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H.EG. NO.

083559926

1990-B

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
l

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ANTICUERPOS ANTINUCLEARES OCULTOS EN SUEROS


DE PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO

(L E S)

TESIS
QUE

PARA

PROFESIONAL
OBTENER

LICENCIADO

EN

EL

TITULO

DE

BIOLOGIA

PRESENTA

JULIA RDDRIGUEZ GARCIA


DIRECTOR DE TESIS: Q.F.B. SILVIA MEJIA ARREQUIN
GUADALAJARA, JALISCO

1992

AGRAOE C I MI E NT OS

A MI MAMA Y MIS HERMANAS


POR BRINDARME SU APOYO Y SU PACIENCIA.

QFB

SILVIA MEJIA ARREQUIN

POR DARME ALGUNOS DE SUS TANTOS


CONOCIMIENTOS, GUIARME EN ESTE TRABAJO
Y BRINDARME SU AMISTAD.

M EN C ERENDIRA
POR SU_AMISTAD Y SUS
ACERTADOS CONSEJOS.

OFB

RODOLFO

POR LA ORIENTACION Y SUS CONOCIMIENTOS


QUE VINIERON A COMPLEMENTAR LA
TERM!NACJON DE ESTE TRABAJO.

OE O1 C A T OR I A

ESTE TRABAJO SE LO DEDICO A TODOS LOS PACIENTES CON


LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO

( L E S ), QUE COOPERARON

PARA QUE SE LLEVARA A CABO ESTE TRABAJO CON ALGUNA


ESPERANZA PARA MANTENERSE EN PIE Y SEGUIR LUCHANDO
POR LO MAS BELLO QUE PUEDA EXISTIR:

"LA VIDA".

REPORTE DE ANOMALIAS
CUCBA

A LA TESIS:

LCUCBA00322

Autor:

Rodriguez Garcia Julia

Tipo de Anomala:

Errores de Origen: Faltante de lndice de contenido

C AP I T U L O

INTRODUCCION

El lupus eritematoso sistmico es una enfermedad inflamatoria aguda o

~r6nica.

autofnmune, en la cual los pacien--

tes desarrollan anticuerpos dirigidos contra sus propios antgenos.

La enfermedad afecta predominantemente a las muje-

res (1:4) y es ms frecuente en la raza negra (14).

El origen del lupus eritematoso sistmico (LES), no est definido; pero se sabe que estn involucrados factores g~
nticos. inmunolgicos, virales y ambientales (9).

Entre los trastornos inmunolgicos que presenta el pa-ciente, adems de la formacin de autoantjcuerpos, est la disminucin de.los linfocitos T y aumento de los B; que son
las celulas productoras de anticuerpos.

Aunque cuantitativ~

mente no se ha informado de la e1evacin de los cniveles de inmunoglobulinas en forma especfica de acuerdo al tipo de anticuerpos que presentan estos pacientes (2).

Durante el desarrollo de la enfermedad destaca la pre-sencia de una gran variedad de anticuerpos en el suero; que
precipitan en fro (crioglobulinas) y que son agregados de IgG, IgM

de

co~plemento

(factores de activacin)

(26).

Uno de loa anticuerpos que se han encontrado en el

su~

ro de estos pacientes con LES, es el que est dirigido contra


el AON nativo de doble cadena ( ADNn).

Adems de la determi-

nacin de los anticuerpos anti-ADNn; la demostracin de la


disminucin total del complemento o la disminucin de las - fracciones C3 y C4 son de gran valor para el diagnstico de este padecimiento (26, 24).

Kunkel, uno de los pioneros en el estudio de las alteraciones inmunolgicas en el LES, describe a los autoanticuer-pos que se encuentran en la enfermedad y los divide de manera
general en dos grupos:

A.

Aquellos que estn dirigidos contra antgenos nuclea


res y citoplasmticos.

B.

Los que estn dirigidos a rganos especficos:

ant

genos tiroideos. de msculo, hgado, estmago,

supr~

rrenales (18).

