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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE NAYARIT

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS Y


FARMACUTICAS

Asociacin entre los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 de Salmonella


typhimurium, el polimorfismo en FCGR3A y correlacin con el BASDAI
en pacientes con espondilitis anquilosante
Tesis
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE
QUMICO FARMACOBILOGO

Presenta
Edmundo Gutirrez Tpach

Director de tesis
Dr. Jos Francisco Zambrano Zaragoza

Co-director de tesis
Dr. Norberto Vibanco Prez
Tepic Nayarit, Abril 2015

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio de Inmunologa


de la Unidad Acadmica de Ciencias Qumico Biolgicas y
Farmacuticas, con apoyo del Programa Integral de Fortalecimiento
Institucional (PIFI) 2011-18-MSU0019M-05 y del Programa de
Fortalecimiento de la Calidad en Instituciones Educativas
(PROFOCIE) 2014-18-MSU0019M-04-01

AGRADECIMIENTOS
Al ser supremo:
Gracias por haberme permitido llegar hasta este momento en mi vida.
A mis padres:
Gracias por apoyarme en todo momento, por el esfuerzo que hicieron para
ayudarme a concluir mis estudios y por estar de acuerdo con las decisiones que
he tomado, por sus consejos.
A mi familia:
Gracias por los consejos que he recibido de cada uno de ustedes y por
apoyarme incondicionalmente, por inculcarme que la familia es lo primero, por
confiar en m. Su apoyo ha sido un gran estmulo para m y me ha ayudado a
llegar hasta este punto en mi vida.
A mis profesores:
Por tener confianza en m, por el apoyo que me han dado y principalmente por
todos los conocimientos que he recibido de cada uno de ustedes, por su
paciencia y dedicar su tiempo en m, y gracias por todo lo que han hecho por
m.
A mis amigos:
Gracias por haber compartido su tiempo conmigo, por escucharme, por
tenerme mucha paciencia, por haber sido como hermanos en este gran periodo
de mi vida.

NDICE
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS.................................................................................I
ABREVIATURAS.......................................................................................................II
RESUMEN................................................................................................................IV
INTRODUCCIN.......................................................................................................1
Espondilitis anquilosante (EA)...............................................................................1
Sntomas y alteraciones de la EA..........................................................................1
Prevalencia e incidencia de la EA..........................................................................2
El diagnstico de la EA...........................................................................................2
ndice de actividad de la enfermedad (BASDAI)....................................................3
Origen de la enfermedad........................................................................................3
Factores genticos..............................................................................................4
Factores ambientales..........................................................................................4
Relacin entre factores genticos y ambientales con la EA..................................5
OBJETIVOS...............................................................................................................8
Objetivo general.....................................................................................................8
Objetivos particulares.............................................................................................8
MATERIAL Y MTODOS...........................................................................................9
Poblacin estudiada...............................................................................................9
Medicin del BASDAI.............................................................................................9
Extraccin de DNA genmico.................................................................................9
Cuantificacin del DNA........................................................................................10

Genotipificacin del polimorfismo rs396991 FCGR3A.........................................10


Obtencin de la p30 de Salmonella typhimurium.................................................11
Cultivo de Salmonella typhimurium...................................................................11
Extraccin y purificacin de la p30....................................................................11
Medicin de los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 en suero de pacientes con EA
..............................................................................................................................11
Anlisis estadstico...............................................................................................12
RESULTADOS Y DISCUSIN.................................................................................13
Genotipos de FCGR3A en pacientes con EA......................................................13
Verificacin de la pureza de la p30......................................................................14
Comparacin de los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con
EA agrupados segn el genotipo FCGR3A..........................................................15
Correlacion entre anticuerpos IgG totales anti-p30 y BASDAI............................16
CONCLUSIONES....................................................................................................19
BIBLIOGRAFA........................................................................................................20
ANEXO....................................................................................................................26

LISTA DE TABLAS Y FIGURAS

Tabla.1 Criterios modificados de Nueva York para el diagnstico de la EA de 3


1984

Figura 1.

Patrones electroforticos de los productos de PCR de la 13

Figura 2.
Figura 3.

genotipificacin del receptor FCGR3A


Electroforesis de la p30 electroeluida.
14
Comparacin de los anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes 15

Figura 4.

con EA agrupados segn el genotipo FCGR3A


Correlacin de los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en 16

Figura 5.

pacientes con EA y BASDAI.


