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II
Agradecimentos
Aps a realizao dessa dissertao e avaliando as contribuies que muitas pessoas
tiveram durante este ano, no podendo deixar de os referir, expresso aqui os meus
agradecimentos:
Ao Doutor Paulo Crespo agradeo por ter estado na origem deste projecto to
aliciante e pelas suas palavras de apoio sempre com um toque de motivao.
Margarida Abrantes, um agradecimento especial, pela co-orientao,
dedicao, amizade, pacincia em ensinar e pela disponibilidade demonstrada em me
ajudar tanto quando precisava de uma co-orientadora ou de uma amiga.
Catarina Mamede, pela amizade, disponibilidade, pela pacincia por me
acompanhar durante o tempo da durao do projeto pela ajuda e apoio incondicional
na realizao deste.
Mafalda Laranjo e Ana Brito, pela disponibilidade em ajudar sempre que
precisava, Professora Brbara Oliveira pela disponibilidade em me ajudar na anlise
estatstica dos resultados, aos estagirios de Medicina Nuclear da ESTS do Porto pela
ajuda que me deram ao longo do ano, Cludia Claridade pela ajuda diria e aos
ii
Resumo
A vitamina C uma substncia essencial apresentando inmeras propriedades
fisiolgicas. Ela apresenta-se sob duas formas, a reduzida e a oxidada. O cido
ascrbico (AA), a forma reduzida da vitamina C, um potente antioxidante
hidrossolvel, na medida em que neutraliza os radicais livres, constituindo um
potencial mecanismo anticancergeno. O AA actua tambm como pr-oxidante,
promovendo a formao de espcies reactivas de oxignio (ROS), como o perxido de
hidrognio (H2O2), que comprometem a viabilidade celular. Por outro lado, a maioria
das clulas tumorais no transporta directamente o AA para o seu interior, razo pela
qual as clulas obtm a vitamina C na sua forma oxidada, o cido dehidroascrbico
(DHA). As clulas tumorais demonstram ainda outra particularidade, a diminuio da
catalase (enzima responsvel pela destoxificao do H2O2), num factor entre 10 e 100,
relativamente s clulas normais. Assim, o aumento da produo de H2O2, acoplado
deficincia da actividade da catalase nas clulas neoplsicas e presena de metais de
transio, poder redundar na citotoxicidade selectiva da vitamina C e na consequente
revelao do seu potencial teraputico.
O objectivo deste trabalho avaliar o metabolismo da vitamina C e mostrar o
efeito citotxico da forma reduzida, em clulas de adenocarcinoma colorectal e de
melanoma melanoctico, recorrendo a mtodos bioqumicos e de imagiologia nuclear.
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iv
Lista de abreviaturas
-Selectividade
AA cido Ascrbico
ADN cido Desoxirribonucleico
ATP Trifosfato de Adenosina
Bq Becquerel (uma desintegrao por segundo - unidade do sistema internacional)
CAT Catalase
CPM Contagens por Minuto
CPS Contagens por Segundo
Da Dalton
DHA cido Dehidroascrbico
DMEM Dubelccos Modified Eagles Medium
GLUT Transportadores de Glicose
GSH glutationa reductase
HETP - Height Equivalent to the Theoretical Plate
HPLC High Performance Liquid Chromatography
H2O2 Perxido de Hidrognio
KeV kilo electres volte
Km Constante de Michaelis
vi
ndice Geral
Agradecimentos .......................................................................................................... i
1.
Vitamina C .......................................................................................................... 3
1.1.
1.1.1.
Antioxidante............................................................................................................. 6
1.1.2.
Pr-oxidante ............................................................................................................ 7
1.2.
vii
Funes......................................................................................................................... 5
Transporte .................................................................................................................... 8
1.2.1.
1.2.2.
2.
Stresse Oxidativo.............................................................................................. 13
2.1.
3.
4.
Radiofrmacos ............................................................................................................ 18
4.2.
Controlo de Qualidade................................................................................................. 20
4.2.1.
1.
2.
2.2.
2.3.
2.4.
2.4.1.
2.4.2.
2.5.
2.5.1.
viii
3.
3.2.
Desenvolimento de Xenotransplantes.......................................................................... 42
3.3.
3.4.
3.5.
Tc-AA .................................... 41
4.
1.
2.