En las enfermedades autotnmunes es de gran valor la de-terminacin de los anticuerpos antinucleares

AN ), espe--

cialmente en el prototipo de ellas, LES; si~ embargo, exist?


una pe~uena proporcin de pacientes, donde los anticuerpos
antinucleares dan resultados falsos negativos por los mtodos
tradicionales { inmunofluorescencia indirecta,

utiliz~ndo

--

como substrato antignico hgado de rata ) ; esto provoca desconcierto. en el diagnstico Y pronstico del padecimiento.

Estos casos son denominados "seronegativos"

(21).

El por qui de los resultados falsos negativos no estaclarado, aunque algunos Investigadores citan que estas rea~
ciones podran haberse producido por la ausencia de algn
factor srico o deberse al exceso de alguno de ellos (14).

Viendo la frecuencia con la que se presentan estas reaf


ciones, se implement la tcnica de inmunofluorescencia indl
recta, utilizando como substrato antignico, clulas HEp-2 y
cortes de hgado de rata y se revel la unin antgeno-anticuerpo con antisueros del tipo IgG y C3, marcados con

isoti~

cianato de fluorescena donde la tcnica presenta una mayor


senstbiltdad para C3, dando un alto porcentaje de casos posl
ttvos, no asf para lgG (11).

C A P I T U L. O

I I

ANTECEDENTES

La historia de los anticuerpos antinucleares. se inici


con la descripcin de las clulas LE (polimorfonucleares que
fagocitan linfocitos ) en 1948 por Maleen Hargraves y colab~
radares; sta fue la primera evidencia de un anticuerpo que
pareci reaccionar con el nQcleo de una c~lula autloga. lsf
como heterloga.

Aunque esta prueba se utiliza ampliamente

hasta la actualidad, tiene sus limitaciones en lo que

respe~

ta a su realizacin, su pobre cua~tificacin y su tnterpret~


cin hasta cierto punto subjetiva (.lO).

Desde 1954, se localizaron en el suero de estos pacientes con LES, varios anticuerpos poco frecuentes.

q~e

actaan

en contra de los propios tejidos de1 paciente (23).

En 1957, Friuo di a conocer la tcnica "anticuerpos


antinucleares fluorescentes" ( FANA ) .
riz el estudio de los pacientes con

Mtodo

sos~echa

que estandade alguna en--

fermedad del tejido conjuntivo (6).

Desde hace 20 aos, el uso de inmunofluorescencia indirecta para la deteccin de los anticuerpos antinucleares - ( AAN ), en el suero de los pacientes con enfermedades

reum~

ticas generalizadas, se ha venido utilizando de manera rutinaria en diversos hospitales.

Inicialmente se utilizaron --

cortes de tejidos de mamferos como substrato antignico y esto se sigue haciendo en la mayora de los lugares. utili-zando fundamentalmente cortes de hgado y riHn de rata. PO!
ter.iornente se ha introducido el uso de diversas 1 ineas ce l.!!_
lares como substrato antignico, entre los cuales. las ms usadas son los fibroblastos de ratn y las clulas HEp-2.

Con el uso de estos ltimos substratos existe la ventaja de que se suprime la fluorescencia inespecifica, que con
frecuencia se observa al utilizar tejidos de mamferos, ya que con las lneas celulares se tienen clulas individuales
desprovistas de tejido conjuntivo intracelular (28).

El lupus eritematoso sistmico es una enfermedad reumtica autoinmune en la cual se ha encontrado anti:cuerpos diri
gidos contra diversos componentes del ncleo, nucleolo y citoplasma celular.

Su concentracin y especiftctdad, son

co~

troles in val uabl es para el tratamiento, manejo y pronstico


del paciente (22).

Estos anticuerpos pueden clasificarse de acuerdo a su


especificidad:

anti-Sm { anticuerpo

di~igido

a riboprote--

nas Y se encuentra en LES ), anti-ADN ( anticuerpo dirigido


contra el ADN y se encuentra en LES ), anti-RNP ( anticuerpo
dirigido a ribonucleoproteinas y se encuentra en la enfermedad mixta del tejido conjuntivo )

y RAP (anticuerpo que se-

encuentra en artritis reumtica (4).

La valoracin de los anticuerpos antinucleares ( AAN )


se da en crus;es depend ende de su concentracin ( +,,. ++++).

