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Cromatografa lquida de alta

presin, de alta resolucin de o


de alto precio

HPLC

HPLC
Al principio se seleccion la presin como
el criterio principal de la cromatografa
lquida y de ah su nombre: High Pressure
Liquid Chromatography.
Esto parecera indicar que se mejora el
comportamiento de la columna debido
principalmente a la elevada presin.

HPLC

HPLC
Esto no es cierto, la buena resolucin es
el resultado de la combinacin de muchos
factores: partculas muy pequeas
distribuidas en un intervalo de tamaos
angosto, tamao de poros uniforme, bajos
volmenes de inyeccin de muestras,
detectores de bajo volumen sensibles y
por supuesto, buen sistema de bombeo.

HPLC
Naturalmente, la presin se necesita para
permitir circular un determinado caudal de
la fase mvil, pues de otra manera, resulta
ser un factor negativo que no contribuye a
mejorar la separacin.

HPLC
Fase mvil : es un lquido
Hay cuatro tipos bsicos de
cromatografa:
- Particin o reparto.
- Adsorcin o lquida slido.
- Intercambio inico.
- Exclusin por tamao o permeacin por
geles.

HPLC Aplicaciones

Productos farmacuticos.
Productos qumicos.
Alimentos.
Toxicologa.
Ambiente.
Bioqumica.
Petroqumica.
Polmeros.

HPLC
Aplicabilidad a sustancias que son de
mucho inters para la industria, la ciencia
y el pblico.
Ejemplos : aminocidos, protenas, cidos
nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos,
drogas, terpenoides, pesticidas,
antibiticos, esteroides, especies rgano
metlicas y una variedad de sustancias
inorgnicas.

HPLC
Anlisis de compuestos voltiles y no
voltiles.
Determinacin de molculas neutras, o
inicas.
Aislamiento y purificacin de compuestos.
Separacin de compuestos
estrechamente relacionados.

HPLC
Usos generales
Separacin de una amplia variedad de
compuestos orgnicos, inorgnicos y
biolgicos, polmeros, compuestos
trmicamente lbiles y desde iones
pequeos hasta macromolculas.
Anlisis de impurezas.

HPLC
Medicin de niveles de compuestos
txicos (pesticidas, insecticidas).
Monitoreo de muestras ambientales.
Purificacin de compuestos en mezclas.
Separacin de polmeros y determinacin
de la distribucin de la masa molecular
relativa de los polmeros en una mezcla.

HPLC
Control de calidad.
Seguimiento de reacciones de sntesis.

HPLC
Cmo trabaja?
En la cromatografa, los solutos se
resuelven con velocidades diferenciales
de elucin a medida que pasan por la
columna cromatogrfica.
Separacin: distribucin del soluto entre la
fase mvil y la fase estacionaria.

HPLC
Es la tcnica analtica ms ampliamente usada,
siendo un proceso separativo basado en la
transferencia de masa del soluto entre la fase
estacionaria y la fase mvil.
Emplea una fase mvil lquida para separar los
componentes de una mezcla. Estos analitos, se
disuelven primero en un disolvente, y luego se
los fuerza a fluir a travs de una columna
cromatogrfica, mediante una presin elevada.

HPLC
En la columna, la muestra se resuelve en
sus componentes.
El grado de resolucin es importante,
pues depende del grado de interaccin
entre los componentes solubles y la fase
estacionaria.
La fase estacionaria se define como el
material de relleno inmvil en la columna.

Historia
Las primeras, incluyendo la de Tswett, se
efectuaron en columnas de vidrio con
dimetros de 1 a 5 cm y largos de 50 a
500 cm. Para asegurar caudales
razonables, el dimetro de las partculas
de la fase estacionaria estaba entre 150 y
200 m.

Cromatografa lquida

Columna: tubo de vidrio.


Relleno: carbonato de calcio pulverizado.
Muestra: extracto de hojas de plantas.
Fase mvil: ter de petrleo.
El nombre ha permanecido hasta hoy a
pesar que la mayor parte de los
compuestos analizados son incoloros.

Historia
Los cientficos se dieron cuenta que
aumentaba la eficiencia de la columna al
disminuir el tamao de partculas del
relleno.
A partir de 1960, aparece la HPLC con
dimetros de partculas del relleno entre
3 m y 10 m, empleando equipos ms
sofisticados, con mayores presiones.

HPLC
Es la ms utilizada de todas las tcnicas
separativas analticas. Las razones de la
popularidad del mtodo son:
Sensibilidad.
Adaptabilidad a determinaciones
cuantitativas precisas.
Adecuabilidad para separar especies no
voltiles o trmicamente frgiles.

