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UNIVERSIDAD DE OVIEDO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA FUNCIONAL


REA DE MICROBIOLOGA

MICROBIOTA INTESTINAL HUMANA: ANLISIS Y


EVOLUCIN DE POBLACIONES REPRESENTATIVAS E
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS PROBITICAS

Memoria presentada por Susana Delgado Palacio para optar al Grado


de Doctor

Este trabajo ha sido realizado en el Instituto


de Productos Lcteos de Asturias (IPLA-CSIC)

Oviedo, 2005

Deseo expresar mi agradecimiento a todas las personas que han contribuido a la


realizacin de esta Tesis Doctoral:

Al Dr. Baltasar Mayo Prez, bajo cuya direccin y supervisin he realizado este
trabajo, por su labor en mi formacin cientfica.
Al Dr Juan Carlos Bada, director del Instituto de Productos Lcteos de Asturias
(IPLA), por darme la oportunidad de hacer este trabajo en el centro.
A la Dra. Covadonga Barbs Miguel, mi tutora en la Universidad, por su ayuda en
la revisin de la memoria.
Al Dr. Adolfo Surez del Servicio de Digestivo del Hospital de Cabuees (Gijn),
por la seleccin de los individuos y proporcionarnos las muestras de estudio.
Al Ministerio de Educacin y Ciencia, por la concesin de una beca de Formacin
de Personal Investigador (FPI).
A los Drs. Gerald Fitzgerald de la University College Cork (Irlanda) e Ingolf F.
Ness de la Agricultural University of Norway (Noruega), por permitirme realizar
estancias de investigacin en sus laboratorios.
A todos los que de un modo u otro han participado en este trabajo y
especialmente a los compaeros del IPLA con los que he compartido tanto tiempo, a
los presentes y a los que ya no estn en el centro.

Por ltimo quiero dar las gracias a mi familia, sobre todo a mis padres por sus
constantes nimos y motivacin, y de forma muy especial a lvaro por su apoyo
incondicional.

NDICE

Introduccin.

1. EL TRACTO GASTROINTESTINAL (TGI) HUMANO.

1.1. Anatoma y fisiologa.

1.2. La microbiota del TGI.

1.2.1. El desarrollo de la microbiota intestinal.


1.2.2. Influencia de factores genticos y ambientales en la microbiota
intestinal.
1.2.3. Papel fisiolgico y capacidad metablica de la microbiota
intestinal.
1.2.4. Implicaciones de la microbiota intestinal en la salud.

5
6
8
10

1.2.4.A. Infecciones gastrointestinales.

10

1.2.4.B. Enfermedades de base inmunolgica.

11

1.2.4.C. Cncer de colon.

13

1.2.5. Mtodos de estudio de la microbiota intestinal.

14

1.2.5.A. Mtodos tradicionales directos.

14

1.2.5.B. Mtodos tradicionales indirectos.

14

1.2.5.C. Mtodos moleculares.

15

1.2.5.D. Gnotobitica.

17

2. PROBITICOS.

18

2.1. Probiticos y alimentacin funcional.

18

2.2. Microorganismos utilizados como probiticos.

19

2.2.1. El gnero Lactobacillus.

20

2.2.2. El gnero Bifidobacterium.

22

2.3. Efectos beneficiosos de los probiticos.

24

2.3.1. Efectos nutricionales.

25

2.3.2. Inmunomodulacin.

25

2.3.3. Efectos teraputicos.

26

2.4. Criterios de seleccin de bacterias probiticas.

27

2.4.1. Seguridad de uso.

28

2.4.2. Criterios funcionales.

29

2.4.2.A. Resistencia al trnsito gastrointestinal.

29

2.4.2.B. Supervivencia en el lugar de accin.

29

2.4.3. Criterios tecnolgicos.

Objetivos del trabajo.

30

32

Material y Mtodos.

34

1. Toma y procesado de las muestras.

34

2. Anlisis microbiolgicos.

35

3. Anlisis bioqumicos en heces.

35

3.1. Medida de actividades enzimticas.

35

3.2. Determinacin de la concentracin de amonio.

37

3.3. Deteccin y cuantificacin de cidos grasos de cadena corta (SCFAs).

37

3.3.1. Preparacin de las muestras y extraccin.

37

3.3.2. Condiciones cromatogrficas.

37

4. Anlisis estadstico.

38

5. Aislamiento de microorganismos.

38

5.1. Medios y condiciones de cultivo.

38

6. Identificacin de microorganismos.

39

6.1. Obtencin de extractos celulares.

39

6.2. Amplificacin parcial del gen del ARNr 16S y secuenciacin.

39

7. Tipificacin de aislados de bifidobacterias.

41

7.1. Perfil de fermentacin de carbohidratos.

41

7.2. RAPD-PCR.

42

8. Anlisis molecular.

43

8.1. Aislamiento y purificacin del ADN total.

43

8.2. Amplificacin parcial del ADNr 16S.

44

8.3. Clonacin y secuenciacin de los amplicones.

45

9. Ensayos de caractersticas probiticas.

47

9.1. Resistencia a sales biliares.

47

9.2. Resistencia a pH cido.

47

9.3. Actividades enzimticas.

47

9.4. Resistencia a antibiticos.

48

9.5. Inhibicin de patgenos.

48

9.6. Produccin de bacteriocinas.

49

9.6.1. Caracterizacin de la sustancia inhibidora.

50

-Estimacin del tamao molecular.

50

-Tratamiento del inhibidor con calor.

50

-Tratamiento con enzimas proteolticos.

51

9.7. Adherencia a lneas epiteliales humanas.

51

9.7.1 Lneas celulares epiteliales.

51

9.7.2. Ensayos de adhesin.

52

Resultados y discusin.

53

Captulo I: Evolucin a lo largo del tiempo de parmetros


microbiolgicos y bioqumicos de heces. Estudio de la microbiota
asociada a mucosa intestinal.

53

I.1. Seguimiento diario de la microbiota de heces y actividades


enzimticas asociadas.
I.1.1. Recuentos microbiolgicos.

53
53

I.1.2. Medida de actividades enzimticas.


I.2. Seguimiento mensual de la microbiota de heces y parmetros
bioqumicos asociados.
I.2.1. Recuentos microbiolgicos.
I.2.2. Anlisis bioqumicos.

56
58
59
63

I.2.2.A. Medida de actividades enzimticas.

63

I.2.2.B. Determinacin de la concentracin de amonio.

65

I.2.2.C. Deteccin y cuantificacin de SCFAs.

67

I.3. Estudio de la microbiota asociada a mucosa intestinal.


I.3.1. Recuentos microbiolgicos.

69
69

Captulo II: Aislamiento, identificacin y tipificacin de


microorganismos mayoritarios y bacterias lcticas de heces y
mucosa intestinal. Comparacin de tcnicas clsicas y moleculares.

72

II.1. Identificacin de bacterias cultivables mayoritarias en heces y


mucosa intestinal.
II.1.1. Muestras de heces.

72
73

II.1.2. Muestras de mucosa intestinal.


II.2. Anlisis molecular directo de bacterias mayoritarias en heces y
mucosa intestinal.
II.2.1. Muestras de heces.
II.2.2. Muestras de mucosa intestinal.
II.3. Aislamiento e identificacin de bifidobacterias y lactobacilos en
heces y mucosa intestinal.
II.3.1. Muestras de heces.
II.3.2. Muestras de mucosa intestinal.
II.4. Anlisis molecular de bifidobacterias en heces y mucosa
intestinal.
II.4.1. Muestras de heces.
II.4.2. Muestras de mucosa intestinal.

74
76
77
81
84
84
89
90
91
92

II.5. Tipificacin de aislados de bifidobacterias.

93

II.5.1. Perfil de fermentacin de carbohidratos.

94

II.5.2. RAPD-PCR.

97

Captulo III: Caracterizacin y seleccin de bifidobacterias y


101
lactobacilos con potencial probitico.
III.1. Resistencia a sales biliares.

101

III.2. Resistencia a pH cido.

104

III.3. Actividades enzimticas.

106

III.4. Resistencia a antibiticos.

108

III.5. Inhibicin de patgenos.

111

III.6. Produccin de bacteriocinas.

113

III.6.1. Caracterizacin preliminar de la sustancia inhibidora.


III.7. Adherencia a clulas epiteliales humanas.

115
116

Discusin general.

119

Conclusiones.

130

Bibliografa.

132

Anexos.

153

ABREVIATURAS

ANOVA: Anlisis de la varianza.

PBS: Phosphate Buffered Saline.

ARNr: cido ribonucleico ribosmico.

p/v: Peso/volumen.

ATTC: American Type Culture Collection.

RAPD: Randomly Amplified Polymorphic

BAL: Bacterias del cido Lctico.

DNA.

BHI: Brain Heart Infusion.

RCA: Reinforced Clostridial Agar.

BLAST: Basic Local Alignment Search

rpm: Revoluciones por minuto.

Tool.

SCFAs: Short chain fatty acids.

CECT: Coleccin Espaola de Cultivos Tipo.

SDS: Dodecilsulfato sdico.

CFS: Cell Free Supernatant.

TBE: Tampn Tris-borato-EDTA.

CIM: Concentracin Inhibitoria Mnima.

TE: Tampn 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA

dNTPs: Desoxinucletidos trifosfato.

pH 8.

EBA: Esculin Bile Agar.

Tris:

EDTA: cido etilendiamino tetractico.

propanodiol.

G+C: Guanina + Citosina.

TGI; Tracto Gastrointestinal.

GRAS: Generally Regarded As Safe.

TTC: Cloruro de trifenil-tetrazolio.

IPTG: isopropil--D-tiogalactopiransido.

UCC: University College Cork.

MRSC: Medio de Man Rogosa y Sharpe con

ufc: Unidades formadoras de colonia.

0,25% de L-cistena HCl.

UI: Unidades Internaciones.

MVSP: Multi-Variate Statistical Package.

UPGMA: Unweighted Pair Group Method

NCCLS: National Committee for Clinical

with Arithmetic Averages.

Laboratory Standards.

v/v: Volumen/ volumen.

NCDO:

National

Collection

of

Dairy

Tris

2-amino-2

(hidroximetil)-1,3-

VRBA: Violet Red Bile Agar.

Organisms (UK).

VRBGA: Violet Red Bile Glucosa Agar.

NCIMB: National Collections of Industrial

X-gal:

and Marine Bacteria (UK).

galactopiransido.

pb: Pares de bases nucleotdicas.

YGCA:

PCR: Polymerase Chain Reaction.

Chloramphenicol Agar.

5-bromo-4-cloro-3-indolil--DYeast

extract

Glucose

Introduccin

1. EL TRACTO GASTROINTESTINAL (TGI) HUMANO.


1.1. ANATOMA Y FISIOLOGA.
El tracto gastrointestinal (TGI) humano est formado por la boca, la cavidad
orofarngea, el esfago, el estmago, el intestino delgado y el intestino grueso o colon.
El TGI tiene funciones de digestin, absorcin, secrecin y de barrera, adems de ser
un rgano endocrino y formar parte del sistema inmunolgico.
En el hombre, el intestino delgado mide entre 4 y 5 metros y se divide en tres
secciones: el duodeno, el yeyuno y el leon. Una de las principales funciones del
intestino delgado es la absorcin de nutrientes. Para llevar a cabo esta funcin, la
superficie intestinal est aumentada unas 600 veces por pliegues, vellosidades y
microvellosidades, resultando en una superficie total de entre 150 y 200 m2. Las
vellosidades intestinales son estructuras en forma de dedos de aproximadamente 1
mm de altura que se proyectan hacia el lumen (Figura 1). La superficie luminar de las
vellosidades est recubierta con clulas epiteliales especializadas, los enterocitos, cuya
funcin primordial es la toma de nutrientes. Para ello su membrana luminar est
cubierta con microvellosidades, estructuras de aproximadamente 1 m de alto y 0,1
m de dimetro que a su vez estn recubiertas por una capa de mucus protector
formada por glicoprotenas. Esta enorme superficie est en contacto constante con el
medio externo y se cree que durante la vida media de un individuo procesa cerca de
100 toneladas de alimentos (Johnson, 2001).
El intestino grueso o colon del hombre mide alrededor de 1,5 m de largo
dependiendo de la altura de la persona y se divide en varias regiones: el ciego, el
colon ascendente o derecho, el colon transversal, el colon descendente o izquierdo y el

Introduccin

colon sigmoideo que finaliza en el recto. El colon humano absorbe y secreta


activamente electrolitos y agua, adems de almacenar y excretar los desechos.
La movilidad del intestino es muy distinta en las diferentes secciones, lo que
condiciona el tiempo de trnsito del bolo alimentario. En el intestino delgado, con una
gran movilidad, el tiempo de trnsito es de entre 4 y 6 h, mientras que en el intestino
grueso, con una movilidad mucho mas reducida, el tiempo de trnsito se sita
normalmente por encima de las 60 h (Tannock, 1995).

Figura 1. Estructura del intestino humano y representacin de las vellosidades


intestinales.

Duodeno

Colon transverso
Yeyuno
Colon descendente
Colon ascendente

Vellosidades intestinales

Ciego
Apndice
Colon sigmoideo

Recto

leon

1.2. LA MICROBIOTA DEL TGI.


La flora normal ha sido el trmino ms comnmente usado en la literatura
mdica durante dcadas para referirse a las comunidades microbianas que habitan en
el cuerpo del animal sano. Otros trminos utilizados han sido el de microflora
autctona y ms recientemente microbiota normal. Este ltimo es el trmino ms

Introduccin

correcto ya que los trminos flora y microflora tienen una desafortunada


connotacin botnica.
En el cuerpo humano se estima que hay ms clulas microbianas que clulas
eucariotas (1014:1013) (Luckey, 1972). De entre las ms de 400 especies descritas en el
TGI, unas 30 o 40 representan el 99% de los microorganismos (Drasar y Barrow,
1985) y constituyen la microbiota normal, compuesta mayoritariamente por
bacterias. La microbiota aumenta en cantidad y complejidad a medida que avanzamos
por el TGI. As, en el estmago, debido a la secrecin de cido gstrico, nicamente se
desarrollan especies resistentes a pH cido como estreptococos y lactobacilos (Macy y
cols., 1978). En el intestino delgado los niveles aumentan progresivamente, desde 104
unidades formadoras de colonia (ufc) por gramo de contenido en la parte superior
(duodeno), donde son mayoritarios nuevamente los lactobacilos y los estreptococos
(Simon y Gorbach, 1982), hasta 108 ufc/g en la regin distal del leon. Las especies
cultivables ms numerosas en esta regin son las bifidobacterias, enterobacterias,
bacteroides y fusobacterias (Croucher y cols., 1983; Nord y Kager, 1984). Los
principales factores limitantes para el establecimiento de los microorganismos en el
intestino delgado son los movimientos peristlticos y la secrecin de jugos pancreticos
y biliares.
El mayor nmero de bacterias en el TGI humano reside en el intestino grueso,
donde constituyen entre el 35 y el 50% del volumen del contenido slido (Stephen y
Cummings, 1980). En el colon existe un ambiente muy reductor y desprovisto de
oxgeno por lo que la mayora de las poblaciones son anaerobias estrictas y
constituyen lo que se denomina la microbiota dominante, caracterizada por
concentraciones del orden de 109-1012 ufc/g. Dentro de esta microbiota, el gnero

Bacteroides (constituido por bacilos Gram-negativos no esporulados) es uno de los ms

Introduccin

abundantes (Tannock, 1995). Tambin son dominantes otros microorganismos Grampositivos no esporulados pertenecientes a los gneros Eubacterium, Bifidobacterium,

Peptostreptococcus y Ruminococcus (Conway, 1995). Los bacilos Gram-positivos


esporulados estn representados esencialmente por los clostridios. En concentraciones
inferiores

aparecen

poblaciones

de

bacterias

anaerobias

facultativas

como

enterobacterias, enterococos, lactobacilos y estreptococos que constituyen la


microbiota subdominante, con tasas comprendidas entre 105 y 108 ufc/g (Hagiage,
1994; Holzapfel y cols., 1998). En la Tabla 1 se representan los grupos microbianos
habituales en heces humanas, los cuales se consideran un reflejo de la microbiota del
colon.

Tabla 1. Microorganismos detectados comnmente en heces humanas y su


concentracin.

Grupo microbiano

Nmero (ufc/g)

Bacteroides

109-1012

Bifidobacterias

109-1011

Eubacterias

109-1011

Peptoestreptococos

109-1011

Peptococos

109-1011

Ruminococos

105-1011

Fusobacterias

106-1010

Clostridios

106-109

Lactobacilos

105-108

Enterobacterias

105-108

Enterococos

105-107

Estreptococos

103-105

Levaduras

102-105

Estafilococos

0-104

Compilado de Hagiage (1994), Cummings (1997), Holzapfel y cols. (1998) y Salminen y cols.
(1998c).

Introduccin

1.2.1. EL DESARROLLO DE LA MICROBIOTA INTESTINAL.


La composicin inicial de la microbiota del TGI se determina desde el nacimiento y
depende fundamentalmente de dos factores: el tipo de parto y la alimentacin (Fanaro
y cols., 2003).
Si el parto se produce de forma natural, el TGI del recin nacido es colonizado por
la microbiota vaginal y/o intestinal de la madre y por los microorganismos del ambiente
(Ross y Needham, 1980; Rotimi y Duerden, 1981). As, la microbiota intestinal inicial
est formada por bacterias anaerobias facultativas; coliformes y estreptococos
principalmente. Estas bacterias crean un ambiente reductor favorable para el desarrollo
de los microorganismos anaerobios, de manera que las bifidobacterias pueden alcanzar
al cabo de la primera semana de vida niveles de 108-1011 ufc/g de heces. Cuando el
parto se produce por cesrea, el establecimiento de la microbiota normal se retrasa, ya
que la colonizacin microbiana depende exclusivamente del medio externo. En este
caso las poblaciones microbianas son diferentes a las que se desarrollan cuando el
parto es natural, con un menor desarrollo de microorganismos anaerobios estrictos,
sobre todo del grupo de los bacteroides (Grnlund y cols., 1999).
La alimentacin es determinante tambin en la evolucin de esta microbiota, tal y
como se ha demostrado en estudios comparativos entre nios con alimentacin
materna y nios alimentados con leche de frmula (Harmsen y cols., 2000a). En la
microbiota de los primeros dominan las poblaciones de bifidobacterias, mientras que la
presencia de clostridios y coliformes es mas baja. Por el contrario, los bebs
alimentados con leche de frmula presentan una microbiota ms compleja con
presencia de bacteroides, bifidobacterias, clostridios, estreptococos y coliformes en
proporciones similares (Kleessen y cols., 1995; Harmsen y cols., 2000a). Tras el

Introduccin

destete, coincidiendo con la introduccin de los suplementos alimenticios, se empieza a


desarrollar una microbiota mucho ms diversa. A partir de los dos aos, la microbiota
del nio va evolucionando hacia la que ser la microbiota del adulto. El nmero de
bacteroides y cocos Gram-positivos anaerobios aumenta hasta incluso superar a las
bifidobacterias, mientras que los coliformes y estreptococos disminuyen (Mackie y
cols., 1999; Favier y cols., 2002).
Aunque la mayora de los autores sostienen que el feto en el tero es estril y la
colonizacin del recin nacido se produce fundamentalmente por la microbiota del
canal del parto, estudios recientes parecen apuntar a que la leche materna podra ser
tambin una fuente de microorganismos (Martn y cols., 2004). Estos autores
especulan sobre el posible paso de bacterias a travs del epitelio intestinal de la madre
hacia otras localizaciones como las glndulas mamarias, desde donde alcanzaran el
intestino de los lactantes.

1.2.2. INFLUENCIA DE FACTORES GENTICOS Y AMBIENTALES EN LA


MICROBIOTA INTESTINAL.
La microbiota del TGI en el adulto constituye un equilibrio dinmico que puede
variar entre los grupos humanos e incluso de persona a persona debido a diferencias
especficas del hospedador como la edad, el estado de salud, la dieta, el estrs o la
administracin de antibiticos u otros medicamentos (Tannock, 1983; Miksuoka,
1992a).
La microbiota intestinal cambia con la edad, siendo distinta en la infancia y en la
edad adulta. En la Figura 2 se muestra la evolucin de los principales grupos
microbianos intestinales desde el nacimiento a la vejez.

Introduccin

Figura 2. Evolucin de la microbiota intestinal con la edad.

Bacteroides, Eubacterium, Peptostreptococcus


11

log10 recuentos/g heces

10
Bifidobacterium
8

Escherichia coli, Enterococcus

Lactobacillus

Clostridium prefringes

2
nacimiento

destete

madurez

vejez

Tomado de Mitsuoka (1992a).

A lo largo de la vida el nmero de clostridios va aumentando mientras que la


proporcin de bifidobacterias disminuye. En la senectud es frecuente el aislamiento de

Clostridium difficile y aparecen mayores niveles de mohos y enterobacterias en


comparacin con la microbiota de individuos jvenes (Gorbach y cols., 1967; Mitsuoka,
1992a; Hopkins y cols., 2001).
La microbiota intestinal depende tambin de los substratos o nutrientes aportados
por la dieta y estn descritas grandes diferencias en la composicin de la microbiota
del TGI entre grupos humanos con hbitos alimenticios diferentes (Finegold y cols.,
1977; Noack-Loebel y cols., 1983). Aunque la asociacin entre el tipo de dieta y los
distintos grupos microbianos an no est clara, se han observado mayores niveles de
bacteroides y clostridios y una menor presencia de bacterias lcticas en comunidades
occidentales (con una ingesta alta en grasa y protenas de origen animal y un bajo

Introduccin

contenido en fibra), en comparacin con la microbiota de otras comunidades con


dietas ricas en fibra como la orientales (Benno y cols., 1986; Hayashi y cols., 2002a).
Aunque los conocimientos actuales an son escasos, existen evidencias de que el
genoma del hospedador puede ser un factor modulador de la composicin de la
microbiota gastrointestinal (Zoetendal y cols 2001; Toivanen y cols., 2001).

1.2.3. PAPEL FISIOLGICO Y CAPACIDAD METABLICA DE LA MICROBIOTA


INTESTINAL.
Muchas de las caractersticas bioqumicas y fisiolgicas del hospedador estn
influenciadas por la presencia de microorganismos en el TGI (Guarner y Malagelada,
2003). La microbiota normal afecta a la estructura anatmica y fisiolgica del intestino,
aumentando la superficie de absorcin y promoviendo la renovacin de las clulas de
las vellosidades. Adems los microorganismos del TGI aumentan el contenido
intraluminal y aceleran el trnsito intestinal. Se ha postulado incluso que los
microorganismos interactan con el hospedador modulando la expresin de genes
relacionados con diversas funciones intestinales (Hooper y cols., 2001).
Los microorganismos constituyen un enorme potencial enzimtico en el intestino,
desempeando una amplia variedad de funciones metablicas. Una de las ms
importantes es la hidrlisis o degradacin de los componentes de la dieta (glcidos,
protenas, lpidos). A travs de este proceso se obtiene energa y nutrientes, tanto para
los propios microorganismos intestinales como para el hospedador. La fermentacin de
los carbohidratos resulta en una disminucin del pH y la produccin de metabolitos
como los cidos grasos de cadena corta (SCFAs). Los SCFAs ms abundantes en el
intestino son el actico, el butrico y el propinico y tienen una gran importancia en la
fisiologa y nutricin del TGI (Cummings, 1997). La mayor parte de los SCFAs

Introduccin

producidos en el colon se absorben en la mucosa. El epitelio del colon consume casi


por completo el butirato formado, constituyendo la principal fuente de energa para los
colonocitos. El butirato se ha relacionado tambin con la reversin de clulas
neoplsicas, pudiendo participar en la prevencin de procesos cancergenos (Gibson y
cols., 1992; Scheppach y cols., 1995). El acetato y el propionato, por su parte, pasan a
la circulacin portal y se consumen en el hgado o en los tejidos perifricos. La
degradacin de las protenas por la microbiota (putrefaccin) tambin genera SCFAs,
pero produce al mismo tiempo una serie de compuestos secundarios potencialmente
txicos como aminas, amonio, fenoles, tioles e indoles (Rowland, 1995).
La capacidad metablica de estos microorganismos incluye tambin la degradacin
de determinados compuestos txicos, favoreciendo de esta manera la eliminacin de
sustancias carcinognicas y/o mutagnicas (Parodi, 1999). En otras ocasiones, el
metabolismo bacteriano puede dar lugar a la formacin de metabolitos ms txicos
que los compuestos originales (Macfarlane y Macfarlane, 1997).
Los microorganismos en el intestino pueden participar igualmente en la sntesis de
vitaminas (Hill, 1997) y favorecer la absorcin de diversos minerales como calcio,
fsforo, magnesio y hierro (Miyazawa y cols., 1996).
En el intestino delgado el ambiente es fundamentalmente oxignico y la mayora
de las reacciones microbianas son hidrolticas. Por el contrario, el intestino grueso es
anxico y las reacciones bioqumicas son normalmente reductoras, aunque existen
grandes diferencias en funcin de la seccin del colon. Los productos de la
fermentacin de carbohidratos (SCFAs, gases y etanol) estn presentes en altas
concentraciones en el ciego y colon ascendente, donde la disponibilidad de substratos
es mayor. Por el contrario, los productos de la degradacin de protenas (amonio,

Introduccin

cidos grasos de cadena ramificada, compuestos fenlicos y sulfurados voltiles) se


producen fundamentalmente en el colon descendente (Macfarlane y cols., 1992).

1.2.4. IMPLICACIONES DE LA MICROBIOTA INTESTINAL EN LA SALUD.


La microbiota intestinal tiene gran importancia mdica ya que las bacterias pueden
influir de forma beneficiosa o daina sobre la salud del hospedador. Entre los posibles
efectos

perjudiciales

podemos

incluir

infecciones

intestinales,

infecciones

extraintestinales y carcinognesis.
En condiciones normales el ecosistema intestinal est en equilibrio y los
microorganismos perjudiciales no ejercen su poder patgeno; sin embargo, en
determinadas situaciones, stos pueden dar lugar a infecciones y enfermedades
nocosomiales si se establecen en regiones del cuerpo en las que no son residentes
habituales o cuando su nmero se incrementa de forma excesiva debido a
perturbaciones del ecosistema intestinal. Entre los miembros de la microbiota
anaerobia estricta, Bacteroides fragilis es el que con ms frecuencia causa infecciones
y sepsis a partir de contaminacin fecal (Patrick, 1993); mientras que Escherichia coli,
la bacteria anaerobia facultativa cultivable ms frecuente en heces, es la causa ms
habitual de infecciones del tracto urinario (Sobel y Kaye, 1995).

1.2.4.A. Infecciones gastrointestinales.


Infecciones por microorganismos enteropatgenos. Un porcentaje importante de
los viajeros que visitan reas geogrficas de alto riesgo infeccioso desarrollan diarreas
agudas, denominadas diarrea del viajero. La causa de la mayor parte de estas diarreas
es una infeccin por E. coli o diversas especies de shigelas y salmonelas (Sanders y
Tribble, 2001).

10

Introduccin

Infecciones por rotavirus. Las infecciones por rotavirus son la mayor causa de las
diarreas graves durante la infancia y la adolescencia. Desde el punto de vista clnico, la
mucosa intestinal se ve afectada y se modifica la composicin de la microbiota
intestinal, lo que da lugar a un episodio de diarrea osmtica seguida de un crecimiento
excesivo de alguna de las poblaciones bacterianas no dominantes (Ciarlet y Estes,
2001).
Diarrea por Clostridium difficile asociada al tratamiento con antibiticos. Uno de los
desrdenes intestinales ms importantes y mejor documentados es la diarrea asociada
al tratamiento con antibiticos. La incidencia de esta diarrea se sita entre un 5 y un
25% de los casos de la terapia antibitica, siendo mucho ms frecuente cuando se
utilizan antimicrobianos de amplio espectro. El tratamiento con antibiticos perturba el
balance de la microbiota intestinal normal permitiendo la proliferacin de patgenos
emergentes como Cl. difficile, causante de la colitis pseudomembranosa que se
produce entre el 10 y el 20% de estas diarreas (Bergogne-Brzin, 2000).
Infecciones por Helicobacter pylori. H. pylori es una bacteria espiral Gram-negativa
que coloniza la mucosa gstrica humana. Este microorganismo se ha asociado con el
desarrollo de gastritis crnicas, lceras ppticas y cncer gstrico. Uno de sus
principales factores de patogenicidad es la presencia de la enzima ureasa que hidroliza
la urea generando amonio, de forma que el pH local aumenta y se favorece la
colonizacin y la proliferacin del microorganismo (Malfertheiner y cols., 2002).

1.2.4.B. Enfermedades de base inmunolgica.