La presencia de anticuerpos antinucleares dirigidos


contra el ADN nativo de doble cadena ( ADNn ), se considera
que es exclusivamente de pacientes con LES, mientras que
aquellos de ADN de una sola cadena, se pueden encontrar en
otras enfermedades reumticas.

Los ttulos de anticuerpos anti-ADN se han correlacionado estrechamente con la actividad de la enfermedad; anticuerpos que disminuyen al iniciar el tratamiento con inmunQ
supresores y que hay una elevacin de los mismos al exacerbarse los sntomas (3).

El lupus eritematoso sistmico es una enfermedad difcil de diagn6sticar en su inicio.


zan con tromboci topenia (. TP ) .

Algunos pacientes empieLa trombocitopenia que

pr~

cede al LES es dificil de diferenciar de la TP de otros orf


genes; lo que
dos.

~etarda

el diagnstico y tratamiento adecua--

En pacientes con trombocitopenia que precede al LES,

los anticuerpos antinucleares suelen ser negativos; por esta razn no puede predecirse cules pacientes con TP desa-rrcillar<in LES, posteriormente (27).

CAP 1 T UL O

1 I I

HIPOTESIS

La deteccin de anticuerpos antinucleares l AAN ), en


pacientes con LES seronegativos, es ms eficiente cuando se detectan los complejos inmunes en substratos antigni-cos de clulas HEp-2 y cortes de hgado de rata, al ser rf
velados con anti-C3.

CAP I T UL O

I V

11

OBJETIVO

Demostrar en sueros de pacientes con LES, la sensibilidad de la tcnica de inmunofluorescencia indirecta.

utiliza~

do como substrato antignico clulas HEp-2 y revelados con anti-C3,


tivos.

ya

que por los mtodos tradicionales resultan nega-

CAP I TUL O

13

JUSTIF ICAC ION

En algunos pacientes con lupus eritematoso sistmico, no se detectan anticuerpos antinucleares, por lo que se les
denomina "seronegativos".

Viendo la frecuencia con la que -

se presenta este problema, se decidi realizar un estudio


tendiente a evaluar una.alternattva de laboratorio, con la cual, los anticuerpos antinucleares ocultos sean revelados y
a la vez aportar un dato para el mejor manejo de estos
ci entes.

pa~

--------------------------~------~-~-

CAPITULO

VI

15

MATERIAL Y METODOS

Se estudiaron 40 pacientes con LES, provenientes del


tro Mdii:o de Occidente.

Ce~

38 fueron sexo femenino y 2 del sexo

masculino, con edades comprendidas entre 17 y SZ aos ( edad


promedio de 37 aos ).

Todos los pacientes se encontraron en

remisin (.sin sntomas ) bajo tratamiento de prednizona, clQ.


roquina y peroxican.

Como testigos se estudiaron 10 sujetos

clnicamente sanos.

Obtencin de muestras

Se tomaron 10 ml. de sangre venosa perifrica en jeringa


desechable, la cual se depos1t en un tubo de ensayo y se dej

retraer el cogulo para obtener el suero.

tom una alicuota para

~eterminar

De inmediato se

las fracciones C3 y C4 del

complemento, el resto se congel a -20C

hasta el momento de

realizar las pruebas de inmunofluorescencia.

As mismo se

tom un fragmento de hgado de ratn de la cepa Balb/C sacrificados por descerebracin.

El fragmento de hgado de rata -

se mont en una.platina metlica con una base de gel


Tek Clay Adams 9001085 ).

Tissu-

Se conservaron dentro del criosta-

to a una temperatura de -25C

hasta que se hicieron los cor--

tes de 4 micras para ser estudiados corno substrato antignico.

Las placas de clulas HEp-2 fueron un donativo del labo-

16

ratoro de anlisis clfncos del Hospital de Pediatra {IMSS).

Inmunodifusin radial

Utilizada para cuantificar las fracciones C3 y C4 del complemento.

Enseguida de obtener el suero, se colocaron 10

microlitros en cada pocillo de las cajas de inmunodifusin ( Norpartigen J. se dejaron reposar a temperatura ambientepor 24- 48 horas.

La lectura de la inmunodifusin se hace

con la ayuda de una lupa graduada por medio de la cual se oQ.


tiene una cifra correspondiente al dimetro de la difusin,
esta cifra

~e

lleva a tablas con valores ya establecidos por

la casa fabricante.