Aplicaciones de cada tipo de HPLC


PM > 10 000: permeacin por geles y
cromatografa de fase inversa.
PM < 10 000 y especies inicas: cromatografa
por intercambio inico.
Especies no inicas, polares, pequeas
(separacin de miembros de series homlogas):
cromatografa por particin o reparto.
. Especies no polares e ismeros estructurales,
hidrocarburos alifticos de alcoholes
alifticos:cromatografa por adsorcin o
lquido slido..

Cromatografa

Tres componentes fundamentales:


MUESTRA.
FASE MVIL.
COLUMNA.

HPLC
Condiciones de la cromatografa:
Muestra: tamao.
Fase mvil: caudal; composicin.
Columna: largo y dimetro; relleno;
temperatura.

HPLC
Determinacin cualitativa y cuantitativa.
Mtodo no destructivo.

Limitaciones
La identificacin de compuestos puede
estar limitada si no se acopla con un
espectrmetro de masas.
La resolucin puede ser difcil de obtener
en muestras complejas.
Solamente se puede analizar una muestra
por vez.

Limitaciones
Las bandas no solamente se separan sino
que adems se ensanchan.
El ensanchamiento de las bandas se
puede minimizar si se realiza una
adecuada seleccin del tamao de las
partculas de la fase estacionaria y la
forma en que se rellena la columna.

Porqu la HPLC?
Tiempo: Una cromatografa clsica puede
tardar entre 2 y 12 h. Con HPLC, un
anlisis equivalente se reduce a 2 y 12
min.
Reproducibilidad: la clsica se debe
rellenar en cada anlisis, incrementando
la posibilidad de errores. Una columan de
HPLC se puede utilizar para cientos o
miles de muestras.

Porqu la HPLC?
Cuantificacin: la clsica fue y es an
una tcnica excelente para la preparacin
o purificacin de muestras, pero requiere
recoleccin adicional y anlisis para ser
til en un anlisis cuantitativo.
Con HPLC, los detectores on line proveen
informacin cuantitativa durante el curso
de la separacin.

Porqu la HPLC?
Sensibilidad: en la CL clsica, se
emplearon columnas largas y volmenes
grandes de fase mvil, con lo que se diluia
la muestra y eso limitaba la sensibilidad
de la tcnica.
La HPLC minimiza las columnas (son
miniaturas) y mantiene la dilucin en un
mnimo.

Fase mvil
El tipo y la composicin de la fase mvil
(eluyente) es una de las variables que
influyen en la separacin.
Las propiedades comunes a los diversos
disolventes que se emplean son:

Propiedades disolventes FM

Pureza.
Compatibilidad con el detector.
Solubilidad de la muestra.
Baja viscosidad.
Inercia qumica.
Precio razonable.

Eficiencia de la columna
Efecto del tamao de partculas del
relleno.
Ensanchamiento de banda extra columna.
Tamao de muestra.

Efecto del tamao de partculas


CM, coeficiente de transferencia de masa
de la fase mvil,es funcin del d2p que
conforman el relleno.
Se incrementa dramticamente la
eficiencia de la columna de HPLC, si
disminuye el dimetro de partcula.

HPLC
Ensanchamiento de banda extra columna,
en cromatografa lquida:
A veces ocurren fuera del relleno de la
columna, a medida que el soluto pasa por
tubos abiertos, tales como: el sistema de
inyeccin, la regin del detector y la
conexin de tuberas.

HPLC
El ensanchamiento surge por diferencia
de las velocidades del flujo entre capas
del lquido adyacente a las paredes y el
centro del tubo.
La difusin es ms lenta en el lquido que
en el gas, por eso se vuelve notable para
estos casos. (100 veces ms lenta).

Ensanchamiento extra columna

r2 u
Hex = -----------24 DM

HPLC
Efecto del tamao de la muestra sobre la
eficiencia (microgramos de muestra por
gramo de relleno).
Se nota el mejor comportamiento de la
cromatografa en fase inversa, en rellenos
ligados comparados con los otros.

Instrumentos para CL
Para obtener caudales de eluyente
razonables con rellenos de 2 m a 10 m,
es necesario emplear presiones de
bombeo de varios miles de psi.
Por eso, el equipo es ms elaborado y
caro, respecto de los otros tipos de
cromatografa.

HPLC

HPLC

Instrumentacin

Son 8 componentes bsicos:


Reservorios de la fase mvil.
Sistema de suministro de disolvente.
Elemento para introducir la muestra.
Columna.
Detector.
Reservorio del residuo.
Tuberas de conexin.
Computadora, integrador o registrador.

Reservorios de la fase mvil


* Uno o ms, recipientes limpios, inertes, de vidrio o acero
inoxidable.
Contienen generalmente 200 a 1000 ml de un
disolvente.
Equipados con un desgasificador (generalmente para O2
y N2), para eliminarlos pues interfieren formando
burbujas en la columna y en el sistema de deteccin.
Filtrado si es necesario, para eliminar las partculas
pequeas.
Con tapa que permita pasar la tubera.
Reactivos altamente purificados, grado HPLC.