En las sociedades desarrolladas, la incidencia de alergias y de algunas
enfermedades con componentes autoinmunes ha crecido de modo importante durante
la segunda mitad del siglo XX. La hiptesis de la higiene excesiva sugiere que la falta

11

Introduccin

de exposicin a agentes bacterianos en las edades tempranas de la vida podra estar


en la base de la creciente aparicin de disfunciones del sistema inmunolgico (Hopkin,
1997). En la actualidad numerosos estudios tratan de clarificar y establecer las posibles
relaciones de los microorganismos o sus productos con los trastornos gastrointestinales
no infecciosos.
Sndrome del intestino irritable. Una de las causas ms comunes de problemas
gastrointestinales es el sndrome del intestino irritable. La enfermedad se caracteriza
por una alteracin de la actividad motora en todo el intestino, aunque gran parte de
los sntomas se sitan en el colon. La prevalencia de esta patologa en pases
industrializados se ha estimado en torno a un 10% de la poblacin (Camilleri, 2001).
Su etiologa es hasta el momento desconocida, pero aparece con frecuencia despus
de una gastroenteritis o tras el tratamiento con antibiticos (Thornley y cols., 2001),
por lo que se ha asociado con alteraciones en la microbiota intestinal (Nobaek y cols.,
2000; Pimentel y cols., 2000). La hipersensibilidad a alimentos, variables psicosociales
como el estrs o defectos en neurotransmisores han sido propuestos tambin como
posibles factores que favoreceran su desarrollo o su sintomatologa (Horwitz y Fisher,
2001).
Enfermedad inflamatoria intestinal: enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. La
enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una patologa crnica que afecta al colon
y/o al intestino delgado. Dentro de este trmino se engloban dos enfermedades
comunes que afectan al 0,1% de la poblacin en las sociedades occidentales y que
presentan una incidencia en aumento: la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. La
etiologa es todava poco clara, aunque en ambos casos parece demostrado que el
sistema inmune reacciona de manera anormal contra algunos componentes de la
microbiota intestinal. Se ha comprobado en ratones que la colonizacin intestinal por

12

Introduccin

bacterias anaerobias, especialmente del gnero Bacteroides, podra promover la


produccin de citoquinas proinflamatorias que median el desarrollo de una colitis
crnica semejante a la humana (Hata y cols., 2001). Adems, en algunos pacientes
con EII se ha encontrado una significativa produccin sistmica de anticuerpos contra

Bacteroides ovatus (Saitoh y cols., 2002).


Alergias o enfermedad atpica. La alergia o enfermedad atpica en sus distintas
formas de presentacin (ezcema atpico, rinitis alrgica o asma) es una disfuncin
crnica de importancia creciente en los pases desarrollados. La dermatitis atpica
afecta en la actualidad al 15-20% de los nios (Holgate, 1999). Estudios poblacionales
recientes parecen indicar que una exposicin adecuada a los microorganismos en las
primeras etapas de la vida protege contra diversos episodios alrgicos (Kirjavainen y
Gibson 1999; Kalliomki y cols., 2001). Esto sera debido al papel crucial que las
bacterias intestinales tienen en la maduracin del sistema inmune.

1.2.4.C. Cncer de colon.


En el desarrollo de cncer de colon parecen estar implicados factores de
interaccin entre la microbiota colnica, la dieta y el epitelio del colon (Moore y Moore,
1995; Greenwald y cols., 2001). Diversos estudios llevados a cabo con modelos
animales han asociado algunos tipos de tumores con ciertas actividades enzimticas de
las bacterias intestinales. Algunas de las enzimas bacterianas implicadas en la
generacin de mutgenos, carcingenos y promotores de tumores son: la

-glucuronidasa, la -glucosidasa, la nitrorreductasa y la azorreductasa (Rowland,


1995; Goldin, 1996; Kim y Jin, 2001). Por el contrario, se ha observado que el butirato
producido por ciertas poblaciones intestinales es un inductor de la diferenciacin
celular y en varios estudios se ha relacionado con la reversin de clulas neoplsicas

13

Introduccin

en el colon (Gibson y cols., 1992; Scheppach y cols., 1995). De esta forma el efecto
protector de la fibra dietaria en el cncer de colon se asocia con una mayor produccin
de butirato (Mortesen y Clausen, 1996).

1.2.5. MTODOS DE ESTUDIO DE LA MICROBIOTA INTESTINAL.


1.2.5.A. Mtodos tradicionales directos.
Tradicionalmente el estudio de la microbiota intestinal se ha abordado
fundamentalmente a travs del cultivo de los microorganismos y en su identificacin
mediante pruebas fenotpicas clsicas: morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas. El
cultivo de la microbiota fecal en medios selectivos y diferenciales es en apariencia el
mtodo ms simple y directo, sin embargo, no posee una alta fiabilidad debido a la
existencia de bacterias no cultivables. El 99% de las bacterias del contenido fecal son
anaerobias estrictas y muchas de ellas extremadamente sensibles al oxgeno, lo que
obliga a procurar estrictas condiciones reductoras durante el procesado y el cultivo.
El anlisis directo mediante recuento microscpico suele ser complementario para
controlar la eficacia de la metodologa de cultivo. Sin embargo, presenta el
inconveniente de que no proporciona informacin de la diversidad microbiana y los
recuentos pueden tambin infravalorarse si las bacterias tienden a unirse y formar
grumos.

1.2.5.B. Mtodos tradicionales indirectos.


Consisten bsicamente en el estudio del metabolismo bacteriano. El principio se
basa en la estimacin de la microbiota intestinal mediante el anlisis y la cuantificacin
de sus metabolitos o ciertas actividades enzimticas. Se pueden estudiar metabolitos
como los cidos grasos voltiles o productos del metabolismo de los cidos biliares

14

Introduccin

mediante tcnicas cromatogrficas, o actividades enzimticas de origen microbiano


como las glicosidadas o las reductasas. Estos mtodos de estudio presentan el
inconveniente de que muchas actividades enzimticas no son especficas de un
microorganismo o de un grupo bacteriano concreto; a lo que hay que aadir la
existencia, en ocasiones, de una gran variabilidad o plasticidad metablica en las
especies.

1.2.5.C. Mtodos moleculares.


Los inconvenientes que los mtodos tradicionales de estudio presentan han llevado
al desarrollo de estrategias alternativas. La aplicacin de herramientas de gentica
molecular independientes de cultivo ofrece un gran potencial en la identificacin,
cuantificacin y tipificacin de los microorganismos del TGI (OSullivan, 2000;
Vaughan y cols., 2000; Zoetendal y cols., 2004). La reaccin en cadena de la
polimerasa o PCR Polymerase Chain Reaction con todas sus variantes es una de las
metodologas ms extendidas y utilizadas para estimar los microorganismos no
cultivables. Muchas estrategias se basan adems, en las diferencias de secuencia en el
gen que codifica el cido ribonucleico ribosmico (ARNr) 16S, que debido a la
alternancia de regiones conservadas y variables (Figura 3), con claras implicaciones
filogenticas, es especialmente til para el estudio de la diversidad microbiana (Woese,
1987).
Algunas de las tcnicas ms utilizadas son:
-FISH (Fluorescence In Situ Hibridization). Esta tcnica cuantitativa consiste en
la utilizacin de sondas para el ARNr marcadas con fluorescencia que se hibridan
directamente con preparaciones bacterianas fijadas sobre un portaobjetos. La
deteccin o visualizacin se realiza por microscopa de fluorescencia. Esta metodologa

15

Introduccin

se ha aplicado con xito en diversos estudios de la microbiota intestinal (Welling y


cols., 1997; Harmsen y cols., 2000b).
-Construccin de bibliotecas genmicas de secuencias del ADNr 16S obtenidas por
amplificacin directa del ADN bacteriano de las muestras. Si la amplificacin no est
sesgada, el nmero y la diversidad de los clones de la genoteca sern un reflejo de las
especies presentes en la muestra original. La diversidad microbiana se determina tras
la secuenciacin y comparacin de las secuencias con las depositadas en las bases de
datos (Altschul y cols., 1997; Cole y cols., 2003). El uso de esta metodologa ha puesto
de manifiesto que, al igual que en otros ambientes, una parte importante de la
microbiota intestinal no haba sido descrita mediante las tcnicas convencionales (Suau
y cols., 1999; Hold y cols., 2002)

Figura 3. Estructura del ARNr 16S en la que se sealan las regiones variables ms
importantes (V1 a V9).

-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis y TGGE (Temperature Gradient


Gel Electrophoresis). Ambas metodologas se basan en la separacin de fragmentos
de amplificacin con distinta secuencia mediante electroforesis en un gradiente

16

Introduccin

desnaturalizante qumico o de temperatura. Se obtiene de esta forma una huella


genmica de las comunidades microbianas. Estas tcnicas se han aplicado con xito a
la caracterizacin y monitorizacin de las poblaciones bacterianas del TGI en humanos
(Zoetendal y col., 1998; Requena y cols., 2002; Zoetendal y cols., 2002).

1.2.5.D. Gnotobitica.
La Gnotobitica es un mtodo de estudio in vivo de la microbiota intestinal que
utiliza animales de experimentacin libres de microorganismos (Falk y cols., 1998).
Tras el parto, realizado generalmente por cesrea, los animales se disponen
directamente en cabinas estriles, donde adems de la atmsfera, todos los materiales
y nutrientes que se les proporciona son estriles. En otros casos, el estado de
esterilidad se consigue con un primer bibern de antibiticos que imposibilita la
implantacin de bacterias en el TGI. En estos animales se pueden introducir con
posterioridad microorganismos de forma controlada para su estudio.
Gran parte de las funciones que se le atribuyen a la microbiota intestinal se han
determinado mediante la comparacin de animales axnicos (estriles) y animales
holoxnicos (animal convencional con microbiota normal). As se ha visto que en los
animales axnicos los glcidos son degradados a hexosas y pentosas, pero esta
degradacin no va acompaada de la produccin de cido lctico y de cidos grasos
voltiles provenientes del metabolismo bacteriano, tal y como sucede en los animales
convencionales (Midtvedt, 1997). En los animales axnicos se ha observado tambin
una menor tasa de reemplazamiento celular en la mucosa del intestino delgado y un
menor desarrollo del sistema inmune (Falk y cols., 1998).

17

Introduccin

2. PROBITICOS.
2.1. PROBITICOS Y ALIMENTACIN FUNCIONAL.
Hasta finales del siglo XX, la meta en la alimentacin humana era asegurar un
aporte adecuado de energa y de macro y micronutrientes en la dieta. Hoy en da est
naciendo un nuevo concepto de nutricin, que procura, adems de los objetivos
tradicionales, la promocin de la salud y el bienestar y la prevencin de las
enfermedades. En este contexto, aparecen los alimentos funcionales, una de cuyas
definiciones ms aceptadas es la de aquel alimento modificado o ingrediente
alimentario que provee un beneficio para la salud adems de satisfacer los
requerimientos nutritivos tradicionales (Sanders, 1998). El concepto de alimento
funcional incluye que su ingesta se efecte como componente habitual de la dieta y
que ste ejerza sus efectos en las cantidades ingeridas normalmente en una dieta
equilibrada. Dentro de los alimentos funcionales tienen un papel destacado, y en
general bien reconocido, los probiticos y los prebiticos.
Los prebiticos son ingredientes alimenticios no asimilables por nuestro
organismo que promueven la proliferacin selectiva de bacterias intestinales
beneficiosas (Gibson y Roberfroid, 1995). Fructooligosacridos, inulina, lactulosa y
galactooligosacridos son algunas de estas sustancias.
Los probiticos son alimentos o suplementos alimenticios con bacterias vivas que
contribuyen a mantener el equilibrio microbiano del TGI (Fuller, 1989). Una definicin
ms precisa dice que stos son microorganismos vivos que, tras su ingestin en cierto
nmero, ejercen efectos beneficiosos en el hospedador ms all de los inherentes a la
nutricin bsica (Guarner y Schaafsma, 1998). Recientemente Schrezenmeir y de
Vrese (2001) han redefinido el concepto, puntualizando que un probitico es un

18

Introduccin

preparado o producto que contiene microorganismos definidos, viables y en nmero


suficiente para modificar la microbiota de un ecosistema del hospedador ejerciendo
como consecuencia efectos beneficiosos sobre la salud.
En la actualidad existe en el mercado una importante y variada oferta de
productos suplementados con prebiticos y/o probiticos. El principal vehculo de
administracin de stos son los productos lcteos, especialmente las leches
fermentadas, aunque se pueden encontrar en muchos otros productos como helados,
quesos, embutidos, zumos e incluso bizcochos, chocolate o cereales.

2.2. MICROORGANISMOS UTILIZADOS COMO PROBITICOS.


El espectro de microorganismos utilizados como probiticos en humanos es muy
amplio e incluye especies de muchos gneros diferentes como Lactobacillus,

Bifidobacterium, Propionibacterium, Bacillus, Escherichia, Enterococcus, Streptococcus


y algunas levaduras del gnero Saccharomyces. En la Tabla 2 se muestran algunos de
los microorganismos empleados de forma habitual como probiticos. Los ms utilizados
pertenecen al grupo de las Bacterias del cido Lctico (BAL), incluyendo en un
sentido amplio a las bifidobacterias.
Las BAL, ya mencionadas en los postulados de Metchnikoff (1907), son miembros
habituales de la microbiota intestinal normal del hombre y de otros muchos animales.
Adems, forman parte de la dieta a travs de diversos productos fermentados, entre
los que se incluyen muchos productos lcteos. Por estas razones poseen un
privilegiado status de microorganismos saludables (GRAS, Generally Regarded As
Safe) y sus efectos positivos sobre la salud se admiten de un modo generalizado. La
utilizacin de las BAL como probiticos se remonta a principios del siglo XX (Rettger y
col., 1935). Desde entonces, ha aparecido un inters creciente por productos

19

Introduccin

probiticos elaborados con estos microorganimos, sobre todo de los gneros

Lactobacillus y Bifidobacterium. Esto ha dado lugar a la explotacin comercial de varias


cepas como: Lactobacillus casei Shirota (Aso y Akazan, 1992), Lactobacillus acidophilus
LA1 (Bernet y cols., 1994) (en la actualidad Lactobacillus johnsonii NCC 533),

Lactobacillus rhamnosus GG (Saxelin, 1997), etc.

Tabla 2. Principales especies microbianas utilizadas como probiticos, entre parntesis


las cepas ms conocidas.
Lactobacilos

Bifidobacterias

Otras BAL

No BAL

Lactobacillus
johnsonii (NCC 533)

Bifidobacterium
bifidum

Enterococcus faecium

Propionibacterium
freudenreichii

Lactobacillus casei

Bifidobacterium breve

Streptococcus
thermophilus

Escherichia coli

Lactobacillus
delbrueckii

Bifidobacterium
longum

Bacillus cereus (Toyoi)

Lactobacillus
rhamnosus (GG)

Bifidobacterium lactis

Saccharomyces
cerevisiae (Boulardii)

Lactobacillus reuteri

Bifidobacterium
adolescentis

(Shirota)

(Bb 12)

(Nissle)

Lactobacillus gasseri
Lactobacillus
plantarum (299v)
Compilado de Collins y cols. (1998), Fooks y cols. (1999) y Salminen (2001).

2.2.1. EL GNERO Lactobacillus.


Los lactobacilos son bacilos o coco-bacilos Gram-positivos que frecuentemente
forman cadenas. Son catalasa negativos, no esporulados y en general inmviles (unas
pocas especies presentan flagelos peritricos). Es un gnero muy amplio en el que se

20

Introduccin

incluyen ms de 100 especies con propiedades heterogneas. Esta diversidad se ve


reflejada en el contenido en G+C de sus miembros, que vara desde un 32% hasta un
52%. En cuanto a su temperatura ptima de crecimiento, pueden ser mesfilos o
termfilos. El pH ptimo de crecimiento oscila entre 5,5 y 6,2. Son anaerobios
aerotolerantes y su crecimiento se ve favorecido en atmsfera microaerfila con un 510% de CO2. Desde el punto de vista fenotpico y atendiendo a sus caractersticas
metablicas, se pueden clasificar en tres grupos en funcin de la presencia o ausencia
de los enzimas fructosa-1,6- difosfato aldolasa y fosfocetolasa (Kandler y Weiss, 1986):
Grupo I. Homofermentadores estrictos. Comprende el grupo de Lactobacillus

acidophilus formado por seis especies: L. acidophilus, L. gasseri, L. johnsonii, L.


crispatus, L. amilovorus y L. gallinarum. Tambin se incluyen en esta categora las
especies L. delbrueckii, L. helveticus, L. leichmanii, L. salivarius y L. jensenii.
Grupo II. Heterofermentadores facultativos. Las especies principales de este grupo
son: L. casei, L. plantarum, L. sakei y L. curvatus.
Grupo III. Heterofermentadores estrictos. Se incluyen en este grupo L. reuteri, L.

fermentum, L. cellobiosus, L. brevis, L. buchneri y L. viridescens.


Esta clasificacin no concuerda con los resultados del anlisis de sus secuencias
del ADNr 16S (Schleifer y Ludwig, 1995a,b) ni obedece a relaciones filogenticas entre
las especies, sino que deriva de la clasificacin inicial propuesta por Orla-Jensen en
1924 y que se sigue utilizando por motivos prcticos (Axelsson, 1998).
Los lactobacilos se encuentran presentes en una amplia variedad de nichos
ecolgicos, siempre que en ellos exista abundante fuente de carbohidratos
hidrosolubles, productos de degradacin de protenas, vitaminas y una tensin de
oxgeno reducida. Podemos encontrarlos en hbitats tan variados como la leche y sus
derivados, vegetales, carne y sus derivados, bebidas fermentadas y formando parte de

21

Introduccin

la microbiota gastrointestinal y genitourinaria del hombre y los animales. En general,


son las BAL que mejor toleran la acidez y muchas de sus especies se utilizan
habitualmente en la industria alimentaria.

2.2.2. EL GNERO Bifidobacterium.


Las bifidobacterias son microorganismos Gram-positivos, anaerobios estrictos
(aunque el grado de sensibilidad al oxgeno depende de la especie), inmviles, no
esporulados y catalasa negativos. Presentan una gran variedad de formas: cocoide,
con protuberancias y/o bifurcaciones, con extremos espatulados o cadenas estrelladas.
Su nombre hace referencia a las formas bfidas con dos ramas en Y o V que presentan
en ocasiones. En la Figura 4 se muestra una fotografa en la que se puede apreciar las
formas pleomrficas.

Figura 4. Observacin al microscopio ptico de bacterias del gnero Bifidobacterium.

22

Introduccin

Las bifidobacterias fueron descritas por vez primera por Tissier a comienzos del
siglo pasado, quien las denomin Bacillus bifidus. A partir de los aos 50 pasaron a
denominarse Lactobacillus bifidus, para constituir ms tarde el gnero Bifidobacterium.
Aunque poseen algunas caractersticas comunes con las BAL, y en muchas ocasiones
se incluyen dentro de stas por razones prcticas, el gnero Bifidobacterium pertenece
en realidad a la subdivisin Actinomycetes con un alto contenido cromosmico en G+C
(>50%) (Axelsson, 1998).
El metabolismo de los azcares difiere tambin del de las verdaderas bacterias
lcticas

ya

que

las

bifidobacterias

carecen

de

aldolasa y glucosa-6-fosfato

deshidrogenasa. Las hexosas son degradadas exclusivamente por la ruta de la


fructosa-6-fosfato, caracterizada por la presencia de la enzima fructosa-6-fosfato

fosfocetolasa (F6PPK) tpica de este gnero. Esta va metablica de fermentacin de


carbohidratos conduce a la formacin de cido lctico y cido actico en una
proporcin 2:3, sin produccin de CO2. Adems, las bifidobacterias no pueden utilizar
los cidos grasos u otros cidos orgnicos como fuentes de carbono y son negativas en
la reduccin de nitrato, la formacin de indol, la licuefaccin de gelatina y la
fermentacin de glicerol (Scardovi, 1986). La cistena es un aminocido esencial para
estos microorganismos y acta adicionalmente en los medios de cultivo como agente
reductor (Shah, 1997). El pH ptimo para el crecimiento de las bifidobacterias se sita
entre 6 y 7 y la temperatura ptima de crecimiento alrededor de los 37C.
Actualmente el gnero est formado por unas 32 especies, aisladas del TGI
humano y de diversos animales, as como de aguas residuales (Ventura y cols., 2004).
Estas especies forman una unidad filogentica coherente con un grado de identidad
superior al 93% en las secuencias del gen del ARNr 16S (Miyake y cols., 1998) (Figura
5). La especie tipo del gnero es Bifidobacterium bifidum (Orla-Jensen, 1924).

23

Introduccin

Figura 5. rbol filogentico de las especies del gnero Bifidobacterium, obtenido a


partir de la comparacin de secuencias del gen del ARNr 16S.

0.01

Tomado de Ventura y cols. (2004).

2.3. EFECTOS BENEFICIOSOS DE LOS PROBITICOS.


Son muchos los efectos beneficiosos sobre la salud de los microorganismos
probiticos que estn bien documentados cientficamente (Dunne y cols., 2001;
Marteau y cols., 2002; Ouwehand y cols., 2002). Entre los principales podemos citar su
contribucin metablica, la inhibicin de patgenos y la inmunomodulacin. Se conoce
poco, sin embargo, de los mecanismos moleculares a travs de los cuales proveen las
acciones favorables (Salminen y cols., 1998c; Hooper y Gordon, 2001).

24

Introduccin

2.3.1. EFECTOS NUTRICIONALES.


Entre los beneficios nutricionales imputados al consumo de probiticos en
productos lcteos se incluye el aumento de la absorcin de minerales como el calcio,
zinc, hierro, manganeso, cobre y fsforo, debido a que la acidez del medio facilita la
ionizacin de stos y la formacin de sales solubles asimilables. Igualmente, por la
accin microbiana aumenta la digestibilidad de la protena del yogurt y la biodisponibilidad de vitaminas como la riboflavina, haciendo estos nutrientes ms
fcilmente utilizables (Ortega y cols., 2002).
El consumo de bacterias probiticas tambin contribuye, mediante la produccin
de enzimas especficos, al aprovechamiento de otros nutrientes en el intestino. Muchas
bifidobacterias poseen glicosidasas con capacidad para metabolizar carbohidratos no
digeribles de la dieta. La degradacin de estos compuestos, en su mayor parte
oligosacridos, da lugar a la produccin de SCFAs (Cummings y cols., 2001).
Debido a la capacidad de desconjugacin de sales biliares que poseen algunas de
estas bacterias, se ha postulado que los probiticos podra estimular el catabolismo del
colesterol reduciendo la colesterolemia (Klaver y van der Meer, 1993; Tahri y cols.,
1995).

2.3.2. INMUNOMODULACIN.
La microbiota intestinal normal a travs del contacto y la interaccin con el tejido
linfoide de la mucosa intestinal desempea un papel fundamental en el desarrollo y
maduracin del sistema inmune competente (Gordon y cols., 1997; Cebra y cols.,
1998; Noverr y Huffnagle, 2004). El carcter inmunomodulador de los probiticos hace
referencia a un amplio espectro de efectos sobre la inmunidad celular y humoral

25

Introduccin

(Borruel, 2003). Ciertos probiticos son capaces de aumentar la inmunidad innata, por
ejemplo mediante un incremento de la capacidad fagoctica (Donnet-Hughes y cols.,
1999; Gill y cols., 2001). Adicionalmente, se ha descrito que los probiticos pueden
producir una estimulacin de la inmunidad adquirida o especfica induciendo la
produccin de inmunoglobulinas especficas del tipo A, que son las que defienden las
mucosas (Link-Amster y cols., 1994; Tejada-Simon y cols., 1999). En otras situaciones
patolgicas hay evidencias de que los probiticos pueden inducir efectos opuestos,
como la inhibicin de reacciones de hipersensibilidad o reduccin de alergias (Majamaa
e Isolauri, 1997; Isolauri y cols., 2001; Kalliomki y cols., 2001).

2.3.3. EFECTOS TERAPUTICOS.


Entre los beneficios teraputicos atribuidos a los probiticos mejor documentados
se encuentran la mejora de la digestin de la lactosa en personas con intolerancia a
este disacrido, la inhibicin de patgenos en el intestino y el tratamiento y la
prevencin de la diarrea (Salminen y cols., 1998c; Guarner y Malagelada, 2003).
Una gran parte de la poblacin mundial presenta bajos niveles de lactasa (-

galactosidasa) en la mucosa intestinal. Las personas con esta deficiencia no absorben


la lactosa en el intestino delgado y su fermentacin en el colon provoca diversas
molestias. Las bacterias del yogurt poseen los enzimas necesarios para digerir la
lactosa, de forma que en numerosos estudios se ha demostrado la eficacia del
consumo de yogures y otros probiticos en el tratamiento de la sintomatologa de esta
disfuncin intestinal (Kolars y cols., 1984; Sanders, 1993; Jiang y cols., 1996).
Mediante estudios clnicos se ha demostrado tambin la utilidad los probiticos en
la prevencin y el tratamiento de diversos tipos de diarreas. Los trabajos publicados se
refieren sobre todo a diarreas infantiles por rotavirus (Sugita y Togawa, 1994;

26

Introduccin

Saavedra y cols., 1994; Shornikova y cols., 1997), pero tambin se ha comprobado


una

reduccin en la frecuencia y duracin de otras diarreas infecciosas, como la

diarrea del viajero o la diarrea asociada al tratamiento con antibiticos (Hilton y cols.,
1997; Vanderhoof y cols., 1999).
Recientemente se han comenzado a realizar estudios sobre el tratamiento con
probiticos de otras alteraciones intestinales como las enfermedades inflamatorias
(enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) (Gupta y cols., 2000; Guslandi y cols., 2000;
Hamilton-Miller, 2001), el cncer colorrectal (Hirayama y Rafter, 2000; Wollowski y
cols., 2001) o las gastritis crnicas y las lceras gstricas causadas por H. pylori (Sheu
y cols., 2002); aunque no en todos los casos se ha podido demostrar de forma clara su
papel bioteraputico.

2.4. CRITERIOS DE SELECCIN DE BACTERIAS PROBITICAS.


Con independencia del tipo de microorganismo que se quiera utilizar como
probitico, existen una serie de requisitos que ste debe cumplir y que han evaluarse
de forma individual en cada cepa. Las bases tericas para la seleccin de bacterias
probiticas incluyen aspectos de seguridad, criterios funcionales y criterios
tecnolgicos (Huis int Veld y Shortt, 1996; Brassart y col., 1998; Guarner y
Schaafsma, 1998; Collins y cols., 1998; Tannock, 1999a). Recientemente Reuter y cols.
(2002) han establecido que para poder asegurar la calidad de los alimentos que
contienen microorganismos probiticos, los cultivos bacterianos deberan cumplir las
siguientes condiciones:
1- Ejercer algn efecto beneficioso demostrado para la salud.

27

Introduccin

2- Alcanzar el intestino humano en estado viable y a una concentracin adecuada,


para lo que las cepas han de resistir las barreras del TGI.
3- Permanecer viable y en nmero suficiente durante todo el periodo de vida til
del producto en el que se incluyan. Las cepas deben retener sus propiedades durante
las fases de produccin, distribucin y almacenamiento.
Un elemento importante tambin a tener en cuenta en el proceso de seleccin de
probiticos es la procedencia de la cepa. El origen humano de la cepa es deseable ya
que la interaccin entre la bacteria y el hospedador es con frecuencia especfica.
Aunque existen microorganismos probiticos de otras fuentes, la mayor parte de los se
han ensayado con xito son de procedencia humana (Salminen y col., 1998a).

2.4.1. SEGURIDAD DE USO.


Las BAL estn consideradas, en general, como bacterias GRAS para el consumo
humano, ya que a lo largo de la historia han estado presentes en numerosos alimentos
fermentados. Sin embargo, no se puede asumir que todas las cepas compartan el
mismo historial de seguridad. Adems, en los ltimos aos ha aumentado el nmero
de casos de infecciones en las que se han aislado microorganismos pertenecientes al
grupo de las BAL, entre ellos algunos probiticos (Gasser, 1994; Rautio y cols., 1999;
Mackay y cols., 1999). Por esta razn, la seguridad debe ser verificada de forma
individual, asegurndose de que cada cepa probitica est libre de factores de
virulencia y determinantes de patogenicidad. Tambin es importante evaluar la
presencia de actividades enzimticas perjudiciales para el hospedador y la ausencia de
resistencias transferibles a antibiticos (Salminen y cols., 1998b; Ishibashi y Yamazaki,
2001).

28

Introduccin

2.4.2. CRITERIOS FUNCIONALES.


Para que los microorganismos probiticos tengan efecto sobre la salud del
hospedador han de ser capaces de alcanzar, sobrevivir e implantarse o mantenerse
viables durante un cierto tiempo en el intestino. Los criterios funcionales hacen
referencia a las propiedades biolgicas y a las caractersticas de probiosis de las cepas
e incluyen aspectos de resistencia al trnsito gastrointestinal y supervivencia en el
lugar de accin.

2.4.2.A. Resistencia al trnsito gastrointestinal.


Los microorganismos probiticos a su paso a travs del TGI han de resistir la
acidez estomacal y la presencia de enzimas gstricos y pancreticos, as como las sales
biliares intestinales que presentan una importante actividad antibacteriana. Estas
cualidades pueden evaluarse mediante sencillos ensayos in vitro o mediante modelos
ms complejos en los que se simule el proceso dinmico de la digestin (Marteau y
cols., 1997).

2.4.2.B. Supervivencia en el lugar de accin.