Correlacin entre los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 en 17
pacientes con EA y BASDAI agrupados segn el genotipo del
receptor FCGR3A

ABREVIATURAS
C

Grados centgrados

IL
g

Interleucina
Microgramos

kDa
L

Kilodaltones
Microlitros

mL
BASDAI

Mililitros
ndice de actividad de la espondilitis anquilosante

mM
BSA

Milimolar
Albumina srica bovina

MPM
DNA

Marcador
de peso molecular
cido desoxirribonucleico

ng
dNTPs

Nanogramos
Desoxirribonucletidos trifosfatados

NK
EA

Clulas
asesinas
naturales
Espondilitis
anquilosante

nm
FcRIIIA

Nanmetros
Protena del Receptor para Fc de IgG tipo 3A

p30
FCGR3A

Protena
de 30 kDa
deFc
Salmonella
typhimurium
Gen del receptor
para
de IgG tipo
3A

pb
HLA

Pares
de de
bases
Antgeno
leucocitos humanos

PBS
IgG

Solucin
salina amortiguada
con fosfatos
Inmunoglobulina
G

PCR

Reaccin en cadena de la polimerasa

rpm

revoluciones por minuto

RESUMEN
La espondilitis anquilosante (EA), es una enfermedad inflamatoria crnica, de
naturaleza autoinmune, que afecta fundamentalmente el esqueleto axial y las
articulaciones sacroilacas. La causa de la prdida de tolerancia es desconocida, sin
embargo, se considera que estn involucrados factores ambientales y genticos.
Previamente se ha establecido la asociacin de una banda de aproximadamente 30
kDa de Salmonella typhimurium con la EA, que es reconocida por anticuerpos IgG,
as como el polimorfismo rs396991 en FCGR3A, un cambio G559T, que provoca un
intercambio de una fenilalanina por una valina en la posicin 158 y tiene como
consecuencia un cambio en la afinidad para todas las subclases de IgG y este ha
sido asociado con la EA como factor de riesgo. Con base en lo anterior, el objetivo
del presente trabajo fue establecer la asociacin entre el polimorfismo rs396991 en
FCGR3A con los niveles de anticuerpos IgG totales anti- p30 de Salmonella
typhimurium y la correlacin con el ndice de actividad de la enfermedad (BASDAI)
en pacientes con espondilitis anquilosante. Se incluyeron muestras de sangre
perifrica de 40 pacientes con EA, de las que se obtuvo DNA y suero. El
polimorfismo rs396991 en FCGR3A se genotipific utilizando PCR alelo-especfica,
los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 fueron determinados por ELISA
indirecto y el BASDAI fue calculado por la mdico tratante con base en cuestionario.
Se compararon los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 agrupados segn el
genotipo FCGR3A con la prueba U de Mann-Whitney y se determin la correlacin
entre los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con EA agrupados
segn el genotipo de FCGR3A y el BASDAI, con la prueba de Spearman, en ambos
casos con una confianza del 95%.
Los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 no mostraron diferencia estadsticamente
significativa entre los pacientes agrupados segn el genotipo FCGR3A. Asimismo,
los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 no correlacionan significativamente con el
BASDAI.

INTRODUCCIN
Espondilitis anquilosante (EA)
Las espondiloartropatas (SpA) constituyen un grupo de enfermedades inflamatorias
crnicas interrelacionadas entre s, cuya principal representante es la EA, trmino
que proviene del griego spondylos (vrtebra) y ankylos (rigidez) (1). Es una
enfermedad inflamatoria crnica, de naturaleza autoinmune (2), que afecta
fundamentalmente al esqueleto axial, especialmente a las articulaciones sacroilacas;
aunque tambin puede observarse compromiso de las articulaciones perifricas as
como manifestaciones extra-articulares (3).

