O Mtodo e as Tcnicas

Cromatogrficas
Este um apanhado de informaes para nortear uma introduo geral no
Mtodo Cromatogrfico para os alunos de Etnobotnica e Quimiotaxonomia
Aplicada a Biodiversidade Molecular.

I.

INTRODUO

A Cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao.

Ela est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma
mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases
imiscveis, a fase mvel e afase estacionria.
A grande variedade de combinaes entre fases mveis e estacionrias a
torna uma tcnica extremamente verstil e de grande aplicao.
O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua
utilizao atribuda a um botnico russo ao descrever suas experincias na
separao dos componentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a
passagem de ter de petrleo (fase mvel) atravs de uma coluna de vidro
preenchida com carbonato de clcio (fase estacionria), qual se adicionou
o extrato, levou separao dos componentes em faixas coloridas. Este
provavelmente o motivo pelo qual a tcnica conhecida como
cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar errnea
idia de que o processo seja dependente da cor.
Separao cromatogrfica de substancias de folhas

Apesar deste estudo e de outros anteriores, que tambm poderiam ser

considerados precursores do uso dessa tcnica, a cromatografia foi
praticamente ignorada at a dcada de 30, quando foi redescoberta. A partir
da, diversos trabalhos na rea possibilitaram seu aperfeioamento e, em
conjunto com os avanos tecnolgicos, levaram-na a um elevado grau de
sofisticao, o qual resultou no seu grande potencial de aplicao em
muitas reas.
A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por
comparao com padres previamente existentes, para a purificao de
compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos
componentes de uma mistura, deteco classes metablicas. As diferentes
formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos
critrios, sendo alguns deles listados abaixo:

CLASSIFICAO DAS TCNICAS

CROMATOGRFICAS

1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfico

Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida

em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a
cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (CP),
cromatografia por centrifugao (Chromatotron) e cromatografia em
camada delgada (CCD), so diversos os tipos de cromatografia em coluna,
os quais sero mais bem compreendidos quando classificados por outro
critrio.
2. Classificao pela fase mvel empregada
Em se tratando da fase mvel, so trs os tipos de cromatografia: a
cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia
supercrtica (CSC), usando-se na ltima um vapor pressurizado, acima de
sua temperatura crtica.
A cromatografia lquida apresenta uma importante subdiviso: a
cromatografia lquida clssica (CLC), na qual a fase mvel deslocada
atravs da coluna apenas pela fora da gravidade, e a cromatografia lquida
de alta eficincia (CLAE), na qual se utilizam fases estacionrias de
partculas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso
para a eluio da fase mvel.
A CLAE foi inicialmente denominada cromatografia lquida de alta
presso, mas sua atual designao mostra-se mais adequada.
No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por
cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo
(CGAR). A diferena entre os dois tipos est na coluna. Enquanto na
CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionria um
filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior dimetro
empacotadas com a fase estacionria.
3. Classificao pela fase estacionria utilizada
Quanto fase estacionria, distingue-se entre fases estacionrias slidas,
lquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria ser
constituda por um lquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre
um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados so
considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por
normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separao.
4. Classificao pelo modo de separao
Por este critrio, separaes cromatogrficas se devem adsoro, partio,
troca inica, excluso ou misturas desses mecanismos. Dentre os vrios
tipos de cromatografia, especial nfase ser dada cromatografia em
camada delgada (CCD), cromatografia lquida clssica e de alta eficincia
(CLAE) e cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR).