Estudos in vitro................................................................................................. 56
2.1.
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.3.
2.3.1.
3.
ix
99m
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
Concluso................................................................................................................. 88
Bibliografia ............................................................................................................... 92
ndice de Figuras
Figura 1 : Biossntese da vitamina C a partir da glicose. (Adaptado de Schorah et.al. 1973) ------------------ 4
Figura 2: Reaco de oxidao do cido ascrbico em cido dehidroascrbico.(Adaptado de(Levine, et al.,
1999) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 4
Figura 3: Esquema do sistema de transporte do DHA atravs dos GLUT. (Retirado de (Li and Schellhorn,
2007) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10
Figura 4: Esquema representativo do sistema de transporte do AA atravs dos SVCT.(Retirado de(Li and
Schellhorn, 2007)-------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 11
Figura 5: Esquema ilustrativo de um aparelho do HPLC. 1. Reservatrio de solventes 2. Vlvulas de
abertura 3. Bomba 4. Misturador 5. Vlvula interna 6. Injector 7.Pr-coluna 8.Coluna 9. Detectores 10.
Estao de aquisio de dados 11. Reservatrio de resduos. A seta azul, representa o sentido da
progresso do solvente durante uma anlise Adaptado de Meyer, 2004. --------------------------------------- 23
Figura 6: Visualizao das colnias formadas. Controlo visualizado no microscpio ptico - A375 (A) e
WiDr (C) e o nmero de colnias formadas aps a exposio das clulas a 2 mM de AA - A375 (B) e WiDr
(D). Visualizao macroscpica das colnias referentes ao controlo - A375 (E) e WiDr (G) e colnias
formadas aps exposio das clulas a 2 mM de AA A375 (F) e WiDr (H). ------------------------------------ 62
Figura 7: Imagens obtidas atravs da cmara de raios gama. A - Imagem esttica aos 60 minutos aps a
injeco do 99mTc-AA, de um ratinho com xenotransplante. A seta aponta para a localizao do tumor. B
Imagem esttica aos 30 munitos aps a injeco do 99mTc-AA, de um ratinho normal, onde podem ser
vistos os dois rins. Todas as imagens esto referenciadas mesma escala de cores mostrada. ------------ 77
ndice de Tabelas
Tabela 1: Resumo dos tempos de incubao e respectivos tempos de repouso ------------------------------- 37
Tabela 2: Amostras injectadas no HPLC para o estudos da estabilidade da vitamina C. ---------------------- 39
Tabela 3: Amostras injectadas no HPLC na presena de metabolismo celular para avaliar o meio
extracelular. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 40
Tabela 4: Caractersticas das imagens dinmicas e estticas. ------------------------------------------------------- 43
Tabela 5: Mdias das eficincias de marcao de quatro formulaes farmacuticas ao longo do tempo
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 54
Tabela 6: Mdias dos tempos de reteno referentes a 3 amostras de AA, DHA e DMEM analisadas por
HPLC. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 63
ndice de Grficos
Grfico 1 : Cromatograma da amostra do AA (10mM) injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
determinado por integrao grfica. ------------------------------------------------------------------------------------- 49
Grfico 2: Cromatograma da amostra de FeCl3 (0,1N) injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
determinado por integrao grfica. ------------------------------------------------------------------------------------- 49
Grfico 3: Cromatograma da amostra do 99mTcO4- injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
determinado por integrao grfica. ------------------------------------------------------------------------------------- 49
Grfico 4: Coromatogramas do controlo de qualidade do Kit, resultante de uma formulao
farmautica. A Cromatograma resultante da decteco UV, representando os compostos no
radioactivos presentes na formulao. B Cromatograma resultante da deteco de radioactividade
correspondente ao controlo de qualidade do kit aos zero minutos aps a marcao observando uma
eficincia de marcao igual a 74,16%. C Cromatograma resultante da deteco de radioactividade
correspondente ao controlo de qualidade do kit a 4 horas aps a marcao observando uma eficincia
de marcao igual a 81,84%. D Cromatograma resultante da deteco de radioactividade
correspondente ao controlo de qualidade do kit as 24 horas aps a marcao observando uma eficincia