Sntomas y alteraciones de la EA
Los sntomas de la enfermedad pueden variar de un paciente a otro, ya que algunos
pacientes pueden experimentar slo molestias leves, mientras que otros pueden
verse notablemente discapacitados por la gravedad de sus sntomas, adems stos
no se mantienen constantes, pues los periodos con gran actividad de la enfermedad,
denominados brotes, se alternan con otros en los que el paciente presenta menos
molestias (4).
El dolor y la inflamacin en la columna generalmente comienzan en la parte inferior
de la espalda, justo en la zona de unin entre la columna y la pelvis, que se
acompaa de marcada rigidez matutina; que suele mejorar con el movimiento y
reaparecer con el reposo. Con el tiempo, la inflamacin puede desencadenar un
proceso por el cual las vrtebras llegan a fusionarse o soldarse entre s, haciendo
que la columna pierda toda su flexibilidad. Cuando esto sucede, la rigidez extrema de
la columna provoca un estado de anquilosamiento que limita enormemente la
movilidad del paciente (5). En general los hombres presentan formas ms graves y

con mayor compromiso axial, mientras que las mujeres presentan ms compromiso
particular perifrico y menos sacroiletis (6). No obstante, la mayora de los pacientes
con EA mantienen una capacidad funcional aceptable, lo que les permite llevar una
vida activa (7).

Prevalencia e incidencia de la EA
La prevalencia de la EA vara segn la zona geogrfica y la etnia analizada. Es una
enfermedad que afecta a ms hombres que mujeres, en una proporcin de 2:1 (8).
La incidencia vara entre 0.5 y 14 por cada 100.000 personas por ao, dependiendo
de la poblacin estudiada (9), En Mxico la EA se presenta en aproximadamente el
0.09% de la poblacin (10).

El diagnstico de la EA
El diagnstico de la EA se establece con base en los criterios modificados de Nueva
York de 1984 (11), que toman en cuenta datos clnicos y evidencia radiolgica de
sacroiletis, y poseen una sensibilidad del 83% y una especificidad del 98%. Sin
embargo, el uso de estos criterios para el diagnstico en estadios precoces es muy
limitado, no slo porque la limitacin de la movilidad lumbar y la disminucin de la
expansin torcica suelen ser fenmenos tardos, sino fundamentalmente por la
sacroiletis radiolgica, que aunque se ha visto que est presente en muchos casos
en estadios precoces, en general puede tardar mucho tiempo en aparecer en la
radiografa simple, y ste es un criterio obligado para el diagnstico (12).

Tabla 1. Criterios modificados de Nueva York para el diagnstico de la EA de 1984


(11)
Criterios clnicos
1. Dolor lumbar de al menos 3 meses de duracin que mejora con el ejercicio y
no se alivia con el reposo.
2. Limitacin de la movilidad de la columna lumbar en los planos frontal y
sagital.
3. Limitacin de la expansin torcica respecto a los valores normales para
edad y sexo.
Criterio radiolgico
1. Sacroiletis unilateral grado 3 a 4 o bilateral grado 2 a 4.
Se establece el diagnstico de EA si el criterio radiolgico se presenta junto con al
menos un criterio clnico.

ndice de actividad de la enfermedad (BASDAI).


El BASDAI (por sus siglas en ingls de Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity
Index) (13) es un instrumento que mide el ndice de actividad de la EA (14)(14) y ha
demostrado ser vlido, fiable, sensible al cambio y viable tanto en estudios como en
la prctica clnica diaria (15). Actualmente el BASDAI es el estndar de oro para la
evaluacin de la actividad enfermedad (14), es un cuestionario que consta de 6
preguntas que se refieren a diferentes dominios relacionados con la actividad de la
enfermedad que incluyen fatiga, dolor en esqueleto axial, dolor e inflamacin en
articulaciones perifricas, valorados desde la perspectiva del paciente (anexo) (13)

Origen de la enfermedad
La EA es una enfermedad de naturaleza autoinmune, aunque las causas que
desencadenan la autoinmunidad son desconocidas, se ha descrito que se
encuentran involucrados factores genticos y ambientales. La evidencia de factores
genticos incluye aumento en la prevalencia e incidencia de la enfermedad en ciertas

etnias, as como entre familiares (16). Se acepta que en la EA, al igual que otras
enfermedades

de

naturaleza

autoinmune,

son

desrdenes

multifactoriales

resultantes de la interaccin de factores genticos y ambientales (17).