La supervivencia y persistencia en el intestino de los probiticos depende en gran
medida de los mecanismos de exclusin competitiva que posean las cepas y que
incluyen entre otros la capacidad de adhesin al epitelio intestinal y la actividad
antimicrobiana.
Una vez que el microorganismo ha llegado a su destino tiene que ser capaz de
adherirse a las clulas de la mucosa intestinal y evitar ser eliminado por las secreciones
y los movimientos peristlticos. Los mecanismos que median los procesos de

29

Introduccin

adherencia no estn del todo clarificados y parecen ser diversos. Exopolisacridos,


protenas y cidos lipoteicoicos de la superficie celular son algunos de los factores que
podran participar en la adhesin (Granato y cols., 1999; Roos y Jonsson, 2002;
Pridmore y cols., 2004).
Los probiticos pueden ejercer una actividad antimicrobiana especfica sobre un
microorganismo o un grupo de microorganismos. Esta actividad puede deberse a la
competicin por nutrientes, por sitios de unin al epitelio intestinal o bien a la
produccin de sustancias antimicrobianas (Fuller, 1989). Numerosos metabolitos
producidos por las BAL poseen actividad antimicrobiana, como los cidos orgnicos, los
cidos grasos y el perxido de hidrgeno (Mishra y Lambert, 1996; Ouwehand, 1998);
aunque son las bacteriocinas los compuestos ms estudiados (Yildirim y cols., 1999;
Boris y cols., 2001; Flynn y cols., 2002). Las bacteriocinas son pptidos
antimicrobianos de sntesis ribosomal activos frente a microorganismos estrechamente
relacionados con la especie productora (Jack y cols., 1995; Cleveland y cols., 2001).

2.4.3. CRITERIOS TECNOLGICOS.


Los aspectos tecnolgicos que se valoran en la bsqueda y seleccin de
probiticos pueden ser muy variables y dependen de la forma de produccin y
suministro del producto. En todo caso, el probitico debe de ser fcilmente cultivable y
mantener elevados niveles de viabilidad y estabilidad de sus propiedades en el
producto. Algunos de los factores que afectan a la estabilidad durante el procesado y
el almacenamiento son: la temperatura, la acidez y la composicin del producto
(Sanders y Huis int Veld, 1999; Shah, 2000). La resistencia de las cepas a la
congelacin y a la liofilizacin son tambin caractersticas importantes para el
desarrollo de los cultivos industriales. En el caso de su aplicacin en productos lcteos,

30

Introduccin

se debe de tener en cuenta la compatibilidad con los cultivos iniciadores, ya que la


mayor parte de los microorganismos probiticos no se pueden utilizar como fermentos
(Oberman y Libudzisz, 1998). La tolerancia al oxgeno y la resistencia a bacterifagos
pueden

ser

tambin

factores

importantes.

Adems,

es

deseable

que

los

microorganismos confirieran al producto cualidades organolpticas agradables (MattilaSandholm y col., 2002).

31

Objetivos del trabajo

En los ltimos aos se ha incrementado notablemente el inters por el estudio de


la microbiota intestinal humana. Esto se debe, por un lado, a la existencia de una
relacin cada vez ms clara entre los microorganismos del intestino y la salud, y por
otro, a la posibilidad de modular o modificar esta microbiota mediante el consumo de
probiticos. Hasta hace poco tiempo los estudios se centraban fundamentalmente en
los microorganismos cultivables en heces y la clasificacin de stos se basaba en
caractersticas fenotpicas que no son fiables desde el punto de vista taxonmico. En la
actualidad, y gracias al desarrollo de diversas tcnicas moleculares, es posible el
estudio del ecosistema microbiano intestinal mediante el uso de metodologas
independientes de cultivo. Los resultados ms recientes sugieren la existencia de
numerosos microorganismos en el intestino que no se han podido cultivar todava, los
cuales podran ejercer una gran influencia en la fisiologa e inmunidad del hospedador.
Adems, diversos autores de reconocido prestigio han expresado su preocupacin
porque el anlisis microbiolgico del TGI no se ha efectuado en suficientes
comunidades humanas como para extraer conclusiones universales (Salminen y col.,
1998a; Tannock, 1999). Estos estudios son tambin necesarios para la aplicacin de
prebiticos, probiticos y dems alimentos funcionales de una manera racional y en
toda su potencialidad.

En este contexto, los objetivos que se plantearon en este trabajo fueron los
siguientes:

Analizar la microbiota fecal y la microbiota asociada a la mucosa intestinal en


individuos sanos de nuestra comunidad con hbitos alimenticios normales y
compararla con la descrita en otras poblaciones humanas.

32

Objetivos del trabajo

Conocer diversos parmetros bioqumicos en heces que pudieran estar


relacionados o influenciados por los microorganismos intestinales.

Comparar las metodologas tradicionales de cultivo con las nuevas tcnicas


moleculares

de

identificacin

tipificacin

para

el

estudio

de

los

microorganismos mayoritarios en heces y mucosa intestinal.

Aislar, identificar y caracterizar las especies mayoritarias de bifidobacterias y


lactobacilos intestinales con el fin de seleccionar cepas con posible aplicacin
como probiticos.

33

Material y mtodos

1. TOMA Y PROCESADO DE LAS MUESTRAS.


La seleccin de los individuos que participaron en el estudio corri a cargo del Dr.
Adolfo Surez de la Seccin de Digestivo del Hospital de Cabuees de Gijn, tras la
autorizacin del estudio por parte del Comit tico Regional del Principado de Asturias.
A los voluntarios se les realiz una entrevista personal y una encuesta de hbitos
alimentarios (ver Anexo 1). Se seleccionaron como donantes 10 individuos sanos del
Principado de Asturias; 4 hombres y 6 mujeres, con edades comprendidas entre los 34
y los 66 aos, con hbitos alimentarios normales y sin historial de tratamiento reciente
con antibiticos.
En dos de los sujetos se realiz un muestreo de heces durante dos semanas. En
los otros ocho individuos se llev a cabo un seguimiento a lo largo de un ao, durante
el cual se tomaron muestras de heces a razn de una muestra al mes, como norma
general. Las heces se recogieron en recipientes estriles y se introdujeron en jarras de
anaerobiosis con un sobre de Anaerocult A (Merck).
Cinco de los individuos se sometieron, durante el periodo controlado y por motivos
familiares, a una colonoscopia en la que se tomaron biopsias de mucosa de colon y/o
mucosa de recto. La extraccin del tejido intestinal se llev a cabo mediante una sonda
de biopsia intestinal (Watson). Las muestras de mucosa se introdujeron en una
solucin salina estril compuesta por: 0,9% (p/v) de NaCl (Panreac), 0,1% (p/v) de
proteosa peptona (Oxoid), 0,1% (v/v) de polisorbato 80 (Tween 80) (Panreac) y
0,02% de L-cistena HCl (Sigma).
Todas las muestras se remitieron al laboratorio mediante transporte urgente y se
procesaron en las 2 horas siguientes a su deposicin/extraccin en una cabina de
anaerobiosis Mac 500 (Don Whitley Scientific) con atmsfera reductora controlada
(10% H2, 10 % CO2, 80% N2).

34

Material y mtodos

2. ANLISIS MICROBIOLGICOS.
Las muestras se homogenizaron en una solucin reductora compuesta por: Brain
Heart Infusin (BHI) (Merck) con 0,5% de extracto de levadura (Biokar), 0,5% de
glucosa (Merck), 0,25% de L-cistena, 10 g/l de vitamina K1 (Merck) y 0,02 g/l de
hemina (Sigma). Las muestras de mucosa intestinal debido a su naturaleza mucosa se
disgregaron en la solucin reductora con la ayuda de una pipeta Pasteur aplanada y
con agitacin vigorosa en un vortex.
A partir de los homogenizados se realizaron diluciones decimales sucesivas que se
sembraron en superficie y por duplicado en placas Petri agarizadas con la ayuda de un
asa Digralsky. Los recuentos se expresaron como unidades formadoras de colonias
(ufc) por gramo de muestra. Los medios de cultivo utilizados para los recuentos de los
distintos grupos microbianos y las condiciones de incubacin se relacionan a
continuacin en la Tabla 3.

3. ANALISIS BIOQUMICOS EN HECES.


3.1. MEDIDA DE ACTIVIDADES ENZIMTICAS.
La medida de diversas actividades enzimticas en heces se llev a cabo mediante
las tiras reactivas API ZYM (bioMrieux). Cada tira permite el estudio de 19
actividades enzimticas, incluyendo lipasas, proteasas, fosfatasas y oxidasas. Cada
pocillo de la galera se rellen con 65 l de una dilucin 1/500 de la muestra de heces
en agua destilada estril, incubndose a 37C en cabina de anaerobiosis durante 4 h.
El revelado de las reacciones se efectu siguiendo las recomendaciones de la casa
suministradora y con los reactivos comerciales.

35

Tabla 3. Recuentos microbianos, medios de cultivo (Merck) y condiciones de incubacin.


Grupo microbiano

Medio de cultivo

Suplementacin

Condiciones de incubacin

Microorganismos anaerobios
totales

Brain Heart Infusion Agar


(Agar BHI)

0,5% extracto de levadura, 0,5% glucosa,


0,25% L-cistena, 10 g/l vitamina K1 y
0,02 g/l hemina

Cabina de anaerobiosis, 37C,


48-72 h

Clostridios

Reinforced Clostridial Agar


(RCA)

20 g/ml polimixina B (Sigma)

Cabina de anaerobiosis, 37C,


48-72 h

Bifidobacterias y lactobacilos

Agar de Man, Rogosa y Sharpe


(MRS)

0,25% L-cistena

Cabina de anaerobiosis, 37C,


48-72 h

Bacteroides

Esculine Bile Agar (EBA)

0,25% L-cistena, 10 g/l vitamina K1,


0,02 g/l hemina, 100 g/ml kanamicina y
7,5 g/ml vancomicina (Sigma)

Cabina de anaerobiosis, 37C,


48-72 h

Enterobacterias

Violet Red Bile Glucosa Agar


(VRBGA)

Aerobiosis, 37C,
24-48 h

Coliformes

Violet Red Bile Agar (VRBA)

Aerobiosis, 37C,
24-48 h

Enterococos

Agar de Slanetz y Bartley

Aerobiosis, 44C,
24-48 h

Estafilococos

Agar de Baird-Parker

Mohos y levaduras

50 ml/l emulsin de yema de huevo-telurito


potsico (Biokar)

Aerobiosis, 37C,
24-48 h

Yeast extract Glucose


Aerobiosis, 25C,
Chloramphenicol Agar (YGCA)
3-5 das
Las colonias de bifidobacterias se diferenciaron de las de lactobacilos mediante observacin de suspensiones celulares en un microscopio de
contraste de fases (Olympus).
36

Material y mtodos

3.2. DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE AMONIO.


La concentracin de amonio en heces se midi con una sonda selectiva para iones
amonio (Crison Instruments). La muestra de heces se diluy 1/100 en agua destilada y
se centrifug durante 10 minutos a 4.500 rpm. La concentracin de amonio se
determin por inmersin directa de la sonda en el sobrenadante. Se realizaron 3
mediciones consecutivas de cada muestra. La calibracin del equipo se llev a cabo
con soluciones de amonio de concentracin conocida.

3.3. DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE CIDOS GRASOS DE CADENA


CORTA (SCFAs).
El anlisis se realiz por cromatografa de gases en un cromatgrafo con inyector
de temperatura programada acoplado a un detector de ionizacin de llama, segn el
procedimiento

descrito

por

Tangerman

Nagengast

(1996)

con

algunas

modificaciones.

3.3.1. Preparacin de las muestras y extraccin.


Los SCFAs se obtuvieron de 0,1 ml de una dilucin 1/10 de la muestra de heces en
agua destilada, que se acidific con 0,1 ml de cido frmico (Panreac) al 20% y a la
que le adicion 0,1 ml de cido 2-etil-butrico (2 mg/ml) (Sigma) como patrn interno.
La solucin se extrajo con 1 ml de metanol (Merck) al 100%, centrifugando 10 min a
14.000 rpm. Los sobrenadantes se conservaron congelados a -80C hasta su anlisis.

3.3.2. Condiciones cromatogrficas.


La deteccin y cuantificacin se realiz en un cromatgrafo PE 8600 (Perkin
Elmer). Las separaciones cromatogrficas se realizaron en una columna capilar

37

Material y mtodos

HP-FFAP (25 m de longitud 0,32 mm de dimetro interno 0,52 m de espesor)


(Hewlett-Packard) empleando helio como gas portador a una presin de cabeza de 10
psi. La temperatura del inyector fue de 50 a 250C, con una relacin de split de 50:1,
y la del detector de 250C. La separacin de los SCFAs se llev a cabo en un rango de
temperaturas de 100-140C; con un calentamiento a 100C durante 1 min y una subida
de 5C/min, mantenindose a 140C durante 2 min. Se aplic posteriormente una
segunda rampa de 25C/min hasta 220C, temperatura a la que se mantuvo 2 min
para la limpieza completa de la columna.
Como estndares de calibracin se utilizaron soluciones acuosas de cido actico,
cido propinico, cido butrico, cido isobutrico, cido caproico, cido valrico y cido
isovalrico (todos de Sigma).

4. ANLISIS ESTADSTICO.
Los recuentos microbianos, as como los resultados de SCFAs del seguimiento
mensual de 8 sujetos se sometieron a un anlisis de varianza (ANOVA) de una va
utilizando individuo como factor con 8 categoras. Otos parmetros estadsticos
utilizados fueron: el coeficiente de variacin, la moda, la media y la desviacin
estndar. El anlisis se llev a cabo usando la hoja de clculo Microsoft Excel 2002 y el
programa estadstico SPSS 11.0 para Windows.

5. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS.
5.1. MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO.
Se aislaron un total de 265 cepas de placas de MRSC (MRS con un 0,25% de
cistena) y 57 cepas de placas de BHI, a partir de distintas muestras de heces y
mucosa intestinal de los 10 individuos. Las cepas se crecieron en cabina de

38

Material y mtodos

anaerobiosis durante 24-48 h en caldo MRSC y BHI respectivamente. Todas las cepas
se mantuvieron y conservaron a -80C en el medio de cultivo fresco correspondiente
con un 40% de glicerol (Merck).

6. IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS.
6.1. OBTENCIN DE EXTRACTOS CELULARES.
Para la obtencin de extractos bacterianos se utiliz bsicamente el protocolo
descrito por Song y cols. (2000). Las cepas se crecieron en cabina de anaerobiosis
durante 72 h en placas de MRSC o BHI y a partir de colonias aisladas se obtuvo
biomasa que se lav y resuspendi en 0,1 ml de Tampn TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM
EDTA pH 8) con 0,9% de NaCl. La suspensin celular se calent a 98C durante 10 min
en un termociclador Dualcycler LINUX (Cultek) y posteriormente se centrifug 10 min
a 14.000 rpm para eliminar los restos de material celular. Los extractos se conservaron
congelados a -20C hasta su utilizacin.

6.2. AMPLIFICACIN PARCIAL DEL GEN DEL ARNr 16S Y SECUENCIACIN.


Los extractos de las cepas se utilizaron para amplificar por PCR un fragmento del
gen que codifica el ARNr 16S mediante los oligonucletidos universales Y1 (5-TGG CTC
AGG ACG AAC GCT GGC GGC-3) e Y2 (5-CCT ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3)
(Young y cols., 1991). La regin que se amplifica, de unas 348 pb aproximadamente,
se extiende desde la base 50 a la 400 (segn la numeracin de Escherichia coli) y
contiene las regiones variables V1 y V2 de la molcula del ARNr 16S (Neefs y cols.,
1993). La amplificacin se realiz en un termociclador PCR Sprint (Hybaid). La
reaccin se llev a cabo en un volumen de 50 l, con una concentracin final de 0,25
M de cada oligonucletido, 200 M de cada uno de los dNTPs (Amersham), 2,5

39

Material y mtodos

unidades (U) de ADN polimerasa Taq (Amersham) y 5 l de los extractos celulares. Las
condiciones de la PCR fueron las siguientes:

1 ciclo

30 ciclos

1 ciclo

Desnaturalizacin

95C

5 min

Desnaturalizacin

94C

45 s

Anillamiento

56C

1 min

Extensin

72C

45 s

Extensin

72C

10 min

Los fragmentos amplificados se examinaron mediante electroforesis en geles de


agarosa (SeaKem, FMC) al 1% en tampn TBE (89 mM Tris-borato, 2 mM EDTA pH 8).
Como marcador de tamao molecular se us el patrn EZ Load 100 pb Molecular
Ruler (Bio-Rad). Las bandas de ADN se visualizaron en un transiluminador Gel Doc
2000 (Bio-Rad), tras tincin con una solucin de bromuro de etidio (0,5 g/ml)
durante 20 min (Sambrook y cols., 1989).
Para su secuenciacin, los amplicones se purificaron a travs de las columnas
limpiadoras GenElute PCR Clean Up (Sigma). De esta forma, se evita que los dNTPs y
los oligonucletidos presentes en la reaccin de amplificacin interfieran en las
reacciones de secuenciacin. Las secuencias nucleotdicas se obtuvieron mediante un
secuenciador capilar ABI 373 (Applied Biosystems) en el Servicio de Secuenciacin
del Centro de Investigaciones Biolgicas (CIB-CSIC). La identidad de las cepas se
estableci mediante comparacin de las secuencias con las presentes en las bases de
datos

pblicas

(GenBank:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

Ribosomal

Database Proyect: http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp), mediante el programa BLAST


(Basic Local Alignment Search Tool) (Altschul y cols., 1997).

40

Material y mtodos

7. TIPIFICACIN DE AISLADOS DE BIFIDOBACTERIAS.


7.1. PERFIL DE FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS.
La capacidad de fermentacin de cepas de bifidobacterias se estudi en
microplacas PhP-LB (PhenePlateTM, PhP System), siguiendo las instrucciones de la
casa comercial. Los carbohidratos ensayados fueron: arabinosa, xilosa, galactosa,
maltosa, celobiosa, trealosa, palatinosa, sacarosa, lactosa, melibiosa, manosa,
melecitosa,

inositol,

manitol,

arbutina,

sorbitol,

sorbosa,

ramnosa,

tagatosa,

amigdalina, gluconato y salicina. Los pocillos de las placas se inocularon con 150 l de
una suspensin de las cepas en el medio de fermentacin de la casa suministradora, y
se incubaron durante 48 h a 37C en cabina de anaerobiosis.
Con los resultados obtenidos, codificados como 0 (reaccin negativa) y 1 (reaccin
positiva), se realiz un anlisis numrico empleando el programa MVSP (Multi-Variate
Statistical Package) versin 3.1 (Kovach Computing Service). A partir de las bases de
datos dicotmicas obtenidas se calcularon las similitudes entre las cepas utilizando el
ndice de Sokal y Mitchener (SM o Simple Matching Coefficient), que es el cociente
entre la suma de las pruebas coincidentes entre dos cepas, dividido por las cuatro
combinaciones posibles:

a+b
a+b+c+d
a=(1,1), b=(1,0), c=(0,1) y d=(0,0)

Una vez obtenidas las matrices de similitud se formaron los grupos mediante el
mtodo de agrupamiento UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic

41

Material y mtodos

Averages) (Priest y Austin, 1995). Este algoritmo asocia las distintas cepas en funcin
de su grado de similitud, obtenindose as dendogramas que permiten evaluar la
formacin de grupos y subgrupos y establecer las posibles relaciones entre los
aislados.

7.2. RAPD-PCR.
Se utiliz la tcnica RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) para la
tipificacin genotpica de cepas de bifidobacterias. A partir de cultivos en caldo MRSC
de 24 h se obtuvo ADN cromosmico mediante la utilizacin del kit comercial GenElute
Bacterial Genomic DNA (Sigma), siguiendo bsicamente las recomendaciones de la
casa suministradora y empleando adems 50 mg/ml de lisozima y 100 U/ml de
mutanolisina (Sigma) en la solucin de lisis inicial.
El ADN purificado se utiliz en una subsiguiente amplificacin por PCR, en la que
se uso un nico oligonucletido de 10 pb con un contenido en G+C del 60% (OPA 18:
5'-AGGTGACCGT-3') (Vincent y cols., 1998). La reaccin se realiz en un volumen final
de reaccin de 50 l, adicionando el oligonucletido a una concentracin de 1 M junto
con 200 M de cada uno de los dNTPs, 2,5 U de ADN polimerasa Taq (Eppendorf) y 3
l de la solucin de ADN bacteriano. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes:

1 ciclo

35 ciclos

1 ciclo

Desnaturalizacin

95C

5 min

Desnaturalizacin

95C

1 min

Anillamiento

32C

1 min

Extensin

72C

2 min

Extensin

72C

10 min

42

Material y mtodos

Los fragmentos generados se examinaron mediante electroforesis en geles de


agarosa al 1,2% en tampn TBE. Como marcador de tamao molecular se us el
patrn EZ Load 500 pb Molecular Ruler (Bio-Rad). Para la visualizacin y el examen
de las bandas de amplificacin se procedi de la misma manera que la descrita en el
apartado 6.2.
A partir de los perfiles de amplificacin de las cepas se construy una matriz de
datos dicotmica (presencia ausencia de banda) que se proces con el programa
MVSP. El anlisis de grupos se realiz mediante el algoritmo UPGMA, utilizando el
ndice de similitud de Sorensen-Dice (Dice, 1945):

2a
2a+b+c
a=(1,1), b=(1,0), c=(0,1) y d=(0,0)

8. ANLISIS MOLECULAR.
8.1. AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DEL ADN TOTAL.
El ADN bacteriano total se aisl a partir de dos muestras de heces de dos sujetos y
de dos muestras de mucosa intestinal de otros dos individuos. Las muestras se
diluyeron y homogenizaron en tampn fosfato salino o PBS (tampn fosfato 100 mM
pH 7,4 con NaCl al 0,9%) a razn 1:10 (p/v). Esta suspensin se agit vigorosamente
en presencia de esferas de vidrio de 106 m (Sigma), separndose el material no
soluble y las bolas de vidrio mediante centrifugacin a baja velocidad (800 rpm 2 min).
El sobrenadante se centrifug posteriormente a 14.000 rpm durante 5 min y el
sedimento de clulas bacterianas se congel a -20C. La lisis bacteriana se llev a cabo

43

Material y mtodos

con posterioridad en 50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA y 6,7% de sacarosa (Merck).


Esta suspensin se incub durante 1 h a 37C en presencia de 20 mg/ml de lisozima
(USB Corporation). A continuacin, se aadieron 25 l de SDS (USB) al 10% y 20
mg/ml de proteinasa K (Roche), incubndose la mezcla 1 h a 55C. Para la extraccin y
purificacin de los cidos nucleicos, las muestras se desproteinizaron con fenolcloroformo-alcohol isoamlico 24:24:1 (USB) y el ADN se precipit con etanol absoluto.
El precipitado se lav con etanol al 70% y tras su secado se resuspendi en tampn
TE.

8.2. AMPLIFICACIN PARCIAL DEL ADNr 16S.


Para el anlisis molecular de microorganismos mayoritarios, el ADN purificado de
las muestras se utiliz para amplificar por PCR un fragmento del gen que codifica el
ARNr 16S mediante los oligonucletidos universales Y1 e Y2. Las condiciones de la
reaccin fueron las mismas que las descritas en el apartado 6.2, con la excepcin de
que en este caso se adicion 1 l del ADN total purificado como molde. Las
condiciones de la PCR fueron tambin las mismas, con la salvedad de que se realizaron
nicamente 10 ciclos de amplificacin. El nmero de ciclos se redujo para que la
muestra no se enriqueciera en secuencias que puedan amplificar de forma ms
eficiente (Wilson y Blitchington, 1996).
Para el anlisis molecular de bifidobacterias se utilizaron los oligonucletidos
especficos para el gnero Bifidobacterium Bif 164-PCR (5- GGGTGGTAATGCCGGATG3) y Bif 662-PCR (5-CCACCGTTACACCGGGAA-3) (Langendijk y cols., 1995), entre los
que se incluyen las regiones variables V2 y V4 del gen del ARNr 16S (Neefs y cols.,
1993). En este caso, el fragmento amplificado por PCR es de unas 523 pb y se
extiende desde la base 164 a la 679, segn la numeracin de E. coli. Las condiciones

44

Material y mtodos

de la reaccin fueron esencialmente las descritas por Kok y cols. (1996), adicionando 2
l del ADN total purificado como ADN molde. La PCR se realiz con el siguiente
programa de temperaturas:

1 ciclo

20 ciclos

1 ciclo

Desnaturalizacin

95C

5 min

Desnaturalizacin

95C

1 min

Anillamiento

62C

45 s

Extensin

72C

1 min

Extensin

72C

5 min

8.3. CLONACIN Y SECUENCIACIN DE LOS AMPLICONES.


Los amplicones se clonaron en un vector especfico para fragmentos de PCR (pCR
2.1-TOPOTM), para lo que se utiliz el kit comercial TA Cloning (Invitrogen), siguiendo
esencialmente las recomendaciones de la casa suministradora. La reaccin de ligacin
se llev a cabo a 14C durante 12 h. Posteriormente se transformaron 20 l de clulas
competentes de Escherichia coli One Shot (Invitrogen) con 2 l de la ligacin,
mediante electroporacin en un Gene Pulser Apparatus (Bio-Rad) con cubetas
estndar de 0,2 cm de separacin entre polos. Las condiciones del pulso elctrico
aplicado fueron: 2.500 V, 200 y 25 F. Una vez transformadas, las clulas se
resuspendieron inmediatamente en 1 ml de medio SOC (Hanahan, 1985) y se
incubaron a 37C durante 1 h con agitacin constante (200-240 rpm). Los
electrotransformantes se seleccionaron en placas de medio 2xTY (Sambrock y cols.,
1989) suplementado con 75 g/ml ampicilina, 0,5 mM de IPTG y 80 g/ml de X-gal
(todos de Sigma).

45

Material y mtodos

Para el aislamiento y purificacin del ADN plasmdico de los clones se utiliz el


procedimiento de lisis alcalina de Birnboim y Doly (1979). En otras ocasiones se utiliz
el kit comercial GenElute Plasmid Minipred (Sigma). Para comprobar la presencia de
insertos, el ADN plasmdico se digiri con el enzima de restriccin EcoR1 durante 1h a
37C y se analiz mediante electroforesis en geles de agarosa.
Finalmente, el ADN recombinante se secuenci en la Unidad de Secuenciacin de
la Universidad de Oviedo empleando un secuenciador automtico ABI PRISM 3100
Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Las secuencias se compararon con las
presentes en las bases de datos pblicas. La nomenclatura de las especies y asignacin
a

grupo

filogentico

se

realiz

http://www.cme.msu.edu/bergeys/

con

la

ayuda

(Bergeys

de
Manual

las

pginas
on

Web:
line),

http://www.bacterio.cict.fr/ (List of Bacterial names with Standing in Nomenclature)


y http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm (Bacterial Nomenclature Up-to-Date).

Figura 6. Diagrama de los pasos seguidos en el anlisis molecular de microorganismos


de muestras de heces y mucosa intestinal.

Muestra intestinal o fecal

Aislamiento del ADN total

Amplificacin parcial del ADNr 16S por PCR


5'

3'

Clonacin, secuenciacin y anlisis filogentico

46

Material y mtodos

9. ENSAYOS DE CARACTERSTICAS PROBITICAS.


9.1. RESISTENCIA A SALES BILIARES.
La resistencia a sales biliares de diversos aislados de bifidobacterias y lactobacilos
se determin en placas de MRSC suplementadas con concentraciones gradualmente
crecientes de bilis bovina (Oxgall, Sigma). El rango de concentraciones utilizado fue
entre un 0,06% y 2% de Oxgall. La siembra de las placas se realiz mediante un
inoculador de Steers utilizando cultivos activos de 24-36 h. Los resultados se
evaluaron al cabo de 48 h de incubacin a 37C en cabina de anaerobiosis.

9.2. RESISTENCIA A pH CIDO.


La resistencia a la acidez de bifidobacterias y lactobacilos se ensay por duplicado
en placas Microtiter (Sterilin) con caldo MRSC acidificado con HCl (12 N) a pH 2,5, 3,
3,5, 4 y 4,5. Como control se utiliz MRSC sin acidificar (pH 5,5). Las placas
Microtiter se inocularon al 2% con cultivos activos de las cepas de de 24-36 h y se
incubaron durante 48 h a 37C en cabina de anaerobiosis.

9.3. ACTIVIDADES ENZIMTICAS.


Para la determinacin de diversas actividades enzimticas de bifidobacterias y
lactobacilos se utilizaron las tiras reactivas API ZYM (bioMrieux). Cada pocillo de la
galera se inocul con 65 l de una suspensin celular en agua destilada. Las tiras se
incubaron a 37C durante 4 h en cabina de anaerobiosis. Las reacciones se revelaron
mediante la adicin de los reactivos suministrados por la casa comercial. La actividad
enzimtica se expres en nanomoles de sustrato hidrolizado.

47

Material y mtodos

9.4. RESISTENCIA A ANTIBITICOS.


Se

estudi

la

resistencia

de

bifidobacterias

lactobacilos

diversos

antimicrobianos mediante la determinacin de la Concentracin Inhibitoria Mnima


(CIM). La CIM es la concentracin ms baja de antibitico a partir de la cual no se
observa crecimiento. El ensayo se llev a cabo con el kit comercial Sensititre Anaero3
(Treck Diagnostic Systems). Este mtodo sigue las recomendaciones del NCCLS
(National Committee for Clinical Laboratory Standards) que establece las referencias
estndar para la determinacin de las CIMs de bacterias anaerobias (NCCLS, 1997).
Los

antibiticos

analizados

fueron:

penicilina,

amoxicilina,

amoxicilina+cido

clavulanico, piperacilina, piperacilina+tazobactam, cefoxitina, imipenem, cloranfenicol,


eritromicina, clindamicina, metronidazol, moxifloxacino, tetraciclina y vancomicina. Para
la siembra de las microplacas se siguieron las recomendaciones de la casa
suministradora. La lectura de los resultados realiz tras 48 h de incubacin a 37C en
cabina de anaerobiosis.