II. CROMATOGRAFIA PLANA

Na cromatografia plana, a fase estacionria suportada sobre uma placa
plana ou nos poros de um papel. Nesse caso, a fase mvel desloca-se
atravs da fase estacionria por ao da capilaridade ou sob a influncia da
gravidade. til em separao de compostos polares. Encontra-se bastante
difundida devido sua facilidade experimental e ao seu baixo custo.
1. Cromatografia em Papel
Esta tcnica assim chamada porque utiliza para a separao e
identificao das substncias ou componentes da mistura a migrao
diferencial sobre a superfcie de um papel de filtro de qualidade especial
(fase estacionria). A fase mvel pode ser um solvente puro ou uma mistura
de solventes. Este mtodo muito til para separar substncias muito
polares, como acares e aminocidos. Possui o inconveniente de poder-se
cromatografar poucas quantidades de substncia de cada vez.
Manipula-se o papel com cuidado e pelas pontas, e cortam-se tiras em
tamanhos que possam ser contidos nas cubas. importante cortar o papel
seguindo o eixo das fibras, pois a celulose est orientada neste sentido, o
que facilitar a passagem da fase mvel. Os lquidos polares tero grande
afinidade pelas hidroxilas da molcula de celulose, formando pontes de
hidrognio, ficando retido e funcionando como fase estacionria, e os
lquidos menos polares sero repelidos por esta estrutura, funcionado como
fase mvel.
As cubas devero ser perfeitamente fechadas para permitir a saturao
interna. A cromatografia pode ser ascendente ou descendente, sendo que
esta ltima mais rpida e consome menos eluente. 2cm de altura de
eluente na cuba suficiente para a cromatografia ascendente.
Coloca-se a amostra a ser analisada um pouco acima da extremidade
inferior do papel seco, que aps ter esta extremidade inferior mergulhada
numa mistura de solventes, tero os seus constituintes arrastados,
juntamente com esta mistura que tende a subir por capilaridade. Os
diferentes constituintes apresentaro variao na velocidade de
deslocamento, de acordo com os seus coeficientes de partio. Os
componentes menos solveis na fase estacionria (gua) tero uma
movimentao mais rpida. Pode ser utilizado para anlise de mistura de
aminocidos ou misturas de acares. A cromatografia em papel pode ser
tambm no sentido descendente e bidimensional, este ltimo realizado em
duas etapas com solventes apresentando diferentes propriedades.

2. Cromatografia em Camada Delgada

A cromatografia em camada fina (ou delgada) uma tcnica simples,
barata e muito importante para a separao rpida e anlise quantitativa de
pequenas quantidades de material. Ela usada para determinar a pureza do
composto, identificar componentes em uma mistura comparando-os com
padres; acompanhar o curso de uma reao pelo aparecimento dos
produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes
puros de uma mistura.
Na cromatografia de camada delgada a fase lquida ascende por uma
camada fina do adsorvente estendida sobre um suporte. O suporte mais
tpico uma placa de vidro (outros materiais podem ser usados).
Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em gua
(ou outro solvente) e deixa-se secar. A placa coberta e seca chama-se "placa
de camada fina". Quando a placa de camada fina colocada verticalmente
em um recipiente fechado (cuba cromatogrfica) que contm uma pequena
quantidade de solvente, este eluir pela camada do adsorvente por ao
capilar.

Cromatografia em camada delgada.

A amostra colocada na parte inferior da placa, atravs de aplicaes

sucessivas de uma soluo da amostra com um pequeno capilar. Deve-se

formar uma pequena mancha circular. medida que o solvente sobe pela
placa, a amostra compartilhada entre a fase lquida mvel e a fase slida
estacionria. Durante este processo, os diversos componentes da mistura
so separados. Como na cromatografia de coluna, as substncias menos
polares avanam mais rapidamente que as substncias mais polares. Esta
diferena na velocidade resultar em uma separao dos componentes da
amostra. Quando estiverem presentes vrias substncias, cada uma se
comportar segundo suas propriedades de solubilidade e adsoro,
dependendo dos grupos funcionais presentes na sua estrutura.
Depois que o solvente ascendeu pela placa, esta retirada da cuba e seca
at que esteja livre do solvente. Cada mancha corresponde a um
componente separado na mistura original. Se os componentes so
substncias coloridas, as diversas manchas sero claramente visveis.
Contudo, bastante comum que as manchas sejam invisveis porque
correspondem a compostos incolores. Para a visualizao deve-se "revelar
a placa". Um mtodo bastante comum o uso de vapores de iodo, que
reage com muitos compostos orgnicos formando complexos de cor caf ou
amarela. Outros reagentes para visualizao so: nitrato de prata (para
derivados halogenados), 2,4-dinitrofenilidrazina (para cetonas e aldedos),
verde de bromocresol (para cidos), ninhidrina (para aminocidos), etc.
3. Cromatografia Centrfuga
A cromatografia centrifuga uma cromatografia em camada delgada
preparativa e acelerada centrifugamente. Baseia-se no principio da
operao onde a amostra a ser separada aplicada como uma soluo no
centro do disco giratrio umedecido com o solvente.
A eluio com solvente gera bandas circulares de separao dos
componentes que so removidos juntamente com o solvente para um tubo
de recepo.

