 38. 4. será comprado em farmácia comercial (Ictus®.2.1. 4. Protocolo Experimental Os animais serão separados aleatoriamente em 8 grupos experimentais. A monocrotalina (Crotaline – C240) será comprada da Sigma Aldrich Química Brasil Ltda. orgânica.7. Avaliar do efeito da cerveja sobre parâmetros hematológicos – avaliação in vivo. 4. Biolab Farmacêutica). Para todos os testes.2. 4. até o final do tratamento. agrupados em caixas.2. Serão utilizados Rattus norvegicus (Wistars.13 3.2. A mesma quantidade de cerveja sem álcool será administrada.1.8.2. receberá água.1. Animais A manipulação dos animais obedecerá aos princípios éticos determinados pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais em Pesquisa (CEUA-PUCRS). medicamento amplamente utilizado no tratamento da insuficiência cardíaca em humanos. Será uma cerveja comercial. Quantificar o nível de metabólitos de óxido nítrico (nitratos e nitritos) no plasma e em tecido cardíaco. 3. com controle cíclico claro-escuro e acesso livre à água e ração. A quantidade de cerveja com álcool administrada via gavagem será calculada de forma a oferecer 0. Grupos Experimentais Grupo controle: sem IC. METODOLOGIA 4. Matéria prima e drogas A cerveja utilizada neste estudo será adquirida diretamente da indústria responsável pela sua produção. O carvedilol. diariamente. . Materiais 4. que serão mantidos em caixas apropriadas. ambas uma vez ao dia. a cerveja será previamente degaseificada.570g de etanol/kg de peso do animal.2. tipo pilsen. in vivo e in vitro.1.6. 3. a fim de testar o efeito do consumo moderado de cerveja37. Avaliar a atividade de enzimas antioxidantes em tecido biológico.1. somente após indução de insuficiência cardíaca. 180–220g) machos.

40 na 4ª semana de tratamento com as cervejas.1.2. receberá cerveja sem álcool no período pré e pós IC. Anterior a indução da insuficiência. receberá carvedilol. Grupo carvedilol: sem IC. receberá carvedilol no período pós IC. cerveja. 4. Grupo cerveja sem álcool insuficiente: com IC induzida por MCT. Indução da insuficiência cardíaca A indução da insuficiência cardíaca (IC) será através de uma única injeção intraperitoneal de monocrotalina (MCT. receberá cerveja sem álcool. Animais do grupo controle. com os mesmos grupos experimentais a fim de possibilitar a análise de todos os parâmetros desejados. será retirado sangue do plexo venoso retro-orbital para análises diversas.3. cerveja sem álcool e carvedilol (grupos não insuficientes) receberão uma injeção com o mesmo volume de solução salina nas mesmas condições e tempos experimentais. 4.14 Grupo insuficiente: com IC induzida por MCT.. Após 21 dias a partir da indução de IC os animais serão eutanasiados e serão iniciadas as análises das amostras (sangue e tecido). receberá água no período pré e pós IC. receberá cerveja. 60mg/kg de peso corporal) 39. Grupo cerveja: sem IC. Grupo cerveja insuficiente: com IC induzida por MCT. Este experimento será realizado duas vezes. Grupo cerveja sem álcool: sem IC. Métodos . bem como nos animais não-insuficientes. receberá cerveja no período pré e pós IC. Grupo carvedilol insuficiente: com IC induzida por MCT.