9.5. INHIBICIN DE PATGENOS.


Para el estudio de la inhibicin de patgenos se determin la actividad antagnica
de diversos aislados de bifidobacterias y lactobacilos contra microorganismos de la
coleccin de la UCC (University College Cork). Las cepas ensayadas fueron:

Escherichia coli wt 555, Salmonella enterica serotipo Typhimurium LT2 UK1,


Staphylococcus aureus ATTC 1448, Listeria monocytogenes 1078 y Bacillus cereus
NCIMB 1771, que se crecieron en medio BHI a 37C durante 24 h. Se utiliz un ensayo
de inhibicin en placa de doble capa o test del spot en agar, segn describieron
Jacobsen y cols. (1999). A partir de cultivos de 24-36 h de las cepas, se depositaron 5
l en la superficie de placas de MRSC con solo un 0,2% de glucosa para minimizar el

48

Material y mtodos

efecto inhibidor de la produccin de cidos orgnicos. Las placas se incubaron en


jarras de anaerobiosis con un sobre de Anaerocult A durante 24-48 h, hasta que se
apreci el crecimiento en forma de botn. A continuacin se inocularon 100 l del los
cultivos de una noche de los patgenos en 7 ml de medio BHI suplementado con
0,75% de agar y la mezcla se verti sobre las placas. Los halos de inhibicin se
midieron tras incubacin a 37C durante 48 h. Despus de un ensayo por duplicado,
una zona clara de inhibicin de ms de 1 mm de radio alrededor de los botones de
crecimiento fue considerada como positiva. Se ensay como control negativo el efecto
del caldo MRSC sobre el crecimiento de los patgenos. Como control positivo se utiliz
la cepa de Lactobacillus salivarius UCC 118, capaz de inhibir el crecimiento in vitro de
varios patgenos (Dunne y cols., 1999).

9.6. PRODUCCIN DE BACTERIOCINAS.


La produccin de bacteriocinas de varias cepas de bifidobacterias y lactobacilos se
ensay mediante el test de inhibicin en placa de doble capa y la tcnica de difusin
en agar (Reddish, 1929; Schillinger y Lcke, 1989). Como microorganismos indicadores
se utilizaron dos cepas de origen intestinal (Lactobacillus delbrueckii C102 y

Bifidobacterium longum L13) y la cepa de coleccin Lactobacillus sakei CECT 906.


Como controles positivos se utilizaron las cepas Lactococcus lactis NCDO 497
productora de nisina y Lactobacillus plantarum LL 441 productora de plantaricina C
(Gonzlez y cols., 1994).
El ensayo de doble capa se realiz de forma similar a la descrita en el apartado
anterior para la inhibicin de patgenos. Los indicadores L. sakei, L. plantarum y Lc.

lactis se crecieron en MRS a 32C, mientras que L. delbrueckii y B. longum se crecieron


en cabina de anaerobiosis a 37C. El medio semislido (0,75% de agar) de sobrecapa

49

Material y mtodos

fue MRSC con baja concentracin de glucosa (0,2%), inoculado con el indicador entre
un 2 y un 5%.
Mediante la tcnica de difusin en agar se ensay la actividad antimicrobiana de
los sobrenadantes libres de clulas o CFS (Cell free supernatant). Los sobrenadantes
se obtuvieron por centrifugacin (8.000 rpm 10 min) a 4 C de cultivos activos de 24 h.
Con la ayuda de un sacabocados se excavaron pocillos de 5 mm de dimetro en placas
de 20 ml de MRSC suplementado con agar al 1,5% e inoculado con el indicador al 5%
en profundidad. Cada pocillo se rellen con 30 l del sobrenadante a ensayar. La
actividad antimicrobiana se puso de manifiesto por la aparicin de halos de inhibicin
en el crecimiento en csped de la cepa indicadora.

9.6.1. Caracterizacin de la sustancia inhibidora.


En el caso de la cepa de Bifidobacterium longum L25 se realizaron diversos
ensayos para tratar de determinar la naturaleza del compuesto inhibidor que produca.
El CFS con capacidad de inhibicin se neutraliz a pH 7 con NaOH 1N y se filtr con
filtros de poro de 0,2 m (Whatman).
-Estimacin del tamao molecular. El tamao molecular de la sustancia se
estim utilizando centricones de distintos tamaos de exclusin molecular (10 y 5 kDa)
(Millipore). El CFS activo se filtr a travs de los centricones por centrifugacin a
13.200 rpm durante 20 min. A continuacin se ensayaron las actividades del filtrado y
del retenido sobre los microorganismos indicadores.
-Tratamiento del inhibidor con calor. La termorresistencia del compuesto se
determin mediante tratamiento del CFS con calor (40, 60 y 80C durante 10 min) en
un termociclador Dualcycler (LINUX), ensayndose posteriormente la actividad
residual.

50

Material y mtodos

-Tratamiento con enzimas proteolticos. La sensibilidad de la sustancia


antimicrobiana a las proteasas se ensay incubando el CFS con 1 mg/ml de Pronasa
(Roche), Tripsina (Merck) y Proteinasa K (Boehringer) en 10 mM de tampn fosfato pH
7 durante 30 min a 37C; ensayndose la actividad residual tras el tratamiento.

9.7. ADHERENCIA A CLULAS EPITELIALES HUMANAS.


La capacidad de varios aislados de bifidobacterias y lactobacilos para adherirse a
las lneas epiteliales humanas Caco-2 y HT-29 se ensay siguiendo el mtodo descrito
por Chauviere y cols. (1992) con algunas modificaciones. La adhesin se compar con
la de la cepa comercial Lactobacillus rhamnosus GG, considerada el estndar actual
para cepas probiticas adherentes (Elo y cols., 1991).

9.7.1. Lneas celulares epiteliales.


Las lneas celulares Caco-2 y HT-29 se crecieron en monocapas en medio DMEM
(Dulbeccos Modified Eagles Medium) (Sigma) suplementado con un 10% de suero
fetal de ternero (Sigma) y 100 UI/ml de penicilina-estreptomicina (Sigma), en frascos
para cultivo de tejidos de 75 cm2 (Sarstedt). La incubacin se realiz a 37C en estufa
con atmsfera enriquecida en un 5% de CO2, cambindose el medio cada 2 das
aproximadamente. Al alcanzar un 95% de confluencia, las clulas se transferan a
nuevos frascos previa lisis de las monocapas con una solucin de 0,25% tripsina y
0,02% de EDTA durante 10 min a 37C.
Tras el tratamiento con tripsina, se determino el nmero de clulas viables
mezclando la suspensin celular en DMEM con una solucin de tincin de azul tripano
al 0,4% (Sigma), a razn de 1:10 (v/v). Los recuentos microscpicos se realizaron en
un hemocitmetro (Improve Neubaur), teniendo en cuenta que las clulas muertas

51

Material y mtodos

permiten la penetracin del colorante y aparecen azules, mientras que las clulas
viables se muestran refringentes al repeler el colorante.

9.7.2. Ensayos de adhesin.


Los ensayos de adhesin se llevaron a cabo con las monocapas tras unos 20-30
pases. Las clulas epiteliales se crecieron entonces en placas de seis pocillos para el
cultivo de tejidos (Sarstedt) a una concentracin de 105 clulas/pocillo en 3 ml de
medio. Al cabo de 10 das en cultivo aproximadamente, las clulas estn diferenciadas
y han alcanzado el estado confluente (Pinto y cols., 1983). En ese momento las
monocapas se lavaron dos veces con tampn fosfato salino (PBS tablets, Gibco) y se
aadieron 2 ml de DMEM sin antibitico y 1 ml del cultivo bacteriano a ensayar (con
108-109 ufc/ml aproximadamente). La mezcla se incub durante 2 h a 37C en estufa
de CO2. Tras la incubacin, las monocapas se lavaron cinco veces con PBS para
eliminar las bacterias no adheridas. Para solubilizar las clulas intestinales y las
bacterias adheridas, las monocapas se desintegraron con la ayuda de un rascador y
agua destilada estril helada. El nmero de bacterias adheridas en cada pocillo se
determin mediante recuentos por duplicado en placas de MRSC a partir de diluciones
decimales sucesivas en solucin Ringer (Merck). Las placas se incubaron durante
48 h a 37C en jarras de anaerobiosis con Anaerocult A. Cada ensayo de adhesin se
realiz por duplicado y cada experimento se repiti dos veces. Los resultados se
expresaron como ufc adheridas por 10 cm2.

52

Resultados y discusin: Captulo I

Captulo I: Evolucin a lo lago del tiempo de parmetros


microbiolgicos y bioqumicos de heces. Estudio de la
microbiota asociada a mucosa intestinal.

I.1. SEGUIMIENTO DIARIO DE LA MICROBIOTA DE HECES Y


ACTIVIDADES ENZIMTICAS ASOCIADAS.
Con este trabajo se inici en el IPLA una nueva lnea de investigacin que
implicaba un buen nmero de tcnicas novedosas. Por esta razn, decidimos iniciar el
estudio de manera secuencial. En primer lugar, para tomar contacto con los nuevos
equipos e ir acostumbrndose a las tcnicas especficas del trabajo en condiciones
anxicas, se comenz estudiando las variaciones microbiolgicas y enzimticas diarias
de heces en dos individuos a lo largo de dos semanas de seguimiento. Se pretenda
con ello conocer el rango de variacin de estos parmetros en heces para abordar
posteriormente el estudio a ms largo plazo y en un nmero mayor de individuos.

I.1.1. RECUENTOS MICROBIOLGICOS.


A lo largo de dos semanas se tomaron muestras de heces de dos individuos (B y
D). En este periodo se analizaron 7 muestras del individuo B y 11 del individuo D. En la
Figura 7 se muestra la evolucin diaria de las diversas poblaciones microbianas
controladas.
Los recuentos ms altos se encontraron en las placas para microorganismos
anaerobios totales, clostridios y bifidobacterias, que presentaron niveles de entre

53

Resultados y discusin: Captulo I

109-1011 ufc/g de heces en las muestras de ambos individuos. Estos grupos


microbianos mayoritarios se mostraron relativamente estables a lo largo del
seguimiento, observndose solo pequeas fluctuaciones puntuales. Los recuentos de
bacteroides (alrededor de 108 ufc/g) fueron ms bajos que lo que est descrito en la
literatura (Mitsuoka, 1992b; Conway, 1995). De hecho, estos microorganismos no se
encontraron en algunas de las muestras del sujeto D (lmite de deteccin 107 ufc/g).

Figura 7. Evolucin diaria de diversas poblaciones microbianas en heces de dos


individuos.

Individuo B

Log 10 ufc/g

12
10
8
6
4
2
0
1

Muestra/Da
M. totales

Bifidobacterias

Lactobacilos

Enterobacterias

Mohos y levaduras

Clostridios

Bacteroides

Coliformes

Enterococos

Estafilococos

Individuo D
12
Log 10 ufc/g

10
8
6
4
2
0
1

Muestra/Da

54

10

11

Resultados y discusin: Captulo I

Las placas utilizadas para la enumeracin de los bacteroides (EBA) contenan


varios agentes selectivos como bilis, esculina, kanamicina y vancomicina, que podran
hacer el medio extremadamente selectivo y afectar a la recuperacin de alguno de
estos microorganismos (Corthier y col., 1996). El hecho de que estas bacterias
requieran aportes nutricionales complejos y estrictas

condiciones de anaerobiosis

dificulta an ms su cultivo.
Los recuentos de bifidobacterias fueron bastante estables en niveles de 109 -1011
ufc/g en ambos individuos, mientras que los lactobacilos solo se detectaron en algunas
de las muestras. El medio de recuento utilizado para ambos microorganismos fue el
mismo ya que con ninguno de los medios ensayados para el cultivo selectivo de
lactobacilos (incluso en MRS acidificado a pH 4,5) se pudo inhibir el crecimiento de las
bifidobacterias, lo que situaba el lmite de deteccin para los primeros en torno a 106
ufc/g. En las muestras en las que fue posible estimar su nmero, los niveles se
situaron alrededor de 108 ufc/g en el individuo B y 107 ufc/g en el individuo D.
Los recuentos de microorganismos aerobios (estafilococos, enterococos y mohos y
levaduras) presentaron mayores fluctuaciones, sobre todo en el Individuo D. Estos
grupos, cuyos niveles oscilaron entre 103 y 106 ufc/g, se encontraron en proporciones
inferiores a los de la microbiota anaerobia estricta, tal y como esta descrito en la
literatura (Drasar y Barrow 1985; Mitsuoka, 1992b; Conway, 1995; Tannock, 1999b).
Los recuentos de enterobacterias se correspondieron en la mayora de las muestras
con los de coliformes. Las muestras 6, 7 y 8 en el individuo D constituyeron una
excepcin. En stas, los coliformes se mostraron desplazados por una poblacin de
enterobacterias lactosa negativa, que se identific posteriormente en el Hospital de
Cabuees como Salmonella sp. Este desplazamiento microbiano coincidi en el tiempo
con una perturbacin diarreica acompaada de fiebre sufrida por el sujeto durante tres

55

Resultados y discusin: Captulo I

das. Como se puede ver en la grfica, los grupos microbianos mayoritarios no se


vieron afectados durante este tiempo. Estos datos nos sugieren que cambios en las
poblaciones subdominantes pueden tener un impacto importante en la salud del
hospedador sin que las poblaciones dominantes se vean afectadas.

I.1.2. MEDIDA DE ACTIVIDADES ENZIMTICAS.


Otra aproximacin para el conocimiento de la microbiota intestinal consiste en
estudiar determinados parmetros bioqumicos en heces relacionados con el
metabolismo bacteriano. La medida de metabolitos y actividades enzimticas en
muestras fecales puede dar informacin de la presencia de ciertos grupos de bacterias
y de su actividad metablica. (Tannock, 1999b). Adems de ser indicadores de la
actividad microbiana intestinal, determinadas actividades enzimticas se relacionan en
niveles

elevados

con

ciertas

patologas

tendencias

hacia

determinadas

enfermedades, como es el caso de las actividades -glucuronidasa y -glucosidasa,


capaces de generar compuestos carcinognicos o mutagnicos de los componentes de
la dieta (Rowland, 1995; Goldin, 1996; Kim y Jin, 2001).
En nuestro caso, determinamos diversas actividades enzimticas hidrolticas
(lipasas, proteasas, fosfatasas y oxidasas) en heces mediante las tiras reactivas API
ZYM. En la Tabla 4 se muestran los valores modales de las actividades enzimticas
detectadas en los individuos B y D, as como los datos de las distintas muestras que
difirieron de la moda.
En ninguna de las muestras se detectaron actividades lipasa C14, cistena-

arilamidasa, tripsina, -quimiotripsina, y -manosidasa. Aunque se encontraron


diferencias para algunas actividades entre muestras de un mismo individuo, cada
sujeto parece presentar un perfil enzimtico caracterstico. As por ejemplo, los valores

56

Resultados y discusin: Captulo I

de la actividad lipoltica fueron siempre mayores en el individuo D. Por el contrario, las


actividades fofatasa alcalina, - y -galactosidasa, -glucuronidasa y -glucosidasa se
mostraron ms elevadas en las muestras del individuo B.

Individuo B

Valor Modal
Muestra
1
2
3
4
5
6
7

Individuo D

Valor Modal
Muestra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

-Fucosidasa

N-Acetil--glucosaminidasa

-Glucosidasa

-Glucosidasa

-Glucuronidasa

-Galactosidasa

-Galactosidasa

Val-arilamidasa

Leu-arilamidasa

Esterasa-lipasa (C8)

Esterasa (C4)

Fosfatasa cida

Fosfatasa alcalina

Enzima

Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa

Table 4. Actividades enzimticas expresadas en unidades de actividad en muestras


de heces de los individuos D y B.

19 77 19 14 10 19 ND 38 67 58 29 48 58 10
19

38

14

14
38
38

29
48
77

29 29 19 29
29 38 19

67

38 38 67
38
48 48
77 77

38 38 29 38 19 29 ND 10 58 38 58 10 58 10
5

19
19
77
29

19
19
19
77 19

10
19
19

10
19

10

29 38
29 29 38

5
77

5
5

: 1 Unidad de actividad equivale a 1mol de substrato hidrolizado por hora y por g de heces.
ND: No detectado.

57

Resultados y discusin: Captulo I

Resultados similares han sido puestos de manifiesto por Mykknen y cols. (1998),
quienes describieron que las variaciones diarias en las actividades enzimticas en
heces eran significativamente menores a las variaciones existentes entre individuos.
En el sujeto B se detect un aumento considerable de los niveles de diversas
actividades en las dos ltimas muestras del seguimiento, que fue especialmente
notable en varias glicosidasas. Este aumento no se asoci con ningn cambio aparente
en los recuentos microbianos. Las glicosidasas son, sin embargo, unas de las
actividades enzimticas bacterianas ms importantes en el colon. Los vegetales de la
dieta contienen una gran variedad de glicsidos que son pobremente adsorbidos y
pasan al colon donde se hidrolizan mediante glicosidasas bacterianas, principalmente

-glucosidasas. Las agliconas liberadas pueden ser perjudiciales por su efecto


mutagnico o carcinognico (Parodi, 1999).
En el individuo D, el desplazamiento de la poblacin de coliformes por la
salmonela, descrito en el apartado anterior, se correspondi en el tiempo con un
aumento de la actividad -glucosidasa y un descenso notable de la actividad

-glucosidasa (muestras 7 y 8).

I.2. SEGUIMIENTO MENSUAL DE LA MICROBIOTA DE HECES Y


PARMETROS BIOQUMICOS ASOCIADOS.
Despus de este estudio introductorio, el trabajo se centr en la descripcin y la
evolucin de parmetros microbiolgicos y bioqumicos en heces de 8 personas a lo
largo de un ao. Durante este tiempo se recogieron y analizaron, de forma
generalizada, muestras mensuales de heces de estos individuos. En las muestras se
llevaron a cabo recuentos microbiolgicos similares a los realizados en el estudio
precedente. Del mismo modo, se ensayaron tambin las actividades enzimticas a lo

58

Resultados y discusin: Captulo I

largo del tiempo. Por ltimo, en este periodo pusimos a punto las tcnicas para la
extraccin, deteccin y cuantificacin de cidos grasos de cadena corta (SCFAs) y la
medida de la concentracin de amonio en heces; parmetros relacionados con la
actividad microbiana intestinal (Cummings, 1997; Parodi, 1999).

I.2.1. RECUENTOS MICROBIOLGICOS.


Procedentes de los 8 individuos (denominados con las siglas A, C, E, F, G, H, L y
M) se analizaron un total de 64 muestras de heces. En la Figura 8 se representa las
variaciones muestrales a lo largo del seguimiento en los recuentos de microorganismos
anaerobios totales, bifidobacterias, lactobacilos y coliformes en heces de los distintos
individuos.
Figura 8. Variaciones muestrales en los recuentos de microorganismos anaerobios
totales, bifidobacterias, lactobacilos y coliformes en heces.

Bifidobacterias

Lactobacilos

12

ufc/g

10

log

log10 ufc/g

10

4
2
0
0

A1

C2

E3

4
F

G5

6
H

7L

8M

10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0

1
A

C2

E3

Individuos

4F

5
G

6H

7L

8
M

Individuos

Coliformes

M. Anaerobios totales
10

14

12

8
7
log 10 ufc/g

log10 ufc/g

10
8
6

6
5
4
3

1A

2
C

3E

4F

5
G

Individuos

6H

7L

8
M

1
A

C2

3
E

4F

5
G

6H

7L

8
M

Individuos

59

Resultados y discusin: Captulo I

En la Tabla 5 se muestran las medias y las desviaciones estndar de todos los


recuentos microbianos, as como los resultados del anlisis estadstico ANOVA.
Los microorganismos anaerobios totales se encontraron en niveles de 109- 1011
ufc/g de heces. Los grupos microbianos mayoritarios, al igual que ocurra en los dos
individuos analizados anteriormente, fueron los clostridios, las bifidobacterias y los
bacteroides. Aunque en algunos casos se encontraron variaciones importantes entre
muestras del mismo individuo, estas poblaciones predominantes permanecieron
relativamente constantes en el tiempo, con coeficientes de variacin (CV=desviacin
estndar/media, en %) entre muestras menores del 10%.
El test de ANOVA indic la existencia de diferencias estadsticamente significativas
entre individuos en todos los grupos microbianos analizados excepto en el de los
bacteroides. Para este grupo microbiano, al igual que en las muestras diarias de los
individuos B y D, los recuentos estuvieron bastante por debajo de lo esperado, no
encontrndose en muchas de las muestras analizadas (nivel mnimo detectable 107
ufc/g). El grupo de los bacteroides est constituido por microorganismos anaerobios
estrictos extremadamente sensibles al oxgeno y con unos requerimientos nutricionales
complejos, lo que dificulta su cultivo y recuperacin. Adems, como ya comentamos
anteriormente, la extremada selectividad del medio podra inhibir tambin a
determinadas especies o a aquellas partes de la poblacin que se encuentren en
estados fisiolgicos crticos.
Las bifidobacterias se encontraron en los distintos sujetos en niveles de 109-1010
ufc/g. Los lactobacilos no se detectaron ni en todos los individuos (en los sujetos L y M
no aparecieron nunca), ni en todas las muestras. Cuando estaban presentes, su
concentracin oscil ampliamente entre 105-108 ufc/g en los distintos individuos.

60

Tabla 5. Medias, desviaciones estndar y resultados del ANOVA de los recuentos microbianos en heces durante el seguimiento a lo
largo de un ao en 8 voluntarios.
Recuentos microbianos (Log 10 ufc/g de heces)
N de

Microorganismos

muestras

anaerobios totales

Mohos y

Clostridios

Bifidobacterias

Bacteroides

Coliformes

Lactobacilos

Enterococos

Estafilococos

10,78 0,32

9,93 0,56

9,37 1,05

9,15 1,05

6,23 0,91

8,56 0,37

5,94 0,55

3,80 0,50

2,77 0,76

10,32 0,47

10,30 0,26

9,24 0,71

8,79 0,20

6,94 1,17

6,24 0,61

5,51 0,84

4,23 1,81

3,02 1,33

10,24 0,38

10,31 0,49

9,13 0,50

8,98 0,09

7,50 0,76

7,04 0,20

6,48 0,81

5,02 1,23

2,39 0,42

10,76 0,44

9,97 0,30

9,14 0,71

8,94 0,71

6,62 0,95

7,10 1,07

5,87 0,51

3,60 1,07

3,21 1,14

10

10,27 0,63

10,47 0,08

10,34 0,26

8,66 0,62

8,27 0,59

5,95 0,58

5,54 1,06

4,35 0,68

3,97 0,81

10,11 0,27

9,69 0,37

8,68 0,89

8,80 0,44

6,51 0,67

6,58 0,50

5,95 1,28

4,84 1,29

3,33 0,81

9,89 0,34

9,66 0,40

9,30 0,41

8,28 0,99

7,76 0,83

ND

5,84 0,76

5,12 0,96

2,50 0,44

9,84 0,47

9,83 0,49

9,19 0,44

8,65 0,07

7,88 0,80

ND

4,92 0,68

4,77 0,45

3,79 0,44

NS

***

***

**

Individuo

ANOVA

: Los recuentos de coliformes se correspondieron con los de enterobacterias en todos los casos.
ND: No detectado.
NS: Diferencias no significativas, : p<0,1, *: p<0,05, **: p<0,01, ***: p<0,001.

levaduras

61

Resultados y discusin: Captulo I

La existencia de grandes variaciones entre individuos en el nmero de lactobacilos


ha sido descrita con anterioridad en trabajos similares. Finegold y cols. (1983) pusieron
de manifiesto que los niveles de lactobacilos en heces variaban enormemente, no
detectndose en un 25% de los sujetos. En el estudio de Kimura y cols. (1997), en
donde se presentan unos recuentos de lactobacilos similares de nuestro trabajo, stos
fluctuaban considerablemente entre individuos e incluso entre muestras de la misma
persona y en algunos casos tampoco se detectaban.
Los recuentos de enterobacterias se correspondieron en todos los casos con los de
coliformes. En algunas personas, como los sujetos L, G y M, los niveles de coliformes
resultaron ser siempre elevados (en torno a 108 ufc/g). En otros individuos, sin
embargo, estas poblaciones se mantuvieron alrededor de 106 ufc/g a lo largo de todo
el periodo muestreado.
Los microorganismos aerobios fueron menos numerosos, encontrndose en orden
decreciente enterococos, estafilococos y mohos y levaduras. Estas dos ltimas
poblaciones en muchos casos aparecieron en el lmite de deteccin (102 ufc/g). Se ha
establecido con anterioridad que los microorganismos aerobios y anaerobios
facultativos estn presentes en nmeros ms bajos que los anaerobios estrictos
(Drasar y Barrow 1985; Conway, 1995; Tannock, 1999b). Estas poblaciones
subdominantes

mostraron

mayor

variabilidad

que

la

presentada

por

los

microorganismos anaerobios estrictos (clostridios, bifidobacterias, bacteroides), tanto


entre las muestras de un mismo sujeto (CV entre un 10 y un 30%) como entre
individuos. La mayor estabilidad de las poblaciones anaerobias comparada con la de
los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos se corresponde con resultados
previos de varios autores (Holdeman y cols., 1976; Ikeda y cols., 1994; Fujiwara y
cols., 2001a).

62

Resultados y discusin: Captulo I

I.2.2. ANLISIS BIOQUMICOS.


I.2.2.A. Medida de actividades enzimticas.
Al igual que en el estudio anterior, tambin en este caso se ensayaron las
actividades enzimticas en heces mediante las tiras reactivas API ZYM. Como el
mtodo determina variables discretas (en funcin de la intensidad de color se asigna
un valor a cada reaccin con la ayuda de una tabla de lectura), y debido a que se
encontraron fluctuaciones importantes intraindividuales a lo largo del seguimiento en
distintas actividades, no se consider apropiada la aplicacin del test estadstico
ANOVA. En este caso, se opt por presentar la moda como parmetro ms adecuado
para la descripcin de los datos. En la Tabla 3 se resumen los valores modales de las
actividades enzimticas detectadas durante el seguimiento en las muestras de los
distintos individuos.
Al igual que en las muestras de los individuos B y D, no se encontraron actividades

lipasa C14, cistena-arilamidasa, tripsina, -quimiotripsina, y -manosidasa. En


general, las heces presentaron bajos niveles de actividades protesicas y lipsicas,
mientras que las actividades fosfatasas y oxidasas fueron mayores. Se observaron
diferencias notables entre los individuos para todos los enzimas excepto para la

fosfatasa alcalina, que presentaba en todos los casos la mxima actividad. Al igual que
en el estudio precedente, en algunos casos se reconocan perfiles de actividad
personales. As por ejemplo, el sujeto E present de forma frecuente baja actividad

fosfatasa cida, naftol-AS-BI-fosfohidrolasa, -galactosidasa y -glucuronidasa,


contrastando con una alta actividad -galactosidasa. En el individuo F las actividades
protesicas estuvieron claramente por encima de las del resto de los sujetos, mientras
que el individuo H mostr actividades -galactosidasa y -glucosidasa inferiores a las
de los dems.

63

64

Tabla 6. Valores modales de las actividades enzimticas detectadas en heces de 8 individuos.


Actividad enzimtica

INDIVIDUOS

Unidades de actividad

Esterasa-lipasa (C8)

10

10

10

19

29

29

14

Esterasa (C4)

19

10

19

29

38

19

19

19

Leu-arilamidasa

10

38

77

10

38

19

31

Val-arilamidasa

10

ND

ND

38

ND

ND

ND

ND

Fosfatasa alcalina

77

77

77

77

77

77

77

77

Fosfatasa cida

58

29

10

38

29

38

19

29

Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa

19

19

10

29

19

19

19

29

-Fucosidasa

10

10

10

10

ND

-galactosidasa

48

38

19

48

29

29

38

38

-galactosidasa

77

48

77

38

38

29

58

58

-glucuronidasa

38

77

19

38

58

38

19

34

-glucosidasa

58

67

58

38

29

19

48

58

-glucosidasa

38

38

38

38

77

48

38

29

N-acetil--glucosaminidasa

77

58

38

58

58

48

58

58

11

13

11

12

N de muestras

ND: No detectado.
: 1 Unidad de actividad equivale a 1 mol de substrato hidrolizado por h y g de heces.
: No se pudo establecer un valor modal, por lo que se muestra la media aritmtica.

Resultados y discusin: Captulo I

El individuo C, por su parte,

present una alta actividad -glucuronidasa y el

sujeto G mostr valores de actividad -glucosidasa de casi el doble que el resto de los
individuos.
Es difcil una comparacin directa de nuestros resultados con los que hay descritos
en la literatura debido fundamentalmente a las diferentes metodologas utilizadas. Sin
embargo, s estn descritas variaciones notables entre sujetos en enzimas como la

-galactosidasa, la -glucuronidasa o la -glucosidasa (Mallet y cols., 1988; Ling y


cols., 1992; Ikeda y cols., 1994; Mykknen y cols., 1998).
Aunque poco se conoce de las variaciones o la estabilidad de las actividades
enzimticas normales en heces, stas estn muy influenciadas por cambios en la
ingesta, ya que algunos alimentos pueden presentar por s mismos actividades
enzimticas o pueden contener compuestos que estimulen o inhiban la actividad
(Mallet y cols., 1988; Hill, 1995a; Mykknen y cols., 1997).

I.2.2.B. Determinacin de la concentracin de amonio.