 compatvel com todos os solventes comumente usados nas outras

tcnicas cromatogrficas, inclusive cido actico, no apropriada para uso
com cidos minerais.
Tem como vantagens, a no aplicao de spot ou raspagem de bandas, as
separaes so rpidas, cerca de 20 min, permite a observao direta por
UV ou de compostos coloridos durante a eluio, suas camadas finas de 1,
a 4 mm apresentam alta capacidade,permite a utilizao de pouco solvente
e a eluio por gradiente fcil, o solvente regenerado in situ, podendo
ser re-utilizado, a atmosfera de nitrognio previne oxidao das amostras,
compacta (facilmente removida de um laboratrio para outro), poucos
controles e no necessita altas presses, possui baixo preo e assim a
Chromatotrons custa menos que um simples HPLC preparativo.
III. CROMATOGRAFIA EM COLUNA
A cromatografia em coluna costuma ser citada como o mais antigo
procedimento cromatogrfico. Foi utilizada primeiramente para o
isolamento dos pigmentos existentes nas folhas verdes dos vegetais.
Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plstico, preenchida com
um adsorvente adequado. uma tcnica de partio entre duas fases, slida
e lquida, baseada na capacidade de adsoro e solubilidade. O slido deve
ser um material insolvel na fase lquida associada, sendo que os mais
utilizados so a slica gel (SiO2) e alumina (Al2O3), geralmente na forma de
p.
A mistura a ser separada colocada na coluna com um eluente (fase mvel;
solvente) menos polar e vai-se aumentando gradativamente a polaridade do
eluente e consequentemente o seu poder de arraste de substncias mais
polares. Uma seqncia de eluentes normalmente utilizada a seguinte:
ter de petrleo, hexano, ter etlico, tetracloreto de carbono, acetato de
etila, etanol, metanol, gua e cido actico.

Colunas cromatogrficas. (a) Solvente adicionado coluna; (b) suporte

slido sendo introduzido na coluna.
O fluxo de solvente deve ser contnuo. Os diferentes componentes da
mistura mover-se-o com velocidade distintas dependendo de sua afinidade
relativa pelo adsorvente (grupos polares interagem melhor com o
adsorvente) e tambm pelo eluente. Assim, a capacidade de um
determinado eluente em arrastar um composto adsorvido na coluna
depende quase diretamente da polaridade do solvente com relao ao
composto.
medida que os compostos da mistura so separados, bandas ou zonas
mveis comeam a ser formadas, sendo que cada banda contem somente
um composto. Em geral, os compostos apolares passam atravs da coluna
com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os
primeiros tm menor afinidade com a fase estacionria. Se o adsorvente
escolhido interagir fortemente com todos os compostos da mistura, ela no
se mover. Por outro lado, se for escolhido um solvente muito polar, todos
os solutos podem ser eludos sem serem separados. Por uma escolha
cuidadosa das condies, praticamente qualquer mistura pode ser separada.

Coluna cromatogrfica acoplada a um funil de separao para manter o

nvel do solvente na superfcie superior. O xito de uma coluna depender
ento da escolha de um suporte e solvente adequados para a sua realizao.
Em alguns casos possvel visualizar a separao dos componentes de uma
mistura observando o desenvolvimento de manchas diferentes na coluna ou
acompanhando cm uma luz ultravioleta. Entretanto, na maioria das vezes,
torna-se necessrio o acompanhamento da separao dos componentes pela
tcnica de cromatografia em camada delgada (ccd).

