You are on page 1of 35

Genetisch materiaal

DNA (desoxyribonuclenezuur)
Cellen (~1014)
Chromosomen (bij de mens 46)
Opgebouwd uit genen, die coderen voor eiwitten
Beinvloed het uitzicht en functioneren v/e cel

Structuur van DNA


-

Dubbele helix structuur


Grote purine-basen:
o Adenine
o Guanine
Kleine pyrimidine-basen
o Cytosine
o Thymine (urasil bij RNA)
Complementariteit van de basen
o Adenine-thymine
o Guanine-cytosine
Binding tussen een purine en een pyrimidine is een waterstofbinding
3 fosfaatgroepen waarvan 2 verwijderd worden tijdens de opbouw van DNA
Suiker desoxyribose
Organische basen (adenine, cytosine, guanine, thymine)
DNA heeft op die manier de vorm van een wenteltrap met de basenparen als sporten
De complementaire strengen zijn antiparallel
o 3 -> 5
o 5 -> 3 = sense streng
Lengte wordt uitgedrukt in basenparen (bp) of kilobasen (kb) (1 kb = 1000 bp)

DNA is opgebouwd uit genen


o Intron: stukje DNA in een gen dat niet codeert voor een eiwit
o Exon: stukje DNA in een gen dat codeert voor een eiwit
o Codon: 3 opeenvolgende nucleotiden, codeert voor 1 AZ

DNA aanwezig in:


o Nucleus
o Plasmiden, chloroplasten, mitochondrin
DNA heeft 2 functies:
o Eiwitsynthese (transcriptie van DNA)
o (Zelf)replicatie

Replicatie van DNA

Replicatie van DNA: vermeerdering van DNA (1e belangrijke functie van DNA)
DNA bestaat uit 2 ketens nucleotiden
Deze ketens gaan verbroken worden (denaturatie) (enzym helicase)
DNA replicatie: vorming van een tweede streng complementair aan de eerste
Enzym DNA-polymerase vereist
Twee strengen aan elkaar door enzym ligase

Eiwitsynthese

DNA-transcriptie

= DNA naar RNA


RNA-polymerase: herkent startcodon v/h gen op de DNA streng
Deel helix (corresponderend met gen) wordt ontwonden
Ontdubbelen van de strengen
Enzym RNA-polymerase:
o Synthese mRNA corresponderend met template DNA
o Herkent het startcodon of beginpunt v/e gen op DNA keten
RNA transcriptie stopt wanneer een stopcodon is bereikt 'UAA', 'UAG', 'UGA'
Via splicing worden de introns verwijderd
mRNA komt los en migreert naar cytoplasma
Ligase: enzym dat de complementaire basen terug aan elkaar zet na de transcriptie, H-bruggen
tussen de basen gaan terug hersteld worden
Initiatie: promotor bestaande uit een TATA-box en een DNA regulatory sequentie van een bepaald
gen
Transcriptie factor wordt geactiveerd
activatie van co-activator eiwit complexen die de chromatine structuur openen
Terminatie: poly-A staart duidt op het einde van de RNA vorming

Verschil DNA en RNA:


Suiker desoxyribose
Thymine i.p.v. uracil
dubbele streng nucleotiden
Een DNA-molecuul bestaat uit duizenden nucleotiden
Langere levensduur
-

Suiker desoxyribose
Thymine i.p.v. uracil
dubbele streng nucleotiden
Een DNA-molecuul bestaat uit duizenden nucleotiden
Langere levensduur

3 vormen van RNA:


mRNA (messenger RNA): enkelstrengige keten die complementair is met het gen op het DNA
tRNA (transfer RNA): heel specifiek klaverblad-vormige molecule (75 tot 93 mononucleotiden) met
aan ene uiteinde een anticodon en aan het andere uiteinde een aanhechtingsplaats voor een AZ
rRNA (ribosomaal RNA): van belang bij het samenbrengen van mRNA en tRNA op de ribosomen

Translatie
-

eiwitten worden in cytoplasma gesynthetiseerd door ribosomen


DNA bevindt zich in de celkern
mRNA verplaatst zich naar het cytoplasma

Ribosomen
-

Ribosomen op het ruw endoplasmatisch reticulum


Ribosomen vrij in het cytoplasma
Bestaan uit 2 delen (groot en klein)
o Klein: binden van mRNA (zonder mRNA zin 2 onderdelen los v elkaar)
o Groot: bestaat uit enzym dat peptidebanden tussen de AZ vormt

mRNA
-

tRNA
-

is een kopie van een deel van het DNA (van een actief gen)
migreert via het cytoplasma naar het ribosoom en brengt de genetische code over

transport AZ -> ribosoom


triplet bepaald aan welk deel mRNA het wordt gebonden
ieder tRNA vervoert 1 welbepaald AZ

Verschillende stappen eiwitsynthese (translatie)


-

mRNA door het ribosoom afgelezen


tRNA voert aminozuren aan
anticodon van tRNA koppelt aan een triplet (codon) van het mRNA
m.b.v. enzym (peptidyl-transferase) worden de aminozuren aan elkaar gekoppeld
de eiwitvorming start vanuit het triplet AUG (startcodon) en eindigt bij stopcodon (UAA, UAG en
UGA)

Expressie van genen


-

Alle cellen hebben zelfde genen


Andere expressie afhankelijk van:
o Plaats in het lichaam
o Tijdstip
Huishoudgenen: staan in vr basisfuncties v/e cel
Specifieke genen
Controlemechanisme dat de expressie van genen regelt

Korte definities
-

Gen= de basesequentie die 1 eiwit codeert


Locus= plaats van een gen in het genoom (en dus op de chromosomen)
Nucleotide= molecule die bestaat uit een suiker (ribose (RNA) of deoxyribose (DNA)), fosfaat en
een base (purine of pyrimidine)
Oligonucleotide= enkele nucleotiden aan elkaar
Polynucleotiden= heel veel nucleotiden na elkaar (vb. DNA en RNA)
Polymorfisme= fenomeen dat 1 gen verschillende expressies kan hebben (zo zijn er geen 2 dieren
aan elkaar gelijk)
Allel= de bepaalde vorm van een gen
Vermits een mens gepaarde chromosomen heeft kunnen de allelen gelijk of verschillend zijn
Exo- en endonucleasen: enzymen die het DNA verknippen respectievelijk aan de uiteinden en
binnen de DNA-streng
Restrictie-enzymen= endonucleasen die een bepaalde basensequentie in het DNA herkennen en
slechts dit DNA verknippen

Virussen

Geschiedenis
-

Virussen voor het eerst beschreven in 1892:


o TMV kan andere planten infecteren
o Kan niet verwijderd worden door te filteren over een bacteriefilter
o Term virus door het infectieuze principe (vloeibaar levende smetstof), kleiner dan
bacterie
1915: beschrijving van virussen die bacterin als gastheer hebben: bacteriofaag
1935: TMV zuivering en kristallisatie
Virus is een nucleoprotene (nuclenezuur (RNA of DNA), en eiwit)
Virussen kunnen kleine filters niet passeren
Zichtbaar met elektronenmicroscoop
Levend of niet?
o Cel wordt als kleinste levende eenheid gezien, virussen zijn producten van cellen, door
inbreng virusnuclenezuur, virussen zijn proto-organismen

Structuur en samenstelling
-

Grootte: 20-300 nm

Plantenvirussen:
RNA: enkelstrengig (of dubbelstrengig)
Soms DNA: dubbelstrengig (of enkelstrengig)
Dierenvirussen:
DNA: dubbelstrengig (of enkelstrengig)
RNA: enkelstrengig (of dubbelstrengig)

Bouw
-

Virion= rijp infectieus virusdeeltje (virus)


Kern van 1 soort nuclenezuur (RNA of DNA)
Capside, eiwitmantel of eiwitkapsel: eiwitten op een geordende wijze het nuclenezuur
omkapselen (staafje, veelvlak of ingewikkeldere vorm)
Envelop: kapsel, huls of mantel rond capside, bevat eiwitten met een enzymatische functie
Nucleinezuur + eiwitkapsel = nucleocapside
Lipiden, glycoprotenen, polyaminen (structuren die niet steeds aanwezig zijn)
Bacteriofagen: kop, staart, staartfibrillen, heeft bacterie als gastheer