Adems de las actividades enzimticas, decidimos estudiar tambin la presencia en
heces de algunos metabolitos relacionados los microorganismos. Uno de stos es el in
amonio (NH4+), que procede del catabolismo de las protenas y la urea y es producido
por una amplia variedad de bacterias intestinales, incluyendo enterobacterias,
bacteroides y clostridios (Hespell y Smith, 1983). La medida de amonio en heces puede
ser indicadora tambin de la salud del colon, ya que este compuesto en altas
concentraciones es txico para el epitelio intestinal y parece actuar como promotor de
tumores (Lin y Visek, 1991; Parodi, 1999).
La concentracin de amonio se determin en 3-4 muestras de heces por individuo.
En la Figura 9 se representan los valores de amonio (en mmoles/Kg de heces)

65

Resultados y discusin: Captulo I

obtenidos en las distintas muestras, as como la media y la desviacin estndar de los


datos de los 8 individuos.
Los valores de amonio fueron diferentes entre los distintos sujetos, con los
individuos F y H mostrando las concentraciones medias ms bajas. Ambos individuos
presentaban igualmente nmeros bajos de enterobacterias en heces (ver Tabla 5), sin
embargo, no pudimos establecer una asociacin clara entre estos recuentos y los
valores de amonio. Los datos de la concentracin de amonio oscilaron tambin
ampliamente entre las muestras de un mismo individuo, presentando coeficientes de
variacin mayores del 30%.

Figura 9. Concentracin de amonio en muestras de heces de 8 sujetos.

40

35

30

mmol/Kg de heces

25

20

15

10

0
0

1A

2C

3E

4F

5G

6
H

7L

Individuos

Valores medios y desviaciones estndar (mmol/Kg de heces)

66

Individuo A

9,5 13,0

Individuo G

Individuo C

22,3 12,5

Individuo H

6,5 5,7

Individuo E

14,3 7,0

Individuo L

12,8 6,7

Individuo F

5,8 3,4

Individuo M

9,0 5,3

14,3 7,4

8M

Resultados y discusin: Captulo I

Aunque estos valores de dispersin se consideran muy elevados, est descrito que
los metabolitos bacterianos, particularmente los productos de putrefaccin, pueden
variar ampliamente entre muestras diarias (Ikeda y cols., 1994). Estas diferencias, que
se observan incluso en adultos aparentemente sanos, pueden ocurrir como resultado
de diversos factores como la dieta y el tiempo de trnsito intestinal (Rowland y cols.,
1985; Stephen y cols., 1987).
En los distintos estudios de la concentracin de amonio en heces se emplean
diferentes mtodos analticos (Benno y Mitsuoka, 1992; Fujiwara y cols., 2001a;
Fujiwara y cols., 2001b) que dificultan la comparacin de resultados. No obstante,
nuestros datos se corresponden con los descritos por Ikeda y cols. (1994), quienes
reportan unas concentraciones de amonio y rangos de variacin similares.

I.2.2.C. Deteccin y cuantificacin de SCFAs.


Otro parmetro que nos pareci interesante determinar fue la concentracin de
SCFAs en heces. Las medidas de SCFAs pueden relacionarse con un metabolismo
especfico en el intestino puesto que los distintos grupos bacterianos pueden producir
de forma caracterstica productos finales de fermentacin diferentes. Los cambios en la
concentracin de SCFAs pueden ser indicadores de variaciones en la microbiota
intestinal. Sin bien, al igual que otros parmetros bioqumicos, los niveles de SCFAs en
heces estn influenciados por la ingesta alimentaria (Midtvedt y Midtvedt, 1992;
Edwards y cols., 1994) y varan entre individuos (Hoverstad y cols., 1984).
La concentracin de SCFAs se determin en 51 muestras de heces procedentes de
los 8 individuos del estudio, analizndose una media de 7 muestras por individuo. En la
Figura 10 se representan los valores promedio, en mmol/Kg de heces, de los SCFAs

67

Resultados y discusin: Captulo I

detectados y los niveles de significacin del ANOVA para aquellos que presentaron
diferencias entre individuos.
La concentracin total oscil en funcin del sujeto entre 60 y 100 mmol/Kg. El
actico fue el compuesto mayoritario en todas las muestras, con niveles de alrededor
de 60 mmol/Kg de heces, triplicando, de forma habitual, las cantidades del segundo
SCFA ms frecuente en heces: el butrico o el propinico, dependiendo del individuo.
Se encontraron adems, trazas de cido valrico e isovalrico en todos los sujetos. El
cido caproico y el isobutrico se detectaron solo en algunas muestras de ciertos
individuos y curiosamente nunca de forma conjunta en la misma persona. En los
individuos M y L, estos cidos grasos no se detectaron en ninguna ocasin. Debido a
su aparicin puntual, el anlisis estadstico de ANOVA no pudo aplicarse para estos dos
ltimos SCFAs. Para el resto, exceptuando el isovalrico, el ANOVA puso de manifiesto
la existencia de diferencias estadsticamente significativas entre individuos.

Figura 10. Valores promedio de los SCFAs detectados en heces.

mmol /Kg de heces

120
100
Caproico
80

Isovalrico

60

Valrico * p<0,05

40

Isobutrico
Butrico *** p<0,001

20

Propinico *** p<0,001

Actico ** p<0,01
A

Individuos

68

Resultados y discusin: Captulo I

Tanto los niveles totales como las cantidades relativas de los distintos cidos
difirieron entre los individuos, observndose en algunos casos perfiles de produccin
personales. As por ejemplo, en las muestras del sujeto G se encontr siempre una
notable cantidad de cido caproico. El individuo L, por su parte, se caracteriz por una
baja produccin de SCFAs, con unos niveles de butrico y propinico mucho ms bajos
que los del resto de sujetos.
Las concentraciones y las proporciones relativas de los SCFAs en heces se
corresponden bastante bien con las que se relacionan en la literatura. La mayora de
los autores describen el actico como el SCFA ms comn y detectan de forma
frecuente una mayor cantidad de cido propinico que de butrico (Hovertad y cols.,
1984; Midtvedt y Midtvedt, 1992; Ikeda y cols., 1994).

I.3. ESTUDIO DE LA MICROBIOTA ASOCIADA A MUCOSA INTESTINAL.


La posicin relativa de los microorganismos en las distintas secciones del TGI es
determinante del papel que stos ejerzan en los procesos metablicos, fisiolgicos e
inmunolgicos del hospedador (Hooper y Gordon, 2001). En este sentido, la microbiota
asociada a la mucosa del epitelio intestinal tendra, supuestamente, un mayor contacto
e influencia en el hospedador. Por esta razn, nos pareci interesante conocer las
poblaciones microbianas presentes en la mucosa intestinal de los individuos y
compararlas, en la medida de lo posible, con las encontradas en heces.

I.3.1. RECUENTOS MICROBIOLGICOS.


Cinco de los individuos del estudio se sometieron a una colonoscopia, en algn
momento del seguimiento. Mediante esta tcnica se realizaron biopsias del epitelio
intestinal y se tomaron muestras de mucosa de colon y/o recto. En las muestras de

69

Resultados y discusin: Captulo I

cuatro de los individuos se realizaron recuentos para los distintos grupos microbianos,
mientras que la muestra intestinal del sujeto M se utiliz exclusivamente para aislar y
caracterizar cepas de bifidobacterias. En la Figura 11 se muestran los recuentos
microbianos de las cuatro muestras de mucosa intestinal de los individuos A, C, F y G,
comparados con la media de los correspondientes grupos encontrados en heces.
Como puede verse, los recuentos microbianos de las diversas poblaciones fueron
diferentes en los distintos individuos. En general, los clostridios y las bifidobacterias
presentaron niveles entre 105 y 108 ufc/g de tejido. Las poblaciones de coliformes
oscilaron tambin dentro de estos rdenes de magnitud.

Figura 11. Recuentos microbianos en muestras de mucosa intestinal de 4 individuos


comparados con la media de heces.

Individuo C

Bi

C
lo

st
ri

ta
le
s
.T
o

En
te
ro
co
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s
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es

Bi

Co
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M

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s

log

10

6
4
2
0

12
10
8
6
4
2
0
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os
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co
oh
s
os
y
le
va
du
ra
s

ufc/g

12
10
8

ta
le
s

log

10

ufc/g

Individuo A

Mucosa Intestinal

le
va
du
ra
s
y

co
co
s
oh
os
M

st
af
ilo
E

nt
er
oc
oc
os
E

ifo
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l

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M

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10
8
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Es
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M
co
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s
y
le
va
du
ra
s

log

10

ufc/g

Individuo G

di
os

Bi

C
lo
st
ri

.T
o
M

70

Heces

12
10
8
6
4
2
0
ta
le
s

log

10

ufc/g

Individuo F

Resultados y discusin: Captulo I

En ninguna de las muestras intestinales se apreci crecimiento en las placas de


EBA para bacteroides. En la muestra del individuo G tampoco se detect la presencia
de colonias de bifidobacterias. Solo se obtuvieron recuentos de lactobacilos en la
mucosa del individuo F, donde fueron incluso superiores a la media de heces. Los
enterococos, estafilococos y mohos y levaduras aparecieron en las muestras
intestinales en niveles entre 102 y 104 ufc/g.
Los resultados se corresponden en gran medida con los descritos en trabajos
similares (Croucher y cols., 1983; Poxton y cols., 1997; Dunne y cols., 2001). En varios
estudios se aprecia tambin que los lactobacilos generalmente no forman parte de las
poblaciones mayoritarias de BAL asociadas con la mucosa de colon (Sghir y cols.,
2000; Nielsen y col., 2003). Una posible explicacin podra ser que muchos de los
substratos que necesitan se encuentran en baja concentracin en el colon debido a su
utilizacin en el tramo final del intestino delgado, donde su proporcin relativa parece
ser mayor (Sghir y cols., 2000; Marteau y col., 2001). Al comparar los recuentos de los
distintos grupos microbianos en las muestras de mucosa intestinal con los de las
muestras de heces, se observa que, en la mayora de los casos, los recuentos son
superiores en heces, tal y como se ha descrito por otros autores (Zoetendal y cols.,
2002; Ouwehand y cols., 2004). Adems, la relacin de bacterias anaerobias
estrictas/facultativas en mucosa se aprecia disminuida en comparacin con la que se
encuentra en heces. Si bien hay que tener en cuenta que las muestras de mucosa
examinadas son puntuales y con ello su representatividad es escasa, la presencia de
niveles elevados de microorganismos anaerobios facultativos y aerobios en muestras
de biopsias intestinales est tambin descrita en la literatura (Marteau y cols., 2001;
Zoetendal y cols., 2002).

71

Resultados y discusin: Captulo II

Captulo II: Aislamiento, identificacin y tipificacin de


microorganismos mayoritarios y bacterias lcticas de heces
y mucosa intestinal. Comparacin de tcnicas clsicas y
moleculares.

II.1 IDENTIFICACIN DE BACTERIAS CULTIVABLES MAYORITARIAS


EN HECES Y MUCOSA INTESTINAL.
Con el fin de hacernos una idea de las especies a las que pertenecan los
microorganismos cultivables mayoritarios en heces y mucosa intestinal, se decidi
aislar colonias de todas las morfologas procedentes de las placas de BHI en las que se
efectuaron los recuentos de microorganismos totales. Los aislados se identificaron
mediante amplificacin y secuenciacin de un fragmento del gen que codifica el ARNr
16S, despus de su comparacin con las secuencias depositadas en las bases de datos.
El alineamiento y la comparacin de estas secuencias se utiliza desde hace tiempo para
la identificacin gentica de las bacterias y el estudio de sus relaciones evolutivas
(Stackebrandt y Goebel, 1994; Palys y cols., 1997). El anlisis se llev a cabo en dos
muestras puntuales de heces de los individuos C y G, y en dos muestras de mucosa
intestinal de los individuos A y G. Se escogi una de las muestras de heces y otra de
mucosa del mismo sujeto (G) para comparar si las bacterias mayoritarias eran las
mismas en ambas localizaciones.

72

Resultados y discusin: Captulo II

II.1.1. MUESTRAS DE HECES.


De las muestras de heces se aislaron un total de 21 colonias, 9 procedentes de la
muestra del sujeto C y 12 del sujeto G. La asignacin de los aislados a grupo
filogentico y especie bacteriana se recoge en la Tabla 7. Se parti del supuesto de
que cuando los porcentajes de identidad entre las secuencias del ADNr 16S son
mayores del 97% pertenecen a la misma especie (Stackebrandt y Goebel, 1994).

Tabla 7. Identificacin y mximos porcentajes de homologa con secuencias de las


bases de datos de microorganismos mayoritarios aislados de heces.
Grupo
filogentico

N de
aislados

Homologa con secuencias de


microorganismos cultivables

Homologa con
secuencias de clones
y amplicones

Cepas aisladas del Individuo C

Clostridium

subgrupo XIVa

Actinobacteria

L34421 Eubacterium ventriosum


L76604 Ruminococcus torques

AY169422 Clostridium

clostridioforme

AB080865 Clon de

92 bacteria no cultivada del

intestino humano JW1A1


AB064730 Clon de

97

96 firmicute no cultivado

99

NB2A8

AJ508452 Clostridium bolteae

92

AY328370 Bacteria no
cultivada A-44

98

L14676 Roseburia cecicola

96

AB064887 Firmicute
intestinal humano CO13

98

AY166537 Bifidobacterium longum 98

Cepas aisladas del Individuo G

Clostridium

AF499841 Clon de

AY169428 Eubacterium rectale

88 bacteria no cultivada

AY169428 Eubacterium rectale

98

Bacteroidete
(grupo CFB)

AB050110 Bacteroides uniformis

98

Actinobacteria

AB011816 Collinsella aerofaciens

98

-Proteobacteria

AE016770 Escherichia coli

99

LCLC2

subgrupo XIVa

CFB (Cytophaga, Flavobacterium y Bacteroides).

73

99

Resultados y discusin: Captulo II

De los aislados del individuo C, dos mostraron una homologa del 98% con
secuencias de la especie Bifidobacterium longum. El resto de los aislados presentaron
un porcentaje de identidad inferior al 97% con secuencias de diversas especies
cultivables pertenecientes al subgrupo de Clostridium coccoides XIVa (Collins y cols.,
1994). Estas ltimas secuencias mostraron una identidad ms alta con secuencias de
las bases de datos obtenidas por procedimientos independientes de cultivo.
Entre los aislados del individuo G se encontr una mayor diversidad; 5 aislados se
relacionaron filogenticamente con el subgrupo de Cl. coccoides XIVa, 5 con la clase
-proteobacteria (Escherichia coli), un aislado con la clase de las actinobacterias
(Collinsella aerofaciens) y otro con la clase de los bacteroides. Excepto 3 de los
aislados del subgrupo Cl. coccoides XIVa, el resto mostraron porcentajes de identidad
superiores al 98% con secuencias de especies cultivables. La presencia de una alta
proporcin de aislados de E. coli (5 de 12) concuerda con los datos obtenidos de los
recuentos microbianos en este individuo, en el que habamos registrado unos altos
niveles de coliformes (108 ufc/g) en todas las muestras de heces (ver Tabla 5).

II.1.2. MUESTRAS DE MUCOSA INTESTINAL.


Para el estudio se aislaron 36 cepas a partir de las placas de BHI de dos muestras
de mucosa de los individuos A y G. Las cepas se identificaron de igual manera que en
el caso anterior. Procedentes de la muestra del individuo A se analizaron un total de 11
aislados, mientras que fueron 25 los estudiados en el sujeto G. Las secuencias de
todos los aislados mostraron un porcentaje de identidad mayor del 97% con
secuencias de distintas bacterias cultivables. En laTabla 8 se representa las especies a
las que fueron asignados los aislados.

74

Resultados y discusin: Captulo II

Tabla 8. Identificacin y mximos porcentajes de homologa con secuencias de las


bases de datos de microorganismos mayoritarios aislados de mucosa intestinal.
Grupo filogentico

N de
aislados

Homologa con secuencias de


microorganismos cultivables

Cepas aisladas del Individuo A


3

AE016770 Escherichia coli

100

X96963 Shigella flexneri


AY186041 Escherichia coli

100

M58839 Streptococcus salivarius

99

AF003933 Streptococcus parasanguinis

98

AY188352 Streptococcus salivarius


AF393762 Streptococcus mitis

98

17

AY310729 Klebsiella pneumoniae

99

AY278485Citrobacter freundii
AF025368 Citrobacter braakii

99

Grupo BLS

AY691539 Streptococcus anginosus

98

Clostridiales

AJ555140 Veillonella atypica

98

-Proteobacteria

Grupo BLS*

Cepas aisladas del Individuo G

-Proteobacteria

BLS (Bacillus, Lactobacillus y Streptococcus).

Los nicos microorganismos anaerobios estrictos aislados se encontraron en el


individuo G y pertenecan al gnero Veillonella. Estos cocos Gram-negativos son
habitantes habituales del intestino humano (Salminen y cols., 1998c; Wang y cols.,
2004).
La mayora de los aislados de ambos sujetos se identificaron con especies de
bacterias anaerobias facultativas (enterobacterias y estreptococos). En consonancia
con estos resultados, los recuentos microbianos de mucosa en ambos individuos

75

Resultados y discusin: Captulo II

haban mostrado altos niveles de enterobacterias, del orden de 107-108 ufc/g (ver
Figura 11). Especies de los gneros Klebsiella o Citrobacter forman parte de la
microbiota intestinal humana, aunque pueden llegar a comportarse como patgenos
oportunistas, dando lugar a diarreas o infecciones extraintestinales (Hagiage, 1994;
Struve y Krogfelt, 2004). Miembros del gnero Streptococcus (St. salivarius, St.

parasanguinis, St. anginosus) se asocian frecuentemente a la microbiota de la boca


(estreptococos orales), aunque se han descrito tambin en menores niveles en otras
posiciones del TGI (Hagiage, 1994; Salminen y cols., 1998c).
La presencia de microorganismos anaerobios facultativos en niveles elevados en
muestras de biopsias intestinales se ha descrito en trabajos similares (Marteau y cols.,
2001). Estos resultados podran explicarse por una reduccin de la viabilidad de los
microorganismos anaerobios estrictos debido a que las muestras de biopsia son muy
pequeas y estn expuestas ms fcilmente al oxgeno durante el procesado o
muestreo. Por otra parte, algunos autores apuntan a que la difusin de oxgeno a la
mucosa intestinal pudiera ser uno de los factores que propiciara la mayor proporcin
de microorganismos aerotolerantes en estas posiciones (Hill, 1995b).

II.2. ANLISIS MOLECULAR DIRECTO DE BACTERIAS MAYORITARIAS


EN HECES Y MUCOSA INTESTINAL.
El tracto intestinal es un hbitat complejo en el que coexisten numerosos tipos
microbianos distintos, para muchos de los cuales no se conocen los requerimientos
necesarios para su crecimiento. Adems, las condiciones limitantes del intestino
favorecen que algunos de estos microorganismos se encuentren en un estado
fisiolgico viable pero no recuperable. Por estos motivos, la descripcin microbiana del
TGI por medio de tcnicas de cultivo tiene sus limitaciones y es necesario

76

Resultados y discusin: Captulo II

complementarla mediante tcnicas independientes de cultivo. Con el fin de completar


la descripcin de los microorganismos mayoritarios en heces y mucosa intestinal
mediante una tcnica molecular, se llev a cabo la construccin y anlisis de genotecas
de secuencias parciales del ADNr 16S, generadas por amplificacin a partir de ADN
bacteriano total de heces y mucosa. Los amplicones generados mediante los
oligonucletidos universales Y1 e Y2 se clonaron en el vector comercial pCR 2.1TOPOTM, especialmente diseado para la clonacin de fragmentos de ADN amplificados
con la ADN polimerasa Taq. La construccin de estas libreras se ha aplicado con xito
en estudios similares (Suau y cols., 1999; Hold y cols., 2002; Wang y cols., 2003)

II.2.1. MUESTRAS DE HECES.


Con el objetivo de poder comparar mejor los resultados con los obtenidos del
cultivo se utilizaron para la construccin de genotecas las mismas muestras de los
individuos C y G, de las que se haban aislado e identificado los microorganismos
cultivables mayoritarios en BHI. En total se analizaron 40 clones, 16 obtenidos a partir
de la muestra del sujeto C y 24 del sujeto G. Los resultados de la comparacin de las
secuencias que portaban los clones con las de las bases de datos se muestran en las
Tablas 9 y 10.
En el individuo C se encontr que la mayora de las secuencias estaban asociadas
a la clase de los clostridiales; 11 pertenecan al subgrupo XIVa (con Cl. coccoides como
representante del cluster) y 2 al grupo IV, en el que Cl. leptum es la especie tipo
(Collins y cols. 1994). La identidad de estas secuencias con microorganismos
cultivables oscil entre un 94 y un 98%, principalmente con representantes de los
gneros habituales en heces Ruminococus y Eubacterium. Se encontraron adems tres

77

Resultados y discusin: Captulo II

clones cuyas secuencias se correspondan con miembros de la clase actinobacterias (B.

longum y C. aerofaciens).

Tabla 9.-Porcentajes de identidad de las secuencias amplificadas de una muestra de


heces del individuo C con las secuencias de las bases de datos.
Grupo
filogentico

N de
clones

Homologa con secuencias de


microorganismos cultivables

Homologa con
secuencias de clones y
amplicones

AY169428 Eubacterium rectale

98

L34621 Eubacterium halii

98

AY169419 Ruminococcus obeum 96

X85101 Ruminococcus obeum

AB064754 Clon de
AY169411 Ruminococcus obeum 94 Ruminococcus no
cultivado N044

AB064895 Ruminococcus sp.


CO7 (R. obeum)

Clostridium
subgrupo
XIVa

Clostridium
grupo IV

X85022 Faecalibacterium

prausnitzii

AY169429 Faecalibacterium

prausnitzii

AY166537 Bifidobacterium

longum

AF052417 Bacteria no
cultivada A20

AB064752 Clon de
95 Ruminococcus sp. no
cultivado NO54

AB064753 Clon de
97 Ruminococcus sp. no
cultivado NB2F4

99

97

98

97

96

AF052411 Bacteria no
cultivada A10

99

95

AJ408989 Clon de bacteria


no cultivada HuCB5

99

99

97

AJ131149 Coriobacterium
sp. CCUG 33917

99

Actinobacteria
1

AB011816 Collinsella

aerofaciens

78

Resultados y discusin: Captulo II

Tabla 10. Porcentajes de identidad de las secuencias amplificadas de una muestra de


heces del individuo G con las secuencias de las bases de datos.
Grupo
filogentico

N de
clones

Homologa con secuencias de


microorganismos cultivables

Homologa con
secuencias de clones y
amplicones

AY169428 Eubacterium rectale

98

L34619 Dorea formicigenerans

96

AY169415 Clostridium nexile

99

AY169428 Eubacterium rectale

90

AB080865 Clon de
bacteria no cultivada del
intestino humano
JW1A1

99

L34619 Dorea formicigenerans

94

AB064740 Clon de
firmicute no cultivado
NO62

99

AY169415 Clostridium nexile


L76604 Ruminococcus torques

95

AF371596 Clon de
bacteria no cultivada
p-2431-55G5

99

AY341237 Ruminococcus

94

AF371597 Clon de
bacteria no cultivada
p-1561-b5

98

Clostridium

subgrupo XIVa

Clostridium
grupo IV

Clostridium

grupo XVIII

AY169411 Ruminococcus

obeum
AY169411 Ruminococcus

obeum
AY169427 Faecalibacterium

prausnitzii

99

96

AB064753 Clon de
Ruminococcus sp. no
cultivado NB2F4

99

98

99

X85099 Ruminococcus bromii

100

L34625 Eubacterium siraeum

99

X73441 Clostridium spiriforme

89

AB030225 Catenibacterium

97

Clostridiales

-Proteobacteria

79

gnavus

AF371595 Clon de
bacteria no cultivada
p-596-a5

mitsuokai
X96964 Shigella sonnei
AE016991 Shigella flexneri

98

AB099797 Clon de
clostridio no cultivado
OLDB-C1
AF445227 Bacteria
fecal porcina FPC54
-

99

98
-

Resultados y discusin: Captulo II

En la muestra del sujeto G la mayor parte de los clones se asociaron con la clase
de los clostridiales. La identidad con bacterias cultivables oscil entre un 89 y un
100%. 16 secuencias se relacionaron con el subgrupo XIVa de Cl. coccoides, 4 con el
grupo IV de Cl. leptum y 2 con miembros del grupo XVIII, cuya especie tipo es Cl.

ramosum (Collins y cols. 1994).


En la Tabla 11 se muestra la comparacin de la diversidad microbiana encontrada
en las muestras de heces de estos dos sujetos mediante ambas metodologas.

Tabla 11. Resumen comparativo de la diversidad microbiana en dos muestras de


heces mediante cultivo y anlisis molecular.
Clase o grupo filogentico

Aislados

Clones
Individuo C

-Proteobacterias
Bacteroidetes
Actinobacterias
grupo IV
subgrupo XIVa
Clostridiales
grupo XVII
otros
-Proteobacterias
Bacteroidetes
Actinobacterias
grupo IV
subgrupo XIVa
Clostridiales
grupo XVII
otros

3
2
11

7
Individuo G
5
1
1
5

1
4
16
2
1

Al comparar ambas metodologas, en la muestra del individuo G se observ que


mediante la tcnica molecular se detectaba la presencia de microorganismos
relacionados con la clase clostridiales casi de forma exclusiva. Sin embargo, estos
microorganismos haban aparecido entre los aislados en igual proporcin que el grupo
de las enterobacterias (-proteobacterias).

80

Resultados y discusin: Captulo II

La mayora de los microorganismos detectados pertenecan a la rama de las


bacterias

Gram-positivas

con

bajo

contenido

en

G+C,

estando

relacionados

principalmente con miembros de los grupos XIVa y IV de los clostridiales. Estos grupos
aparecen como constituyentes mayoritarios de la microbiota fecal humana en muchos
trabajos (Wilson y Blitchington, 1996; Zoetendal y cols., 1998; Suau y cols., 1999;
Hayashi y cols., 2002b; Matsuki y cols., 2002).
La escasa deteccin de secuencias relacionadas con el grupo de los bacteroides se
corresponde bien con los reducidos niveles de estas poblaciones encontrados mediante
los

recuentos

microbianos.

Aunque

se

han

descrito

grandes

diferencias

interindividuales en nmero y especie, las poblaciones de bacteroides encontradas en


este trabajo fueron mucho menores que las descritas en otras comunidades humanas
mediante tcnicas dependientes e independientes de cultivo (Wilson y Blitchington,
1996; Zoetendal y cols., 1998; Suau y cols., 1999; Hayashi y cols., 2002b; Matsuki y
cols., 2002).
La diversidad microbiana que se puso de manifiesto mediante la tcnica molecular
fue mayor que la encontrada mediante cultivo, tal y como otros autores han descrito
con anterioridad (Langendijk y cols., 1995; Wilson y Blitchington, 1996; Suau y cols.,
1999).

II.2.2. MUESTRAS DE MUCOSA INTESTINAL.


A partir del ADN bacteriano total de la misma muestra de mucosa del individuo A
de la que haban aislado e identificado las bacterias cultivables mayoritarias, se
construy un banco gentico de secuencias parciales del ADNr 16S, del que se
analizaron 20 clones. En la Tabla 12 se muestra los resultados de la comparacin de
las secuencias obtenidas.

81

Resultados y discusin: Captulo II

Tabla 12. Porcentajes de identidad de las secuencias amplificadas de una muestra de


mucosa intestinal del individuo A con las secuencias de las bases de datos.
Grupo
filogentico

Homologa con secuencias de


microorganismos cultivables

X73443 Clostridium nexile

96

AB099735 Clon de
bacteria no cultivada
OLDB-F3

98

AY169415 Clostridium nexile

96

AJ270484 Bacteria
productora de butirato
A2-231

99

AY169415 Clostridium nexile


L76604 Ruminococcus torques

95

AF371596 Clon de
bacteria no cultivada
p-2431-55G5

99

Clostridium

subgrupo XIVa

Clostridium
grupo IV

Homologa con
secuencias de clones y
amplicones

N de
clones

AY341237 Ruminococcus

gnavus

100

L34619 Dorea formicigenerans

96

AJ408996 Clon de
bacteria no cultivada
HuCB21

99

Y18184 Clostridium indolis

95

AB064773 Clon de
firmicute no cultivado
NS2F9

99

AY169428 Eubacterium rectale

98

Bacteroidete
(grupo CFB)

Grupo BLS

-Proteobacteria 2

AJ413954 Faecalibacterium

prausnitzii

AJ420107 Megamonas

hypermegale

M58839 Streptococcus

salivarius

L37785 Sutterella

wadsworthensis

94

AF371724 Clon de
bacteria no cultivada
p-2840-6C5

98

96

AB064837 Clon de
Gram-positivo no
cultivado NB4B4

100

100

95

AB064866 Clon de
-Proteobacterium no
cultivado NB2C10

100

-Proteobacteria 1

AE016767 Escherichia coli

99

-Proteobacteria 1

AE016991 Shigella flexneri

99

82

Resultados y discusin: Captulo II

La homologa de las secuencias de los clones con las de microorganismos


cultivables oscil entre un 94 y un 100%. Tambin en este caso una gran proporcin
de las secuencias analizadas (16) se relacionaron con la clase clostridiales (14 se
asociaron al subgrupo XIVa y 2 al grupo IV). El representante cultivable ms prximo
de 8 de los clones del subgrupo XIVa fue Clostridium nexile. Aunque como la identidad
entre las secuencias fue menor del 97% podra tratarse de una especie nueva. Se
encontraron tambin, dos clones pertenecientes al grupo de las -proteobacterias y
uno perteneciente a la clase bacteroides. Aparecieron adems, aunque en baja
proporcin, secuencias de bacterias anaerobias facultativas (Shigella flexneri, E. coli,

St. salivarius). Estas especies de estreptococos y enterobacterias se corresponden con


las identificadas en las placas de BHI de esta muestra (ver Tabla 8); sin embargo,
entre estos aislados no haba aparecido ningn microorganismo anaerobio estricto.
As pues, tambin en esta localizacin se detect mediante la tcnica molecular
una mayor diversidad microbiana, fundamentalmente de bacterias anaerobias estrictas
que no haban aparecido mediante cultivo y aislamiento. Una mayor exposicin al
oxgeno de las muestras de mucosa y la extrema sensibilidad al mismo de estos
microorganismos podran contribuir a que stos se encuentren en estado no
recuperable.
Existen varios estudios en los que se ha analizado la composicin bacteriana a
nivel de especies mediante tcnicas independientes de cultivo en muestras de biopsias
intestinales (Hold y cols., 2002; Zoetendal y cols., 2002; Nielsen y cols., 2003; Wang y
col., 2003; Ouwehand y cols., 2004). En muchos de estos trabajos, los grupos
filogenticos XIVa y IV de los clostridios aparecen como mayoritarios. Sin embargo, al
contrario que en nuestros resultados, tambin se describen de forma frecuente
secuencias relacionadas con los bacteroides (Hold y cols., 2002; Wang y cols., 2003).