de marcao igual a 90,40%. ----------------------------------------------------------------------------------------------- 51
xi
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Tc-AA e do
Tc-AA e do
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Tc-AA e do
Tc-AA e do
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mesma cancentrao do
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Tc-AA nas WiDr e A375. As duas linhas celulares foram incubadas com a
Tc-AA e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os dados
xii
concentrao do AA, nas WiDr e A375. As linhas celulares foram tratadas com as concentraes
referidas no grfico. Os resultados so a mdia de trs estudos independentes.------------------------------ 61
Grfico 14: Cromatogramas das amostras padro injectadas no HPLC. A Amostra do DHA (10 mM). B
Amostra DMEM. C Amostra do AA (10mM).-------------------------------------------------------------------------- 63
Grfico 15: Cromatogramas de amostras de DMEM com 10 mM de AA. A Cromatograma
correspondente injeco do DMEM com 24 horas de incubao. B Cromatograma de DMEM e AA
para 1 hora de incubao. C - Cromatograma de DMEM e AA para 24 hora de incubao. D Cromatograma de DMEM e AA para 48 hora de incubao. E - Cromatograma de DMEM e AA para 72
hora de incubao. F - Cromatograma de DMEM e AA para 96 hora de incubao.--------------------------- 64
Grfico 16: Cromatogramas de amostras de DMEM com 10 mM de DHA. A Cromatograma
correspondente injeco do DMEM com 24 horas de incubao. B Cromatograma de DMEM e DHA
para 1 hora de incubao. C Cromatograma de DMEM e DHA para 24 hora de incubao. D
Cromatograma de DMEM e AA para 48 hora de incubao. E Cromatograma de DMEM e DHA para 72
hora de incubao. F Cromatograma de DMEM e DHA para 96 hora de incubao. ------------------------ 66
Grfico 17: Cromatograma de amostras controlo. A 1 hora de incubao. B 96 horas de incubao. 67
Grfico 18: Estudo comparativo para a valiao do meio extracelular aps incubao com AA. A WiDr
foram tratadas durante 1, 24, 48, 72 e 96 na presena do AA e na ausncia (C) com trs concentraes
referidas no grfico. Aps injeco no HPLC os respectivos tempos de reteno foram comparados bem
como as reas por integrao grfica.------------------------------------------------------------------------------------ 68
Grfico 19: Estudo comparativo para a valiao do meio extracelular aps incubao com DHA. A WiDr
foram tratadas durante 1, 24, 48, 72 e 96 na presena do DHA e na ausncia (C) com trs concentraes
referidas no grfico. Aps injeco no HPLC os respectivos tempos de reteno foram comparados bem
como as reas por integrao grfica.------------------------------------------------------------------------------------ 68
Grfico 20: curva de calibrao para determinar a linearidade da deteco UV. Foram injectadas cinco
amostras de AA com as concentraes apresentados no grfico. ------------------------------------------------- 69
Grfico 21: Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 3 mM.
Aps integrao grfica dos cromatogramas evidenciados nos grficos 17, 18 e 19, foi feita a anlise
comparativa entre as reas dos picos do AA e DHA ao longo do tempo.----------------------------------------- 69
Grfico 22 : Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 7 mM.
Aps integrao grfica dos cromatogramas evidenciados nos grficos 17, 18 e 19, foi feita a anlise
comparativa entre as reas dos picos do AA e DHA ao longo do tempo.----------------------------------------- 70
Grfico 23: Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 10 mM.
Aps integrao grfica dos cromatogramas evidenciados nos grficos 17, 18 e 19, foi feita a anlise
comparativa entre as reas dos picos do AA e DHA ao longo do tempo.----------------------------------------- 70
Grfico 24: A - Biodistribuio do
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xiii
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ndice de Quadro
Quadro 1: Tempo de reteno das amostras padro injectadas no HPLC. Os valores referentes s
amostras padro representam a mdia de trs injeces ...................................................................... 50
Quadro 2: Mdia dos tempos de reteno (com n=6) referentes amostras controlo analisadas no HPLC.
............................................................................................................................................................ 67
Quadro 3: Anlise da razo entre a capatao do 99mTc-AA em ratinhos Balb/c nu/nu atmicos e normais.