Desgasificadores
Pueden ser un sistema de bombas de vaco, un
sistema de destilacin, aparatos para calentar y
agitar el disolvente, o sistemas de burbujeo en
que los gases son barridos de la disolucin por
finas burbujas de un gas inerte de baja
solubilidad (He).
A veces contienen un sistema de filtro de polvo
y material particulado de los disolventes.

Desgasificadores
Tanto los degasificadores como los filtros
pueden no ser parte del instrumento.

Separaciones
La que usa un solo disolvente de
composicin constante (o una mezcla), se
denomina elucin isocrtica.
Se mejora frecuentemente la eficiencia de
la separacin mediante la elucin por
gradiente.
En ella se emplean dos o a veces ms
disolventes, que difieren
significativamente en polaridad.

Separaciones
Se vara la relacin de los disolventes en una
manera programada, continuamente o en
etapas.
Actualmente, en los equipos hay reservorios de
donde salen dos o ms disolventes a una
cmara de mezclado a velocidades que varan
continuamente.
La relacin de los volmenes se puede alterar
linealmente o exponencialmente con el tiempo.

Separaciones
Las ms sencillas, se pueden realizar
usando la elucin isocrtica.
Para anlisis ms complejos, se requiere
la elucin por gradiente.
Se modifica la composicin de la fase
mvil a medida que ocurre la separacin.
Los compuestos altamente retenidos
eluyen menos rpidamente y los que son
eluidos primero quedan bien resueltos.

Ejemplos
La segunda es una elucin isocrtica con
una solucin 50 % (v/v) de metanol
agua.
La primera es para una elucin por
gradiente, que se inici con 40 : 60 de los
dos disolventes y luego la concentracin
de metanol se increment a una velocidad
de 8 %/min.

Ejemplos
La separacin se acorta significativamente
por la elucin por gradiente sin sacrificar
la resolucin de los picos iniciales.
Los efectos de la elucin por gradiente,
son semejantes a los efectos producidos
por la programacin de temperatura en la
cromatografa gaseosa.

HPLC
La elucin por gradiente, puede ser lineal,
convexa o cncava, o una secuencia
compleja de ellos.
Se generan de tres formas:
1) se miden cantidades de eluyente (hasta
4) en una cmara de mezclado antes de
llegar a la bomba de presin, que lo enva
a la columna.

HPLC
2) Se regula la cantidad de cada disolvente
mediante una vlvula proporcional. El disolvente
pasa a la bomba de alta presin y fluye hacia la
columna.
3) Se enva la muestra a un cmara de
mezclado de alta presin.
4) Si el mezclado se hace a baja presin, hay
problemas por la posible formacin de burbujas

Sistema de bombeo
Los requerimientos de presin son severos e
incluyen:
Generacin de presiones de hasta 6000 psi.
Salida libre de pulsos.
Caudales entre 0,1 ml/min a 10 ml/min.
Control de flujo y reproducibilidad de flujo de
0,5% o mejor.
Componentes resistentes a la corrosin (sellos
de acero inoxidable o Teflon).

Condiciones ambientales
Las altas presiones no constituyen un
peligro explosivo pues los lquidos no son
muy compresibles.
A lo sumo, la rotura puede producir una
prdida.

Bombas
Hay tres tipos:
Reciprocantes (caudal constante).
Tipo jeringa o de desplazamiento
(mecnicas).
Neumticas o de presin constante.

Bombas
Sistema de suministro de disolvente
(bomba)
Asegurar un suministro de caudal libre de
pulsos, constante, reproducible, preciso
Tipos:
1) de presin constante.
2) de caudal constante (la ms comn).

Bombas
Si se provocan pulsos en los flujos, estos
son indeseables pues:
* causan problemas a la hora de la
deteccin.
* impiden un buen anlisis cuantitativo.
* conducen a una temprana falla de la
columna.

Bomba reciprocante

Bombas reciprocantes
Se usan en el 90 % de los equipos,
consisten generalmente de una cmara
pequea, en la que el disolvente se
bombea hacia delante y hacia atrs
mediante un pistn movido por un motor.
Dos vlvulas que se abren y cierran
alternadamente, controlan el flujo del
disolvente hacia adentro y fuera de un
cilindro.

Bombas reciprocantes
En el movimiento hacia atrs, el pistn
aspira el eluyente desde el reservorio y
debido a las vlvulas de chequeo se cierra
la salida a la cmara de separacin.
Durante el avance, el eluyente es
empujado dentro de la columna y la
entrada del reservorio se cierra.