IV. CROMATOGRAFIA GASOSA

Cromatografia data de 1903 no trabalho do cientista russoMikhail
Semenovich Tswett. O estudante graduadoalemoFritz Prior desenvolveu a
cromatografia gasosa de estado slido em 1947. Archer John Porter Martin,
quem foi vencedor do Prmio Nobel por seu trabalho no desenvolvimento
das cromatografias lquido-lquido (1941) e em papel (1944), estabeleceu
os fundamentos para o desenvolvimento da cromatografia gasosa e
posteriormente produziu a cromatografia gs-lquido (1950). Tcnica de
separao e anlise de misturas por interao dos seus componentes entre
uma fase estacionria e uma fase mvel.
Tcnica utilizada na Cromatografia Gasosa:
Uma cromatografia gasosa uma tcnica que se baseia na anlise qumica
instrumental por separao de compostos qumicos e uma amostra
complexa. Uma cromatografia gasosa usa um tubo estreito atravs do qual
se d o fluxo conhecido como coluna, atravs do qual diferentes
constituintes de uma amostra passam em uma corrente de gs (gs
condutor, ou transportador, a fase mvel) em diferentes taxas dependendo
de vrias propriedades fsicas e qumicas e suas interaes com um
especfico recheio da coluna, chamada fase estacionria. Como os
composto qumicos saem no final da coluna, so detectados e
identificados eletronicamente.
A funo da fase estacionria na coluna seperar componentes diferentes,
causando a cada um sada da coluna em um tempo diferente (tempo de
reteno). Outros parmetros que podem ser usados para alterar a ordem ou
tempo de reteno so a taxa de fluxo do gs condutor e a temperatura.
Em uma anlise CG, um volume conhecido de analito gasoso ou lquido
injetado na entrada da coluna, geralmente com o uso de uma microseringa
(ou com fibras de microextrao de fase slida, ou ). Conforme o gs
carreador leva as molculas do analito atravs da coluna, essa
movimentao inibida pela adsoro das molculas do analito nas paredes
da coluna ou no material do empacotamento da mesma.
A taxa com que as molculas progridem ao longo da coluna depende da
fora da adsoro que, por sua vez, depende do tipo de molcula e do
material da fase estacionria. Uma vez que cada tipo de molcula tem uma
taxa de progresso diferente, os vrios componentes da mistura de analito
so separados conforme progridem ao longo da coluna, chegado ao fim
dela em momentos diferentes (tempos de reteno). Um detector
empregado para monitorar o fluxo de sada da coluna.
Assim, o momento em que cada componente sai da coluna, e a quantidade
deles, pode ser determinada. Geralmente, as substncias so identificadas
(qualitativamente) pela ordem com que emergem (eluem) da coluna e pelo
tempo de reteno do analito na coluna.

Aplicaes prticas da Cromatografia Gasosa:

Qumica:
1. Determinao de antioxidantes, nutrientes ou contaminantes em
alimentos.
Indstria:
1. Monotorizao de processos industriais.
Sade:
- Anlises dos constituintes do sangue.
- Anlise forense.
Ambiente:
- Determinao de resduos de pesticidas em produtos alimentares, guas
ou esgotos.
- Determinao de gases e solventes orgnicos na atmosfera, solos ou rios.
As partes de um Cromatgrafo Gasoso:
A cromatografia um mtodo fsico de separao, no qual componentes a
serem separados so distribudos entre duas fases: a fase estacionria, e a
fase mvel. A amostra transportada por uma corrente de gs atravs de
uma coluna empacotada com um slido recoberta com uma pelcula de um
lquido. Devido a sua simplicidade, sensibilidade e efetividade para separar
os componentes de misturas, a cromatografia de gs uma das ferramentas
mais importantes em qumica. amplamente usada para anlises
quantitativos e qualitativos de espcies qumicas e para a determinar
constantes termoqumicas tais como calores de soluo e vaporizao,
presso de vapor e coeficientes de atividade. A cromatografia de gs
tambm usada para monitorar os processos industriais de forma automtica:
analisam-se as correntes de gs periodicamente e realizam-se reaes de
forma manual ou automtica para compensar variaes no desejadas.