............................................................................................................................................................ 74
ndice de Equaes
Equao 1: Dismutao do radical ascorbil.............................................................................................. 7
Equao 2: A e B reao de Fenton ......................................................................................................... 7
Equao 3: Reaco de reduo de compostos derivados de quinona ..................................................... 7
Equao 4: Equao de Michaelis-Menten .............................................................................................. 9
Equao 5: Resoluo ........................................................................................................................... 24
Equao 6: A - Nmeros de pratod tericos (N). B Eficincia (HETP) ................................................... 24
Equao 7: Selectividade () ................................................................................................................ 24
Equao 8: Equao para a determinao da captao do radiofrmaco ............................................... 35
Equao 9: determinao da viabilidade celular .................................................................................... 35
Equao 10: A - Eficincia da placa. B - Factor de sobrevivncia. ........................................................... 38
Equao 11: Linearidade (retirado de Snyder, 2002) ............................................................................. 40
Equao 12: Percentagem de dose do radiofrmaco injectado por grama de rgo............................... 42
Equao 13: Clculo do volume do tumor ............................................................................................. 42
xiv
Captulo I - Introduo
Introduo
1. Vitamina C
As vitaminas fazem parte de uma classe de nutrientes essenciais para o organismo
humano, devido s suas funes em mltiplos processos bioqumicos e fisiolgicos. O
ascorbato ou cido ascrbico (AA), mais tarde designado por vitamina C, um derivado da
glicose isolado em 1928 pelo bioqumico e Prmio Nobel Szent-GyorGyi. A biossntese do cido
ascrbico a partir da glicose decorre principalmente no fgado ou nos rins de vrios animais
devido presena do enzima gulonolactona oxidase (GULO) responsvel por catalizar o ltimo
passo da reaco (figura 1). Os humanos, os primatas e outros animais perderam a capacidade
de sintetizar endogenamente o cido ascrbico devido s inmeras mutaes que levaram a
inactivao do gene que codifica o enzima GULO; deste modo necessrio obter a vitamina C
a partir da dieta. Uma alimentao deficiente em vitamina C leva ao desenvolvimento do
escorbuto, doena caracterizada por afectar a sntese do colagnio, dificuldade em cicatrizao
das feridas, defeitos na formao dos dentes e na ruptura dos vasos sanguneos provocando
equimoses. Uma dieta rica em frutos e vegetais frescos aumenta a ingesto de vitamina C,
prevenindo assim o escorbuto. Aceita-se a designao de ascorbato ou cido ascrbico (AA)
para a vitamina C, sendo esta a forma reduzida, tendo o cido dehidroascrbico (DHA) como a
forma oxidada. Estas duas formas coexistem de igual modo nos alimentos ricos em vitamina C,
sendo que a forma reduzida a fisiologicamente activa. A sntese do DHA a partir do AA
atravs de uma reaco de oxidao, onde dois electres so removidos, dando origem
primeiramente ao radical ascorbil e de seguida ao cido dehidroascrbico, essa reaco
mediada pelos enzimas redutases (figura 2) (Fransson and Mani, 2007; Levine, et al., 1999;
Verrax and Calderon, 2008).
Introduo
1.1.
Funes
Antioxidante
Introduo
(membrana citosol), protegendo assim as membranas celulares de radicais livres (Verrax and
Calderon, 2008).
2A- +2H AA+DHA
1.1.2.
Pr-oxidante
O cido ascrbico conhecido principalmente por ser um antioxidante, mas ele tambm
apresenta funo de pr-oxidante em concentraes farmacolgicas. A actividade proxidante da vitamina C pode ocorrer de duas formas. A primeira logo quando o AA oxidado
para DHA dentro da clula pela enzima glutationa redutase (GSH), um antioxidante celular. No
entanto, durante este processo a glutationa redutase GSH consumida e transformada em
dissulfeto de GSH, perdendo a sua capacidade antioxidante levando ao aumento dos radicais
livres na clula. Outra forma do seu efeito pr-oxidante atravs da reao de Fenton
(equao 2 A e B). A vitamina C na presena de metais livres de transio como o ferro e o
cobre in vitro tem a capacidade de os reduzir levando assim formao dos ies Fe2+ e Cu+ e
A- que interagem com o H2O2 produzindo radicais hidroxilo (Engel and Evens, 2006; Verrax
and Calderon, 2008).