Functie envelop of capside:


Bepaalt de vorm van het virion
Beschermt nuclenezuur tegen ongunstige milieu-invloeden
Functie bij het binnendringen van het virus in de cel
Ook eiwitten met een enzymatische functie, bv. voor oplossen celwand, reverse transcriptase bij
retro-virussen,

Dissociatie en associatie

Virussen kunnen experimenteel gesplitst worden


Nuclenezuur, eiwit individuele capsomeren
Naakte nuclenezuren: kunnen in een gevoelige cel opnieuw volledige virionen vormen erfelijke
informatie zit vervat in nuclenezuur
Zelf-assemblage: buiten de cel uit de gedissocieerde componenten weer complete virionen
opbouwen, omdat de informatie nodig voor de vorm van de capside in de structuur van de
individuele bouwstenen besloten ligt

Virusinfectie
-

Vermeerdering van virusdeeltje: enkel in levende cellen


Enzymen en celstructuren nodig voor de aanmaak van virus DNA en viruseiwit worden van de
gastheercel geleend

Stadia:
Aanhechting
o Op bepaalde, specifieke plaatsen van de celmembraan
o Sommige virussen hebben herkenbare aanhechtingsstructuren (staartfibrillen bij
bacteriofagen, penton fibers bij adenovirussen, )
o Aanhechting van 1 virusdeeltje voldoende om het infectieproces in de cel op gang te
zetten
o Geen aanhechting -> geen infectie
o Enkel cellen met juiste aanhechtingsplaats zij gevoelig voor infectie v dat virus

Penetratie
o Na aanhechting aan de celmembraan dringt het virion de cel binnen
o 2 verschillende mechanismen in dierlijke cel
Endocytose: virus maakt gebruik van de bestaande celactiviteit, nodig om
macromoleculen op te nemen. Door afsnoering van de membraan wordt een
coated vesicle gevormd. Virusenvelop wordt aangetast en nucleocapside komt
vrij in cytoplasma
Penetratie door fusie: fusie tussen membraan en virusenvelop: nucleocapside
komt direct in cytoplasma
o Welk mechanisme meest effectief: niet duidelijk
o Meeste virionen die binnendringen, brengen geen vermenigvuldiging teweeg
o Penetratie in plant en bacterie is moeilijker door de aanwezigheid van een celwand
o Plantenvirussen in plantencel via insecten
o Bacteriofagen injecteren nuclenezuren direct in de bacteriecel, staart is injectienaald
Vermenigvuldiging
o Synthese van de viruscomponenten zeer strikt
o Processen die in gang worden gezet: afhankelijk van het soort virus/nuclenezuur
o Replicatiestrategie afhankelijk van:
Type nuclenezuur (enkelstrenig of dubbelstrengig DNA, enkelstrenig of
dubbelstrenig RNA)
Polariteit van het nuclenezuur
o Virale genetische component DNA (vb. adenovirus)
DNA dient als matrijs voor vermeerdering DNA (DNA replicatie)
DNA ook via transcriptie RNA
mRNA wordt door de cellulaire ribosomen vertaald (translatie) naar virusspecifieke enzymen en structurele eiwitten
o enkelstrenig DNA (parvovirussen) (klein genoom)
ssDNA wordt omgevormd naar dsDNA
dsDNA dient opnieuw voor de zelfreplicatie van DNA
Het dsDNA wordt via transcriptie omgezet naar mRNA, dat dan via translatie de
nodige virale enzymes en bouwstenen manteleiwitten levert
o Genetische component van het virion ssRNA
Positief enkelstrengs RNA-virussen (vb. picornavirussen): viraal RNA heeft
dezelfde polariteit als het mRNA
Virus RNA zal vertaald worden in enzymen die de productie van viraal
RNA verzorgen
RNA dient tevens als mRNA en de synthese van virusspecifieke eiwitten
op volgende wijze
o mRNA wordt vertaald op discontinue wijze, zodat een aantal
afzonderlijke eiwitten wordt gevormd, 1 eiwit voor ieder gen
o mRNA wordt vertaald in 1 grote polypeptideketen, die dan
verdeeld wordt in een aantal eiwitten met verschillende functies
(o.a. virus replicatie)
Negatief enkelstrengs RNA-virussen (vb. paramyxovirussen, rhabdovirussen,
arenavirussen): polariteit van het virus RNA is tegengesteld aan het viraal mRNA,
virus RNA kan niet zomaar dienst doen als mRNA
Deze groep virussen bevat een enzym dat zorgt voor de synthese van de
complementaire RNA-streng, die als mRNA fungeert
Daarna zelfde als bij de positieve enkelstrengs RNA-virussen
o Dubbelstrengs RNA virussen: vb. reovirussen: viraal enzym om enkelstrengs RNA te
vormen, daarna opnieuw replicatie dsRNA
o eigenschappen van RNA- als DNA-virussen: genoom bestaat uit ssRNA
RNA via reversed transcriptase naar DNA
DNA in cellulair genoom gastheer
Verandert de normale gastcel in een tumorcel

Assemblage
o Bij voldoende virus-nuclenezuur en virusspecifieke bouwstenen in de cel: spontaan
assemblage van de virusdeeltjes
Rijping
o Wanneer er voldoende virusdeeltjes in de cel zijn: zullen zij de cel verlaten om nieuwe
infectiecyclus te starten
Door afbraak eigen celcomponent krijgen we lyse van de genfecteerde cel
virusdeeltjes in omgeving
Virus treedt naar buiten via tubulaire structuren
Virusdeeltjes rijpen aan het plasmamembraan en worden via een uitstulping van
de membraan (budding) aan de omgeving vrijgegeven
o Bij bacterin: lysogene infectie door gematigde fagen:
Replicatie van de virus onderdrukt, DNA gaat deel uitmaken van het genoom van
de bacterie
Gebeurt ook soms bij bepaalde virussen bij dieren
Provirus
Dit kan leiden tot een transformatie van de cel, waarbij deze een ongeremde
delingsactiviteit gaat vertonen

Genetisch materiaal bij prokaryoten


-

Vrij centraal in cytoplasma


Nucleode: 1 enkel cirkelvormige DNA, molecule, geen eiwit
Plasmide: klein circulair DNA, enkele genen, onafhankelijke replicatie, vaak resistentie-genen
(weerstand tegen antibiotica). Kan gemakkelijk aangepast worden

DNA bij eukaryoten


Algemeen
-

Chromatine-materiaal: DNA gekoppeld aan arsenaal v eiwitten


Chromosomen: dragers van genen
Zichtbaar maken bij delende cellen via Giemsa kleuring
Tijdens metafase: steeds 2 chromatiden
Karyogram: rangschikking van de chromosomen naar grootte en vorm
o wordt in genetisch onderzoek frequent gebruikt:
Pre-nataal onderzoek: trisomie 21, turner-syndroom, andere geslachtsafwijkingen,
trisomien,
Kankeronderzoek: opsporen afwijkingen karakteristiek voor een bepaalde soort
kanker
Heterochromatine: sterk gekleurde delen
Euchromatine: licht gekleurde delen
Meeste eukaryoten: 2 exemplaren van chromosomen (diplod) (2n)
Eencelligen, schimmels (haplod) (n)
Menselijk genoom: 46 chromosomen, 3,2.109 baseparen, 25 000 30 000 genen

Celcyclus:
G1-fase: cel neemt 20% in omvang toe, defecten in DNA repareren, enzymen voor DNA replicatie
aanmaken (8 u)
S-fase: DNA duplicatie (8 u)
G2-fase: enzymen voor mitose aanmaken, organellen bijmaken, cel groeit (3 u)
G1, S, G2-fase: interfase: controle van de processen door enzymen, met eventuele afdoding van de
cel als er fouten optreden
M-fase: kerndeling (1 u)
o Profase: DNA moleculen spiriliseren, chromosomen worden zichtbaar
o Metafase: chromosomen verplaatsen naar middenvlak
o Anafase: chromatiden uit elkaar getrokken
o Telofase: chromatiden naar polen
o Cytokinese: nieuw kernmembraan
G0-fase: rustfase