Muitas anlises de rotina so realizadas rapidamente no campo medicinal e

outros. Por exemplo, por meio do uso de apenas 0.1 centmetros cbicos
(0.003 onas) de sangue, pode-se determinar as porcentagens de oxignio
dissolvido, nitrognio, dixido de carbono e monxido de carbono. A

cromatografia de gs til tambm na anlise de contaminantes do ar,

lcool no sangue, leos essenciais e produtos alimentcios.
O mtodo consiste primeiramente na introduo da mistura de prova ou
amostra em uma corrente de gs inerte, normalmente hidrognio, hlio,
nitrognio ou argnio, que atuaro como gs de arrastre. As amostras
lquidas vaporizam-se antes da injeo no gs de arrastre. O fluxo de gs
passa pela coluna empacotada atravs da qual os componentes da amostra
se deslocam a velocidades influenciadas pelo grau de interao de cada
componente com a fase estacionria no voltil. As substncias que tm a
maior interao com a fase estacionria so retidas por mais tempo e, por
tanto, separadas daquelas de menor interao. medida que as substncias
eluem da coluna, podem ser quantificadas por um detector e/ou tomadas
para outra anlise.

Existem dois tipos de cromatografia de gs: cromatografia Gs - Slido

(CGS) e cromatografia Gs - Lquida (CGL). A cromatografia Gs - Slida
se baseia na base slida estacionria, na qual a reteno das substncias
analisveis a consequncia da absoro fsica. A cromatografia Gas
-Lquida til para separar ons ou molculas dissolvidas em um solvente.
Se a soluo de amostra estiver em contato com um segundo slido ou fase
lquida, os diferentes solutos interagem com a outra fase em diferentes
graus, devido a diferenas de adsoro, intercmbio de ons, partio, ou
tamanho. Estas diferenas permitem que os componentes da mistura se
separem usando estas diferenas para determinar o tempo de reteno dos
solutos atravs da coluna.

V. CROMATOGRAFIA LQUIDA
A cromatografia lquida (HPLC) um processo de anlise de separao
fsico cuja aplicao permite a anlise qualitativa mais comumente e
quantitativa de uma amostra. Esse mtodo analtico vem sendo amplamente
empregado graas ao rpido tempo de anlise. Permite separar constituintes
de uma mistura atravs de sua distribuio em duas fases: fase mvel um
lquido e a fase estacionria um slido.
A cromatografia liquida utilizada em vrias reas da cincia, no
acompanhamento de snteses, em anlises de pesticidas, feromnios, no
isolamento de produtos naturais e sintticos e na produo e controle de
qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicaes.
A cromatografia a lquido permite, entre outras, a anlise das seguintes
classes dos principais compostos: protenas, cidos nuclicos, aminocidos,
corantes, polissacardeos, pigmentos de plantas, compostos inicos, ons
metlicos, ctions, lipdeos polares, explosivos, polmeros sintticos,
surfatantes, farmacuticos, metablicos de plantas, nions, complexos de
metais pesados, etc.