A
B
Acredita-se que in vitro a reduo dos metais livres de transio pode ser a principal razo
do efeito pr-oxidante da vitamina C mas tambm pode reduzir compostos derivados da
quinona (Q) formando radicais que podem ser reoxidados por molculas de oxignio atravs
da reaco apresentada pela equao 3.
AH- + Q A- + Q- + H+
Q- + Q2 Q + Q2
1.2.
Transporte
Introduo
1.2.1.
Protenas especficas medeiam a entrada e a sada do DHA das clulas por difuso
facilitada, sendo esta caracterizada pelo movimento do lquido apenas na direco de um
gradiente qumico ou eletroqumico do soluto transportado. Nos intestinos, onde se d a
maior absoro da vitamina C, o intake do AA inibido pela glicose proveniente da dieta o que
leva a uma diminuio da entrada dessa forma da vitamina C nos entercitos; contudo, essa
inibio no se verifica para o DHA. Assim, o transporte do AA para o interior das clulas
feito de forma indirecta, atravs da oxidao do AA em DHA, em que este transportado
atravs dos GLUTs e, de seguida, reduzido dentro da clula a AA. No entanto, o DHA que no
absorvido pelos entercitos entra no plasma sanguneo, onde poder ser absorvido por
outras clulas reduzindo-o a AA, ou ser filtrado nos capilares do glomrulo renal, e de seguida
ser reabsorvido atravs da membrana luminal das clulas epiteliais que formam os tbulos
9
Figura 3: Esquema do sistema de transporte do DHA atravs dos GLUT. (Retirado de (Li and Schellhorn,
2007)
1.2.2.
10
Introduo
transporte para dentro das clulas feito a favor do gradiente electroqumico do sdio que
mantido pela bomba sdio-potssio, por isso um transporte secundrio (figura 4). O AA
transportado atravs de duas isoformas dos transportadores dependentes de sdio o SVCT1 e
SVCT2, em que para cada dois caties de sdio entra um anio ascorbato, sendo que o excesso
de sdio excretado para fora da clula pela troca com o potssio. Essas duas isoformas
apresentam diferenas nas suas propriedades e expresso em diferentes tipos de clulas e
tecidos (Rivas, et al., 2008). Tem sido demonstrado que o SVCT1 tem maior capacidade de
transportar o AA do que a outra isoforma, porm o SVCT2 apresenta uma maior afinidade.
No se sabe se esta diferena uma caracterstica intrnseca da protena SVCT1, ou se
por existir mais SVCT1 do que SVCT2 nas membranas plasmticas das clulas
transportadoras. Para alm desta diferena, estas duas isoformas possuem tambm
distribuies e funes distintas: o SVCT1 expressa-se predominantemente nas clulas
epiteliais, nomeadamente no intestino, rim e fgado, e pode transportar quantidades de
ascorbato superiores s suas necessidades, enquanto que o SVCT2 poder estar envolvido
na manuteo dos nveis intracelulares de vitamina C para o funcionamento neuronal e
proteco contra o stresse oxidativo, e encontra-se presente em clulas como, clulas do
crebro, olho e placenta (Wilson, 2005).
Figura 4: Esquema representativo do sistema de transporte do AA atravs dos SVCT.(Retirado de(Li and
Schellhorn, 2007)
11
12
Introduo
2. Stresse Oxidativo
O stresse oxidativo geralmente definido como um desiquilbrio entre a produo de
radicais livres e as defesas antioxidantes. Os radicais livres so compostos que apresentam um
ou mais electres desemparelhados. Destes os derivados do oxignio, so a classe mais
importante dos radicias livres gerados no organismo, sendo estes conhecidos como espcies
reactivas de oxignio (ROS). Estas espcies incluem o radical anio superxido (O2-), o oxignio
singleto (O2-), o perxido de hidrognio (H2O2) e o radical hidroxilo (OH-), um anio muito
reactivo. As ROS tm um importante papel na regulao de vrios processos metablicos na
clula pela activao de vrias cascatas enzimticas e de factores de transcrio. Desse
processo de activao, diferentes respostas podem ser desencadiadas dependendo do tipo de
clula e da concentrao celular das ROS, podendo estar envolvida no aparecimento de
diversas patologias, como a diabetes tipo II, arteriosclerose, isqumia, doenas
cardiovasculares e at mesmo o cancro.(Orrenius, et al., 2007; Schumacker, 2006; Wilson,
2002).