DNA en histonen
-

DNA-moleculen eukaryoten > DNA-moleculen prokaryoten


Lineair (behalve plasmiden circulair)
Geassocieerd met eiwitten (histonen en niet-histonen) en fracties RNA
Cel bevat uitgerold 2 meter lang DNA-molecule
Geheel van DNA en nucleosomen: chromatine
Chromatine: opgebouwd uit nucleosomen
1 nucleosoom: opgebouwd uit 8 histonen (octameer)
Core-DNA: binnenste DNA: DNA rond dit histoncomplex in een 1 winding, die gemiddeld 140 bp
bevat
linker-DNA: verbinden de nucleosomen, ongeveer 60bp
Per nucleosoom= ongeveer 200 bp
Condensatie in heterochromatine sterker dan in euchromatine
Dankzij nucleosomen kan de DNA-molecule in een cel passen
Door die compacte verstrenging: DNA zit effectief op slot en kan niet gelezen worden
openen en sluiten van DNA gebeurt door chemische sleutels, waaronder methyl en acetyl (DNA
komt zo minder strak rond eiwitbolletjes)
Om de chemische sleutels in en uit slot te krijgen: enzymen nodig
Nucleosomen bestaan uit vier verschillende eiwitten, histonen genaamd, met meerdere
bindingsplaatsen voor chemische groepen

(1. Enkelvoudig DNA, 2. Chromatine (DNA met nucleosoom), 3. Nucleosoom)


Histonen
Hoog gehalte basische aminozuren (20 tot 30%)
Spelen een belangrijke rol in de structuur van chromatine
Interactie tussen de positief geladen histonen en de negatief geladen fosfaatgroep van DNA
In kop spermacellen histonen vervangen door protaminen waardoor een nog compactere
structuur mogelijk
Histon H1 (n type): bevindt zich aan de buitenzijde van het nucleosoom bij het linker-DNA,
betrokken bij het handhaven van de nucleosoomstructuur
Histonen vormen als het ware 'klosjes' waar het lange DNA-molecule omheen is gewonden
Ze spelen een belangrijke rol bij het samentrekken (condenseren) van het DNA, zodat een
chromosoom kan ontstaan
Histoneiwitten per lengte-eenheid constant
Hoeveelheid niet-histoneiwitten ~ activiteit van het DNA
Verschil pro- en eukaryoten op vlak van DNA?
Prokaryoot
Centraal in cytoplasma
plasmiden

Eukaryoot
Gekoppeld aan eiwitten= chromatine
Diplod en haplod

Hoe is chromatine, nucleosoom opgebouwd?


Chromatine: opgebouwd uit nucleosomen
1 nucleosoom: opgebouwd uit 8 histonen (octameer)
Wat is een karyogram?
Rangschikking van de chromosomen naar grootte en vorm

Enzymen en nuclenezuren
-

In elke cel zijn enzymen aanwezig die nuclenezuurmoleculen als substraat hebben
Enzymen kunnen die nuclenezuren veranderen, vb. methyleren van DNA, aan elkaar koppelen van
DNA-fragmenten, repliceren van DNA, synthetiseren van RNA
In labo: enzymen aanwenden om DNA en RNA te veranderen of synthetiseren

Groepen goed kennen!


Vijf groepen:
Toposomerasen
Ligasen
Modificerende enzymen
Nucleasen
Polymerasen

Toposomerasen
-

Kunnen het aantal windingen van een DNA-molecule veranderen door het aanbrengen van een
knip in n of in beide strengen van de DNA-molecule
Knipplaatsen kunnen dus voorkomen in zowel lineair als circulair DNA
Komen voor in pro- als eukaryoten
Relaxed DNA super-coiled DNA
Mate van supercoiling: bepaald door de antagonistische werking van de beide enzymes
Overgang van superhelix-vorm naar meer relaxed vorm: energie komt vrij
Aanbrengen van torsie: kost energie
Twee types:
o Toposomerase I: werkt alleen in op DNA met negatieve supercoiling, draait deze rechts
om de andere streng heen en lijmt vervolgens de breuk, aantal negatieve windingen
neemt toe of af met 1
o Toposomerase II: knipt in beide strengen, het aantal negatieve windingen neemt toe (af)
met 2

Ligasen

= lijm-enzymen, kunnen fragmenten van nuclenezuren aan elkaar koppelen


Herstel van breuken van DNA
Aanbrengen van fosfodisterbinding tussen 2 opeenvolgende nucleotiden
Energierijke verbindingen vereist: ATP
Belangrijk bij recombinant technologie

Modificerende enzymen
-

Enzymes die geringe veranderingen bij nuclenezuren kunnen aanbrengen door verwijdering of
toevoeging v/e methylgroep
Methylasen: brengen methylgroepen aan op bepaalde basen, blokkeren zo de werking van
bepaalde restrictie-enzymes
Alkalische fosfatase (AP): verwijdering van de fosfaatgroep aan het 5-einde van een DNAmolecule
o AP gaat in vitro een 5 fosfaatgroep verwijderen die dan bv. door een radioactief gelabelde
fosfaatgroep kan vervangen worden
o AP dient ook om herstel van een aangebrachte knip in het DNA-molecule te voorkomen

Polynucleotide-kinase (PNK): additie van een fosfaatgroep aan het 5-uiteinde, in vitro meestal een
gelabelde fosfaatgroep
Terminaal-transferase: enzym zorgt voor additie van 1 of meer desoxyribonucleotiden aan 3
uiteinde DNA molecule

Nucleasen
-

Enzymen die nuclenezuren afbreken door het verbreken van de fosfodisterbindingen


! Exonucleasen: knippen vanaf het uiteinde steeds 1 nucleotide af, kunnen circulair DNA niet
knippen
! Endonucleasen: splitsen fosfodisterbindingen binnen de nucleotidenketen
! Restrictie-enzymes: herkennen specifieke sequentie
! DNasen
! RNasen: hittebestendig, zijn pas onwerkzaam na 4u bij 250C

Polymerasen
-

Enzymes die nucleotiden kunnen polymeriseren tot polynucleotiden


DNA-polymerasen:
o bezitten ook exonuclease-activiteit i.v.m. de te verrichte DNA-reparatie
o Betrokken bij repliceren en repareren
RNA-polymerasen:
o Kunnen niet tijdens synthese gemaakte fouten repareren
RNA-moleculen hebben kortere levensduur de eventuele fouten hebben minder grote gevolgen
RNA-virussen geven fouten wel door op nageslacht: mutatiefrequentie is groter dan bij DNAvirussen
DNA-polymerasen polymeriseren in de richting 5 3, exonuclease activiteit in beide richtingen
Reverse transcriptase (RT)
o Heeft RNA als matrijs en wordt aangetroffen bij retro-virussen
o In vivo: zet RNA-virus om in DNA-fragment, zodat dit in de gastheer kan worden
ingebouwd
o In vitro: mRNA om te zetten in complementair DNA (cDNA)

Werking antibiotica
-

Eiwitsynthese van prokaryoten stoppen zonder deze van eukaryoten aan te tasten
Peptidyl-transferase uit de ribosomen van prokaryoten meer gevoelig voor het antibioticum
chlooramfenicol dan analoge enzym bij eukaryoten
Remming peptidyl-transferase: aaneenschakeling van AZ voorkomen
Streptomycine: verhindert een correcte start eiwitsynthese prokaryoten
tRNA kan niet binden waardoor een misreading van mRNA gebeurt
Puromycine: voortijdige stop eiwitsynthese bij zowel pro- als eukaryoten, tRNA kan geen AZ meer
inbouwen