Seu princípio está baseado na peroxidação de lipídeos endógenos e exógenos a azo-iniciadores. representando o Trabalho de Conclusão de Curso do aluno de Química Industrial Daniel Janke Faustino da Silva. O fundamento do método é o mesmo da TRAP. quinonas. mede-se a capacidade que o objeto de estudo (cerveja) tem de ser “scavenger” de radicais em meio lipossolúvel. A partir da análise qualitativa. a fim de determinar a quantidade destes compostos presentes na cerveja. Reatividade antioxidante total (TAR): a TAR mede a qualidade dos antioxidantes presentes na amostra em estudo. 4. Desta maneira. Determinar a capacidade antioxidante da cerveja in vitro e ex vivo. Desta maneira. Para fins comparativos. de modo a avaliar espectrofotometricamente a descoloração que ocorre quando o radical ABTS•+ é reduzido a ABTS. cumarinas.2. diferentes . Esta análise será realizada em parceria com a Faculdade de Química da PUCRS. triterpenos. determinada através da medida da intensidade de quimioluminescência do luminol (LH2) induzida pela adição de ABAP à temperatura ambiente. os mesmos testes serão realizados com o carvedilol. Pode ser aplicado a todos os fluidos biológicos e é determinado através do consumo de O2 e/ou através da detecção direta de radicais peroxil por quimioluminescência48.3.2-difenil-1-picrilhidrazilo): O método consiste em medir espectrofotometricamente o consumo de DPPH através da redução da absorbância na região visível de comprimento de onda de 515nm do radical DPPH• por antioxidantes. tais como catequinas. Será feita a determinação qualitativa de outros compostos.3. Desenvolvido por Brand-Willams46 e modificado por Kim47. esteróis. como o ABAP.43. glicosídios cardiotônicos. flavonóides diversos.2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolin) 6-ácido sulfônico): O método ABTS utilizado será o método descrito por Re 44 e modificado por Kuskoski45. Determinar a concentração de compostos fenólicos totais na cerveja: O índice de polifenóis totais será determinado pelo método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu41. mede-se a capacidade que o objeto de estudo (cerveja) tem de ser “scavenger” de radicais em meio hidrossolúvel. saponinas. Método DPPH (2. será feita a análise quantitativa.15 4. O método consiste em gerar radicais ABTS•+ por reação com 2. In vitro: Método ABTS (ácido 2.2'-azo-bis (2-amidinopropano (ABAP). taninos. alcalóides42.1. Capacidade antioxidante total (TRAP): representa a capacidade antioxidante não enzimática.

4. bem como cor das patas e focinho. O monitoramento da produção deste radical é realizado espectrofotometricamente a 560 nm. levando à formação de radical ânion superóxido e ácido úrico. Formação e monitoramento dos radicais ânion superóxido (O2•-): O radical ânion superóxido é gerado através da reação catalisada pela enzima xantina oxidase que utiliza a xantina como substrato. uréia. Será determinada a concentração de proteínas no homogeneizado de fígado utilizando-se a albumina sérica bovina (BSA) como padrão.3.4. Será verificada e registrada também a incidência de mortes durante o período experimental.3. 4. pela redução do tetrazólio nitroazul (NBT). fosfatase alcalina. Os resultados serão expressos em nmoles de MDA/g de proteína. A medida destas substâncias é usada como marcador de peroxidação lipídica em sistemas biológicos. como respiração alterada. que corresponde. É medida a queda na emissão de luz.16 nas concentrações de liminol. Observar a aparência geral (sinais clínicos) e quantificar o índice de mortalidade dos animais após injeção de monocrotalina Será feita uma curva de crescimento através da aferição individual do peso do animal. Este método detecta de forma inespecífica as substâncias capazes de reagir com o ácido barbitúrico. ao malondialdeído. glicose em jejum. três vezes por semana a contar do primeiro dia de experimento. Formação e monitoramento de radicais hidroxila (•OH): Este método baseia-se na oxidação da deoxirribose provocada por radicais hidroxila. mostrando o quanto a amostra consegue neutralizar esta reação quimioluminescente49. In vivo: Método TBARS: A determinação da capacidade antioxidante em tecido biológico (fígado) será feito através da avaliação das substâncias reativas ao ácido barbitúrico (TBARS)52. monitoradas espectrofotometricamente a 532 nm51. Dentre os testes de função hepática serão utilizados: níveis séricos de albumina. AZO e amostras adicionadas. alanina . em sua maioria. aspartato aminotransferase (AST). a 295nm50. Avaliar as funções hepática e cardíaca nos animais insuficientes. Serão verificados sinais clínicos clássicos de insuficiência cardíaca. produzidos pela reação do peróxido de hidrogênio com o ferro. A atividade da xantina oxidase é avaliada pela medição colorimétrica da formação de ácido úrico a partir da xantina.3. levando a formação de substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBA). amônia.