Bombas reciprocantes
El movimiento de bombeo del pistn
produce un flujo de pulsos que requiere
atenuacin.
Estas bombas generan una alta presin
de salida con caudales constantes y la
posibilidad de usar la elucin por
gradiente.

Bombas reciprocantes
Cmara de 35 l a 400 l de disolvente.
Con cabeza simple, el 50 % del tiempo la
fase mvil fluye hacia la columna y en el
otro 50 % se llena la cmara.
Con cabezas gemelas, operan desfasadas
180 y la fase mvil fluye hacia la
columna el 100 % del tiempo, libre de
pulsos.

Bombas reciprocantes
Desventajas: producen flujo con pulsos, que se
deben minimizar porque su presencia aparece
como ruido en la lnea base del cromatograma.
Ventajas: pequeo volumen interno (35 l a 400
l), presiones de salida de hasta 10 000 psi,
fcil adaptabilidad a elucin por gradiente y
caudales constantes, independientes de la
presin de la columna y viscosidad del
disolvente.

Bombas por desplazamiento


Consisten de cmaras tipo jeringa, grandes,
equipadas con un mbolo que es activado por
un mecanismo de tornillo con un motor en
etapas.
Presuriza un volumen finito de disolvente y
enva un flujo constante libre de pulsos al
sistema.
Producen un flujo que tiende a ser
independiente de la viscosidad y la presin, libre
de pulsos.

Bombas por desplazamiento


Desventajas:
Capacidad de disolvente limitada (250 ml).
Considerables inconvenientes cuando se
deben cambiar los disolventes.
Son caras.

Bombas neumticas
Se operan va presin de un gas. Un
pistn de gran rea mueve a otro de rea
pequea cuando acta la presin de una
lnea de gas.
La presin del gas es amplificada en la
relacin de las reas de las fuerzas de los
pistones y se introduce un lquido a alta
presin,a presin constante.

Bombas neumticas
Ventajas: Son baratas y libres de pulsos.
Si ocurre un bloqueo parcial en el sistema
ocurre una cada en el caudal pero la
presin se mantiene constante.
Desventajas: Tienen poca capacidad.
No sirven para elucin por gradiente y se
utilizan con presiones inferiores a 2000
psi.

Sistemas de control
Muchos equipos tienen elementos
controlados por computadora para medir
el caudal, determinando la cada de
presin en una restriccin colocada a la
salida de la bomba.
Cualquier diferencia con un valor prefijado
se usa para incrementar o disminuir la
velocidad del motor de la bomba.

Sistemas de programacin
Muchos equipos tienen un medio para
variar la composicin del disolvente ya
sea continuamente o en forma
escalonada.

Equipo

YouTube - High Performance Liquid Chromatography HPLC.url

HPLC

Sistemas de inyeccin de la
muestra
A menudo la precisin de la cromatografa
lquida est limitada por la reproducibilidad con
que se introducen las muestras en el relleno de
la columna.
El problema es mayor cuando se produce el
ensanchamiento de bandas por la sobrecarga
de la columna.
Por eso, los volmenes deben ser minsculos
(dcimas de microlitros hasta 500 l)
Conviene no despresurizar el sistema.

Sistemas de inyeccin de la
muestra
El medio ms simple e inicial para la
introduccin de la muestra, es la inyeccin
con jeringa a travs de un septum.
Con este fin, se emplean las microjeringas
diseadas para soportar presiones hasta
1500 psi.

Sistemas de inyeccin de la
muestra
En las inyecciones de flujo parado, se
interrumpe el flujo del disolvente
momentneamente, se elimina una
conexin en la cabeza de la columna y se
inyecta la muestra directamente en la
cabeza del relleno de la columna.
Despus del reemplazo de la conexin, se
presuriza el sistema nuevamente.

Ventajas y desventajas
Ventaja: su simplicidad.
Desventaja: la reproducibilidad de la
inyeccin de la jeringa es raramente
superior al 2% a 3% y es an peor.
El mtodo ms empleado de introduccin
de la muestra en la CL es mediante los
lazos de muestreo.

Lazos de muestreo
A menudo son una parte integral de los equipos
de la CL y tienen lazos intercambiables que
proveen una eleccin de los tamaos de la
muestra desde 5 hasta 500 L.
Los lazos de muestreo de este tipo permiten la
introduccin de muestras hasta 7 000 psi con
precisiones de algunas dcimas porcentuales
relativas.
Se disponen de vlvulas de inyeccin de las
micro muestras con lazos de muestreo, que
tienen volmenes de 0,5 a 5 L.

Muestras
Estado:
Debe estar en forma lquida para la
inyeccin en el instrumento; las muestras
slidas se deben disolver en un disolvente
compatible con las fases mvil y
estacionaria.