83

Resultados y discusin: Captulo II

II.3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE BIFIDOBACTERIAS Y


LACTOBACILOS EN HECES Y MUCOSA INTESTINAL.
Uno de los objetivos del trabajo era identificar las especies de bifidobacterias y
lactobacilos que forman parte de la microbiota intestinal, debido al presuntivo papel
beneficioso que estos ejercen sobre la salud del hospedador (Salminen y col., 1998b;
Tannock, 1999a). Al mismo tiempo, estbamos interesados tambin en aislar y
caracterizar representantes de estos gneros que pudieran llegar a utilizarse como
probiticos. Por este motivo, se fueron aislando diversas colonias de bifidobacterias y
lactobacilos de las placas de MRSC de los recuentos, para su estudio posterior. Los
aislados se subcultivaron en el mismo medio y se identificaron y clasificaron mediante
amplificacin parcial y secuenciacin del ADNr 16S, despus de su comparacin en las
bases de datos.

II.3.1. MUESTRAS DE HECES.


A partir de 47 muestras de heces, procedentes de los 10 individuos que
participaron en el estudio, se aislaron un total de 227 cepas. Tras analizarse sus
secuencias se comprob que todos los aislados, excepto dos, mostraban ms de un
97% de identidad con especies conocidas de bifidobacterias o lactobacilos. En la Figura
12 se muestra la distribucin por especies de los aislados identificados y en la Tabla 13
las especies encontradas en cada individuo.
En total se encontraron 7 especies diferentes de bifidobacterias y 12 de
lactobacilos. Los dos aislados que no pudieron asignarse a ninguna especie mediante
este procedimiento, presentaban una homologa del 97% con clones de lactobacilos no
cultivados y un 90% con la especie de Lactobacillus murinus, por lo que pudiera
tratarse de una nueva especie relacionada con sta.

84

Resultados y discusin: Captulo II

Figura 12. Identificacin de los aislados de bifidobacterias y lactobacilos en heces y


distribucin por especies.

32

Bifidobacterias
75
B. longum/infantis

31

B. pseudocatenulatum
B. bifidum
B. adolescentis
B. catenulatum
B. dentium
B. animalis/lactis

35

2
2 2
3

Lactobacilos

11
23

4
5
5
15
8

L. gasseri
L. casei/paracasei
L. delbrueckii
L. rhamnosus
L. ruminis
L. brevis
L. plantarum
L. johnsonii
L. parabuchneri
Lactobacillus sp.
L. vaginalis
L. sakei

En muchas ocasiones las cepas presentaban homologas del mismo porcentaje con
secuencias de dos o ms especies, no pudiendo llegar a asignarse a una nica especie
de forma inequvoca con este criterio. Este es el caso de B. animalis y B. lactis, para las
que Masco y cols. (2004) han propuesto su unificacin en una nica especie: B.

animalis, dividida en distintas subespecies. De la misma manera, B. longum y B.


infantis son idnticas en la regin amplificada del ADNr 16S por lo que no fue es

85

Resultados y discusin: Captulo II

posible su diferenciacin. Ambas especies estn estrechamente relacionadas como han


indicado estudios de similitud de secuencias del ADNr 16S y homologa de DNA-DNA
(Miyake y cols., 1998), por lo que se ha propuesto que B. infantis se incorpore dentro
de la especie B. longum, quedando esta ltima dividida en diferentes biotipos (Sakata y
cols., 2002).

Tabla 13. Identificacin de especies y nmero de aislados de bifidobacterias y


lactobacilos en heces de 10 individuos.
Individuos

Especies

B. longum

18

B. pseudocatenulatum

26

16

12

11

B. catenulatum

B. bifidum

B. adolescentis

20

10

B. dentium

B. animalis
L. gasseri
L. casei

1
5

16

L. rhamnosus

L. delbrueckii

L. brevis

1
3

4
3

L. johnsonii

L. parabuchneri

L. vaginalis

L. plantarum

L. ruminis

L. sakei

Lactobacillus sp.

N de aislados

23

17

13

29

41

24

15

24

27

14

N de muestras

86

Resultados y discusin: Captulo II

La comparacin de las secuencias amplificadas no permiti distinguir tampoco


entre las especies de L. casei y L. paracasei. La dificultad para diferenciar estas
especies ya fue puesta de manifiesto por otros autores (Dellaglio y cols., 2002),
quienes han propuesto la desaparicin de L. paracasei y la reclasificacin de las cepas
de esta especie como L. casei. De la misma manera, aunque las especies de B.

pseudocatenulatum y B. catenulatum no son completamente idnticas en la regin


amplificada con los oligonucleotidos universales Y1-Y2, algunos autores consideran que
estas especies se deberan tratar como una unidad debido a la proximidad gentica
entre ambas (Matsuki y cols., 1998).
El nmero de especies de bifidobacterias distintas por individuo oscil entre 1 y 4.

B. longum se encontr en 8 de los 10 sujetos analizados, siendo predominante entre


los aislados de cinco de ellos (individuos A, C, H, L y M). B. longum est descrita como
una de las especies de bifidobacterias que con ms frecuencia se asla en heces de
individuos adultos (Matsuki y cols., 1999; Matsuki y cols., 2003; Mulli y cols., 2003;
Matsuki y cols., 2004). En orden de importancia numrica a B. longum le sigui B.

pseudocatenulatum, que se encontr en la mitad de los individuos analizados y fue la


mayoritaria en el sujeto E. Esta especie, que ya haba sido aislada en el pasado de
heces humanas (Biavati y cols., 1986), se ha descrito en trabajos moleculares recientes
entre las bifidobacterias dominantes en el intestino humano junto con la
estrechamente relacionada B. catenulatum (Matsuki y cols., 1999; Matsuki y cols.,
2003; Matsuki y cols., 2004; Mulli y cols., 2003). En el individuo D la mayora de las
cepas se identificaron como B. bifidum y B. adolescentis. En los individuos G y F el
nmero de aislados de bifidobacterias fue muy escaso y en ambos casos apareci la
especie B. dentium.

87

Resultados y discusin: Captulo II

El nmero de aislados de lactobacilos present una gran variacin entre


individuos, no recuperndose ninguna cepa de este gnero en los sujetos D, L y M. En
estos dos ltimos individuos no se haban encontrado lactobacilos en los recuentos en
placa en ninguna muestra, mientras que en el sujeto D, estas poblaciones solo haban
aparecido en tres de las 11 muestras analizadas (Captulo I, Figura 7). En los dems
individuos se encontraron entre 1 y 7 especies por persona. Son varios los autores que
han descrito que las poblaciones de lactobacilos son muy variables en funcin del
individuo y de la posicin en el intestino (Finegold y cols., 1983; Tannock, 1991;
Nielsen y cols., 2003).

L. gasseri fue la especie aislada con mayor frecuencia, siendo predominante entre
los lactobacilos de dos de los tres individuos en los que apareci. L. casei y L.

delbrueckii le siguieron en abundancia, detectndose en cuatro y tres sujetos


respectivamente. En el individuo G, se encontr una rica variedad de especies, con
cepas pertenecientes a L. casei, L. rhamnosus, L. brevis, L. johnsonii, L. parabuchneri y

L. plantarum, as como los dos aislados que no pudieron asignarse a ninguna especie.
Un nmero considerable de las cepas del individuo B se identificaron como L. ruminis.
Esta especie se haba aislado en el pasado del rumen de bovinos (Kandler y Weiss,
1986), pero recientemente, mediante tcnicas independientes de cultivo, se ha
encontrado tambin como componente regular de la microbiota de las heces humanas
(Reuter, 2001; Heilig y cols., 2002).
En general, tanto las especies aisladas de heces como su proporcin relativa
coinciden con lo observado por otros autores. As, L. gasseri, L. casei, L. rhamnosus y

L. delbrueckii han sido referidas como especies frecuentes en el intestino humano


(Song y cols., 2000; Ventura y cols., 2000; Reuter, 2001; Heilig y cols., 2002; Vaughan
y cols., 2002). Sin embargo, los lactobacilos descritos mediante diversas tcnicas y en

88

Resultados y discusin: Captulo II

distintas poblaciones son muy variados y no existe ningn consenso respecto a las
especies dominantes.

II.3.2. MUESTRAS DE MUCOSA INTESTINAL.


Con el objetivo de comparar los aislados de bifidobacterias de heces con los
presentes en la mucosa intestinal del mismo sujeto, se aislaron a partir de tres
muestras de biopsia intestinal de los individuos A, C, y M un total de 39 colonias de
placas de MRSC. Los aislados se identificaron mediante el mismo procedimiento que en
el apartado anterior. La comparacin de secuencias del ADNr 16S mostr que todos las
cepas posean ms de un 97% de identidad con las especies B. longum y B.

pseudocatenulatum. En la Tabla 14 se relacionan los resultados, comparndose los


aislados de mucosa con los de heces.
Como puede verse, en las dos localizaciones se aislaron las mismas especies. En el
individuo A solo apareci la especie B. longum, tanto en heces como en mucosa. En el
individuo C se aislaron en mucosa y en heces ambas especies y en proporciones
similares.

Tabla 14. Identificacin de aislados de bifidobacterias en mucosa intestinal y


comparacin con los aislados en heces.

Especies de

Aislados en mucosa

Aislados en heces

Individuos

Individuos

bifidobacterias

B. longum

10

18

11

15

14

20

10

14

B. pseudocatenulatum
N de aislados

89

18

Resultados y discusin: Captulo II

Sin embargo, en el sujeto M, aunque se encontraron tambin las dos especies, sus
proporciones relativas aparecen invertidas. As, mientras que de las 14 cepas aisladas
de heces solo tres se identificaron como B. pseudocatenulatum, 15 de los 20 aislados
de mucosa pertenecan a esta especie.
Aunque el nmero de aislamientos no es muy grande, los resultados se
corresponden en general con lo observado por Hold y cols. (2002). Estos autores
tampoco encuentran grandes diferencias en los mayores grupos microbianos de
muestras fecales y mucosa del colon. Sin embargo, en otros estudios se describen
diferencias cualitativas y cuantitativas importantes entre las poblaciones mayoritarias
de heces y mucosa (Marteau y cols., 2001; Zoetendal y cols., 2002; Ouwehand y cols.,
2004).

II.4. ANLISIS MOLECULAR DE BIFIDOBACTERIAS EN HECES Y


MUCOSA INTESTINAL.
Con el fin de completar el estudio de la presencia del gnero Bifidobacterium en el
intestino mediante una tcnica independiente de cultivo, se abord la construccin y el
anlisis de libreras gnicas de secuencias del ADN 16S especficas de bifidobacterias
en dos muestras de heces y dos muestras de mucosa. El ADN bacteriano purificado de
estas muestras se amplific en este caso con los oligonucletidos especficos para el
gnero Bifidobacterium Bif 164-PCR y Bif 662-PCR. Los amplicones se clonaron y se
analizaron mediante el mismo el procedimiento y en el mismo vector que el utilizado
para el anlisis molecular de las bacterias mayoritarias. Las especies de bifidobacterias
detectadas de esta forma se compararon con las aisladas mediante las tcnicas de
cultivo.

90

Resultados y discusin: Captulo II

II.4.1. MUESTRAS DE HECES.


Para el estudi molecular de bifidobacterias en heces se utilizaron las dos mismas
muestras que habamos usado para el anlisis molecular de microorganismos
mayoritarios y que procedan de los individuos C y G. En total se analizaron y
secuenciaron 55 clones. Tras el anlisis comparativo se comprob que las secuencias
de todos los clones presentaban una identidad mayor del 97% con especies de
bifidobacterias conocidas. En la Tabla 15 se comparan estas especies con las
identificadas entre los aislados.

Tabla 15. Anlisis comparativo de especies de bifidobacterias detectadas en heces


mediante anlisis molecular y mediante cultivo.

Especies de

Individuo C

Individuo G

bifidobacterias

B. longum

Clones

Aislados

Clones

26

B. pseudocatenulatum
B. dentium

Aislados

3
1

21

B. animalis

B. minimum

B. psychroaerophilum

En la muestra del individuo C, en la que se analizaron 27 clones, se encontr que


todos excepto uno se correspondan con la especie B. longum, mayoritaria tambin
entre los aislados identificados en este sujeto.
Entre los 28 clones del individuo G apareci una mayor diversidad, detectndose la
presencia de secuencias de 5 especies diferentes. Cuatro de los clones se adscribieron
a la especie B. psychroaerophilum, descrita recientemente en el intestino de cerdo

91

Resultados y discusin: Captulo II

(Simpson y cols., 2004). La mayora de las secuencias se identificaron sin embargo con

B. dentium, especie a la que corresponda tambin el nico aislado cultivable de


bifidobacterias de este individuo. Esta especie, aunque descrita tambin en el intestino
humano, se ha asociado frecuentemente a la microbiota de la cavidad oral y se ha
relacionado en algunos casos con el desarrollo de caries (Becker y cols., 2001).
En el individuo G, el anlisis molecular mostr una diversidad mayor que la tcnica
de cultivo. Algunas de las especies detectadas molecularmente podran tener
requerimientos de cultivo complejos, motivo por el que no se recuperan de las placas
de recuento.
Los resultados sugieren que los tipos de bifidobacterias son caractersticos de cada
sujeto particular, ya que las especies identificadas difieren sustancialmente de un
individuo a otro.

II.4.2. MUESTRAS DE MUCOSA INTESTINAL.


Las metodologas dependientes e independientes de cultivo tambin se quisieron
comparar para el estudio de las poblaciones bfidas en la mucosa intestinal. Se
escogieron para ello dos muestras, una del individuo A, de la que ya disponamos del
ADN total (y que se haba utilizado en el anlisis molecular de microorganismos
mayoritarios en mucosa) y otra del individuo M, de la que se haban aislado e
identificado un nmero importante de bifidobacterias. Procedentes de las dos muestras
se analizaron y secuenciaron 58 clones, 30 del individuo A y 28 del sujeto M. Los
clones mostraron tambin en este caso homologas mayores del 97% con especies
descritas de bifidobacterias. En la Tabla 16 se presentan los resultados y el anlisis
comparativo con las especies cultivables identificadas.

92

Resultados y discusin: Captulo II

Tabla 16. Anlisis comparativo de especies de bifidobacterias detectadas en mucosa


intestinal mediante anlisis molecular y mediante cultivo.

Especies de

Individuo A

Individuo M

bifidobacterias
Clones

Aislados

Clones

Aislados

B. longum

29

B. pseudocatenulatum

20

15

B. animalis

En los clones obtenidos de la mucosa del individuo A se encontr casi de forma


exclusiva la especie B. longum, al igual que en los aislados cultivables. En el individuo
M la mayora de las secuencias se identificaron como B. pseudocatenulatum. Tambin
en este caso se obtuvo una buena correspondencia entre las dos tcnicas, puesto que
entre los aislados esta especie era la mayoritaria.
Estos datos corroboran lo que se haba puesto de manifiesto en el apartado II.3.2:
que las especies de bifidobacterias mayoritarias en heces son las mismas que aparecen
en la mucosa intestinal; en el caso de los individuos analizados, B. longum y B.

pseudocatenulatum.

II.5. TIPIFICACIN DE AISLADOS DE BIFIDOBACTERIAS.


La descripcin microbiolgica de un determinado hbitat debe incluir la
composicin en especies pero tambin establecer la variabilidad fisiolgica y gentica
presente a nivel de cepas. En este trabajo utilizamos tcnicas fenotpicas y genticas
para tipificar 50 aislados de bifidobacterias de las especies mayoritarias B. longum y B.

pseudocatenulatum, con el fin de conocer la diversidad de cepas en un mismo

93

Resultados y discusin: Captulo II

individuo y su estabilidad y evolucin a lo largo del tiempo. En la Tabla 17 se muestra


el nmero de aislados que se analizaron de cada individuo y de cada muestra.

Tabla 17. Distribucin por muestras e individuos de los aislados de bifidobacterias


utilizados en la tipificacin.
N de muestras

N de
aislados de
heces

N de
aislados de
mucosa

C
H
L
M

2 heces + 1 mucosa
3 heces
2 heces
3 heces + 1 mucosa

7
8
6
8

E
M

6 heces
2 heces + 1 mucosa

10
3

Especies

Individuos

B. longum

B. pseudocatenulatum

2
4

II.5.1. PERFIL DE FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS.


El patrn de fermentacin de carbohidratos se estableci mediante el sistema de
microplacas PhenePlate-LB (Figura 13). De esta forma se tipificaron fenotpicamente
33 aislados de B. longum y 17 de B. pseudocatenulatum (Tabla 17).
El nmero de carbohidratos utilizados por las cepas de bifidobacterias vari entre 9
y 15. Todos los aislados degradaron arabinosa, xilosa, galactosa, maltosa, sacarosa,
lactosa y melibiosa, mientras que ninguna cepa utiliz sorbosa, tagatosa, ramnosa o
celobiosa. Las especies de B. longum y B. pseudocatenulatum se diferenciaron
fundamentalmente en la fermentacin del inositol, que fue positiva en todos los
aislados de B. pseudocatenulatum. Adems, ninguna de las cepas de B. longum
ferment la trehalosa o el gluconato mientras que la capacidad para utilizar estos
carbohidratos fue variable entre los aislados de la otra especie. Por el contrario, las
cepas de B. longum presentaron una fermentacin variable del manitol y la melecitosa,
carbohidratos no utilizados por B. pseudocatenulatum.

94

Resultados y discusin: Captulo II

Figura 13. Fotografa de una microplaca PhP-LB, utilizada para determinar los perfiles
de fermentacin de azcares de las cepas de bifidobacterias.

Se encontraron 21 patrones de fermentacin distintos, 11 entre los aislados de B.

longum y 10 entre las cepas de B. pseudocatenulatum. A partir de los diferentes


patrones se calcul la similitud entre cepas mediante el ndice de Sokal y Mitchener,
utilizando el mtodo de agrupamiento UPGMA. Este anlisis numrico dio lugar al
dendograma que se muestra en la Figura 14.
Todos los aislados de B. longum de las tres muestras del individuo H mostraron
idntico patrn de fermentacin, as como los aislados del individuo M (con la
excepcin de una cepa de mucosa). Sin embargo, en las cepas de los individuos C y L
se observ algo ms de variabilidad. As, entre los 6 aislados analizados del sujeto L se
encontraron 4 perfiles de fermentacin distintos. En el individuo C se encontraron 5
patrones entre los 7 aislados de heces, mientras que las dos cepas de mucosa
mostraron diferente perfil.

95

B. pseudocatenulatum

*: cepas de mucosa.

Figura 14. Dendograma obtenido por el mtodo UPGMA a partir de los perfiles de fermentacin de carbohidratos de los aislados.

Resultados y discusin: Captulo II

B. longum

96

Resultados y discusin: Captulo II

Aunque el nmero de perfiles distintos es relativamente grande (21 en 50 cepas),


la tcnica puso de manifiesto una similitud elevada entre diversos grupos de cepas, lo
que indica cierto grado de parentesco entre los componentes de los grupos.
El perfil de fermentacin ha sido uno de los procedimientos clsicos a los que se
ha recurrido para la clasificacin y caracterizacin de las bifidobacterias, ya que la
utilizacin de carbohidratos vara considerablemente entre especies (Shah, 1997). Sin
embargo, la capacidad de fermentacin puede verse afectada por el estado fisiolgico
de la cepa y las condiciones en las que se realiza el ensayo. En consecuencia, la
diferenciacin de cepas mediante esta metodologa precisa complementarse con otras
tcnicas.

II.5.2. RAPD-PCR.
El RAPD-PCR ha sido utilizado con xito para describir la heterogeneidad y
relacionar aislados de bifidobacterias de diversos orgenes (Vincent y cols., 1998;
Simpson y cols., 2003; Mtt y cols., 2004). Por esta razn, los 50 aislados de las
especies de B. longum y B. pseudocatenulatum, tipificados mediante fermentacin de
carbohidratos y relacionados en la Tabla 17, se sometieron a una tipificacin gentica
mediante esta tcnica. En la Figura 15 se muestran los distintos perfiles de bandas
obtenidos con el oligonucletido OPA-18 en las dos especies y en la Figura 16 se
representa el dendograma que se obtuvo tras la aplicacin del anlisis de similitud
utilizando el ndice de Dice y mediante el mtodo UPGMA.
Dependiendo de la cepa, se observaron entre 6 y 11 bandas de amplificacin, la
mitad de ellas de intensidad fuerte y con un tamao comprendido entre las 500 y las
3000 pb. Se encontraron 16 patrones RAPD distintos, 12 entre los aislados de B.

longum y 4 en la especie B. pseudocatenulatum.

97

Resultados y discusin: Captulo II

Figura 15. Distintos perfiles electroforticos obtenidos mediante la tcnica RAPD-PCR


en las cepas tipificadas de B. longum y B. pseudocatenulatum.
B. longum

Ind. C

Ind. H

Ind. L

Ind. M

B. pseudocatenulatum

PM

PM

C51 C72 C64 H82 H94 L23 L43 L45 L47 M27 M62 M19 M119 M63 E74 E137
*
*
*

*: aislados de mucosa.

Entre los aislados de B. longum, se apreci una mayor diversidad en los


procedentes del individuo L. En B. pseudocatenulatum esta tcnica estableci un
nmero menor de grupos que los obtenidos mediante la fermentacin de
carbohidratos.
En lneas generales, el genotipado permiti establecer una separacin clara entre
especies y diferenci los aislados en funcin del individuo del que procedan de una
forma ms precisa que el fenotipado. Sin embargo, la similitud entre los grupos que se
puso de manifiesto mediante RAPD fue menor, debido quizs a que los ndices de
similitud aplicados en el anlisis numrico son distintos.

98

B. pseudocatenulatum

*: cepas de mucosa.

B. longum

*
*
*
Individuo M
Individuo E
Individuo H

99
Individuo M

Figura 16. Dendograma obtenido por el mtodo UPGMA a partir de los perfiles RAPD de los aislados.

Resultados y discusin: Captulo II

Resultados y discusin: Captulo II

Aunque algunos sujetos presentaban ms diversidad que otros, en la mayora de


los casos las cepas de un mismo individuo se mostraron idnticas o estrechamente
relacionadas entre s. En ningn caso detectamos la presencia de cepas con el mismo
perfil en individuos diferentes, confirmando la composicin microbiana personal que se
haba venido constatando a lo largo de todo el trabajo. La existencia de una cierta
estabilidad a nivel de cepas de bifidobacterias ha sido establecida con anterioridad por
otros autores (McCartney y cols., 1996; Satokari y cols., 2001; Mtt y cols., 2004).

100

Resultados y discusin: Captulo III

Captulo

III:

Caracterizacin

seleccin

de

bifidobacterias y lactobacilos con potencial probitico.

La capacidad de las bacterias para sobrevivir y crecer en un nicho microbiolgico


depende de las condiciones biolgicas y fsico-qumicas del ecosistema en particular.
En el caso de las bacterias intestinales, y en concreto de los probiticos, para
mantener la viabilidad en el ambiente del TGI han de ser resistentes a la acidez
estomacal y a la presencia de sales biliares intestinales que tienen una importante
actividad antibacteriana. Adems, han de ser capaces de colonizar la mucosa intestinal,
y competir por espacio y nutrientes con otros muchos microorganismos. A esta
competencia contribuyen la capacidad de adhesin al epitelio intestinal y la facultad
para producir sustancias antimicrobianas. Adems es deseable que las cepas a utilizar
sean de origen humano y estn libres de factores de patogenicidad (Salminen y cols.,
1998b; Guarner y Schaafsma, 1998; Ishibashi y Yamazaki, 2001).
Con estas premisas se estudiaron, de forma secuencial, diversas caractersticas
probiticas a partir de 242 cepas (181 bifidobacteria y 61 lactobacilos) aisladas en
heces y mucosa intestinal, con el fin de seleccionar aquellas con las mejores
propiedades de cara a su aplicacin o inclusin en productos probiticos.

III.1. RESISTENCIA A SALES BILIARES.


Aunque la concentracin de bilis en el intestino es variable y difcil de predecir en
un momento dado, es razonable que se seleccionen para su uso como probiticos las
cepas ms resistentes. Las concentraciones de bilis ms habitualmente utilizadas en

101

Resultados y discusin: Captulo III

muchos estudios de bsqueda y seleccin de cepas resistentes se sitan entre el 0,1 y


el 4% (Prasad y cols., 1998; Gmez-Zavaglia y cols., 1998; Kociubinski y cols., 1999).
En nuestro caso, se ensayaron concentraciones crecientes desde un 0,06% hasta un
2% de bilis bovina (Oxgall). En las Figuras 17 y 18 se representa la susceptibilidad a
este compuesto de los aislados de bifidobacterias y lactobacilos respectivamente.
Se observ que la bilis afectaba de forma importante al crecimiento bacteriano, de
forma que la adicin de un 0,06% de Oxgall lo disminua apreciablemente. A pesar
de ello, se encontr que el 45% de las cepas eran capaces de crecer en un 2% de
bilis. La tolerancia vari entre los aislados de B. longum y B. pseudocatenulatum, con
ms de un 50% de las cepas de esta ltima especie resistentes a esta concentracin.
Todos los aislados de B. adolescentis (9), B. catenulatum (3), B. dentium (2) y B.

animalis (1) crecieron entre un 1 y un 2% de Oxgall. La tolerancia de B. bifidum a


bilis fue bastante alta, ya que mas del 90% de los aislados crecieron en un 1%.
Todos los aislados de L. ruminis (5), L. brevis (4), L. johnsonii (2), L. parabuchneri
(2), L. plantarum (1), L. vaginalis (1), as como la mayora de las cepas de L. casei
crecieron tambin en presencia de un 2% de Oxgall. La tolerancia a bilis en las cepas
de L. gasseri fue muy variable; as, el 30% de los aislados creci en concentraciones
de 1 y 2% de Oxgall, mientras que el resto no creci por encima del 0,25%. La
especie L. delbrueckii fue la ms sensible, dado que slo uno de los ocho aislados
creci por encima de un 0,25% de Oxgall.
La resistencia a sales biliares en bifidobacterias y lactobacilos es una caracterstica
que depende de la especie y de la cepa, tal y como otros autores han puesto de
manifiesto con anterioridad (Clark y Martin, 1994; Charteris y cols., 1998a; Prasad y
cols., 1998; Chung y cols., 1999; Gmez-Zavaglia y cols., 1999; Xanthopoulos y cols.,
2000).

102

Resultados y discusin: Captulo III

Figura 17. Resistencia a Oxgall de aislados de bifidobacterias.

B. animalis
B. dentium
0,25%

B. catenulatum

0,5%
1%

B. adolescentis

2%
B. bifidum
B. pseudocatenulatum
B. longum
0

20

40

60

80

100

Nmero de aislados

Figura 18. Resistencia a Oxgall de aislados de lactobacilos.

L. sakei
L. plantarum
L. vaginalis
Lactobacillus sp.

0,25%

L. parabuchneri

0,5%

L. johnsonii

1%

L. brevis

2%

L. ruminis
L. rhamnosus
L. casei
L. delbrueckii
L. gasseri

10

15

20

25

Nmero de aislados

103

Resultados y discusin: Captulo III

Es importante mencionar que la actividad inhibitoria puede ser diferente


dependiendo del origen de las sales biliares. As, Dunne y cols. (1999) encontraron
diferencias importantes en la resistencia microbiana a sales biliares de origen bovino,
porcino y humano.

III.2. RESISTENCIA A pH CIDO.