Veranderingen in het genetisch materiaal


-

DNA-diagnostiek = verschillende toepassingsgebieden waarin een diagnose wordt gesteld op basis


van DNA-onderzoek
Vele aandoeningen hebben genetische oorsprong
Mutaties
o Ioniserende straling, bepaalde chemische stoffen,
Variaties tussen mensen
o SNPs (single nucleotide polymorphisms): subtiele verschillen op DNA-niveau tussen
individuen
Liggen verspreid over de 46 chromosomen
Gemiddeld genomen ~ 10 miljoen bp verschillend tussen 2 individuen
Variatie van 1/300
o CNVs: copy number variations: repeterende stukken DNA die voor variaties zorgen

Veranderingen in de genen
-

Veranderingen in de genen: mutatie


Deletie: verwijdering van 1 of meerdere nucleotiden. Vb. mucoviscidoseMutatie: veranderingen in
de genen
Additie of insertie: toename van nucleotiden in de keten. Vb. ziekte van Huntington
Puntmutatie: vervanging van een nucleotide door een ander
Gevolg van mutatie:
o Silent mutation: mutatie verandert de DNA-code, maar verandert niets aan het eiwit dat
wordt gesynthetiseerd -> gn probleem
o Missense mutation: mutatie resulteert in een wijziging v/e aminozuur v/h eiwit
o Nonsense mutation: mutatie resulteert in een voortijdig stopcodon die de eiwitsynthese
voortijdig doet stoppen
o Frameshift mutation: gevolg v/e deletie of additie v/e basenparen met een getal
verschillend v/e veelvoud v 3, zodat totaal andere combinaties v codons ontstaan die
resulteren in een totaal andere combinatie v AZ

Veranderingen in de chromosomen
Structurele veranderingen
-

Deletie: verwijdering van een deel of een volledig chromosoom. Vb: Angelman syndroom/PraderWilli
Duplicatie: chromosoom wordt langer door een deel chromosoom dat zich verdubbeld
Translocatie: uitwisseling van chromosomaal materiaal tussen 2 chromosomen
Inversie: het uitknippen van een deel van de dubbele helix, waarna dit deel wordt teruggeplaatst
op dezelfde plaats maar met de andere orintatie

Veranderingen in aantal
-

Polyplodie: het aantal van alle chromosomen is veranderd


o Niet leefbaar in dieren
o Komt wel voor bij planten
Polysomie: het aantal van 1 of enkele chromosomen is veranderd
Trisomie: 3 i.p.v. 2 chromosomen
Monosomie: 1 i.p.v. 2 chromosomen. Vb: Turner syndroom

Verschil in genetische en chromosomale aandoeningen +vb.

Erfelijke aandoeningen
-

Microscopisch waarneembare chromosoomafwijkingen: karyogram of FISH


Multigene aandoeningen: meerdere genen betrokken: sommige kankers, alzheimer, hart- en
vaatziekten
Monogene aandoeningen: 1 gen betrokken
o 5000 beschreven
o Meest onderzocht

Biotechnologische technieken
-

PCR (polymerase chain reaction)


DNA-sequentie opsporen
DNA-diagnostiek
Fingerprinting
Genetische modificatie
Klonen bij dieren
Transgene dieren
Cel- en weefseltherapie

PCR (polymerase chain reaction)


-

1980 ontwikkeld door Carry Mullis


Exponentieel vermenigvuldigen van een DNA-fragment
Polymerase ketting reactie: cyclisch proces
2 primers nodig:
o oligonucleotiden van ongeveer een 20 tal basenparen met gekende sequentie die passen
op de uiteinden van de te vermeerderen DNA-sequentie
Gebruik PCR techniek bevorderd dankzij ontdekking van thermostabiele DNA-polymerase uit de
bacterie Thermus aquaticus
Deze bacterie leeft in omgeving van heetwaterbronnen en kan temperaturen van iets meer dan
90C doorstaan
enzyme van deze bacterie (Taq-DNA-polymerase of Taq-polymerase) blijft stabiel na denaturatie
2 primers: aan elke kant van target-DNA
na hybridisatie vanaf elke primer polymerisatie in de richting 3' 5'
Opstellen primers:
o nucleotidensequenties van target-DNA kennen
o complementaire sequenties moeten zeer specifiek zijn (alleen voor vermeerdering targetDNA)
o Primers zijn niet gelijk, nieuwe strengen worden in tegengestelde zin gesynthetiseerd

Cyclische verandering:
Denaturatie (> 90C): hoge temperatuur doet de complementaire strengen uit elkaar wijken
Annealing (~55C): (primebinding) primers hechten zich aan de complementaire sequentie
Primer extension (~72C): optimale temperatuur om door enzyme polymerase dNTPs vanaf de
primers in te bouwen
Deze 3 stappen worden gedurende verscheidene cycli herhaald (n cycli geeft 2n fragmenten)

Bestanddelen:
DNA-polymerase (uit thermofiele bacterie)
DNA-template (enkele ng genoeg)
2 primers
dNTPs
Buffer
Mg2+-ionen (vaak reeds aanwezig in buffer)
Minerale olie: vormt laagje op reactiemengsel en voorkomt verdamping en condensatie
In nieuwe toestellen is geen minerale olie meer nodig, vermits deksel verwarmd wordt om
verdamping tegen te gaan
Voordelen:
Weinig DNA nodig (reeds voldoende met enkele ng)
DNA mag gedeeltelijk gedegradeerd zijn
Zeer snel en zeer makkelijk
Via RT-PCR (reversed transcriptase PCR) kan mRNA omgezet worden in DNA en dit dan gebruikt
worden in PCR (introns zijn niet meer aanwezig in RNA en maakt het soms makkelijker om
genherschikkingen op te sporen)
Nadelen:
Mispriming (primers die op verkeerde plaatsen binden) bij lage temperatuur:
o Kan verholpen worden met een hot start
o Primers met voldoende GC (hogere annealing)
Contaminatie van een negatief staal
o Pre- en post-PCR scheiden
o PCR ruimtes DNA en RNA vrijmaken door UV-bestraling (UV maakt alles kapot)
o Nieuwe technieken waarbij PCR producten gevalueerd worden zonder openen epjes
Evaluatie v/d PCR producten
Agarose of polyacrylamide gel elektroforese (polysaccharide opgekookt en opgesteven)
Scheidt de DNA fragmenten volgens grootte
Elektrische stroom zorgt voor migratie van de fragmenten door de agarose of polyacrylamide gel:
DNA is negatief en migreert naar positieve pool van een stroombron
Kleinste fragmenten migreren sneller
DNA ladder

Amplificeren van RNA

RNA vermeerderen gaat ook, mr dan is er 1 stap extra in de cyclus: eerst RNA omzetten naar DNA en dan
PCR-cyclus.
= RT-PCR
Toepassingen:
Opsporen genherschikkingen waarbij de breuken in de intronen tss de exonen aanwezig zijn

Productie chymosine vertrekkende van mRNA uit cellen kalvermagen

Aanvullende technieken

Kwantitieve real-time PCR (Q-PCR):


PCR waarbij op ieder moment de toename van het aantal kopien gedetecteerd wordt
Oorspronkelijke DNA concentratie
in vaststellen
viral load (aantal virusdeeltjes bij bv. AIDS patinten, aangetaste gewassen)
minimal residual disease (het vaststellen van het aantal kopien van het gemuteerde DNA bij het
opvolgen van leukemie patinten)
Bepaling hoeveelheid ggos, allergenen in voedingsmiddelen
Kleurstof dat bindt met ds DNA
Intensiteit van de kleurstof ~ gevormd PCR product
Werkwijze:
o DNA-probe complementair aan target DNA, niet verlengt met DNA polymerase
o Bevat quencher en reporter
o Verloop fluorescentie vergelijken met een gekende standaardreeks
o 2 primers + DNA-probe
Voordelen:
o Kwantificatie
o Geen gel-electroforese nodig
o Minder kans op contaminatie
o Enkel kwantificatie van juiste PCR product (door gebruik probe)

Verschilpunten met Taqman probe:


o Zelfde voordelen als Taqman maar minder specifiek (alle PCR product wordt gemeten)
o Goedkoper (geen dure probe nodig)
Probe hybridiseren met het gevormde DNA tijdens annealing
Intensiteit van de kleurstof probe ~ gevormd PCR product

Andere veel gebruikte PCR technieken


Inverse PCR

Asymmetrische PCR
Sterk verschillende concentratie van de 2 primers, daardoor ontstaat uiteindelijk veel ssDNA

Aanhangsels aan het 5-einde van de primers


(vb. een restrictieplaats, promotor plaats, stopcodon)

Gelokaliseerde mutagenese
Doelbewust aangebrachte veranderingen in primer die dan een lagere annealingstemp. op het DNA zal
binden en teruggevonden wordt in het geamplificeerde DNA.