Muestras
Cantidad:
Se inyectan de 1 l a 100 l; generalmente 5 l
a 10 l; las cantidades en masa inyectadas
varan dependiendo de la sensibilidad y el rango
dinmico del detector.
Preparacin:
Se puede requerir una preparacin de la
muestra limitada o extensa, que queda definida
por la complejidad relativa de la muestra.

Preparacin de la muestra
Puede incluir cualquiera de las etapas
siguientes:
Dilucin.
Preconcentracin.
Filtracin.
Extraccin.
Ultrafiltracin.

Tiempo de anlisis
Est comprendido en un intervalo de
5 min a 2 h.
Generalmente ocurre entre 10 min y 25
min.
La preparacin de la muestra difiere de
una a otra. Puede ser extensa y requerir
ms tiempo que el anlisis mismo.

Anlisis
Requiere entrenamiento de manera de
optimizar las separaciones.
Se requiere a menudo la preparacin de la
muestra.

Columnas
Se construyen de acero inoxidable,
plstico, aunque a veces hay de vidrio. En
este caso, la presin mxima es 600 psi.
Los precios de la columnas rellenas varan
de 200 a 500 dlares.

Columnas analticas
La mayora de la columnas tiene entre
10 cm y 39 cm.
Normalmente son rectas con largos
adicionales, cuando se necesita, mediante
acoples de dos o ms columnas juntas.
El dimetro interior est comprendido
entre 4 mm y 10 mm.
Los tamaos de partcula del relleno ms
comunes son:3 m, 5 m 10 m.

Columnas analticas
Las columnas ms comunes de 25 cm de
largo, 4,6 mm de dimetro interior y con
relleno de partculas de 5 m, tienen entre
40 000 y 60 000 platos / m.
Se han producido an ms pequeas, con
largos de 3 cm a 7,5 cm. Pueden tener
hasta 100 000 platos/ m, con mucha
velocidad y consumo mnimo de
disolvente.

Columnas analticas

Columna de guardia o precolumna


Se coloca antes de la columna analtica
para incrementar su vida, eliminando el
material particulado y los contaminantes
del disolvente.
Adems, sirven para saturar la fase mvil
con la fase estacionaria de manera de
minimizar las prdidas del disolvente de la
columna analtica.

Columna de guardia o precolumna


La composicin del relleno de la columna de
guardia debe ser similar a la de la columna
analtica, pero el tamao de partculas es
generalmente ms grande, sin embargo, para
minimizar la cada de presin.
Cuando se contamina, se rellena nuevamente o
se descarta y reemplaza por una nueva del
mismo tipo.
Se la sacrifica para proteger a la columna
analtica, que es mucho ms cara.

Termostatos
Para muchas aplicaciones, no es necesario el
control de temperatura y las columnas operan a
la temperatura ambiente.
A menudo se obtienen mejores cromatogramas
si se la mantiene constante, desde la ambiente
hasta 150 C.
Pueden tener tambin baos con agua, con
temperatura constante.

Tipos de rellenos
Se han usado dos en CL:
Pelicular.
Partcula porosa.

Relleno pelicular
Consiste de bolillas esfricas, no porosas,
de vidrio o polmero, con dimetros tpicos
de 30 a 40 m.
Se deposita una delgada capa porosa de
slice, almina, una resina sinttica de
poliestireno divinil benceno o una resina
de intercambio inico, sobre la superficie
de estas bolillas.

Relleno pelicular
Para algunas aplicaciones, se aplica un
recubrimiento adicional, que consiste de
una fase estacionaria lquida que se
mantiene adsorbida.
Pueden tambin ser tratadas
qumicamente para dar una capa de
superficie orgnica.

Relleno pelicular
Se emplean ms para las columnas de
guardia y no tanto para las columnas
analticas.

Relleno poroso
Un relleno de partculas porosas tpico
para CL consiste de micropartculas
porosas que tienen dimetros entre 3 m
a 10 m.
Las partculas son de slice, almina, una
resina sinttica de poliestiereno divinil
benceno o una resina de intercambio
inico, con la primera como la ms
comn.

Relleno poroso
Se preparan las partculas de slice
aglomerando submicro partculas de slice
bajo condiciones que conducen a
partculas ms grandes que tiene
dimetros muy uniformes.
Las partculas resultantes se recubren a
menudo con pelculas orgnicas delgadas,
que son unidas qumica o fsicamente a la
superficie.

Detectores
A diferencia de la cromatografa gaseosa,
no tiene detectores universales y
confiables como los de ionizacin en llama
y conductividad trmica.