Factores genticos

Entre los factores genticos asociados con la EA destaca la portacin del gen para el
antgeno de leucocitos humanos (HLA)-B27, ya que aproximadamente el 90% de los
pacientes son positivos para l (18), asimismo se ha publicado que los pacientes con
EA HLA-B27 positivos presentan sntomas articulares ms graves y prolongados,
mayor compromiso axial y de caderas, manifestaciones extra articulares como uvetis
y afeccin cardiaca que los pacientes HLA-B27 negativos. Es importante resaltar que
tener el HLA-B27 no es una condicionante para desarrollar EA, ya que, si bien cerca
del 5% de la poblacin general es HLA-B27 positiva, la mayora de ellos permanece
sana (19).
Por otra parte, el gen HLA-B1, los genes desiertos en los cromosomas 2p15 y 21q22
(20) y polimorfismos de un nuclotido (SNP) (2, 10, 21-24) han sido asociados con la
EA. Entre los SNP destacan el rs2287987 de ERAP1 (aminopeptidasa de retculo
endoplasmtico 1), que ha mostrado tener asociacin, la ms fuerte despus del
HLA-B27, (25), as como los polimorfismos; rs16944, rs2856836, rs17561, rs1894399
del gen de la IL-1, (26-28), el rs11209032 y rs1343151 del gen para receptor de
interleucina 23 (IL23R ) (23) y el rs1801274 y rs396991 de los receptores para el Fc
de IgG (FcR) (24).
Factores ambientales

Se ha postulado que los agentes infecciosos desempean un papel crucial como


factores desencadenantes para algunas enfermedades autoinmunes. Sin embargo,
los mecanismos por los que estos antgenos microbianos estn involucrados en la
etiopatogenia de la enfermedad siguen sin conocerse por completo. En el caso de la
EA, la asociacin se ha establecido con enterobacterias como Klebsiella
pneumoniae, Shigella flexneri, Yersinia enterocolitica y Campylobacter jejuni, ya que
la respuesta humoral contra estas bacterias est exacerbada (9, 24).

Entre las enterobacterias, Klebsiella pneumoniae ha sido considerado como el


principal agente microbiano implicado en la EA, ya que tanto la respuesta celular
como humoral contra esta bacteria estn elevadas en paciente comparadas con
sujetos sanos (29-31).
Por otra parte, se ha publicado que una banda de 30 kDa de S. typhimurium es
reconocida por los anticuerpos IgG de la mayora de los pacientes con EA
estudiados, asimismo que los niveles de anticuerpos IgG sricos contra esta banda
se encuentran significativamente ms elevados en pacientes con EA que en los
grupos control, por lo que podra estar implicada en la inmuno-patognesis de la
enfermedad (24, 32).

Relacin entre factores genticos y ambientales con la EA


Considerando que en los pacientes con EA la respuesta inmune humoral contra S.
typhimurium se dirige principalmente contra la p30, y que la principal clase de
anticuerpo que se produce es IgG (32), se postula que la relacin entre la respuesta
humoral observada y la patognesis de la enfermedad pudiese ser explicada, al
menos en parte, por la interaccin con los FcR (24).
Los FcR son una familia heterognea de glicoprotenas de membrana que unen la
fraccin Fc de la inmunoglobulina G (IgG) (33), se encuentran distribuidos en la
superficie de macrfagos, linfocitos B y clulas asesinas naturales (NK), entre otras
(34). Los FcR permiten la interaccin entre los anticuerpos IgG en inmunocomplejos
y las clulas inflamatorias (35). De esta manera, los FcR constituyen el puente de
unin entre el sistema inmune adaptativo (anticuerpos especficos producidos tras la
exposicin antignica) y el sistema inmune innato (clulas efectoras del sistema
inmune como los macrfagos, neutrfilos, clulas cebadas o clulas NK) (34).
Los FcR son molculas que median las diferentes acciones de IgG. As, la
inflamacin inducida por inmunocomplejos y la citotoxicidad dependiente de IgG
tienen lugar a travs un mecanismo dependiente de los FcR. Adems, stos
constituyen un sistema de control de la tolerancia inmunolgica y de la gnesis de