Creatina Kinase e sua isoenzima CK-MB54. UFRGS). ainda anestesiados. por meio de uma cânula introduzida no coração.3. Superóxido dismutase (SOD): A atividade da SOD. Avaliar as medidas hemodinâmicas e morfométricas de coração. os animais serão pesados. O coração será retirado imediatamente.17 aminotransferase (ALT) e gama glutamil-transferase (gama-GT). e depois das medidas. de acordo com protocolo utilizado no laboratório em que será realizada a análise (Laboratório de Fisiologia. Dosagens da atividade de enzimas antioxidantes em tecido biológico. 4. para obtenção das relações peso úmido/peso seco dos pulmões e do fígado. 4. A atividade da enzima é expressa em U/mg de proteína60 Glutationa peroxidase (GPx): É uma enzima que catalisa a reação de hidroperóxidos com a glutationa reduzida (GSH) formando glutationa oxidada (GSSG) e o . enzima antioxidante que reduz o radical superóxido a peróxido de hidrogênio. pois constituem a primeira linha de defesa contra as espécies ativas de oxigênio59. Do mesmo modo será feito com o fígado (peso do fígado sobre peso corporal – mg/g)57. A hipertrofia direita será avaliada pelo peso do ventrículo direito sobre o peso corporal (mg/g) e a hipertrofia cardíaca pelo peso do coração sobre o peso corporal do rato (mg/g). serão eutanasiados por exangüinação para retirada dos órgãos. Com relação à congestão pulmonar e hepática.6. Medidas Hemodinâmicas: As medidas de pressão ventricular sistólica direita e pressão ventricular diastólica final direita serão feitas através de medida direta. Em cada caso. As enzimas antioxidantes têm papel fundamental na proteção do organismo.3. que também serão separados. os átrios serão separados e pesados a fim de observar o peso dos ventrículos. Estes testes serão realizados no soro dos animais através de análises bioquímicas. Antes do acesso às medidas hemodinâmicas. será determinada em homogeneizados de fígado pela taxa de inibição da reação do radical superóxido com o pirogalol. Troponinas I55 e peptídio natriurético tipo B (BNP)56. Os biomarcadores para doenças cardiovasculares que serão determinados são: albumina modificada pela isquemia (IMA)53. os tecidos serão pesados e colocados em estufa a 70ºC até peso constante58. pulmões e fígado.5. os órgãos serão removidos e liberados de tecidos aderentes.

3. triglicerídios (GPO-ANA) serão analisados utilizando os kits comerciais – Labtest Diagnóstica S. Catalase (CAT): É uma hemoproteína altamente específica que catalisa a decomposição do peróxido de hidrogênio à água e oxigênio. A atividade da GPx será determinada em espectrofotômetro. Os resultados serão apresentados como média ± desvio padrão. Avaliação do efeito da cerveja sobre parâmetros hematológicos.05. Quantificar o nível de metabólitos de óxido nítrico (nitratos e nitritos) no plasma e tecido cardíaco Os níveis de nitrato e de nitritos no plasma e tecido cardíaco serão medidos pela reação das amostras com o reagente de Griess. que será retirado do plexo venoso retro-orbital para análises diversas Os marcadores bioquímicos para colesterol total (COD-ANA). ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados serão submetidos à análise estatística usando o software SPSS (Statistical Package for the Social Sciences). Teste post hoc Bonferroni para comparações entre os grupos.A. A atividade da enzima é expressa em nmoles/min/mg de proteína61. 4. colesterol VLDL. sendo expressa em nmoles/mg de proteína62.. 4.7. Brasil.3. onde sserão consideradas diferenças significativas quando P < 0. colesterol HDL.8. . medindo-se a oxidação do NADPH em um meio de reação contendo solução reguladora de fosfatos. 5. colesterol LDL. Os animais ficarão em jejum por 12 horas antes da retirada do sangue.18 produto da redução do hidroperóxido. Os compostos formados pela reação serão medidos em espectofotômetro no comprimento de onda de 540 nm e espresso em nmol/L63. Sua atividade será medida pela diminuição da absorção do peróxido de hidrogênio a 240 nm. O efeito sobre o perfil lipídico será avaliado através de análise bioquímica.