Tipos de Detectores
Hay dos categoras:
De propiedades masivas, por ejemplo, el ndice
de refraccin, la constante dielctrica o
densidad de la fase mvil, que es modulada por
la presencia de solutos.
De propiedades del soluto, como absorbancia
de radiacin UV, fluorescencia o corriente de
difusin, que no es poseda por la fase mvil.
Estos son ms sensibles que los primeros en el
orden de 1000 veces o ms

Detectores
El rol ms importante del detector de
HPLC es monitorear los solutos a medida
que eluyen.
Genera una seal elctrica, proporcional
al nivel de alguna propiedad de la fase
mvil o de solutos.

HPLC
Caractersticas necesarias de un buen detector
de HPLC
1) Sensibilidad.
2) Linealidad.
3) Predecibilidad en la respuesta.
4) Confiabilidad.
5) Indestructible.
6) Fcil de usar.
7) Bajo volumen muerto.

Detectores
En una encuesta de 1982, el 71 % eran de
absorcin de UV, 15 % de fluorescencia, 5,4 %
de ndice de refraccin, 4,3 % de medicin
electroqumica y 4,3 % para otros.
De radiacin UV, el 39 % se basaba en las
lneas de emisin de mercurio, el13 % radiacin
filtrada de una fuente de deuterio y 48 % de
radiacin emitida de un monocromador a red.

Detector de absorbancia de
radiacin UV
Ms del 70 % de los detectores de HPLC.
La seal es proporcional a la
concentracin del soluto.
Se detectan alquenos, compuestos
aromticos y aqullos que tienen uniones
mltiples de C, O, N, y S.
La fase mvil no debe interferir en la
deteccin.

HPLC

Detectores de absorbancia
Tienen forma de z.
Se mide la absorbancia de los eluyentes
de una columna y para minimizar el
ensanchamiento de banda, se mantiene el
volumen lo ms pequeo posible, entre
1 l y 10 l y largos de celda entre 2 mm y
10 mm.
Estn restringidos a presiones debajo de
600 psi.

Detector de absorbancia
Por eso, a menudo se requiere un
reductor de presin.
Muchos son de doble haz; un rayo pasa a
travs de la celda del eluyente y el otro a
travs de un filtro para reducir la
intensidad.
Se emplean detectores fotoelctricos para
comparar las intensidades de los dos
rayos.

Detector de absorbancia
Alternativamente, se puede usar un
chopper junto con un fototubo.
En cada caso, el cromatograma consiste
de un grfico de log de la relacin de las
dos seales transducidas como funcin
del tiempo.

Detector de absorbancia
Igualmente, se pueden encontrar
instrumentos de simple haz, en los cuales
se almacenan las mediciones de la
intensidad del sistema disolvente en la
memoria de una computadora y se la
emplea para los clculos de la
absorbancia.

Detectores de absorbancia en UV
con filtros
Fotmetros de filtro.
Fuente: lmpara de Hg.
La lnea intensa ms comn es a 254 nm,
aislada por los filtros.
Con algunos otros instrumentos, se
pueden emplear las lneas a 250, 313, 334
y 365 nm con sustitucin de filtros.

Detectores de absorbancia en UV
con filtros
Estn restringidos a aquellos solutos que
absorben a una de estas .
Muchos grupos funcionales orgnicos y un
nmero importante de especies
inorgnicas exhiben amplias bandas de
absorcin, que caen en una o ms de
estas longitudes de onda.

Detectores de absorbancia en UV
con filtros
Otra posibilidad es con fuentes de
deuterio o tungsteno con filtros de
interferencia que permiten detectar las
especies absorbentes a medida que
eluyen de la columna cromatogrfica.
Algunos equipos ms modernos tienen
ruedas de filtros que se pueden cambiar
rpidamente para detectar varias especies
a medida que eluyen.

Detectores de absorbancia en UV
con filtros
Estos son adecuados para anlisis
cuantitativos repetitivos, en los cuales se
conoce la composicin cualitativa, de
manera que se puede seleccionar una
secuencia adecuada de filtros.
A menudo estos cambios se realizan
mediante un control de computadora.

Detectores de absorbancia en UV
con monocromadores
Algunos pueden actuar en el UV
solamente y otros en el UV y el visible.
Se pueden elegir varios modos operativos.
Por ejemplo, se puede obtener el
cromatograma entero a una nica;
alternativamente, cuando los picos del
eluyente estn suficientemente separados
en el tiempo, se pueden elegir diferentes
para cada pico.

Detectores de absorbancia en UV
con monocromadores
Se usa el control con computadora para
seleccionar la mejor para cada eluyente.
Los ms poderosos son los de arreglo de
diodo.
Se permite recolectar datos de un
espectro entero en un segundo.

Detectores de absorbancia en UV
con monocromadores
Una forma de presentacin de los datos
espectrales es en un grfico tridimensional
que es til para identificar especies y
elegir las condiciones para una
determinacin cuantitativa.
Se obtuvieron los espectros en intervalos
sucesivos de 5 s.