Toepassingen PCR
-

DNA-diagnostiek
Screening op virussen, zoals IBR (bovine herpesvirus), BVD (bovine viraal diarree) en bacterin
zoals TBC, brucellose,
Screening op defecte genen zoals deleties of translocaties
Identificaties in de gerechtelijke geneeskunde of om sanitaire redenen

DNA-sequentie analyse
-

= Bepaling precieze opeenvolging van nucleotiden in DNA-monster


Dideoxyketenterminatie methode van Sanger
DNA synthese 4 soorten dNTPs: ATP, GTP, CTP en TTP
Dideoxymethode nucleotiden toegevoegen die 3OH groep niet hebben
Dideoxynucleotide DNA elongatie stopt
chain termination method

Procedure:
DNA denaturatie (dubbelstrengig -> enkelstrengig)
mengsel van 4 normale dNTPs en een kleine hoeveelheid van ddNTPs met een verschillend
fluorescent gelabeled kleur
+ DNA polymerase
Elongatie (verlenging) gebeurt tot bij toeval een ddNTP wordt toegevoegd i.p.v. een normale dNTP
Correcte verhouding dNTPs en ddNTPs: fragmenten van 1 basenpaar tot enkele honderden
basenparen
Fragmenten scheiden volgens lengte
Toestel detecteert verschillende fluorescente stoffen

Eerste generatie sequentie analyse:


3 miljard bp
3 miljard dollar
13 jaar
Humaan genoom project
o Gestart in 1990 met als doelstelling
het volledige menselijk genoom te
sequencing
o Gecordineerd door US department
of Energy and the National Institute
of Health, in samenwerking met
9000 wetenschappers in 36 landen
o Doelstellingen:
Identificatie van de ongeveer 25 000 genen in humaan DNA
Het in kaart brengen van de 3 miljard bp
Deze informatie stockeren in databases
Deze gegevens gebruiken voor een betere data analyse
o Nu volledige menselijk genoom in kaart is gebracht, nieuwe perspectieven:
o Onderzoek naar de identificatie van de genen die betrokken zijn bij erfelijke ziekten,
kankers, schrizofenie,
o Inzicht verkrijgen in het ziekteproces
o Algemeen streven naar een verbetering van de menselijke gezondheid en de bestrijding
van ziektes
o Onderzoek naar mogelijkheden gentherapie
Tweede generatie:
Verbetering technologie
o Pyrosequencing: reacties in gaatjes van enkele picometer breed 1,6 miljoen
sequentiereacties op 1 plaatje (genoomchip)
o Identificatie tijdens polymerisatie
Derde generatie:
DNA sequencen met de nanoporiemethode
o Gaatje van enkele nm DNA erdoor trekken
o Direct aflezen van elektrische stroom

Toepassingen:
Mutaties opsporen en identificeren
Humaan genoom project (zonder sequencing onmogelijk)

Gentherapie:
Gentherapie: opties om erfelijke ziekte te genezen
Methode:
o cellen uit het lichaam van de patint nemen
o in labo in die cellen correcte versie van slecht functionerende gen inbrengen
o cellen weer terugbrengen in het menselijk lichaam
Hoop voor erfelijke ziektes
Maar: bij vele ziekten meerdere genen betrokken

Genetisch profiel, DNA-polymorfisme

Afkortingen & wat!


Vingerafdrukken zijn uniek
Genetisch profiel = DNA fingerprint is uniek (uitzondering neiige tweelingen)
Gevoeliger, universeler, betrouwbaarder
Belang:
o Ouderschapsonderzoek
o Opsporen daders
o Verwantschap
Methode: DNA-technieken gebaseerd op DNA-polymorfismen
Slechts 2% DNA mens codeert voor eiwitten
Andere delen: introns
Introns bestaan hoofdzakelijk uit enkele basenparen,vaak of minder vaak herhaald
Repeterende sequenties, microsatellieten, of repeats
CNVs (copy number variations): aantal repeats genoom verschilt per individu
VNTR's (variable number of tandem repeats) (9-80 bp)
STRs (short tandem repeats) (2 8 bp)
Mutaties
o Willekeurig
o Grotere kans in een intron
o In introns geen effect op functie
o Makkelijk overerfbaar
o Geen invloed op selectie
DNA-polymorfisme uniek
Familiale gelijkenissen
Specifieke mutaties binnen families
Variaties om 200 300 basenparen bij niet-verwante individuen
DNA fingerprint: techniek om genetische vingerafdruk te maken (DNA profiel)

RIFLIPS, RFLP fingerprinting

= random fragment length polymorphism


DNA behandelen met EcoRI restrictie-enzym: geeft ongeveer 1 000 000
fragmenten
Polymorfisme: variatie in knipplaatsen en fragmentlengte
Minder variatie meer verwant
Fragmenten met verschillende groottes scheiden op een agarose gel
1 000 000 is teveel om te evalueren (geeft een smeer)
Afdruk van de gel op membraan maken (blotten)
Met radioactieve merker (probe) deel van de VNTRs zichtbaar maken
Probe: kort stuk ssDNA dat aan een complementair DNA sequentie kan binden
(hybridiseren)
Jeffrey: probe 16 bp herkent repeats binnen intron gen myoglobine en ~ 30
andere minisatelliet sequenties
DNA: 1- 4 fg (druppel bloed en sperma)
Het streepjespatroon is uniek voor elke persoon
Homozygoot - hererozygoot
Ideaal voor vaderschapstest of aanwijzen dader bij een crimineel feit

RAPD (random amplified polymorphic DNA)


-

Vereenvoudigde PCR met slechts 1 primer


Ontworpen of random gekozen (13 bp)
Verwantschappen vergelijkbaar patroon op een agarosegel
Amplificatie DNA:
o primers met juiste orintatie
o geschikte onderlinge afstand
primers 2 en 5, 3 en 6 geven PCR product
ander individu: primer 2 bindt niet meer

Gelelektroforese nodig

AFLP (ampiflied fragment lenght polymorfism)


Procedure:
Genomisch DNA verknippen zoals RFLP

Ontwikkeling adaptor moleculen specifiek voor de restrictieplaatsen


DNA fragmenten lijmen aan de adaptor moleculen (ligase)

pre-selectieve PCR amplificatie: met primers complementair aan adaptor sequenties + 1 gekozen
basepaar (reductie tot 1/16 van het oorspronkelijke aantal fragmenten)

tweede selectieve PCR met eerste PCR producten als template, primers eerste PCR + 2 additionele
basenparen (na de twee reacties subfractie van 1/4096 oorspronkelijk complex mengsel)

Gelelectroforese maakt evaluatie mogelijk

Voordelen:
Reproduceerbaar, hoge resolutie en efficintie
Gevoeligheid voor detectie polymorfismen op vlak van het volledig genoom
-

Microsatellieten
-

STR: korte DNA-fragmenten met repetitief motief (2 tot 8 bp). Vb: TA, CA, GTG,
VNTR: iets grotere fragmenten
Variatie in het aantal herhalingen van het basismotief
Passende primers om specifieke microsatellieten te isoleren en amplificeren

Recombinant DNA-technologie
-

Begin jaren 70
recombinant DNA technologie of genetic engineering en gen cloning
Benodigdheden: restrictie-enzymen, ligasen en polymerasen.
recombinant-DNA: DNA van verschillende herkomst aan elkaar koppelen

Procedure:
Isolatie v DNA: DNA uit cellen
Bewerking DNA: Knippen DNA
o Gen afzonderen: knippen met restrictie-enzymes (herkenningssequentie 4,6,8 bp)