anticuerpos, mediante la regulacin de la maduracin de las clulas dendrticas y


linfocitos B y de la supervivencia de las clulas plasmticas (33, 35).
Los FcR humanos descritos son FcRI, FcRIIA, FcRIIB, FcRIIC, FcRIIIA y
FcRIIIB (36) de los cuales, el FcRI es de alta afinidad, y los FcRIIA, FcRIIB,
FcRIIC, FcRIIIA y FcRIIIB de baja afinidad, estos ltimos slo unen IgG en IC.
Como se muestra en la Figura , los FcRs se clasifican tambin en activadores
FcRI, FcRIIA, FcRIIC, FcRIIIA e inhibidor FcRIIB (35, 37).
Los FcR son el principal sistema utilizado por las clulas del sistema inmune innato
para llevar a cabo las funciones dependientes de IgG encaminadas a la eliminacin
de patgenos. En neutrfilos, la fagocitosis de agentes microbianos opsonizados y
de IC con IgG est mediada por seales cooperativas desencadenadas por FcRIIA y
FcRIIIB (38). Asimismo, la unin de los IC a los neutrfilos a travs de los FcR,
conlleva la secrecin de especies reactivas de oxgeno, proteasas, y mediadores
inflamatorios (35, 39) Los FcR activadores median diferentes acciones en
macrfagos tales como fagocitosis, degranulacin, citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpo, liberacin de especies reactivas de oxgeno, citocinas (TNF-, IL-1 e
IL-6), factores de crecimiento y quimiocinas (40).
La mayora de los FcR presentan polimorfismos genticos con relevancia funcional
que afectan la afinidad del receptor por la IgG y por tanto, a la intensidad de las
funciones resultantes de dicha interaccin (34), lo que podra propiciar un aumento el
tiempo de respuesta y tener como resultado la prolongacin de la inflamacin, por lo
que podra ser uno de los factores involucrados en la patogenia de la EA (24, 41-43).
El polimorfismo rs396991 en FCGR3A, una mutacin G559T, lo que provoca una
sustitucin de una fenilalanina por una valina en la posicin 158 (34) en el dominio
extracelular 2 de la protena. Esta sustitucin modifica la afinidad de FcRIIIA por las
subclases de IgG (41), aunque la diferencia es ms marcada con IgG1 e IgG3, de
manera que la variante FcRIIIA-158V se une a IgG1 e IgG3 con ms afinidad que la
variante FcRIIIA-158F

Como se ha mencionado, el desencadenamiento de la EA conjuga factores


medioambientales, genticos e inmunolgicos (17, 24, 31). Estos ltimos se
caracterizan por la respuesta de linfocitos T y/o B autorreactivos (31) inflamacin (44)
y produccin de auto anticuerpos (45). De esta manera, el desequilibrio entre el
balance de receptores Fc inhibidores o activadores puede ocasionar la ruptura de la
tolerancia y desencadenar enfermedades autoinmunes (19, 24). Por lo tanto la p30
como factor ambiental, los anticuerpos de clase IgG anti-p30 y el polimorfismo
rs396991 en FCGR3A, podran establecer, al menos en parte, el vnculo entre
factores genticos y ambientales que propicien el proceso inflamatorio observado, y
tener influencia en la patogenia de la enfermedad (24, 32).

OBJETIVOS

Objetivo general
Establecer la asociacin entre los niveles de anticuerpos IgG totales anti- p30 de
Salmonella typhimurium y el polimorfismo rs396991 en FCGR3A y la correlacin con
el ndice de actividad de la enfermedad (BASDAI) en pacientes con espondilitis
anquilosante.

Objetivos particulares
Comparar los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 de Salmonella typhimurium
en pacientes con EA agrupados segn el genotipo FCGR3A
Correlacionar los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con EA
agrupados segn el genotipo FCGR3A con el ndice de actividad de la enfermedad
(BASDAI).

MATERIAL Y MTODOS
Poblacin estudiada
Se incluyeron 40 muestras de sangre perifrica de pacientes con EA, diagnosticados
en la Clnica de Reumatologa del Departamento de Medicina Interna, del HGZ No. 1
del Instituto Mexicano del Seguro Social, Tepic, Nayarit, Mxico, de acuerdo con
criterios modificados de Nueva York para el diagnstico de EA de 1984 (11). Las
muestras se utilizaron para la obtencin de DNA y suero.
Todos los participantes firmaron una carta de consentimiento informado de acuerdo
con la declaracin de Helsinki (1975).