Dicha lectura da concentraciones en

gr~

mos por litro (8).

Inmunofluorescencia indirecta

Se diluy el suero de los pacientes y controles con PBS


(1:5) y se colocaron 10 microlitros de la dilucin sobre los
cortes de hgado de rata y clulas HEp-2, las cuales son fijados previamente en

~cetona

por lO minutos,

se incubaron -

30 minutos a temperatura ambiente en cmara hmeda, se lavaron dos veces con PBS por 5 minutos en los recipientes de
Koplin con agitacin suave, se elimin el PBS y los cortes
de higado de rata y clulas HEo-2 se cubrieron con 10 microlitros de anti-C3 y de anti-lgG humana en cabra conjugada
con FITC ( isotiocianato de fluorescena ), se incubaron __

17

durante 30 minutos en cmara hmeda a temperatura ambiente. Se lavaron los

cort~s

de hfgado y clulas HEp-2 dos veces con

PBS por 5 minutos, se dejaron estilar

se cubrieron con

un~

gota de glicerina amortiguada entre porta y cubreobjetos. las


preparaciones se observaron al microscopio de fluorescencia.

18

FLUJOGRAMA
SANGRE VENOSA
PERIFERICA ( 5 m1.)

SUERO

1 :5 )

CELULAS HEp-2
CARCINOMA LARINGEO )

CORTES DE HIGADO DE
RATA Balb/C

INCUBACION EN CAMARA
HUMEDA 30 MIN. TEMP. AMBIENTE l TA )

l
DOS LAVADOS CON PBS

ANTI -C3 ANTI- I gG


INCUBACION EN CAMARA HUMEDA
30 MIN. TEMP. AMBIENTE

DOS LAVADOS CON PBS

OBSERVACION AL MICROSCOPIO DE
FLUORESCENCIA

CA~ I T ULO

V1 I

----------------------------------

---

20

RESUL TAO OS

,..

En la tabla No. l se observa que al utilizar como substr-.


to antignico clulas HEp-2. el 47.5% de sueros de pacientes -

'

con

~ES

fueron positivos para IgG y el 77.5% con anti-C3. Cuan

do se utiliz como substrato hgado de rata. 30% de los sueros


fueron positivos para IgG y el 46,7% lo fueron para C3.

Estos resultados muestran una elevacin importante de la


positividad de los sueros de los pacientes con LES cuando se utiliza como substrato las clulas HEp-2. puesto que el 52.5%
de los sueros fueron negativos para IgG y el porcentaje de negatividad se redujo al 22.5% al utilizar anti-C3.

Los result-.

dos con higado de rata muestran una similitud en su comporta-miento con antt-IgG y C3.

Aunque los porcentajes de positivi-

dad fueron ms bajos 30% y 46.7% respectivamente. los cuales no son significativos.

Para apoyar estos resultados. realizamos algunas pruebas


estadsticas como son: x2 para saber si habfa significancia entre nuestros porcentajes, los cuales se observan en las ta-blas No. 2 y 3.

Tambin se realiz la prueba de comparaciones

de Cok Man para observar la sensibilidad de los dos substratos;


as como de los dos antisueros utilizados, esto lo podemos observar en la tabla No. 4 y 5.

21

Los patrones de inmunofluorescencia observados con mayor


frecuencia fueron el homogeneo ( se observa fluorescencia difusa

di~tribuida

uniforme en todo el ncleo ) y el granular -

fino ( el ncleo de las clulas muestran una apariencia finamente granular ) segn se muestran en las fotografas No. 1 y
2.

En la medicin de las fracciones C3 y C4 en el suero de


los pacientes con LES, no se muestra ninguna alteracin; las
cifras se encuentran normales con respecto a los valores de r~ferencia.

La media que se obtuvo en C3 fue de X

= 1.35

y -

la de C4 fue de X = 0.45 y la desviacin estandar fueron para


C3 de 0.47 y para C4 de 0.293, estos datos se compararon por
medio de una T estuden y no obtuvimos ninguna significancia.
E~to

se observa en la tabla No. 6 en donde solo se grafic

los valores de C3 por ser .los ms importantes para nosotros.