Selectie vector
o De gepaste vector zoeken met merkergenen
o Plasmide (circulair DNA aanwezig in bacterin en gisten), YAC
o Virussen (bloemkoolmozaekvirus)
Bewerking v/d vector: Knippen vector

Inbrengen DNA in vector: Stukjes DNA aan elkaar lijmen (ligase): DNA-fragmenten + vector,
vectoren samen, fragmenten samen
DNA-fragment + cloning vector = recombinant DNA molecule

recombinant DNA molecule introduceren in een gast cel (meestal de bacterie E. coli) via
transformatie of gistcellen (posttranslationele veranderingen)
specifieke tertiaire structuur v/d eiwitten

Selectie gewenste kloon: Bacterie of gist uitplaten: kloon = kolonie van cellen met elk recombinant
DNA molecule

Gepaste gastheer selecteren voor de vermeerdering (bacterin, gisten)


o Bacterin: gram+ kunnen makkelijk DNA opnemen, gram- eerst competent maken
(transformatie)
o Eukaryote cellen (voordeel: eiwitten modificeren en gepaste tertiaire structuren geven):
gisten, planten, dierlijke cellen, menselijke cellen

Toepassing:
Sequentie van gekloneerd DNA-fragment
Genen eukaryoten tot expressie brengen in bacterin of in gistcellen (vb menselijk groeihormoon,
stollingsfactoren)
Eiwitten ontwerpen voor speciale doeleinden (protein engineering) en basis voor gentherapie.

Hybridisatie
-

Temperatuur verhogen: beide strengen dsDNA laten los (denatureren)


Afkoelen: DNA-strengen herenigen dsDNA: 'reannealing'
ssDNA + complementair ssDNA afkomstig van ander organisme dsDNA-molecule (hybride-DNA)
Hybridiseren: mate van hybridisatie is maat voor verwantschap van het DNA
Hybridisatie van ssDNA met RNA ook mogelijk (DNA/RNA-hybriden) (sterker)
Hybridisatie uitgevoerd met een onbekend, aan te tonen DNA, het z.g. target-DNA
Probe: kortere, bekende DNA is gelabeld
De hybridisatie kan in verschillende situaties voorkomen, zoals op een membraan, in de cel
(intracellulair) of in een oplossing (in vitro).
Stringentie: percentage mismatching dat bij hybridisatie wordt toegestaan
Vraagstelling van het onderzoek bepaalt de mate van stringentie
Bijvoorbeeld virus classificeren: hoog percentage mismatching toestaan (lage stringentie)
Verschil tussen proto-oncogen en een oncogen met 1 nucleotide: hybridiseren hoge mate
stringentie
Fluorescentie in situ hybridisatie (of FISH technologie): hybridisatie met fluorescente probe
Frequent gebruikt in prenataal en kankeronderzoek

meerdere fluorescente labels, waardoor evaluatie van meerdere genen of


chromosoomfragmenten per hybridisatie
M-FISH: alle 23 chromosoomparen tegelijkertijd te visualiseren

Radioactieve hybridisatie: blotting


Blotten: overbrengen DNA, RNA, of eiwit van een gel op een membraan
Southern blotting: DNA als target
Northern blotting: RNA als target
Western blotting: eiwit als target

Toepassingen:
Ziektediagnosis (probe complementair aan stuk micro-organisme)
Onderzoek aan- of afwezigheid van een eigenschap (DNA complementair aan een deel van het
gen): selectie
Erkenning rassen,
Microarrays:
nieuwe techniek om genexpressies te meten
1 experiment om de expressie van 1000den genen tegelijkertijd te meten
Genen worden via transcriptie omgezet in mRNA en deze gaat via translatie naar eiwit
Hoeveelheid mRNA is een maat voor de expressie van het respectievelijke gen
array: glazen plaatje van 2x6 cm waarop probes specifiek voor een gen zijn aangebracht
mRNA wordt uit het staal gextraheerd
Via RT-PCR omgezet in cDNA
cDNA wordt fluorescent gemerkt en kan binden met probe op array
mRNA eerste staal omzetten naar cDNA en fluorescent merken met rode kleur
mRNA tweede staal omzetten naar cDNA en fluorescent merken met een groene kleur
Beide stalen op een array brengen
Met een toestel groene en rode kleur meten en via de computer elk stipje op de array vergelijken

Antisense technologie
-

Genen mRNA (transcriptie)


mRNA eiwitten (translatie)
Door in te grijpen op de hoeveelheid mRNA, wordt ook ingegrepen op hoeveelheid eiwit
Complementair RNA of antisense-RNA: RNA fragment dat bindt met mRNA: dubbelstrengig mRNA
Target RNA kan niet meer vertaald worden naar eiwit

Toepassing:
Bestrijding kanker, virale ziekten en infectieziekten
Manipulatie expressie bloemkleur

Genetische modificatie v planten


-

Eeuwenlange veredeling: kruisingen en selectie van de nakomelingen


Inbreng genen: Agrobacterium of electroporatie
Planten groeien vanaf gewijzigde cellen
GGO: enkel gewenste genen in genoom brengen (ook van andere soorten)
o Opbrengstverhogend, resistenties, kwaliteit verhogend, aanslag op milieu verminderen
o Insecticide-planten: Bacillus thuringiensis bacterie (biologisch bestrijdingsmiddel)
produceert kristallen die darmwand rupsen en kevers aantast (niet stabiel)/Via
recombinant technologie kristallen door plant laten maken
o Herbicide-planten: BASTA
o Mannelijk steriele planten: om zelfbestuiving te vermijden: meeldraden verwijderen
(mechanisch, chemisch, genetisch)
o Verhogen van de voedingswaarde: aardappelen met verhoogd zetmeelgehalte, rijst met
bta-caroteen
o Resistentie tegen milieu invloeden
o Vbn GGOs
Blauwe katoen
Aardappelen met meer zetmeel en minder water
Koolzaad met meer onverzadigde vetzuren
Mas met gen voor kouderesistentie
Rijst met beta-caroteen
Appelen en peren met resistentie tegen Erwinia amylovora
Planten GGOs makkelijk te vormen?
o Planten zijn totipotent (dedifferentiren)
o Plantencellen kunnen uitgroeien tot volledig nieuwe plant(delen) (in vitro-teelt)

Genetische modificatie v dieren


Normale ontwikkeling v dieren
-

Dierlijke cellen: alleen stamcellen zijn flexibel


Genoom bepaald bij bevruchting
Eicel en zaadcel genetisch materiaal
Mutaties in geslachtscellen doorgegeven aan nakomelingen
Genetische variabiliteit gestuurd door selectie en evolutie

Klonen bij dieren


-

Klonen= individuen met eenzelfde genoom


Natuurlijke klonen: eeneiige tweelingen
In landbouw: liefst klonen
o Op die manier planten en dieren met de beste eigenschappen
o Geen variatie meer
Klonen zijn fenotypisch niet 100% gelijk
Fenotype = genotype + omgevingsfactoren
Waarom klonen ?
o allen dezelfde positieve eigenschappen
Meer nadelen dan voordelen
o klonen geen topdieren
o zeer duur
o Zelfde dieren, zelfde ziekten,
o Zeer negatieve publieke opinie
Kunstmatig klonen: embryo in een vroeg stadium splitsen
(embryo-splicing)
Fenotype moeilijk behouden bij seksuele voortplanting
Beperkt aantal klonen

Homozygote, diplode of eenouderlijke dieren

= Klonen van de moeder


Normaal: F1 is een mengsel genotype vader en moeder
Methode: na bevruchting, eicel nemen voor de versmelting eicel en zaadcel
En van de prekernen verwijderen door microchirurgie
Cytochalasine B toevoegen bij eerste celdeling: zorgt voor verdubbeling genoom zonder
cytoplasmatische deling
Op die wijze krijgen we een diplod genoom in 1 enkele cel
Het diplod genoom is wel afkomstig van 1 van de ouders
De bevruchte eicel in een draagmoeder laten ontwikkelen
Enkel XX is leefbaar, YY bestaat niet