Medicin del BASDAI


El ndice de actividad de la enfermedad fue determinado en 38/40 pacientes por el
mdico tratante utilizando el cuestionario del BASDAI (anexo), en la Clnica de
Reumatologa del Departamento de Medicina Interna, del HGZ No. 1 del Instituto
Mexicano del Seguro Social, Tepic, Nayarit, Mxico.

Extraccin de DNA genmico


La extraccin se realiz a partir de sangre perifrica de pacientes con EA con el kit
easy-DNA (Invitrogen), utilizando el protocolo 2, de acuerdo con las instrucciones
del fabricante.
Se mezclaron 32.8 L de sangre perifrica, con 46.9 L de solucin A y se calent a
65C por 6 minutos en bao seco (Thermoblock Thermolyne), despus se
agregaron 86.5 L de cloroformo y se mezcl vigorosamente hasta obtener un color
chocolate, enseguida se agregaron 18.8 L de solucin B, se mezcl vigorosamente
hasta que la muestra estuvo viscosa, posteriormente se centrifug a 12,000 rpm
durante 10 minutos (Eppendorf 5414 R ), se tomaron 50 L de sobrenadante y se

adicionaron 750 L de etanol absoluto, se mezclaron hasta formar un precipitado


blanco. Posteriormente se centrifug a 12,000 rpm durante 10 minutos, se decant el
sobrenadante y se lav el DNA precipitado con 750 L de etanol al 70%. Se repiti el
proceso de centrifugado, se decant el sobrenadante y se dej secar la pastilla, que
fue posteriormente disuelta en 50 L de H 2O dde y el DNA disuelto fue guardado a
-20C hasta su uso.

Cuantificacin del DNA


El DNA fue cuantificado en un espectrofotmetro (Jenway

6405) midiendo las

absorbancias a 260 nm y a 280 nm (46).


La concentracin fue determinada usando la siguiente frmula:
Absorbancia de la muestra a 260 nm X dilucin X 50 = concentracin de DNA en
g/L

Genotipificacin del polimorfismo rs396991 FCGR3A


La genotipificacin de FCGR3A se realiz mediante la tcnica de PCR punto final, se
utilizaron los iniciadores alelo-especficos KIM-G(F): 5'-TCT CTG AAG ACA CAT TTC
TAC TCC CTA A-3', KIM-G(V): 5'-TCT CTG AAG ACA CAT TTC TAC TCC CTA C-3' y
el reverso A013: 5'-ATA TTT ACA GAA TGG CAC AGG-3' (47). Se realizaron dos
reacciones independientes, una para el alelo F y otra para el alelo V, cada mezcla de
reaccin contena: 200 ng de ADN genmico, 200 M de cada dNTP, 6 mM MgCl2,
200 ng de KIM-G (V) o KIM-G (F), 200 ng A013, 5 L regulador para PCR 1x
(Invitrogen) y 1.0 U de Taq polimerasa (Invitrogen), en un volumen final de 25
L. Las condiciones del termociclador ( Mastercycler Eppendorf) fueron las
siguientes: Desnaturalizacin durante 10 min a 95C, 37 ciclos de 95C durante 30
segundos, 57C durante 20 segundos y 72C durante 25 segundos; y un extensin
final

durante

minutos

72C.

Los

productos

de

PCR

se

corrieron

electroforticamente en geles de agarosa. La ubicacin de la banda (160 pb),


correspondiente al alelo V y/o F, fue determinada utilizando marcadores de peso
molecular como referencia (invitrogen).

Obtencin de la p30 de Salmonella typhimurium


Cultivo de Salmonella typhimurium

La cepa de Salmonella typhimurium (32) fue sembrada en agar TSI y se incub


durante 24 horas a 37C, despus se resembr en caldo TSI y se incub 24 horas
ms. Se obtuvo el paquete celular centrifugando 6 mL del cultivo a 10,000 rpm
(Eppendorf 5414 R) durante 3 minutos. Posteriormente se lav el paquete celular, en
PBS 1X y se guard a -20C (32).
Extraccin y purificacin de la p30