CRONOGRAMA Atividades Programadas Jan Mar Abr Mai Julh Jan Abr Jul Nov Fev Jul Nov Mar (2009/2012) 09 09 09 09 09 10 10 10 10 11 11 11 12 Revisão bibliográfica x Apresentação do projeto ao PPGBCM x Defesa pública do projeto Envio ao Comitê de Ética Início dos trabalhos in vitro x x x x x x x Experimentos piloto in vivo x Início dos experimentos in vivo 1 x Elaboração de artigos para publicação Elaboração da tese Entrega da tese ao PPGBCM x x x x Elaboração de artigo para publicação Análise dos resultados obtidos in vivo x x x Início dos experimentos in vivo 2 x x Análise dos resultados obtidos in vitro Análise dos resultados obtidos in vivo x x x x x x x .19 6.

00 1500.000 µl Seringa de insulina 1mL Seringas descartáveis 20 mL Agulha para gavagem Heparina (5000uni/mg) Tampão Salina Fosfato pH 7. Brasil Kit colesterol HDL (GPO-ANA) – Labteste Diagnóstica S.00 160.00 300.00 100.00 30.00 100.00 650.00 190.00 500.00 200.5mg 25mL 5g 10g 100mL 1 kit Preço (R$) 1600.20 7.Sigma.4 SIGMA (10 L) Microtubo de 1.00 600.00 500.00 35.00 300.00 .00 180. 500mg) Carvedilol (Ictus®. KCl (Sigma) Hidroperóxido de tert-butil (T-BOOH – Sigma) Ácido fosfotúngstico 10% (Sigma) Quetamina Xilasina Luminol (Fluka) Xantina (Sigma) Xantina oxidase (Sigma) Ácido nitrilotriacético (NTA) (Sigma) Deoxirribose (Sigma) Peróxido de hidrogênio (Sigma) Ácido tricloroacético (TCA) (Sigma) BNP (rat – Sigma) t-BuOOH (Aldrich) Dietilenotriaminopentaacético (DTPA) (Sigma–Aldrich) Pirogalol (Sigma–Aldrich) Reagente de Griess (Fluka) Kit glutationa S-Transferase (GST) (Sigma) Kit colesterol total (COD-ANA) – Labteste Diagnóstica S.00 150.00 70. Sigma).00 135..00 40.00 100.00 10.00 400.00 50.00 20.00 500.A.00 1600.00 250.00 120..00 250. ORÇAMENTO Descrição Ratos de laboratório Ração padrão Maravalha Luvas para procedimento (caixa com 100 unidades) Ponteiras descartáveis 200 µl Ponteiras descartáveis 1. Biolab Farmacêutica) (caixa com 30 cp) Solução de Cloreto Sódio 0.00 200.5mL 500g 25mL 250mL 10mL 1g 10g 5UN 5g 25mg 500mL 500g 0.5mL (Ependorf) Monocrotalina (Crotaline 2401 .A.00 200.00 200.00 55.00 160.00 180.00 3 kit 3 kit 120.000 µl Ponteiras descartáveis 5.00 200. Quantidade 200 animais 100 kg 50 kg 20 caixas 10 pacotes 10 pacotes 10 pacote 250 un 250 un 1 unidade 1 unidade 1 4 pacotes 1 unidade 1 caixa 5 un 1g 1g 1 litro 2.9% (frasco 500mL) ABTS (Fluka) DPPH (Aldrich) Metanol (Sigma) Tetrazolio nitroazul (NBT.00 150.00 140.

A. Brasil Papel A4 75g/m2 (relatórios – pacote 500 folhas) Cartucho para impressora (preto) Cartucho para impressora (cores) Total de gastos estimados 3 kit 120.00 150.21 Brasil Kit VLDL – Labteste Diagnóstica S.00 12651..00 120.00 1 unidade 2 unidades 1 unidade - 16.00 .

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