Diferentes ensayos in vitro han sido descritos para el estudio y la seleccin de
cepas probiticas resistentes a la acidez. stos varan desde la exposicin a tampn
fosfato ajustado a diferentes pHs (Conway y cols., 1987), la disminucin de densidad
ptica en cultivos activos (Chung y cols., 1999), el uso de modelos de simulacin del
estmago (Marteau y cols., 1997) o la incubacin en jugos gstricos humanos (Dunne
y cols., 2001). Aunque el pH del estmago puede llegar a 1, en la mayora de los
ensayos se utiliza como referencia pH 3, ya que a pHs inferiores a 2 se produce, de
forma general un importante descenso de la viabilidad de estos microorganismos
(Lankaputhra y Shah, 1995).
Con el propsito de aumentar los criterios de probiosis de las cepas, se determin
el crecimiento a pH cido de 68 aislados de bifidobacterias y 29 aislados de lactobacilos
preseleccionados por su resistencia a sales biliares (crecimiento en presencia de 1-2%
de Oxgall). En nuestro caso, utilizamos el criterio de registrar la capacidad de iniciar
el crecimiento a un determinado pH. El ensayo se realiz en caldo MRSC acidificado
con HCl a pH 2,5, 3, 3,5, 4 y 4,5. Como control se utiliz MRSC sin acidificar (pH 5,5).
En la Tabla 18 se muestra el nmero de aislados de cada especie que creci a los
distintos pHs.
El estudio mostr que el 77% de las cepas analizadas creca a pH 4,5, pero slo
un 29% fueron capaces de hacerlo a pH 3,5. Ninguna de las cepas ensayadas fue

104

Resultados y discusin: Captulo III

capaz de iniciar el crecimiento por debajo de este pH. La tolerancia a la acidez de los
lactobacilos fue mayor que la mostrada por las bifidobacterias. As, mientras que slo
un 18% de las bifidobacterias analizadas creci a pH 3,5, un 55% de los lactobacilos
fueron capaces de crecer en estas condiciones, entre ellos los aislados de L. casei (5),

L. rhamnosus (2), L. parabuchneri (2), L. plantarum (1) y L. vaginalis (1).

Tabla 18. Crecimiento a pH cido de aislados de bifidobacterias y lactobacilos.


Aislados que crecen a pH mnimo de:
Bifidobacterias

B. longum
B. pseudocatenulatum
B. bifidum
B. adolescentis
B. catenulatum
B. dentium
B. animalis
Lactobacilos

L. casei
L. brevis
L. ruminis
L. gasseri
Lactobacillus sp.
L. johnsonii
L. parabuchneri
L. rhamnosus
L. sakei
L. delbrueckii
L. vaginalis
L. plantarum

N aislados

3,5

4,5

5,5*

68

12

10

26

20

28
25
7
3
3
1
1

5
3

2
3
4

6
13
1

2
1
1

15
6
2
3

29

16

5
4
4
4
2
2
2
2
1
1
1
1

5
1

1
2
1
2
2
1
1

3
1
1
1

*: control

La mayor resistencia a la acidez en lactobacilos que en bifidobacterias ha sido


puesta de manifiesto anteriormente en estudios similares de seleccin de probiticos
(Dunne y cols., 1999; Dunne y cols., 2001). Los lactobacilos son en general mucho

105

Resultados y discusin: Captulo III

ms resistentes a la acidez que las bifidobacterias, teniendo los primeros un


crecimiento moderado a pH 3 y relativamente bueno a pH 4 (Jin y cols., 1998). Sin
embargo, el pH ptimo de crecimiento de las bifidobacterias se sita en torno a 6,5-7 y
por debajo de 5 el crecimiento de la mayora de las cepas se ve retardado
(Lankaputhra y Shah, 1995). No obstante, se han descrito diferencias cuantitativas
muy marcadas en la resistencia a la acidez de cepas distintas, tanto en las
bifidobacterias como en los lactobacilos (Charteris y cols., 1998a; Gmez-Zavaglia y
cols., 1998; Prasad y cols., 1998; Chung y cols., 1999; Xanthopoulos y cols., 2000;
Acharya y Shah, 2002). En nuestro caso utilizamos un ensayo cualitativo (se observ la
presencia o ausencia de turbidez), motivo por el cual los resultados no se pueden
comparar de forma directa con los que se obtienen por mtodos cuantitativos.
Es importante remarcar que la viabilidad de las bacterias probiticas, a igualdad de
pH, podra ser mayor en condiciones fisiolgicas que en las soluciones in vitro en las
que se llevan a cabo los ensayos; debido a que los constituyentes no cidos de la
secrecin gstrica y los componentes de los alimentos pueden ejercer un efecto
protector sobre los microorganismos durante su paso por el estmago (Conway y cols.,
1987).

III.3. ACTIVIDADES ENZIMTICAS.


A pesar de que las bacterias de los generos Lactobacillus y Bifidobacterium se
consideran

seguras

(GRAS)

no

infectivas,

stas

pueden

comportarse

en

determinados casos como patgenos oportunistas en personas con alguna enfermedad


de base o en inmunodeprimidos (Gasser, 1994; Husni y cols., 1997; Mackay y col.,
1999). Por ello, es importante comprobar que las cepas potencialmente probiticas no
poseen factores de virulencia. La presencia de determinadas actividades enzimticas se

106

Resultados y discusin: Captulo III

considera nociva porque se relacionan con ciertas patologas o tendencias hacia


determinadas enfermedades; tal es el caso de las actividades microbianas
procancergenas -glucoronidasa y -glucosidasa (Goldin, 1996; Kim y Jin, 2001).
Otras glicosidasas bacterianas como la N-acetil--glucosaminidasa podran estar
implicadas en la degradacin de glicoprotenas del moco intestinal (hidrlisis de la
mucina) (Hoskins y Boulding, 1981). Las actividades de la quimiotripsina y diversas
arilamidasas pueden actuar tambin en algunos casos como factores de patogenicidad
(Oakey y cols., 1995). Teniendo en cuenta estas consideraciones, se estudiaron
diversas actividades enzimticas hidrolticas en 19 cepas (11 bifidobacterias y 8
lactobacilos) que habamos seleccionado por su tolerancia a sales biliares y pH cido
(3,5-4). El ensayo se realiz con las tiras reactivas API ZYM. Las actividades
enzimticas detectadas y su cuantificacin se muestran en la Tabla 19.
No se detect la presencia de actividades fosfatasa alcalina, lipasa (C14),

-manosidasa, tripsina, quimiotripsina ni N-acetil--glucosaminidasa en ninguna de las


cepas analizadas. Las actividades val-arilamidasa y cis-arilamidasa no se encontraron
entre los aislados de bifidobacterias. Tampoco se observ en ninguna bifidobacteria la
actividad

nociva

-glucuronidasa, relacionada con la conversin de algunos

precarcingenos en carcingenos, slo se detect en algn lactobacilo y en niveles


muy bajos. La actividad -glucosidasa estuvo presente en las especies de B.

pseudocatenulatum y B. catenulatum, pero no en B. longum ni en la mayora de los


lactobacilos. Las 2 cepas de L. gasseri ensayadas mostraron niveles muy bajos de
todas las actividades enzimticas. Excepto los aislados de L. casei, L. rhamnosus y L.

gasseri, el resto de las cepas presentaron importantes actividades - y/o


-galactosidasa.

107

Resultados y discusin: Captulo III

Naftol-AS-BIfosfohidrolasa

Fosfatasa cida

Esterasa (C4)

Esterasa-lipasa (C8)

Leu-arilamidasa

Val-arilamidasa

Cis-arilamidasa

-Galactosidasa

-Galactosidasa

-Glucuronidasa

-Glucosidasa

-Glucosidasa

-Fucosidasa

Tabla 19. Actividades enzimticas (en nmoles de substrato hidrolizado) de las cepas
de lactobacilos y bifidobacterias seleccionadas.

A21 L. gasseri

F71 L. gasseri

F76 L. casei

40

30

10

B63 L. casei

>40

30

10

G92 L. rhamnosus

2,5

15

10

30

30

2,5

2,5

20

2,5

G42 L. brevis

2,5

10

2,5

2,5

40

20

10

40

15

25

C32 L. vaginalis

2,5

2,5

10

2,5

20

20

>40

G46 L. parabuchneri

2,5

2,5

25

10

10

40

20

30

2,5

2,5

10

15

>40

15

C63* B. pseudoactenulatum

15

10

25

>40

10

20

E72 B. pseudocatenulatum

2,5

2,5

15

15

E113 B. pseudocatenulatum

15

20

30

20

25

2,5

2,5

15

25

30

10

H34 B. pseudocatenulatum

2,5

10

10

10

2,5

L21 B. catenulatum

2,5

15

15

40

25

20

L48 B. catenulatum

2,5

25

30

>40

25

15

L51 B. catenulatum

30

25

>40

35

20

2,5

2,5

25

>40

20

2,5

Enzimas

Lactobacilos

Bifidobacterias
L25 B. longum
C62* B. longum

M115* B. pseudocatenulatum

E43 B. animalis

*: aislados de mucosa intestinal.

III.4. RESISTENCIA A ANTIBITICOS.


La presencia de determinantes de resistencia a antibiticos transferibles es una
caracterstica indeseable en aquellas bacterias que se pretende incorporar en la cadena

108

Resultados y discusin: Captulo III

alimentaria, ya que en el intestino estas bacterias pueden transmitir las resistencias a


microorganismos patgenos (Netherwood y cols., 1999; Teuber y cols., 1999). Por esta
razn se decidi estudiar la resistencia de las 11 cepas de bifidobacterias y 8 de
lactobacilos seleccionadas frente a diferentes antibiticos activos sobre bacterias
Gram-positivas. Los antimicrobianos analizados incluyeron inhibidores de la sntesis de
la pared celular (penicilinas, cefalosporinas y vancomicina), inhibidores de la sntesis de
protenas (tetraciclinas, eritromicina, clindamicina y cloranfenicol) e inhibidores de la
sntesis de cidos nuclicos (metronidazol y moxifloxacino). Los resultados de las CIMs
de los aislados para los antibiticos ms relevantes se muestran el Tabla 20.
En lo que concierne a los inhibidores de la sntesis de la pared celular, todos los
aislados analizados mostraron alta sensibilidad frente al grupo de las penicilinas
(CIM1 g/ml), excepto la cepa de L. brevis que present una CIM de 4 g/ml frente a
penicilina G. La cefoxitina fue el nico -lactmico para el que se encontr resistencia
en algunas cepas de lactobacilos (CIM>64 g/ml), coincidiendo con otros resultados
descritos en la literatura (Charteris y cols., 1998b; Danielsen y Wind, 2003). Excepto
las dos cepas de L. gasseri, todos los dems lactobacilos crecieron en la mayor
concentracin de vancomicina (CIM>8 g/ml). La resistencia a la vancomicina en las
especies de L. casei y L. rhamnosus se relaciona con su caracterstica pared celular
(Billot-Klein y cols., 1997; Tynkkynen y cols., 1998), siendo pues una resistencia
intrnseca y no transferible.
Todos los lactobacilos presentaron resistencia al metronidazol (CIM>32 g/ml), al
igual que se ha descrito en otros trabajos (Charteris y cols., 1998b, Danielsen y Wind,
2003). Sin embargo, la resistencia fue variable entre las bifidobacterias, tal y como han
encontrado tambin otros autores (Lim y cols., 1993; Yazid y cols., 2000; Moubareck y
cols., 2005).

109

Resultados y discusin: Captulo III

Penicilina

Amoxicilina

Cefoxitina

Moxifloxacino

Vancomicina

Cloranfenicol

Eritromicina

Clindamicina

Tetraciclina

Metronidazol

Tabla 20. Resistencia a antibiticos de las cepas de bifidobacterias y lactobacilos


seleccionadas. (CIM en g/ml).

A21 L. gasseri

0,06

0,25

>32

F71 L. gasseri

0,12

0,5

32

>32

F76 L. casei

0,12

0,5

>64

>8

>32

B63 L. casei

0,25

>64

0,25

>8

0,5

>32

G92 L. rhamnosus

0,25

0,5

>64

0,25

>8

0,5

>32

>64

>8

>8

16

16

>32

0,5

0,25

>64

>8

>8

0,5

>16

>32

0,25

0,5

>8

0,5

>32

L25 B. longum

0,25

0,5

0,5

C62* B. longum

0,25

0,25

0,5

>32

C63* B. pseudoactenulatum

0,25

0,25

0,5

0,5

E72 B. pseudocatenulatum

0,06

0,5

0,5

0,5

E113 B. pseudocatenulatum

0,06

0,25

0,5

0,5

16

0,5

>32

H34 B. pseudocatenulatum

0,06

0,25

0,5

0,5

L21 B. catenulatum

0,06

0,25

0,5

16

L48 B. catenulatum

0,06

0,25

>8

0,5

>32

L51 B. catenulatum

0,12

0,25

0,5

>32

E43 B. animalis

0,12

0,25

>8

0,5

16

en

infecciones

Antibiticos

Lactobacilos

G42 L. brevis
C32 L. vaginalis
G46 L. parabuchneri

Bifidobacterias

M115* B. pseudocatenulatum

*: aislados de mucosa intestinal.

El

metronidazol

es

un

antibitico

de

uso

habitual

por

microorganismos anaerobios del TGI, utilizndose frecuentemente contra la colitis

110

Resultados y discusin: Captulo III

pseudomembranosa causada por Cl. difficile (Freeman y cols, 1997). Por esta razn, la
resistencia a este antibitico en cepas probiticas podra ser una caracterstica
deseable.
Ninguna de las cepas analizadas se consider resistente al cloranfenicol (CIM8
g/ml en todos los aislados), siendo las bifidobacterias ms susceptibles que los
lactobacilos. Los aislados de B. animalis, L. brevis y L. vaginalis fueron resistentes a las
tetraciclinas (CIM16 g/ml). Estos dos aislados de lactobacilos mostraron adems
CIMs elevadas frente a clindamicina y/o eritromicina (CIM8 g/ml). Aunque nada
sabemos por el momento del carcter transmisible de estas resistencias, estas cepas
se apartaron del proceso de seleccin.

III.5. INHIBICIN DE PATGENOS.


La capacidad para inhibir el crecimiento de microorganismos patgenos es uno de
los mecanismos mediante el cual los probiticos contribuyen a la proteccin del
hospedador (Ouwehand y cols., 1999). Las BAL producen diversas sustancias con
efectos antimicrobianos como cidos orgnicos, cidos grasos, perxido de hidrgeno,
bacteriocinas y sustancias relacionadas (Mishra y Lambert, 1996). Para determinar si
los aislados de bifidobacterias y lactobacilos seleccionados en este estudio pudieran
inhibir a bacterias patgenas se estudi la actividad antagnica in vitro de 7 cepas de
bifidobacterias y 5 cepas de lactobacilos contra patgenos de la coleccin de la UCC,
usando un ensayo de inhibicin en placa de doble capa. Se midi el dimetro de los
halos de inhibicin y se tipific la actividad antagnica como (-): no inhibicin, (+/-):
algo de inhibicin pero no un halo claro, (+): halo claro de entre 2 y 5 mm alrededor
del crecimiento, (++): 5 mm de inhibicin o ms. Los resultados obtenidos con 12
cepas seleccionadas se muestran en la Tabla 21.

111

Resultados y discusin: Captulo III

monocytogenes 1078

Listeria

LT2 UK1

serotipo Typhimurium

Salmonella enterica

555

Escherichia coli wt

aureus ATTC 1448

Patgenos coleccin UCC

Staphylococcus

Tabla 21. Actividad antimicrobiana contra patgenos de cepas de bifidobacterias y


lactobacilos seleccionadas.

Lactobacilos
A21 L. gasseri

++

+/-

F71 L. gasseri

F76 L. casei

+/-

B63 L. casei

++

+/-

G46 L. parabuchneri

+/-

UCC118 L. salivarius

++

++

C63* B. pseudocatenulatum

+/-

H34 B. pseudocatenulatum

+/-

++

L21 B. catenulatum

++

++

L48 B. catenulatum

+/-

+/-

L51 B. catenulatum

+/-

+/-

+/-

Bifidobacterias
L25 B. longum

E43 B. animalis

-: No inhibicin, +/-: Algo de inhibicin pero no un halo claro, +: Entre 2 y 5 mm de inhibicin,


++: 5 mm o ms de inhibicin.

Ninguna de las cepas ensayadas fue capaz de inhibir a la cepa Bacillus cereus
NCIMB 1771. La mayora de los aislados de las especies L. casei, L. gasseri, B. longum,

B. pseudocatenulatum y B. catenulatum inhiban al resto de los patgenos ensayados.


Esta actividad inhibitoria no se observ con las cepas de L. parabuchneri y B. animalis.
Los efectos antagonistas de los probiticos contra microorganismos patgenos o
alterantes se han atribuido principalmente a la produccin de cidos orgnicos

112

Resultados y discusin: Captulo III

(Ibrahim y Bezkorovainy, 1993; Ashara y cols., 2001; Bruno y Shah, 2002). Sin
embargo, son muchos los autores que han descrito la produccin, tanto en lactobacilos
como en bifidobacterias, de compuestos antimicrobianos no relacionados con la
acidificacin y activos in vitro contra patgenos Gram-positivos y Gram-negativos
(Gibson y Wang, 1994; Bernet y cols., 1997; Livin y cols., 2000; Lee y cols., 2003;
Gagnon y cols., 2004). En el caso de los lactobacilos, la produccin de bacteriocinas
est bien establecida (Zhu y cols., 2000; Boris y cols., 2001; Kawai y cols., 2004;
Ocaa y Nader-Macias 2004), pero muy poco se conoce de la naturaleza de estas
sustancias en las bifidobacterias. Slo recientemente se ha empezado ha especular con
la posible implicacin de pptidos antimicrobianos (Yildirim y cols., 1999; Toure y cols.,
2003).

III.6. PRODUCCIN DE BACTERIOCINAS.


Las bacteriocinas han sido definidas como pptidos antimicrobianos de sntesis
ribosomal, activas generalmente frente a especies relacionadas (Jack y cols., 1995,
Cleveland y cols., 2001), que pueden constituir un mecanismo de competencia al
ayudar a la bacteria productora a imponerse en un determinado hbitat. En este
trabajo se estudi la produccin de bacteriocinas en las cepas que presentaban
actividad antagnica frente a patgenos. En primer lugar se utiliz el ensayo de
inhibicin en placa y posteriormente la produccin se confirm en medio lquido
mediante la tcnica de difusin en agar.
Mediante el ensayo en doble capa, ninguno de los lactobacilos mostr inhibicin
frente a los indicadores utilizados. Sin embargo, si se observ la produccin de halos
de inhibicin en 4 cepas de bifidobacterias. En la Tabla 22 se muestra el espectro de
inhibicin de estas cepas.

113

Resultados y discusin: Captulo III

Cuando se probaron los sobrenadantes libres de clulas o CFS de estos aislados de


bifidobacterias en el ensayo de difusin en agar, se encontr que slo una de ellas (B.

longum L25) presentaba actividad inhibitoria, siendo otro cepa de la misma especie (B.
longum L13) el indicador ms sensible.

L13

B. longum

C102

L. delbrueckii

906

Cepas indicadoras

L. sakei CECT

Tabla 22. Espectro de inhibicin de cepas de bifidobacterias contra bacterias


relacionadas mediante ensayo en placa de doble capa.

Cepas seleccionadas
L25 B. longum

+/-

+/-

++

L48 B. catenulatum

L51 B. catenulatum

H34 B. pseudocatenulatum

Lc. lactis NCDO 497

++

++

L. plantarum LL 441

++

+/-

+/-

Controles

Son varios los autores que describen la necesidad de concentrar el CFS en el


estudio de la produccin de bacteriocinas para poder detectar la actividad inhibitoria
(Holo y cols., 2002; Toure y cols., 2003). Una posible explicacin para la produccin
diferencial en medio slido y lquido pudiera ser la ausencia de contacto entre las
clulas del microorganismo productor y el indicador cuando se ensaya el CFS mediante
el mtodo de difusin en agar. El contacto entre ambos microorganismos podra ser
necesario para la accin de estas sustancias o para inducir su expresin en la bacteria
productora (Toure y cols., 2003; Maldonado y cols., 2004).

114

Resultados y discusin: Captulo III

III.6.1. CARACTERIZACIN PRELIMINAR DE LA SUSTANCIA INHIBIDORA.


En un intento por establecer la naturaleza de la inhibicin causada por la cepa B.

longum L25, se realizaron diversos experimentos de caracterizacin. Por un lado


estimamos el peso molecular de la sustancia mediante el paso del CFS activo a travs
de centricones de tamao de poro conocido. Adems, se estudi la termorresistencia y
la sensibilidad a proteasas del compuesto antimicrobiano.
Se observ que la sustancia inhibitoria era retenida completamente por
centricones de 5 kDa; sin embargo, parte de la actividad era capaz de pasar a travs
de las membranas de 10 kDa. Esto nos indica que el compuesto tiene un tamao
molecular entre 5 y 10 kDa y sugiere tambin la posible formacin de agregados que
dificultaran su paso a travs de las membranas de 10 kDa. La actividad inhibitoria se
perdi tras calentarse el CFS a 60 y 80C durante 10 min, mientras que la sustancia no
se inactivaba al incubarse durante el mismo tiempo a 40C. Las diferentes proteasas
ensayadas (Pronasa, Proteinasa K y Tripsina) no mostraron ningn efecto sobre la
actividad inhibidora, ya que sta no se perdi ni disminuy con el tratamiento del CFS
con1 mg/ml durante 1 h a 37C. La resistencia a proteasas y su termosensibilidad
podran indicar la presencia de estructuras complejas en el compuesto inhibidor. Por
otra parte, se descart que la inhibicin fuera debida a cidos orgnicos, ya que se
segua detectando la actividad cuando el CFS se neutralizaba (de pH 4,5 a pH 7)
(Figura 19).
La produccin de bacteriocinas por bifidobacterias no est todava muy bien
documentada.

Algunos

autores

han

descrito

la

produccin

de

compuestos

antimicrobianos de naturaleza proteica por parte de varias cepas (Meghrous y cols.,


1990; Gibson y Wang, 1994; Toure y cols., 2003), pero hasta el momento slo se han
descrito dos bacteriocinas: bifidin y bifidocin B, siendo sta ltima la nica que ha sido

115

Resultados y discusin: Captulo III

purificada y caracterizada a nivel gentico (Yildirim y Johnson, 1998; Yildirim y cols.,


1999).
Figura 19. Halos de inhibicin del CFS neutralizado de B. longum L25 frente la cepa
indicadora B. longum L13.

III.7. ADHERENCIA A CLULAS EPITELIALES HUMANAS.


Uno de los criterios ms aceptados para la seleccin de bacterias probiticas es la
capacidad de adherencia al tejido epitelial del intestino, ya que ste es, seguramente,
el primer paso en la colonizacin intestinal por el microorganimo (Guarner y
Schaafsma, 1998; Dunne y cols., 2001). Las lneas celulares intestinales HT-29 y Caco2 expresan las caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de los enterocitos humanos
(Brassart y cols., 1998) y se usan de forma habitual mediante propagacin in vitro en
los estudios de adhesin de probiticos (Blum y cols., 1999).
En este trabajo utilizamos estas dos lneas celulares para comprobar la adhesin
de 9 cepas (4 lactobacilos y 5 bifidobacterias) seleccionadas en los pasos anteriores.

116

Resultados y discusin: Captulo III

Los lactobacilos se ensayaron con las dos lneas celulares, mientras que las
bifidobacterias se examinaron slo frente a las clulas Caco-2. La capacidad de
adhesin de nuestros aislados se compar con la de la cepa comercial L. rhamnosus
GG. Los niveles de adherencia se expresaron como ufc/10 cm2 de monocapa epitelial.
En las Figuras 20 y 21 se representa la media y la desviacin estndar de los tres
ensayos realizados.
Tres de las cuatro cepas de lactobacilos fueron capaces de adherirse a las lneas
celulares HT-29 y Caco-2 con niveles similares a los de la cepa estndar. En general,
las cepas se adhirieron mejor a las clulas de la lnea HT-29 que a las de Caco-2,
mientras que el control L. rhamnosus GG se adhiri a ambas por igual.
Las bifidobacterias mostraron tambin variaciones en su capacidad para adherirse
a las clulas Caco-2. As, de las tres cepas de B. catenulatum ensayadas, dos
presentaron niveles de adhesin altos, mientras que la tercera exhibi una adherencia
menor. La cepas de B. longum y B. pseudocatenulatum mostraron valores intermedios.
En el estudio se tuvo en consideracin el hecho de que los niveles de adhesin
pueden depender de la concentracin inicial de la cepa a ensayar (Greene y
Klaenhammer, 1994; Tuomola y Salminen, 1998). Por ello se calcul tambin la
adhesin expresando los resultados como porcentaje de bacterias adheridas respecto
de la cantidad total de bacterias aadidas en el ensayo. Los valores de adhesin
oscilaron en este caso entre el 40 el 80% y coincidieron, en general, con los niveles de
adhesin de las cepas que se muestran en las Figuras 20 y 21.
Varios autores, utilizando distintos modelos de adhesin, han puesto de manifiesto
una enorme variabilidad entre cepas de la misma especie en la capacidad de adhesin
(Crociani y cols., 1995, Tuomola y Salminen, 1998; He y cols., 2001), lo que sugiere
que sta es una particularidad de cada cepa.

117

Resultados y discusin: Captulo III

Figura 20. Adhesin a clulas epiteliales Caco-2 y HT-29 de diversas cepas


seleccionadas de lactobacilos.

Caco-2

1,00E+08

HT-29
1,00E+07

ufc/10 cm2

1,00E+06
1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
B63
L. casei

F76
L. casei

F71
L. gasseri

A21
L. gasseri

GG
L. rhamnosus

Figura 21. Adhesin a clulas epiteliales Caco-2 de diversas cepas seleccionadas de


bifidobacterias.

1,00E+07
1,00E+06
ufc/10 cm2

1,00E+05
1,00E+04
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
L51
L48
B. catenulatum B. catenulatum

118

L21
H34
L25
B. catenulatum B. pseudocatenualtum B. longum

Discusin general

La microbiota intestinal normal y sus actividades.