Androgenese

= Voortplanting zonder inbreng van genetisch materiaal van het vrouwelijk dier
Methode: 2 zaadcellen in 1 eicel = dispermie triplod embryo dat niet leefbaar is
Microchirurgie: prekern eicel verwijderen
Kruising vader met zichzelf of kruising twee mannen
Embryo's zijn nooit tot volledige ontwikkeling gekomen

Gynogenese

= Voortplanting zonder inbreng genetisch materiaal van mannelijk dier


eicel bevruchten met andere eicel i.p.v. door een zaadcel
Eicellen samensmelten met een fusiemiddel
Embryo's zijn nooit tot volledige ontwikkeling gekomen

Overplanting v/d kern (klonen)


-

Overplanten van de kern, na verwijderen prekernen


Celkern kiezen uit bestaand individu (topdier)
Cellen van een volwassen dier al gedifferentieerd
Cellen van een embryo: totipotent, moeten nog differentiren tot een bepaald type
Om van cellen van een volwassen dier (gedifferentieerd) een nieuw organisme te bevorderen
ontwikkelingscapaciteit van de gedifferentieerde kernen herstructureren of "dedifferentiren"
Moeilijk, voor het eerst gelukt in Schotland in 1997 (schaap Dolly)
Spermatogonie is de stamcel waaruit spermatozoden ontstaan
Deze cel is gemakkelijk bereikbaar door een eenvoudige biopsie van de testes
Totipotent; diplod en geschikt om talrijke mitotische delingen
Hoopvol
Maar: te hoge kosten en geringe slagingskans
Commercieel belangrijke eigenschappen moeten op moleculair niveau gedentificeerd worden

Schaap Dolly:
Schotland, 1997
Methode:
o Cel isoleren uit uier topschaap
o Cel inactief maken door uit te hongeren en kweken: op die
manier weer totipotent
o Eicel van een andere of zelfde schaap nemen
o Daaruit kernmateriaal verwijderen
o Eicel activeren met een stroomstoot
Geactiveerde eicel en andere totipotente cel samenbrengen
Cellen smelten samen in een elektrisch veld
Geen 100 % identieke kloon als er een andere eicelmoeder,
mitochondriaal DNA is anders
100% identieke kloon, eicelmoeder gelijk aan de moeder geselecteerde
cel
Ook reeds op andere diersoorten toegepast

Therapeutisch klonen bij de mens


-

Lichaamseigen productie van donororganen


Geen afstotingsverschijnselen
Kern uit volwassen huidcel van een patint
Herprogrammeren tot een totipotente celkern
Laten uitgroeien tot gewenst lichaamsdeel (specifieke groei- en differentiatiefactoren)

Transgene dieren
-

Reeds toegepast (stier Herman)


Genen (DNA) introduceren in dierlijke cellen
Nieuwe genen toevoegen of genen uitschakelen
Doorgeven aan volgende generaties
Doel: ontwikkeling dieren met betere productiekenmerken of als producent farmaceutische
eiwitten
Intranucleaire geninjectie: groot aantal bevruchte eicellen worden genjecteerd met gewenste gen
+ aantal controle-elementen
Enkele genomen gaan nieuwe DNA opnemen (1% of minder bij rund en varken)
Transgene dieren kruisen met niet-transgene dieren eigenschap doorgeven aan volgende
generaties
Intranucleaire geninjectie gecombineerd met kerntransplantatie: Transgene embryos in vitro
kweken en selecteren vooraleer ze in te planten bij draagmoeders Groter succes
Gen introduceren in stamcellen: stamcellen kweken tot vroeg embryonaal stadium genen
inbrengen
Cellen selecteren met gen op de juiste plaats in hun genetische informatie
Kerntransplantatie toepassen: kern uit deze transgene stamcel in een lege eicel brengen
uitgroeien tot een individu
Nog veel onderzoek nodig
Meeste experimenten met micro-injectie van embryos
Misschien in de toekomst meer potentie
Ontwikkeling sneller groeiende dieren (overexpressie groeihormonen)
Goedkope productie farmaceutische eiwitten (via de melk)
DNA gewenste gen koppelen aan expressiesignaal dat enkel tot expressie komt in de uier van het
dier
Konijnen die in melk eiwit bevatten dat geneesmiddel is voor ziekte van Pompe
Transgene stier Herman nakomelingen geven melk met lactoferrine

Toepassingen v/d biotechnologie in de dierlijke productie


Hybridoma-technologie en monoclonale antilichamen
-

Antistoffen aanmaken tegen antigenen van ziektekiem


Capside van virussen bevatten verschillende eiwitten
verschillende antistoffen
Hybridoma: technologie om 1 antilichaam aan te maken
(MA): monoclonaal antilichaam
Via recombinant technologie: B-lymfocyt en kankercel
versmelten en zo productie van monoklonale antilichamen
Toepassing:
o Immuunserum virulente ziekten
o Aantonen infecties met grote zekerheid

Kruisresistentie
-

Virussen opgebouwd uit verschillende antigenen tegen


elk antigeen worden in de gastheer door lymfocyten,
antistoffen aangemaakt
Bij grote gelijkenis tussen 2 kiemen is de immuniteitsopbouw snel verlopen voor de 2e
gedeeltelijke immuniteit = kruisresistentie

Quantitative trait loci (QTL)


-

Uiterlijke kenmerken worden bepaald door verschillende genen


Kenmerken vlees- en melkproductie: polygenen
Quantitative trait loci: plaatsen op het genoom met deze polygenen
Op deze genen selecteren in fokprogrammas
Merkergenen plaatsen op locus interessant gen
MAS: marker assisted selection om superieure dieren te selecteren

Biotechnologie en toepassingen in planten: stand v zaken


Herbicidetolerante gewassen
-

Waarom kiezen boeren voor herbicideresistente gewassen?


o Lagere productiekosten
o Gemak voorbereiding en opvolging teelten
Milieu-impact
o In 2006 6% minder herbiciden
o Gebruikte herbiciden hadden 25% minder impact op milieu
Niet de perfecte oplossing voor duurzame en milieuvriendelijke landbouw
o Blijven afhankelijk van herbiciden
o Eenzijdig gebruik van herbiciden resistentie

Insectresistente gewassen
-

Mas, katoen, koolzaad


Bt toxines (Bacillus thuringiensis) in plant via genetische modificatie

Australi, Argentini: 80% Bt-katoen


China, India, Zuid-Afrika, Mexico: 50% Bt-katoen

Genetische modificatie v/d aardappel

Aardappelziekte
meest bedreigend in regios gematigd klimaat
Verlies ~ 55 miljoen euro
Conventioneel resistente rassen: Bionica, Toluca, Sarpo Mira (beperkt gebruik biologische teelt)
Veroorzaakt door schimmelachtig organisme: Omyceet Phytophtora infestans
Plant en knol aangetast

Phytophthora resistente aardappel


-

Vooral consumptieaardappel
Bintje (40-50%): zeer vatbaar aardappelziekte
10 tot 15 x spuiten/jaar nodig
Bestrijding moeilijker
Aggresievere isolaten Phytophthora infestans
Grotere diversiteit door recombinatie mating types