CAPITULO

V I I l

22
TABLA No.

Porcentajes obtenidos de casos positivos y negativos, utilizando los dos substratos; clulas HEp-2 y cortes de hg9.,
do. de rata y los dos

~ntisueros

anti-lgG y anti-C3.

No. de casos positivos y negativos y sus porcentajes.

Clulas HEp-2

Hgado de rata

C3

C3

IgG

14/46.7%

9/30%

16/53.5%

21/70%

l gG

+ 31/77.5%

19/47.5%

9/22.5%

21/52.5%

Total

40

Nota

40

30

30

40 y 30 son los totales de muestras uti ]izadas en


cada substrato.

-------------------------------------------------------------------------------

23
TABLA No. 2
Significancia y diferencias de positividad.
En este cuadro observamos que con el substrato de clulas
HEp-2 y con los dos antisueros anti-IgG y anti-C3 obtuvimos 50
pruebas positivas con una significancia de P 0.01.

Total

HEp -2

HEp-2

C3

IgG

31

19

50 Pruebas positivas

21

30 Pruebas negativas

40

80 Pruebas totales

40
x2 ( 1 J = 7.68

o .o 1

En este cuadro observamos que la positividad en hfgado de


rata con los dos antisueros anti-!gG y anti-C3, se redujo a menos de la mitad de las pruebas pos.itivas obtenidas en el subs-trato de clula HEp-2. Obtuvimos solo 23 pruebas positivas, no
siendo significativo (NS).
Hg. Rata

Total

Hig. Rata

C3

lgG

14

23 Pruebas positivas

16

21

37 Pruebas negativas

30
2

30

60 Pruebas totales

x l11'= 1. 76

NS.

,-----------------------------------------------------------------------

----

24
TABLA No. 3

En este cuadro observamos que con el anti-C3 en los dos


substratos ( clulas Hep-2 y hgado de rata ) , obtuvimos 45
pruebas positivas dndonos una significancia de p O.Oi.
HEp-2

Hg. Rata

C3

C3

31

14

45 Pruebas positivas

16

25 Pruebas negativas

30

70 Pruebas totales

Total

40
x2 (1)- 7.10

o.01'

En este cuadro se observa el anti-Ig& en los dos substratos ( clulas HEp-2 y cortes de hgado de rata ), obteniendo 28 pruebas positivas. No siendo significativo .

HEp -2

. Hig. Rata

IgG

lgG

19

28 Pruebas positivas

21

21

42 Pruebas negativas

40
x2 ( 1)

30

70 Pruebas totales

Total

2.19

NS

25
TABLA No. 4
Comp~raciones entre los dos substratos y los dos antisueros para observar la sensibilidad del mtodo.

En esta tabla se observa que se di una distribucin ale~


toria en los dos substratos ( hgado de rata y clufas HEP-2 ),
como podemos ver en la primera comparacin en donde comparamos
anti-IgG con anti-C3 en clulas HEp-2, dndonos 16 casos positivos y 6 negativos para los dos antisueros. Observamos que para anti -IgG 15 casos son negativos; pero al ser revelados
con anti-C3 estos casos resultan positivos. Estos 15 casos de
los 40 que s~ utilizaron amo un total de las muestras nos dan
un 37.5% de mayor sensibilid~d para anti-C3. Solo se obtuvieron 3 casos negativos para anti-C3.
Este proceso se sigue en todas las dems comparaciones
realizadas {_2, 3, 4).
(1)

HEp -2

IgG
+

HEp -2
C3

h~~.,-_;;:,....,_-~

Simbolo.gia

37.5%,sensibilidad para
anti-C3, P:? 0.01

Casos negativos para anti -C3


Distribucin aleatoria

c===J

26

TABLA No. 5
(2)

Hig. Rata

C3
+

HEp-2

40%~

sensibilidad HEP-2

p;- 0.01

C3

Hg. Rata

(3)

IgG
+
HEp~2

26.7% ;>sensibilidad HEp-2

NS

IgG

(4}

Hg. Rata
IgG
+

Hg.
rata

C3

__

30~6

> sensibi 1 idad


anti-C3.

NS

para

27

No. 1
Patrn Homogneo

No. 2 Patrn Granular fino

28
TABLA No. 6

Valores promedio de la fraccin C3 srica y su desviacin estandar.