El paquete celular obtenido fue tratado con 700 L de regulador de muestra (2


mercaptoetanol al 5%, azul de bromofenol, SDS 2%, Tris-HCl 80mM, glicerol 10%,
pH 6.78) y se calent a 95C durante 10 min y posteriormente se separaron las
protenas en geles de poliacrilamida al 15%, de acuerdo con el sistema de geles
discontinuos descrito por Laemli (48). La banda de 30 kDa se ubic usando como
referencia a los marcadores de peso molecular (invitrogen) (32).
Posteriormente, el gel que contena la p30 fue cortado en pedazos pequeos y se
colocaron en los tubos de electroleucin (miniprotean II, Biorad). Se llen la cmara
con regulador de corrimiento (Tris base 0.025M, Glicina 0.192M, SDS al 1% a pH
8.3) y se aplicaron 10 mA/tubo durante 2 horas. Se recuper la protena
electrloeluda, se determin la concentracin de protenas por el mtodo de Lowry
(49) y se almacen a -20C hasta su uso.

Medicin de los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 en suero de


pacientes con EA
Se realiz mediante la tcnica de ELISA indirecto, de acuerdo con el mtodo descrito
previamente (32).
Se sensibiliz la microplaca de poliestireno (Corning ) con 0.3 g de p30/pozo diluida
en regulador de carbonatos (Na2CO3 0.015 M y NaHCO3 0.035 M, pH 9.6) durante 12
horas a 4C. Transcurrido este tiempo, la placa se lav 3 veces con PBS-Tween
0.05% (PBS-T) y se bloque con solucin de PBS-BSA al 1% durante 1 hora a 37C,
se repiti el proceso de lavado y en seguida se adicionaron los sueros de los
pacientes, diluidos 1:100 en PBS-T y se incub 1 hora a 37C, despus de lavar la
placa se agregaron 100 L de anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado a
peroxidasa (Carbiochem) diluido 1:2500 en PBS 1X y se incub 1 hora a 37C, se
repiti el proceso de lavado y se agregaron 100 L de solucin reveladora (H 2O2 al
0.012%, Ortofenildiamina 0.4 mg/mL en regulador citrato-fosfato pH 5 ). La reaccin
se detuvo a los 30 minutos con H 2SO4 8N. Se leyeron las absorbancias a 490 nm en
un lector de microplacas (Biorad, Modelo 680). Todas las determinaciones se
realizaron por triplicado. En cada determinacin de incluy un control negativo (pozos
sensibilizados con BSA) y un blanco de reactivos.

Anlisis estadstico
La comparacin de los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con
EA agrupados segn el genotipo de FCGR3A fue realizada mediante la prueba
estadstica U de Mann-Whitney. La correlacin entre los niveles de anticuerpos IgG
totales anti-p30 en pacientes con EA agrupados segn el genotipo de FCGR3A y el
BASDAI, fue realizada mediante la prueba estadstica (rho) Spearman. Ambas
pruebas estadsticas fueron aplicadas con el programa estadstico Minitab versin
17 con una confianza del 95% (p0.05).

RESULTADOS Y DISCUSIN
Genotipos de FCGR3A en pacientes con EA
La figura 3, muestra los patrones electroforticos para los diferentes genotipos de
FCGR3A amplificados mediante la PCR de punto final. El tamao de las bandas
esperadas fue de 160 pb y fueron ubicadas utilizando el marcador de peso molecular
Escalera de 100 pb (invitrogen) como referencia (50).

Figura 1. Patrones electroforticos de los productos de PCR de la genotipificacin del


receptor FCGR3A. Carril 1, MPM (marcador de peso molecular) 100pb (invitrogen). Carril
2 y 3, genotipo homocigoto V/V de FCGR3A. Carril 4 y 5, genotipo heterocigoto V/F de
FCGR3A. Carril 6 y 7 genotipo homocigoto F/V de FCGR3A.

La frecuencia de los genotipos del rs396991 en FCGR3A de los 40 pacientes con


EA, muestra que el genotipo F/F fue el de mayor frecuencia, ya que estuvo presente
en un 50% de la poblacin, despus el genotipo V/F con 42.5% de distribucin en la
poblacin y el genotipo V/V fue el de menor frecuencia, presente en un 7.5% de la

poblacin estudiada. Estos resultados concuerdan con los reportados por MoralesLara, et al, en 2010, que present una distribucin de frecuencias similar a la
obtenida en este trabajo (51) con los genotipos F/F y F/V, aunque con el genotipo V/V
el presento una distribucin tres veces mayor a la obtenida

Verificacin de la pureza de la p30


Una vez extrada la p30, se corrobor su pureza por medio de electroforesis en geles
de poliacrilamida al 15% como puede observarse (figura 4), con la tincin utilizada se
observa hay una sola banda en el producto de electroelucin, correspondiente a la
p30.