Ejemplo
La aparicin y desaparicin de cada uno
de los tres esteroides en el eluyente es
claramente evidente.

Detectores de ndice de refraccin


El disolvente pasa a travs de una mitad de la
celda en su camino hacia la columna. El eluato
fluye a travs de la otra cmara.
Los dos compartimentos estn separados por
un plato de vidrio montados de manera que el
rayo incidente se desve si las dos disoluciones
difieren en ndices de refraccin.
El desplazamiento resultante del rayo con
respecto a la superficie fotosensible, provoca la
variacin en la seal de salida, que cuando se
amplifica y registra, provee el cromatograma.

HPLC

Detectores de ndice de refraccin


Desventajas: responden a casi todos los
solutos. Esto es, son detectores generales como
un detector de llama o de conductividad
elctrica en cromatografa gaseosa.
Pero, son confiables y no son afectados por el
caudal.
Sin embargo, son sensibles a la temperatura y
se los debe mantener a T constante
Adems, no son tan sensibles como los otros
tipos de detectores.

Cromatografa por particin


Es la ms usada.
Se puede subdividir en lquido - lquido y
de fase unida.
La diferencia surge en cmo se mantiene
la fase estacionaria unida a las partculas
del soporte de relleno.

Cromatografa por particin


En la lquido lquido, la fase estacionaria
es mantenida sobre la superficie de las
partculas del relleno por adsorcin fsica.
En la fase unida, se une qumicamente a
las partculas del soporte.

Cromatografa por particin


La ms antigua es la primera; ahora, la
segunda se ha vuelto predominante
debido a ciertas desventajas de la
primera.
Una desventaja de la lquido lquido es
la prdida de fase estacionaria por
disolucin en la fase mvil, lo que requiere
recubrimientos peridicos del soporte.

Columnas para cromatografa de


fase unida
Los soportes se preparan con slice rgido
o composiciones basadas en slice.
Se forman como partculas fuertes
mecnicamente, uniformes, porosas, de
3,5 10 m.
La superficie est ocupada por grupos
silanos Si OH.

Rellenos de fase normal y de fase


inversa
Se distinguen dos tipos segn las polaridades
de las fases mvil y estacionaria:
Fase estacionaria altamente polar (agua o
trietilenglicol) sobre soporte de partculas de
slice o almina; y, disolvente relativamente no
polar tal como el hexano o iso propil ter como
fase mvil.
Esta por razones histricas, se denomina
cromatografa de fase normal.

Cromatografa de fase inversa


La fase inversa es cuando la fase estacionaria
es no polar, a menudo un hidrocarburo y la fase
mvil es un disolvente polar, como el agua, el
metanol o el acetonitrilo.
En la cromatografa en fase normal, el
componente menos polar eluye primero (es ms
soluble en la fase mvil) y al aumentar la
polaridad de la fase mvil disminuye el tiempo
de retencin.

HPLC

Seleccin de columnas en
separaciones de Cromatografa de
particin
Debe haber un equilibrio entre los tres
participantes activos en el proceso
separativo:
Soluto.
Fase mvil.
Fase estacionaria.

Seleccin de la columna
Las fuerzas intermoleculares de describen
cualitativamente por el ndice de polaridad de
cada uno de los tres reactivos.
Las polaridades de varios grupos funcionales
analitos en orden creciente son : hidrocarburos
< teres < cetonas < aldehidos < amidas <
aminas < alcoholes.
El agua es ms polar que cualquier compuesto
que contiene esos grupos funcionales.

Desarrollo del mtodo


Tienden a ser ms complejos en la
cromatografa lquida que en la gaseosa
porque en una fase mvil lquida, los
componentes de la muestra interactan
con ambas fases. En cromatografa
lquida, influye si la fase mvil es
acetonitrilo, hexano o dioxano.

Desarrollo
Al elegir una columna, se compara la
polaridad de la fase estacionaria con la de
los analitos, por lo que se emplea una
fase mvil de polaridad
considerablemente diferente para la
elucin.

Seleccin de la fase mvil


El ms fcilmente manejable es el factor
de retencin (k) porque depende mucho
de la composicin de la fase mvil. Debe
estar entre 2 y 5, pero se puede expandir
entre 0,5 y 20.
A veces tambin es necesario variar los
factores de selectividad() alterando la
composicin de la fase mvil.

Efecto de la fuerza del disolvente


sobre k
Los disolventes que interactan
fuertemente con los solutos, se
denominan solventes polares o fuertes.
La forma de medir es a travs del ndice
de polaridad.(P) (cromatografa de
particin).
Es una medida de la polaridad relativa de
varios disolventes.

Indices de polaridad
La tabla da un listado de ndices de
polaridad y otras propiedades de un
nmero de disolventes que se usan en
cromatografa de particin.
Se puede manejar el factor de retencin
k , que se puede variar cambiando el
ndice de polaridad del disolvente.