C3 g/L

3.0

2.0

1.0

Pacientes
~ =

40

Controles
N = 10

x = 1. 35

x = 1.5 7

S = 0.47

Valores normales de C3 = 1.2 - 1.8

= O. 49

C A P I T UL O I X

30

DISCUSION

Este trabajo confirma lo descrito por otros autores en


el sentido de que existen dos grupos de pacientes con LES;
unos seropositivos por los mtodos convencionales para de-tectar anticuerpos antinucleares y otros que son seronegati
vos por los mismos mtodos. (27.

En un trabajo previo de Vzquez y Gmez, se describi


una modificacin para li! deteccin de anticuerpos antinu-cleares t AAN ), ocultos en pacientes con LES

seronegativ~.

en ese estudio se agregaba C3 fresco para amplificar y elevar la positividad de las reacciones. (13).

En el presente trabajo se uetect que el propio suero


del paciente contiene anticuerpos que fijan C3 y que debido
a ello es posible detectar los anticuerpos que de no ser
por la capacidad de fijar complemento, seguirfan ocuTtos y
darfan lugar. a ser considerados como seronegativos, dificul_
tando de esta manera, el diagnstico y pronstico de los
pacientes con LES que clfnicamente se comportan como portadores del padecimiento.

La causa por la cual estos anticuerpos antinucleares ocultos no son detectables por los mtodos convencionales,
se est analizando.

31

Para explicar el fenmeno se tienen varas alternatv.as,


una de ellas podra ser que los AAN no pueden ser reveladoscon los antisueros .correspondientes, debido a un impedimento
estrco que bien podra ser la fijacin de la molcula deC3 que no permite l enlace de manera adecuada en la reac- cin AAN-anticuerpo, pero que al agregar el anti C3 si se -realiza su identificacin.

CAP I T UL O

33

CONCLUSIONES

l.

La tcnica utilizada en este trabajo result un 40% ms


eficiente en el revelado de anticuerpos antinucleares en LES.

2.

Las clulas HEp-2 demuestran una mayor sensibilidad que


16s cortes de hfgado. de rata en la deteccin de los AAN
ocultos. revelados con anti-C3.

3.

Los AAN revelados con anti-C3 pueden ser una ayuda para
el mdico en la orientacin del diagnstico y tratamien.
to del paciente.

4.

Los pacientes con LES en remisin presentan normales


sus valores de las fracciones C3 y C4.

'

C AP I T UL O

XI

35

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Seccin .................. .

UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA

Expediente

FACULT.-\0 DE CIENCIAS BIOLOGICAS


~lTlero

................. .

C. JULIA RODRIGUEZ GARCIA.


P R E S .E N T E . Manifestamos a

sido aprobado

OCULTOS EN
(LES) "

el

tema de

Tesis

SUEROS DE PACIENTES CON

Al

mismo

ust~d.

que

con esta

fecha ha

"ANTICUERPOS ANTINUCLEARES
LUPUS ERYTEMATOSOS SISTEMICO

tiempo le

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Arrequin.
T E N T ~ M E ~l T E
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Q.F.B. Silvia Mejia ;..nequin ... =:::::.::}

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Boulevard General :uar.,.,lino Garcia Barraglin y Corregidora, SR., Tels. 19-8054 Y 19-a2-92, Fax (361 50-3~. Guadalajara. Jal.

INSTITUTO MEXICANO DEL SEGURO SOCIAL

UNIDAD DE INVESTIGACION BIOMEDICA DE OCCIDENTE


DIVISION DE PATOLOGIA. LAB. DE INMUNOPATOLOGIA

M en C Carlos Beaa Zrate


Director de la Facultad de
Cienci.es

Biol6~icas

Universidad de

de la

Guadalajar~a

P R E S E N T E

APt'eciable

~laestra

Beas por

es~e

iniormarle que la P. de Biol. JULIA RODRIGUEZ GARCIA ha


satisfactot~iamente

el

traba.io

tsis

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titulado:

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ANTINUCLEARES OCULTOS EN SUEROS DE PACIENTES CON LUPUS ERITEMATOSO


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de pt'oqramar la presentacin de su exmer1 de Tesis y Profesional.

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saludo~

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