Hoje a cromatografia lquida de alta eficincia tem as seguintes

caractersticas:
1. alto poder de resoluo;
2. separaes rpidas;
3. monitoramento contnuo do eluente;
4. medidas quantitativas acuradas;
5. anlises repetitivas e reprodutveis com a mesma coluna;
6. automao do procedimento analtico e do manuseio dos dados
Sob alguns aspectos, a cromatografia lquida de alta eficincia mais
verstil que a cromatografia com fase gasosa porque ela no est limitada a
amostras volteis e termicamente estveis e porque a escolha de fases
estacionrias e mveis mais ampla (Mendham et al, 2002).
O emprego da cromatografia a lquido para solucionar problemas analticos
ou preparativos necessita, alm da instrumentao adequada, da
combinao correta das condies experimentais tais como:
1. tipo de coluna (fase estacionria);
2. fase mvel, sua composio e vazo;
3. temperatura;
4. quantidade de amostra injetada, etc.
A seleo correta dessas variveis necessita do conhecimento bsico dos
fatores que controlam a separao na cromatografia a lquido (Ciola,1998).
Cromatografia a lquido de alto desempenho (HPLC)
A cromatografia a lquido de alto desempenho um tipo de cromatografia
que emprega uma fase mvel lquida e uma fase estacionria finamente
dividida e que, para ter um fluxo razovel, opera a presses elevadas.
Originalmente chamava-se cromatografia lquida de alta presso e esta
terminologia foi abandonada quando se constatou que o diferencial de
comportamento desta para as demais cromatografias lquidas no era a
maior presso, mas sim o melhor desempenho cromatogrfico. Dentre as
principais caractersticas e vantagens do mtodo HPLC esto:
1. coluna recheada com partculas de pequeno tamanho ( 3 - 10 mm);
2. alta resoluo;
3. anlise no destrutiva;
4. velocidade de separao;
5. monitorao contnua do efluente da coluna;
6. medio quantitativa exata;
7. anlises repetitivas e reprodutivas com a mesma coluna;
8. automao do procedimento analtico e do tratamento dos dados.
Os componentes essenciais da HPLC so:
1. Bomba de alta presso: dispositivo importante pois est
relacionado ao tempo de reteno, a reprodutibilidade e a
sensibilidade do detector. Este sistema composto por bomba e
controladores de presso e vazo. De uma maneira geral, a bomba

deve ter a capacidade de impulsionar a fase mvel. Existem dois

tipos de bomba, com presso constante e com volume constante.
2. Sistema de injeo da amostra: a introduo da amostra pode ser
realizada por meio de uma vlvula de amostragem ou por meio de
uma seringa de injeo. O efluente desses dispositivos preenche uma
serpentina de volume conhecido e o acionamento da vlvula
transfere, integralmente, esse volume para a corrente de fase mvel.
3. Coluna: so feitas de ao inoxidvel polido, com comprimentos de
10 a 30 cm, com calibre de preciso. Dimetros internos tpicos
variam de menor ou igual a 1 mm para colunas capilares; 2, 3, 4, 5 e
6 mm para colunas analticas recheadas e maior ou igual a 10 mm
para colunas preparativas. Os recheios usados so constitudos por
partculas pequenas, rgidas comum a distribuio granulomtrica
estreita. Os tipos de recheio podem ser divididos em trs categorias:
4. 1- grnulos porosos, polimricos, baseados em copolmeros de
estireno-divinilbenzeno e so utilizados na troca de ons e na
cromatografia por permeao em gel;
2- grnulos de camada porosa , constitudos por uma camada delgada de
slica modificada, estes recheios peculiares so usados em alguma
aplicaes de troca de ons e muito usados em cromatografia de fase
reversa para anlise de compostos orgnicos;
3- partculas de slica totalmente porosas que proporcionam considervel
melhoria da eficincia da coluna, da capacidade de analisar as amostras e
da velocidade de anlise.
1. Detector: monitora a fase mvel medida que elui da coluna. So
duas principais classes em que podem ser divididos: detectores de
propriedades macroscpicas e detectores de propriedades de soluto,
que medem a diferena entre uma propriedade fsica do soluto na
fase mvel e a mesma propriedade na fase mvel pura. Esse
monitoramento efetuado pela deteco propriamente dita,
associada a uma transduo para um sinal eltrico que pode ser
registrado ou arquivado eletronicamente na fase mvel pura. Esse
monitoramento efetuado pela deteco propriamente dita,
associada a uma transduo para um sinal eltrico que pode ser
registrado ou arquivado eletronicamente.

SUBSTANCIAS ISOLADAS E IDENTIFICADAS

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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Acesso em: 03 de maio de 2010.
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