Figura
2.
Electroforesis de la p30 electroeluida. Carril 1, MPM (invitrogen). Carril 2. Protenas
totales de S. typhimurium. Carril 3. p30 electroeluida.

Comparacin de los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en


pacientes con EA agrupados segn el genotipo FCGR3A
Para comprobar si alguno de los genotipos del receptor FCGR3A tena alguna
influencia en los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30, se procedi a comparar
los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con EA agrupados segn
el genotipo del receptor FCGR3A (figura 5), muestra que no hay diferencia
estadsticamente significativa entre los pacientes, por lo que se puede especular que
ninguno de los genotipos del receptor FCGR3A tiene influencia sobre los niveles de
anticuerpos IgG anti-p30 presentes en los pacientes con EA.

Figura 3. Comparacin de los anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con EA


agrupados segn el genotipo FCGR3A.

Correlacion entre anticuerpos IgG totales anti-p30 y BASDAI


No se encontr correlacin estadsticamente significativa entre los niveles de
anticuerpos IgG totales anti-p30 (medidos como absorbancia a 490 nm) en pacientes
con EA y el BASDAI (figura 6), por lo que se procedi agrupar a la poblacin por
genotipos, para observar si cada genotipo tena un comportamiento diferente o si
este era el mismo.

Figura 4. Correlacin de los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes


con EA y BASDAI.

Como se muestra en la figura 5, no se encontr correlacin significativa entre los


niveles de anticuerpos IgG anti-p30 de pacientes con EA y el BASDAI agrupados
segn el genotipo FCGR3A. Con el genotipo V/V no se determin la correlacin
debido a que solo tres pacientes presentaron este genotipo.

Figura 5. Correlacin entre los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 en pacientes con
EA y BASDAI agrupados segn el genotipo del receptor FCGR3A. (A), Correlacin entre
los anticuerpos IgG anti-p30 en pacientes con EA y BASDAI agrupado segn el genotipos
F/F de FCGR3A. (B), Correlacin entre los anticuerpos IgG anti-p30 en pacientes con EA y
BASDAI agrupados segn el genotipo V/V de FCGR3A. (C), Correlacin entre los
anticuerpos IgG anti-p30 en pacientes con EA y BASDAI agrupados segn el genotipo V/F
de FCGR3A.

De acuerdo con los resultados obtenidos se puede establecer que ninguno de los
genotipos del receptor FCGR3A tiene influencia significativa sobre los niveles de
anticuerpos IgG totales anti-p30 que se encuentran en los pacientes con EA y que los
anticuerpos IgG totales anti-p30 no influyen significativamente en el BASDAI. Aunque
no puede descartarse la influencia de los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 sobre
la secrecin de mediadores de inflamacin, o bien, de los niveles de subclases de
IgG anti-p30 con el BASDAI, ya que esta asociacin podra estar dada por las
funciones efectoras existentes entre en un determinado genotipo del receptor
FCGR3A y una de las subclases de IgG presente en los pacientes con EA, por lo que
sera necesario medir las variables inflamatorias que resulten de dicha interaccin

como: la protena C reactiva, interleucinas como IL-1 y IL-6, TNF-, entre otras y as
poder establecer si los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 (totales o subclases) y el
polimorfismo rs396991 del receptor FCGR3A tienen influencia sobre la actividad de la
enfermedad.

CONCLUSIONES

No se encontr diferencia estadsticamente significativa (p>0.05) en los niveles de


anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con EA agrupados segn el genotipo
del receptor FCGR3A.
No se encontr correlacin estadsticamente significativa (p>0.05) entre los niveles
de anticuerpos IgG totales anti-p30 y el BASDAI, en pacientes con EA agrupados
segn el genotipo del receptor FCGR3A.

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ANEXO
BASDAI (versin espaola) utilizando una escala con descriptores numricos (14).