Propiedades de algunos
disolventes de HPLC

HPLC

Cromatografa por adsorcin


Lquido slido.
Separacin de compuestos pequeos
solubles en disolventes no polares.
Se adsorben sobre la fase estacionaria y
se separan por la fuerza de adsorcin.
Fases estacionarias empleadas: almina y
slice.
En lugar del ndice de polaridad, se
emplea la fuerza del disolvente.

HPLC
Los tiempos de retencin son: olefinas
<hidrocarburos aromticos < haluros,
sulfuros < teres < nitrocompuestos <
steres = aldehidos = cetonas < alcoholes
= aminas < sulfonas < sulfoxidos < cidos
carboxlicos

Seleccin del disolvente para


Cromatografa por Adsorcin
La nica variable para optimizar k y , es la
composicin de la fase mvil, diferente de la
cromatografa de particin en la que el relleno
de la columna tiene un efecto pronunciado
sobre la ltima.
La fuerza del disolvente: el ndice de polaridad
puede servir como una gua aproximada de las
fuerzas de los disolventes. Una mejor es la
fuerza del eluyente, un parmetro que depende
del adsorbente.

Seleccin del sistema de


disolventes
Es semejante a la de particin, con un
disolvente con una fuerza alta y el otro
baja.
Se obtiene un buen valor de k variando la
relacin de los volmenes.
Lo nico que la fuerza del disolvente no
vara linealmente como lo hace el ndice
de polaridad, por lo que el clculo de las
mezclas es ms difcil.

Aplicaciones
Para compuestos no polares que tienen
un PM menor que 5 000.
Aunque puede haber superposicin con la
de particin, tienden a ser
complementarias.
Generalmente, es ms adecuada para
muestras solubles en disolventes no
polares y por eso tienen solubilidad
limitada en disolventes acuosos,

Aplicaciones
como los usados en fase inversa en
particin.
Es capaz de diferenciar compuestos
ismeros.

Cromatografa de intercambio
inico

Separacin de especies inicas o ionizables.


Columna: resina de intercambio inico.
Detectores: de conductividad elctrica.
Si la diferencia en conductividad es pequea, se
emplea una segunda columna; contiene una
segunda resina de intercambio inico que
convierte a los iones del disolvente en especies
con poca ionizacin.
Los iones de la muestra aumentan su
conductividad elctrica.

Cromatografa por intercambio


inico
Para separar y determinar iones basado
en resinas de intercambio
inico.(aninicas y catinicas)
El detector es de conductividad elctrica.
Las resinas sintticas datan de 1930 para
ablandamiento de aguas.

Cromatografa de intercambio
inico
El proceso se basa en el equilibrio de
intercambio entre iones en solucin y
otros del mismo signo en la superficie de
un slido rgido, insoluble, de alto PM.
Resinas de intercambio catinico: grupos
sulfnicos, SO3- H+, cido fuerte.
Grupo cido carboxlico: cido dbil.

Cromatografa de intercambio
inico
Resinas de intercambio aninico: grupos
amino terciarios N(CH3)3+OH- (base
fuerte) o primarios
- NH3+ OH- (base dbil).
- kint representa la afinidad de la resina por
B+ relativa a otro catin
(RSO3- B+)s(H+)aq
-

kint = ---------------------------------------(RSO3- H+)s (B+)aq

Valores de kint para resinas de


intercambio catinico sulfonadas
Orden decreciente:
Tl+> Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+> NH4+> Na+>
H+> Li+

Valores de kint para resinas de


base fuerte
Orden decreciente:
SO42- > C2O42 - > I- > NO3- > Br - > Cl- >
HCO2- > CH3CO2- > OH - > F-.

Rellenos
Son pequeas bolillas porosas, formadas
por la copolimerizacin del estireno y el
divinilbenceno. Este ltimo produce el
entrecruzamiento que brinda estabilidad
mecnica a las bolillas.
Para activar el polmero, se unen
qumicamente grupos funcionales cidos o
bsicos a la estructura.

HPLC

Cromatografa de exclusin por


tamao o permeacin por geles
Separacin de compuestos grandes tales como
polmeros y protenas de MMR elevados.
Las partculas del soluto difunden dentro de la
red de poros de la fase estacionaria, constituida
por pequeas partculas de polmero o slice.
Las molculas ms grandes que el tamao del
poro son excluidas y no son retenidas, mientras
que las pequeas quedan dentro.

Cromatografa de exclusin por


tamao o permeacin por geles
Fase estacionaria: geles orgnicos y
partculas basadas en slice : polmeros de
divinilbenceno estireno o poliacrilamida.
Tamao de poros: de 40 A a 2500 A
Curva de calibracin: se grafica MMR vs
volumen de retencin.