Conventionele resistentieveredeling
Rassen Bionica en Toluca
Eerste kruising 1959 2005 bruikbare rassen
Enkelvoudig resistentiegen: Rpi-bib-2 uit Solanum bulbocastanum
Ingewikkeld kruisingsschema
Sarpo mira:
> 40 jaar
grote genenpool zoveel mogelijk kruisingen
Planten in vroeg stadium besmetten met mix P. infestans
95% afgestorven overige behandelen en laten uitgroeien knollen verder kruisen
Het introduceren v resistentie tegen Phytophthora infestans m.b.v. GGOs
Stap 1: identificatie resistentiegenen
o DNA resistente planten vgl met niet resistente planten
o Gebieden in DNA opsporen waarop resistentie gelegen is
o Genoom aardappel gekend zoektocht resistentiegenen vergemakkelijkt
o 20 tal genen gekend
o Cisgenen (gesoleerde genen afkomstig uit kruisbare soorten)
Stap 2: modificeren van aardappellijnen
o Gen in plasmide A. tumefaciens
o Resistentiegenen in DNA plant
Resistentiegen koppelen aan ander gen
Geen selectiemarker aan het over te dragen DNA toegevoegd
o Transgenen (planten waarin via genetische modificatie soortvreemde genen zijn
binnengebracht)
o Nieuw plantje uit weefsel
o Selectie juiste plantjes
Antibiotica/herbicide tolerantie
Geen selectiemerker: controle DNA via PCR (meer tijdrovend en hogere kost)
Stap 3: testen planten in serre
o Plantenkweekkamer serre
o Zijn gewenste eigenschappen aanwezig ? Controle ras-eigenschappen
o Duurzame resistentie = rassen met meervoudige resistentiegenen in ruimte en tijd
afwisselen
Raseigenschappen kunnen verloren gaan als gevolg v 3 fenomenen:
o Insertiemutagenese: fout als gevolg v extra stuk DNA midden in een bestaand gen
verstoort werking v dat gen
o Pleiotropie: onverwachts en ongewenste effecten kunnen optreden a.g.v./h feit dat het
extra stuk DNA op een niet bekende plaats in het DNA v/d plant landt
o Somaklonale variatie: ontstaan v fenotypische (waarneembare) afwijkingen t.o.v./d
aardappel waarv hij is afgeleid. A.g.v./h door in vitro brengen en opnieuw regenerenen v/d
aardappel. Kan bij elke in vitro techniek voorkomen
Fortuna-aardappel v BASF
2 resistentiegenen: Rpi-blb-1 en Rpi-blb-2
Selectiemerker: gemuteerde AHAS-gen (tolerantie tegen sulfonyl-ureum gebaseerd herbicide)
Goede verwerking tot friet

Cisgenese project DuRPh


Nederland start 2006 (10 jarig project)
Doelstelling
o Resistentiegenen identificeren en karakteriseren
o Ggo aardappellijnen maken en testen
o Communiceren met breed doelpubliek
o Duurzaamheidsbenadering !
cisgenese
o Resistentiegenen zijn enkel afkomstig uit Solanaceae
o Resistentiegenen worden niet aangepast, natuurlijke regulatiesignalen
o In finale lijnen geen selectiemerkers
o Kan in principe ook natuurlijk

Amflora aardappel
-

Zetmeel onder 2 vormen


o 20% Amylose: onvertakte vorm
o 80% Amylopectine: vertakte vorm (industrieel nuttig)
Amylose verwijderen
o Arbeidsintensief
o Milieubelastend
o Chemisch
o Ggo alternatief ?

Amflora-aardappel
BASF ggo
Biosynthese zetmeel benvloeden
Extra gbss-gen inbrengen
Extra kopie zorgt voor onderdrukking van expressie natuurlijk gbss-gen
Co-suppressie
Mechanisme tegen indringers
Natuurlijke situatie:
Tetraploid: 4 gbss genen
-

Extra kopie gbss gen zet mechanisme in gang dat RNA kopien afbreekt
Extra gbss-gen in genoom in vorm kop-staart dubbelkopie

2x overgedragen (2 extra gbss-genen)

Amflora-aardappel bevat het npt-II antibioticum


Selectiemerker: npt-II antibioticaresistentiegen
Kanamycine en neomycine resistentie
risico!?
o Highly important antimicrobials for human use
o Overdracht transgene plant bacterie niet aangetoond
o Npt-II gen verschillend van npt-II bacterin
o Reeds aanwezig in natuur

2e genetisch gewijzigde zetmeelaardappel


Modena (geen npt-II gen)
o ABEVE (Ndl)
o Marktaanvraag eind 2009 begonnen
Eliana: traditionele amylose-vrije aardappel
o Via mutagenese (straling): puntmutaties gbss-gen
o Valt niet onder ggo-wetgeving
Fraunhover IME
o TILLING: combinatie chemische mutatie en gerichte genetische screening naar
puntmutatie
o Amylose-vrije aardappel
o testfase

Aandeel transgene gewassen

Transgene gewassen in de toekomst


-

Genoom planten ontrafelen


Functie genen ontrafelen in relatie tot andere genen
Inzicht in hoe verschillende genen, eiwitten en biologische processen elkaar benvloeden
Complexe eigenschappen zoals voedingskwaliteit ontrafelen

Planten zelf opgewassen tegen ziekten


Nematoderesistentie bij aardappelen en rijst

Minder stressgevoelig

Genen identificeren met sleutelrol in stresstolerantie

Meer biomassa
-

meer opbrengst
Kennis ontwikkeling bladeren en wortels
Identificatie 100den genen die rol spelen in ontwikkeling zijwortels
Gewassen die beter verankeren in bodem, beter water en mineralen opnemen

Verfijning v/d technologie


1.

2.

3.

Eigenschappen zelfde soort overbrengen


o Eigenschappen van soortgenoten gebruiken,
o Aardappel ontwikkeld resistent aan bepaalde schimmel: genen uit wilde variant aardappel
Bestaande eigenschappen bijsturen
o Eigenschappen uitschakelen of versterken
o Stoffen die allergie opwekken elimineren
o Ontwikkelen rijst en mas met hogere opbrengst
Nieuwe technieken
o RNAinterferentie: RNAi
o Kleine stukjes DNA inbouwen
RNA past op uit te schakelen gen
o Koffieplanten zonder caffene
o Ajuin zonder traanverwekkende stof

Veiligheid v GGOs

Verschillen en gelijkenissen met de klassieke veredeling

Verschillen:
Mengeling gewenste en ongewenste eigenschappen bij conventionele kruising
Enkel gebruik van eigenschappen uit verwante planten
Gelijkenissen:
Planten met nieuwe eigenschappen
DNA plant verstoren

De weg van labo naar markt


GGOs in voeding
Etikettering verplicht

Gevaar toxische stoffen?


Ook natuurlijke voeding kan gifstoffen bevatten
Strenge testen
Testen:
-

Gedetailleerde moleculaire beschrijving


Toxicologische testen op korte en lange termijn
Analyse mogelijke allergeniciteit
Vergelijking samenstelling klassiek vs. ggo
Analyse gedrag plant in veld

Toxicologische tests
Met gekende giftige stoffen
Proefdieren
Toekomstige wijzigingen
Gevaar voor allergie?
Alle nieuwe voedingsproducten kunnen nieuwe allergien doen ontstaan
Allergeen kan in plant terecht komen via DNA
Vb. interessant eiwit uit paranoot in soja bleek paranoot allergeen te zijn
Onmiddellijke stopzetting
Maar ggo biedt ook de mogelijkheid allergenen en gifstoffen te verwijderen
Transgene soja zonder allergeen dat 50% van alle allergien veroorzaakt
Verplichte testen allergeniciteit binnen Europa

Is genen eten gevaarlijk ?


Alle voedsel bevat DNA (verteerbaar)
Lichaamscellen nemen geen intacte genen op
Veilig in de winkel
Etiket genetisch gewijzigd
Sporen kunnen steeds voorkomen (< 0,9%)
Detectiemethoden zijn gevoelig
Vrijheid consument om te kiezen in EU !!!
GGO ketenbeheer
Verplichte traceerbaarheid
Mogelijkheid in te grijpen mochten er toch problemen opduiken
Middel om etikettering te controleren (ggo afgeleide producten kunnen niet altijd onderscheiden
worden van de conventionele)

GGOs in de natuur
-

Natuur door menselijke activiteiten zwaar onder druk


Biodiversiteit zwaar onder druk

Effect transgene planten op andere organismen


Kan zowel positief als negatief zijn
Verspreiding via zaden
Veel gewassen zodanig veredeld dat ze niet meer in de natuur overleven (mas)
Grassen en koolzaad wel makkelijk te verspreiden
Verspreiding via stuifmeel
Genetische eigenschappen uitwisselen met planten uit vrije natuur via stuifmeel
In omgeving verwante soorten nodig!
Specialisten nodig om dit risico in kaart te brengen
Voldoende afstand met andere telers nodig !
Beoordeling milieuveiligheid
Milieuveiligheid!