En los ltimos aos se ha incrementado notablemente el inters por el estudio del
complejo ecosistema microbiano del tracto grastrointestinal (TGI) del hombre
(Tannock, 1999b) y otros animales (Pryde y cols., 1999; Daly y cols., 2001; Gong y
cols., 2002; Linaje y cols., 2004). Esto se debe a que las poblaciones microbianas
ejercen una gran influencia sobre muchas caractersticas bioqumicas, fisiolgicas e
inmunolgicas del hospedador en el que residen (Gill, 1998; Salminen y cols., 1998c;
Parodi, 1999), existiendo una relacin cada vez ms clara entre la microbiota intestinal
y la salud (Parodi, 1999; Hart y cols., 2002; Guarner y Malagelada, 2003; Noverr y
Huffnagle, 2004). Hasta el momento se conocen los gneros microbianos mayoritarios
y su abundancia relativa en las distintas posiciones del TGI y a lo largo de la vida
(Conway, 1995; Tannock, 1999b). El inters por el estudio de la microbiota intestinal
se ha visto reforzado en los ltimos aos con la aparicin de diversas tcnicas
moleculares que facilitan la caracterizacin y el seguimiento de una enorme variedad
de grupos microbianos, incluyendo poblaciones no cultivables. Con estas nuevas
herramientas se pueden llegar a conocer incluso los componentes individuales de los
diversos tipos y su estado fisiolgico de actividad (Vaughan y cols., 2000; Vaughan y
cols., 2002; Zoetendal y cols., 2004). Mediante el anlisis de secuencias del ADNr 16S
amplificadas directamente de heces humanas y su comparacin con secuencias de
especies cultivables, se ha estimado que slo alrededor de un 30% de las especies
detectadas con las tcnicas moleculares se corresponden con especies cultivables
descritas (Wilson y Blitchington, 1996; Suau y cols., 1999; Hayashi y cols., 2002b).
Estos datos sugieren que, a pesar de su relevancia, an no se conocen con precisin
todos los microorganismos que integran las poblaciones intestinales, ni la importancia y
el papel biolgico con los que cada tipo contribuye a la salud del hospedador. Debido a

119

Discusin general

obvias razones ticas de muestreo, en la mayora de los trabajos los anlisis se llevan a
cabo fundamentalmente en muestras de heces, en las que en la actualidad se han
establecido los grupos y gneros mayoritarios en diversos grupos humanos, pero slo
se poseen datos puntuales en cuanto a la composicin en especies y cepas. Tampoco
se conoce la importancia y el papel fisiolgico de las poblaciones minoritarias que, sin
duda, pueden ser determinantes en posiciones especficas o en algunas situaciones
(Cummings, 1997). S parece claro que factores como la edad, el sexo, el genotipo o
los hbitos alimenticios influyen en la microbiota intestinal (Holdeman y cols., 1976;
Noack-Loebel y cols., 1983; Moore y Moore, 1995; Hopkins y cols., 2001; Zoetendal y
cols., 2001; Hayashi y cols., 2002a). En cualquier caso y tal como hemos resaltado en
los apartados precedentes, resulta necesario, como as lo recomiendan autores de
reconocido prestigio (Salminen y cols., 1998a; Tannock, 1998; Tannock, 1999b),
estudiar la microbiologa del TGI en el mayor nmero posible de comunidades
humanas para poder llegar a extraer unas conclusiones lo ms generales posibles.
Aunque en muchos estudios ya se apunta hacia la existencia de una microbiota
personal y caracterstica para cada individuo.
En nuestro pas, los estudios sobre la microbiota intestinal humana son escasos y,
por tanto, nos vemos en la necesidad de extrapolar los resultados descritos en otras
comunidades humanas. La mayora de los estudios sobre microbiota intestinal, y
especialmente los ms modernos en los que se utilizan novedosas tcnicas
independientes de cultivo, se han llevado a cabo mayoritariamente en Japn y en otros
pocos pases industrializados. Estos grupos humanos tienen regmenes alimenticios
muy alejados de los nuestros. Si aceptamos la hiptesis de que la dieta modula o
determina la composicin de las poblaciones intestinales, habremos de asumir tambin
que en nuestro caso estos grupos microbianos pueden ser distintos a los que estn

120

Discusin general

descritos. En nuestro pas, de manera generalizada, se sigue un rgimen alimenticio


saludable de forma reconocida: la dieta mediterrnea (Trichopoulou y Lagiou, 1997).
Como carcter diferenciador pudiera pensarse tambin en una posible idiosincrasia
gentica que, como otros factores, tiene su influencia en la composicin de la
microbiota intestinal (Zoetendal y cols., 2001; Toivanen y cols., 2001).
Consideraciones de este tipo son las que nos han movido a realizar el estudio que
se detalla en esta memoria. Desafortunadamente, el nmero de individuos y de
muestras analizadas es pequeo y, por tanto, los resultados han de considerarse
puntuales y no se pueden extrapolar a toda la comunidad. Al mismo tiempo que las
poblaciones microbianas, hemos analizado varios parmetros bioqumicos relacionados
directa o indirectamente con la microbiota. El objetivo fundamental del trabajo ha sido
describir los parmetros bioqumicos y microbiolgicos bsicos en personas sanas y
estudiar las variaciones normales, entendiendo por ello aquellas que no se deben a
tratamientos o a patologas.
En los individuos analizados, las poblaciones intestinales dominantes estn
compuestas por grupos de microorganismos anaerobios estrictos (clostridios,
bifidobacterias y bacteroides), con niveles muy superiores a los de las poblaciones
anaerobias facultativas y aerobias (coliformes, lactobacilos, enterococos, etc.), algo
que concuerda bien con los resultados obtenidos mediante cultivo en otras
comunidades humanas (Holdeman y cols., 1976; Koornhof y cols., 1976; Finegold y
cols., 1983; Moore y Moore, 1995). De manera general, las variaciones entre las
muestras de un mismo sujeto fueron inferiores a las que presentaban muestras de
distintos individuos, de forma que se puede pensar en un perfil microbiolgico personal
y relativamente estable a lo largo del tiempo; algo que fue mucho ms obvio cuando
analizamos en mayor profundidad las poblaciones de microorganismos totales y las de

121

Discusin general

las bacterias del cido lctico. Los resultados que obtuvimos mediante la construccin
y anlisis de genotecas de secuencias del ADNr 16S concordaron tambin con los que
la literatura refiere utilizando ste y otros mtodos moleculares (Wilson y Blitchington,
1996; Zoetendal y cols., 1998; Suau y cols., 1999; Sghir y cols., 2000; Hayashi y cols.,
2002b). Conviene mencionar que la diversidad microbiana total que se pone de
manifiesto mediante esta metodologa est en funcin del nmero de clones que se
analicen. En nuestro caso, dado el reducido nmero de clones analizados, estimamos,
tomando como base otros estudios similares (Suau y cols., 1999; Wang y cols., 2003),
que se ha puesto de manifiesto entre un 40 y un 50% de la diversidad existente. Tanto
en heces como en mucosa, los constituyentes mayoritarios estaban formados por
diversas especies pertenecientes al subgrupo XIVa de Clostridium (Collins y cols.,
1994), seguidas por otros clostridiales, bifidobacterias, bacteroides y enterobacterias.
Algunos de los microorganismos anaerobios estrictos, probablemente aquellos con una
mayor sensibilidad al oxgeno y/o unos requerimientos de cultivo ms complejos, slo
se detectaron mediante la tcnica molecular, especialmente en las muestras de
mucosa intestinal, que por su naturaleza y procesado estn ms fcilmente expuestas
al oxgeno A pesar de que los bacteroides se encontraron entre las poblaciones
mayoritarias en los recuentos, los niveles que stos presentaron y la proporcin de sus
secuencias en el anlisis molecular fueron menores que los descritos en la literatura
para otras comunidades humanas, siendo quizs el dato ms discordante de nuestros
resultados. El resultado, no obstante, se obtuvo mediante las dos tcnicas empleadas
(cultivo y molecular), por lo que hay posibilidades de que sea una caracterstica propia
de la microbiota intestinal de nuestra comunidad. El escaso nmero de muestras
analizadas mediante la tcnica molecular y las grandes variaciones individuales
(Zoetendal y cols., 1998; Hayashi y cols., 2002b) pueden ser responsables tambin de

122

Discusin general

la diferencia de resultados. Como caracterstica distintiva puede considerarse tambin


la presencia de clones de bifidobacterias y otras bacterias del cido lctico en varias de
las muestras, algo que tampoco suele ser habitual en trabajos de este tipo (Wilson y
Blitchington, 1996; Zoetendal y cols., 1998; Suau y cols., 1999; Hayashi y cols., 2002b;
Hold y cols., 2002; Matsuki y cols., 2002; Wang y cols., 2003). La combinacin de una
poblacin elevada de bifidobacterias y una poblacin escasa de bacteroides, sugiere
una microbiota de tipo saludable (Parodi, 1999); hiptesis que habr que explorar y
comprobar en el futuro.
En cuanto a las bacterias del cido lctico, Bifidobacterium longum fue la especie
mayoritaria

aislada

de

heces,

seguida

en

proporciones

similares

por

B.

pseudocatenulatum y B. bifidum. Todas estas especies se consideran caractersticas del


intestino de individuos adultos, aunque las especies predominantes y las proporciones
relativas varan enormemente entre los estudios y entre los individuos (McCartney y
cols., 1996; Matsuki y cols., 1999; Satokari y cols., 2001; Matsuki y cols., 2004), tal y
como se ha descrito tambin en los resultados de esta Tesis. Las variaciones incluyen
la presencia de una o ms especies, y dentro de las especies la presencia de una o
ms cepas distintas. Las especies que se aislaban de las heces se aislaron tambin de
las muestras de mucosa y en proporciones similares. La concordancia entre los datos
de los cultivos y, en su caso, de la deteccin molecular validan los resultados de ambas
tcnicas. Lactobacillus gasseri domin entre los lactobacilos, seguido por las especies

L. casei y L. delbrueckii, componentes habituales todos de la microbiota intestinal del


hombre (Finegold y cols., 1983; McCartney y cols., 1996; Song y cols., 2000; Walter y
cols., 2001; Heilig y cols., 2002). En general, los lactobacilos aparecen (en las
posiciones examinadas) en niveles muy inferiores a los de las bifidobacterias (y en
alguno de los sujetos ni siquiera se detectaron), lo que no excluye que en otras

123

Discusin general

localizaciones puedan representar porcentajes superiores (Marteau y cols., 2001). De


hecho, el anlisis y la comparacin de las secuencias genmicas de una cepa de B.

longum (Schell y cols., 2002), otra de L. johnsonii (Pridmore y cols., 2004) y otra de L.
gasseri (http://spider.jgi-psf.org/JGL_microbial/htm; http://compbio.ornl.gov/channel)
revela la existencia de maquinarias bioqumicas distintas para la bifidobacteria y los
lactobacilos, sugiriendo que quiz no sean competidores en las mismas posiciones del
TGI.
La microbiota intestinal, cualquiera que sea su composicin, va a ser responsable
de la mayor parte de las actividades enzimticas de las heces y de muchos de los
metabolitos que all se detectan. Algunos autores proponen que son los compuestos
generados por las actividades microbianas los verdaderos efectores de la capacidad
protectora o daina de la microbiota intestinal (Cummings, 1997; Parodi, 1999). Al
igual que en nuestro caso, la existencia de variabilidad en las determinaciones
bioqumicas en heces es una constante en muchos trabajos, que apuntan al efecto de
la ingesta alimentaria como principal factor modulador (Rowland y cols., 1985; Ikeda y
cols., 1994). No obstante, los perfiles bioqumicos (incluyendo actividades y
metabolitos) presentaron, las mismas propiedades de singularidad que las poblaciones
microbianas. Estamos convencidos de que ambos perfiles personales han de estar
conectados, aunque no hemos sido capaces de establecer correlaciones entre el
componente microbiano y el bioqumico, en algunos casos porque no se dispona de los
datos de todas las variables en estudio en una misma muestra, y en otros porque la
correlacin no fue estadsticamente significativa. Ya sabamos que era difcil establecer
asociaciones entre los parmetros bioqumicos y microbiolgicos, puesto que ni
siquiera es posible relacionarlos en modelos artificiales del TGI ms sencillos (van de
Wiele y cols., 2004; van Neunen y cols., 2004). Poblaciones no cultivables y otras

124

Discusin general

pobremente caracterizadas pueden contribuir a muchas actividades enzimticas y a la


produccin de metabolitos (Duncan y cols., 2002; Duncan y cols., 2004); mxime si
tenemos en cuenta que stas se encuentran entre los microorganismos dominantes.
Con todo, en algunos casos, s apreciamos asociaciones puntuales entre los
parmetros. As por ejemplo, en los individuos L y M la presencia de unos elevados
recuentos de coliformes aparece en combinacin con la ausencia de lactobacilos y la
falta de cido caproico e isobutrico en sus muestras de heces. Otro caso destacado es
el del individuo G, con unas caractersticas microbiolgicas y bioqumicas bien
diferenciadas del resto; como unos altos recuentos de coliformes en heces, una alta
actividad -glucosidasa y unos niveles destacables de cido caproico. Adems, en este
sujeto, la especie mayoritaria de bifidobacterias fue B. dentium y entre los aislados se
recuper una gran diversidad de especies de lactobacilos.

Probiticos y caractersticas probiticas.


El inters por la microbiologa intestinal se ha visto incrementado por la posibilidad
de modular o modificar los constituyentes microbianos mediante la ingesta de
microorganismos beneficiosos (probiticos) o compuestos que los potencien de manera
selectiva (prebiticos) (Reid y cols., 2003; Tuohy y cols., 2003). Los probiticos se
definieron originalmente como organismos y sustancias que contribuyen a mantener
al equilibrio microbiano intestinal (Parker, 1974). Sin embargo, la definicin ha
cambiado varias veces tratando de englobar los mltiples aspectos que el trmino
conlleva y las distintas posibilidades de aplicacin: microorganismos vivos o muertos,
preparados farmaceticos o productos alimenticios, ingestin o aplicacin tpica, etc.
(Fuller, 1989; Guarner y Schaafma, 1998; Salminen y cols., 1999; FAO/WHO, 2001;
Reid y cols., 2003; Sanders, 2003).

125

Discusin general

La industria alimentaria en general, y la industria lctea en particular, estn


promocionando muchos productos probiticos con alegaciones sobre la salud. Sin
embargo, la verificacin efectiva de los supuestos beneficios no es, en estos
momentos, concluyente. En la mayora de los casos, no se ha establecido la validez de
las alegaciones de salud y stas no resultan de evaluaciones rigurosas como las que se
llevan a cabo con los productos farmacuticos (Reid, 1999). Bien es cierto que diversas
especies de bacterias del cido lctico forman parte desde tiempo inmemorial de la
dieta del hombre a travs de numerosos productos fermentados, incluyendo los
productos lcteos, y que a estas bacterias se les ha supuesto desde los postulados de
Metchnikoff a principios del siglo pasado (Metchnikoff, 1907) un papel beneficioso en el
mantenimiento del equilibrio microbiano intestinal necesario para la salud. En esa
misma poca se constat que las bifidobacterias eran una de las poblaciones
dominantes en el intestino de los lactantes, y cmo estas poblaciones disminuyen a lo
largo de la vida (Reuter, 2001). Sin embargo, hay que ser conscientes de que las
razones de uso y los razonamientos empricos basados en su presencia no constituyen
una base cientfica slida en la que se pueda apoyar la utilizacin. En otras partes de la
memoria ya se ha comentado cmo muchos de los gneros y especies mayoritarios
encontrados en ste y otros estudios no se encuentran bien caracterizados desde el
punto de vista fisiolgico o bioqumico, pero es fcil anticipar que algunos tipos con
destacadas actividades beneficiosas (Duncan y cols., 2002; Duncan y cols., 2004)
engrosarn en un futuro las listas de los probiticos.
A pesar de las consideraciones anteriores, hay algunos efectos beneficiosos de las
bacterias probiticas sobre la salud que estn bien documentados de forma cientfica
(Dunne y cols., 1999; Ouwehand y cols., 2002). Entre los principales podemos citar su
contribucin al metabolismo intestinal (fermentacin de la lactosa, produccin de

126

Discusin general

cidos

grasos

de

cadena

corta,

etc.),

la

inhibicin

de

patgenos

la

inmunomodulacin. Poco se conoce, sin embargo, de las propiedades que se requieren


para resistir y competir en el tracto gastrointestinal (aunque se sospecha de
caractersticas como la resistencia a la acidez, la resistencia a sales biliares y la
capacidad de unin a las mucosas). En todo caso, la modificacin de la microbiota por
microorganismos de otro origen choca con la idea de la homeostasis: la fuerza de la
naturaleza que tiende a minimizar los cambios, incluyendo los que se derivan de la
introduccin de bacterias en un hbitat ya ocupado. Los fenmenos de exclusin
competitiva en el intestino (Dunne y cols., 1999; Tannock y cols., 2000; Satokari y
cols., 2003) tienen mucho que ver en la resistencia de las especies residentes a ser
desplazadas por otras forneas y, de hecho, el consumo de grandes cantidades de
probiticos parece no tener grandes efectos en la composicin de la microbiota
intestinal mayoritaria. Los microorganismos introducidos no alcanzan en ocasiones
los niveles de las poblaciones residentes y, en todo caso, desaparecen pronto tras el
cese del consumo (Alander y cols., 1999; Dunne y cols., 1999; Tannock y cols., 2000).
Una limitacin importante de lo efectos deseables es que se sabe muy poco de los
mecanismos moleculares a travs de los cuales se proveen los beneficios al
hospedador (Salminen y cols., 1998c; Hooper y Gordon, 2001), y que tampoco se
conoce de manera precisa la contribucin de cada tipo microbiano a la homeostasis.
Adems, las supuestas actividades beneficiosas parecen ser especficas de cada cepa
en particular (Dunne y cols., 1999; Sanders y Huis int Veld, 1999; Ouwehand y cols.,
2002; Reid y cols., 2003); algo que resulta frustrante en cierto sentido puesto que de
esta forma parece imposible hacer generalizaciones. Hay indicios de que los efectos
pueden ser multifactoriales (Tuohy y cols., 2003), de manera que su demostracin
resulte an ms complicada. S parece claro que uno de los campos ms prometedores

127

Discusin general

es la manipulacin del sistema inmune en relacin con determinadas patologas de


base inmunolgica (Kalliomki y cols., 2001; Gionchetti y cols., 2003), ya que para este
efecto no se precisa desplazar a las especies residentes.
Otra consideracin que hay que tener en cuenta de los probiticos son los criterios
de seguridad, dado que los microorganismos introducidos pueden aumentar
determinadas actividades enzimticas que, en exceso, pueden resultar perjudiciales
(como parece ser el caso de la desconjugacin y deshidroxilacin de sales biliares)
(Salminen y cols., 1998b). Ms preocupante an es la posibilidad de que en ciertas
circunstancias puedan actuar como patgenos oportunistas causando enfermedades;
aunque en el caso de las bacterias del cido lctico ms tpicas esto slo parece ocurrir
cuando hay graves patologas subyacentes (Gasser, 1994; Marteau, 2001).
Consideraciones de este tipo se han tenido en cuenta a la hora de escoger las
pruebas a las que se sometieron los distintos aislados de bifidobacterias y lactobacilos
en la segunda parte del trabajo. Como resultado final, disponemos de pequeo grupo
de cepas que presentan algunos de los criterios in vitro ms reconocidos de los
microorganismos probiticos (Collins y cols., 1998; Parodi, 1999; Dunne y cols., 2001;
Reid y cols., 2003; Saito, 2004). Faltan por ensayar ahora los requisitos tecnolgicos
(Mattila-Sandholm y cols., 2002), determinantes a la hora de su posible aplicacin
industrial; as como y probar sus efectos beneficiosos en modelos animales y en
futuros ensayos clnicos.
Pensamos que, de forma global, a pesar de preliminares, los resultados y
conocimientos que se derivan de este estudio pueden ser interesantes para profundizar
en la relacin de las poblaciones intestinales con la salud en los individuos de nuestra
comunidad. Una vez que conocemos unos valores normales de referencia, stos se
pueden comparar con los que presenten otros subgrupos de la poblacin (personas

128

Discusin general

mayores, pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal, etc.). En ltimo trmino los
conocimientos pueden ser la base para aprovechar en toda su potencialidad los
beneficios de los probiticos (mediante la utilizacin de microorganismos especficos),
los prebiticos (seleccionando compuestos que favorezcan el crecimiento de nuestras
poblaciones beneficiosas) y dems alimentos funcionales. Para ello sern necesarios
ms estudios que, dada la complejidad del ecosistema intestinal, habrn de ser
necesariamente interdisciplinarios para tratar de correlacionar la presencia de
determinados tipos microbianos con actividades y efectos en el hospedador; as como
establecer su relacin con la salud.

129

Conclusiones

1. En los individuos de este estudio, los recuentos microbianos mayoritarios en


heces correspondieron a microorganismos anaerobios estrictos de los grupos de
los clostridios, bifidobacterias y bacteoides. En general, estas poblaciones
fueron relativamente estables entre las muestras de un mismo sujeto. Las
poblaciones subdominantes estuvieron representadas por microorganismos
anaerobios facultativos que presentaron mayores fluctuaciones. Para la mayora
de los grupos microbianos se encontraron diferencias estadsticamente
significativas entre los recuentos en los distintos individuos.
2. Los parmetros bioqumicos analizados en heces (actividades enzimticas,
cidos grasos de cadena corta y amonio) mostraron patrones personales por
encima de las variaciones entre muestras. Aunque en algunos casos se
observaron asociaciones puntuales entre los parmetros microbiolgicos y
bioqumicos en heces, no fue posible establecer la naturaleza ni el alcance de
estas relaciones.
3. La comparacin de los microorganismos mayoritarios aislados de heces y los
que detectamos por medio de la construccin y anlisis de libreras gnicas
utilizando cebadores universales, constat que la microbiota mayoritaria
perteneca a la clase de los clostridiales. En particular, fueron abundantes
especies de los gneros Eubacterium, Clostridium y Ruminococcus.
4. Los recuentos microbianos de la mucosa intestinal, igualmente caractersticos
de cada sujeto, fueron inferiores a los de heces, aprecindose una reduccin en
la relacin de las poblaciones anaerobias estrictas respecto a las anaerobias
facultativas y aerobias. Sin embargo, mediante deteccin molecular se constat
la

presencia

de

microorganismos

anaerobios

estrictos,

principalmente

relacionados con los clostridiales, que no se haban encontrado entre los


aislados mayoritarios de las placas de cultivo.

130

Conclusiones

5. Se ha puesto de manifiesto la existencia de una gran heterogeneidad entre


individuos en las poblaciones de bifidobacterias y lactobacilos. Aunque el
nmero y las especies microbianas fueron caractersticas para cada persona,

Bifidobacterium longum y Bifidobacterium pseudocatenulatum aparecieron


como las especies de bifidobacterias mayoritarias en heces y mucosa intestinal,
con una buena correspondencia entre los resultados de los aislamientos y la
deteccin molecular. La variabilidad entre las cepas de estas dos especies fue
escasa dentro de cada individuo.
6. En los aislados de bifidobacterias y lactobacilos se estudiaron diversas
caractersticas consideradas importantes para su posible aplicacin como
probiticos. La resistencia a las sales biliares, la resistencia al pH cido y la
capacidad de adhesin a clulas intestinales resultaron muy variables entre las
distintas especies y cepas.
7. Varias cepas seleccionadas de lactobacilos y bifidobacterias mostraron actividad
inhibitoria frente a diversos patgenos, como Salmonella, Escherichia,

Staphylococcus y Listeria. Adems, una cepa de Bifidobacterium longum secreta


al medio algn tipo de compuesto, activo en sobrenadantes neutralizados, con
actividad antimicrobiana frente a bacterias de su misma especie.
8. En las cepas examinadas no se detectaron actividades enzimticas consideradas
nocivas, pero algunos aislados presentaron resistencias a diversos antibiticos
(tetraciclina, eritromicina y/o clindamicina). Los niveles de las CIM indican
resistencias atpicas que pudieran estar codificadas en elementos transferibles.
9. Como resultado de estos trabajos se han seleccionado tres cepas de
bifidobacterias (cepas L48 y L51 de B. catenulatum y cepa L25 de B. longum) y
tres de lactobacilos (cepas B63 y F76 de L. casei y cepa F71 de L. gasseri) con
caractersticas probiticas in vitro deseables y un gran potencial de uso prctico
en el futuro.

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Ali

AM,

Shuhaimi

Zoetendal EG, Collier CT, Koike S,

1998.

Mackie RI, Gaskins HR. 2004. Molecular

Characterization and antimicrobial spectrum

ecological analysis of the gastrointestinal

of bifidocin B, a bacteriocin produced by

microbiota: a review. J Nutr 134: 465-472.

Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J Food

Prot 61: 47-51.

Isolation and characterization of a new

bacteriocin from Lactobacillus gasseri KT7.

Yildirim

Z,

Johnson

MG.

Yildirim Z, Winters DK, Johnson MG.

1999. Purification, amino acid sequence

Zhu WM, Liu W, Wu DQ. 2000.

J Appl Microbiol 88: 877-886.

and mode of action of bifidocin B produced


by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J

Appl Microbiol 86: 45-54.

Young JPW, Downer HL, Eardly BD.

1991.

Phylogeny

of

the

prototrophic

Rhizobium strain BTAil by polymerase chain


reaction-based sequencing of a 16S rRNA
segment. J Bacteriol 173: 2271-2277.

Zoetendal EG, Akkermans AD, de Vos

WM.

1998.

Temperature

gradient

gel

electrophoresis analysis of 16S rRNA from


human fecal samples reveals stable and
host-specific

communities

of

active

bacteria. Appl Environ Microbiol 64: 38543859.

Zoetendal

EG,

Akkermans

ADL,

Akkermans-van Vliet WM, de Visser JAGM,


de Vos WM. 2001. The host genotype
affects the bacteria community in the
human gastrointestinal tract. Microb Ecol

Health Dis 13: 129-134.

152

Anexos

Anexos. Datos generales, hbitos alimentarios y estado de salud intestinal de los


individuos donantes de las muestras del estudio.

INDIVIDUO A
Edad

45

Talla

1,73

Peso

84

Sexo

Hombre
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Consumo de pescados:

Hbitos alimenticios

Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Tres/da
Frutas y verduras frescas

1/semana

Leguminosas

1/semana

Patatas

Diario

Pan y cereales

Diario

Pescado azul

1/semana

Pescado blanco

1/semana

Ternera

1/semana

Cerdo

2/semana

Aves

1/semana

Mantequilla

Aceite

5/semana

Margarinas
Consumo de productos lcteos:

Diario

Otras

Leche

Diario

Yogures y quesos

Consumo de bebidas:

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Diario

Refrescos

Bebidas alcohlicas

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Deposicin
Tratamiento con antibiticos

2/semana

1/semana

Gases

Si

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

153

Anexos

INDIVIDUO B
Edad

43

Talla

1,53

Peso

51

Sexo

Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Tres/da
Frutas y verduras frescas

4/semana

Leguminosas

2/semana

Patatas

1/semana

Pan y cereales
Consumo de pescados:

Hbitos alimenticios

Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Diario

Pescado azul

1/semana

Pescado blanco

1/semana

Ternera

1/semana

Cerdo

1/semana

Aves

1/semana

Mantequilla

Aceite

Diario

Margarinas
Consumo de productos lcteos:

2/semana

Otras

Leche

Yogures y quesos

Consumo de bebidas:

4/semana

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Diario

Refrescos
Bebidas alcohlicas

Diario (cerveza
o vino)

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Deposicin
Tratamiento con antibiticos

154

Gases

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

Anexos

INDIVIDUO C
Edad

46

Talla

1,87

Peso

105

Sexo

Hombre
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas

5/semana

Patatas

4/semana

Pan y cereales
Consumo de pescados:

Hbitos alimenticios

Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Consumo de bebidas:

Salud intestinal

Molestias intestinales:

1/semana

Pescado blanco

1/semana

Ternera

1/semana

Cerdo

2/semana

Aves

3/semana

Mantequilla

Diario

Margarinas

Otras

Leche

Diario

Yogures y quesos

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Refrescos

Bebidas alcohlicas

Gases

Si

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento
Uso de anticidos
Deposicin
Tratamiento con antibiticos

Diario

Pescado azul

Aceite

Consumo de productos lcteos:

Diario

Leve
-

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

155

Anexos

INDIVIDUO D
Edad

41

Talla

1,53

Peso

56

Sexo

Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Tres/da
Frutas y verduras frescas

Diario

Leguminosas

3/semana

Patatas

1/semana

Pan y cereales
Consumo de pescados:

Hbitos alimenticios

Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Diario

Pescado azul

1/semana

Pescado blanco

1/semana

Ternera

2/semana

Cerdo

2/mes

Aves

1/semana

Mantequilla

Aceite

Consumo de productos lcteos:

Diario

Margarinas

Otras

Leche

Yogures y quesos

Consumo de bebidas:

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Diario

Refrescos

Bebidas alcohlicas

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Diario (cerveza)

Gases

Ocasional

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos
Deposicin
Tratamiento con antibiticos

156

Diario

Ocasional

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

Anexos

INDIVIDUO E
Edad

38

Talla

1,62

Peso

59

Sexo

Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas

4/semana

Patatas

2/semana

Pan y cereales

Hbitos alimenticios:

Consumo de pescados:
Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Consumo de bebidas:

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Deposicin
Tratamiento con antibiticos

Diario

Pescado azul

1/semana

Pescado blanco

2/semana

Ternera

2/semana

Cerdo

3/semana

Aves

Mantequilla

Aceite

Consumo de productos lcteos:

Diario

Diario

Margarinas

Otras

Leche

Diario

Yogures y quesos

Diario

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Diario

Refrescos

Bebidas alcohlicas

Gases

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

157

Anexos

INDIVIDUO F
Edad

57

Talla

1,70

Peso

89
Hombre
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Hbitos alimenticios:

Consumo de pescados:
Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Tres/da
Frutas y verduras frescas

Diario

Leguminosas

Diario

Patatas

Diario

Pan y cereales

Diario

Pescado azul

1/semana

Pescado blanco

1/semana

Ternera

2/semana

Cerdo

Aves

Mantequilla

Aceite

Consumo de productos lcteos:

Consumo de bebidas:

Diario

Margarinas

Otras

Leche

Diario

Yogures y quesos

Diario

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Diario

Refrescos

Bebidas alcohlicas

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Deposicin
Tratamiento con antibiticos

158

Diario (vino)

Gases

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

Anexos

INDIVIDUO G
Edad

66

Talla

1,68

Peso

80

Sexo

Hombre
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Consumo de pescados:

Hbitos alimenticios

Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Consumo de productos lcteos:

Ms tres/da
Frutas y verduras frescas

Diaria

Leguminosas

Diaria

Patatas

Diaria

Pan y cereales

Diaria

Pescado azul

1/semana

Pescado blanco

3/semana

Ternera

4/semana

Cerdo

2/semana

Aves

Mantequilla

Diario

Aceite

Diario

Margarinas

Otras

Leche

Yogures y quesos

Consumo de bebidas:

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Refrescos

Bebidas alcohlicas

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Deposicin
Tratamiento con antibiticos

Diario (queso)

Diario (vino)

Gases

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

159

Anexos

INDIVIDUO H
Edad

36

Talla

1,67

Peso

58

Sexo

Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas

3/semana

Patatas

1/semana

Pan y cereales

Hbitos alimenticios:

Consumo de pescados:
Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Consumo de productos lcteos:

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Deposicin
Tratamiento con antibiticos

160

Diario

Pescado azul

1/semana

Pescado blanco

2/semana

Ternera

1/semana

Cerdo

1/semana

Aves

1/semana

Mantequilla

Aceite

Diario

Margarinas

Diario

Otras

Leche

Diario

Yogures y quesos

4/semana

Leches fermentadas

3/semana

Probiticos
Consumo de bebidas:

Diario

T y caf

Diario

Refrescos

1/semana

Bebidas alcohlicas

1/semana

Gases

A veces

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

Anexos

INDIVIDUO L
Edad

34

Talla

1,75

Peso

77

Sexo

Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas

4/semana

Patatas

6/semana

Pan y cereales
Consumo de pescados:

Hbitos alimenticios

Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

2/semana

Pescado blanco

1/semana

Ternera

2/semana

Cerdo

3/semana

Aves

Mantequilla

1/semana
Diario

Margarinas

Otras

Leche

Diario

Yogures y quesos

Consumo de bebidas:

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Deposicin
Tratamiento con antibiticos

Diario

Pescado azul

Aceite

Consumo de productos lcteos:

Diario

3/semana

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Diario

Refrescos

Bebidas alcohlicas

Gases

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente

161

Anexos

INDIVIDUO M
Edad

40

Talla

1,55

Peso

56

Sexo

Mujer
Frecuencia de comidas
Consumo de carbohidratos:

Tres/da
Frutas y verduras frescas
Leguminosas

Consumo de pescados:

Hbitos alimenticios

Consumo de carnes:

Consumo de grasas:

Consumo de bebidas:

Salud intestinal

Molestias intestinales:

Deposicin
Tratamiento con antibiticos

162

5/semana

Patatas

Diario

Pan y cereales

Diario

Pescado azul

1/semana

Pescado blanco

2/semana

Ternera

2/semana

Cerdo

1/semana

Aves

Mantequilla

Aceite

Consumo de productos lcteos:

Diario

Diario

Margarinas

Otras

Leche

Diario

Yogures y quesos

Diario

Leches fermentadas

Probiticos

T y caf

Diario

Refrescos

Bebidas alcohlicas

Gases

Diarreas

Dolores intestinales

Estreimiento

Uso de anticidos

Diaria, normal y sin problemas


No recientemente