Outro tipo de resposta celular, que est relacionado com a produo de ROS a regulao
da morte celular, uma vez que em pequenas concentraes levam morte celular por
apoptose e em altas por necrose. As ROS so produzidas tanto por fontes exgenas como por
endgenas. A maioria das ROS produzidas endogenamente tm origem na respirao
mitocondrial (cerca de 1 a 2% do oxignio consumido pela clula convertido em radical
superxido), podendo actuar como bioprodutos prejudiciais para as clulas, bem como
molculas importantes na sinalizao intracelular (Schumacker, 2006; Valko, et al., 2006).
As cluas possuem sistemas de defesas antioxidantes para restaurar o equilbrio redox,
entre as quais se destacamo superxido dismutase (SOD), glutatona peroxidade, mas tambm
de extrema importncia a contribuio das defesas antioxidantes exgenas como as
vitaminas hidrossolveis (vitaminas C e E) (Valko, et al., 2007). A sinalizao celular o
13
mecanismo celular que traduz a resposta ao estmulo externo, induzindo actividades biolgicas
como a contraco muscular, expresso gnica, proliferao celular e at a morte celular.
Como referido anteriormente, as ROS produzidas no stresse oxidativo desempenham um
importante papel na sinalizao celular bem como na regulao da transcrio do sinal. Assim
sendo, as ROS podem influenciar posisitivamente como negativamente o funcionamento
normal das clulas, uma vez que as ROS so naturalmente oxidantes e podem causar danos
irreverssveis a nvel do ADN, protenas e alguns lpidos(Valko, et al., 2006).
2.1.
Vitamina C e Cancro
14
Introduo
em modelos de culturas celulares e em modelos animais com tumores. Estudos usando o cido
ascrbico como suplemento para os doentes com tumores malignos comeou muito cedo, em
que observaram uma melhoria na qualidade de vida em relao ao grupo controlo (Levine, et
al., 2009; Levine, et al., 1999; Padayatty, et al., 2006). Paralelamente, estudos in vitro
demostraram que o AA em concentraes farmacolgicas actuam como pr-oxidante, pois
verificou-se a inibio de proliferao em muitas linhas celulares tumorais diferentes. Acreditase que esse efeito se deve ao facto do AA se transformar em radical ascorbil (A -) reagindo
com o H2O2 no espao extracelular levando
conseguentemente morte celular (Albanes, 2009; Chen, et al., 2007b). Contudo, outros
estudos in vitro com AA onde avaliaram a actividade antitumoral chegaram a concluso que
quando administrado sozinho essse efeito no se verifica (Hoffer, et al., 2008). Assim, o uso da
vitamina C no tratamento do cancro passaria pela combinao desta com outras frmacos
antitumorais, pois estudos epidemiolgicos comprovaram que essa combinao pode
potenciar o efeito citotxico de certos frmacos, estimulando a apoptose celular e interrupo
do ciclo celular. Assim, possvel concluir que a vitamina C pode actuar como um catalizador
no tratamento do cancro. Porm, outros estudos demostraram que para certos frmacos a
concentrao de vitamina C pode actuar como antioxidante inibindo assim o efeito
antitumoral dos frmacos. Com isto pode-se dizer que a vitamina C pode ter um grande
potencial no tratamento do cancro com prognstico reservado e opes teraputicas limitadas
(Chen, et al., 2007b).
No que diz respeito aos mecanismos de aco dos antioxidantes, sabido que muito ainda
h para explorar contudo, existem dados considerveis que permitem sugerir que
determinados antioxidantes, administrados sob circunstncias controladas, podero
significativamente aliviar os efeitos indesejveis da quiomioterapia e radioterapia e, longe de
prejudicar os seus benefcios, podero mesmo contribuir para a melhoria das mesmas. Cada
15
3. Potencial Teraputico/Citotoxicidade
A selectividade do efeito citotxico apresentado pela vitamina C em relaco s clulas
tumorais uma das principais caractersticas para a sua eficcia teraputica, pois neste tipo de
clulas a concentrao da vitamina no suprime o sistema imunitrio, aumentando assim a
resistncia infeco.
A vitamina C actua de forma selectiva nas clulas tumorais, devido diminuio considervel
das enzimas antioxidantes nestas clulas em relaco as clulas normais; assim, quando
expostas vitamina C h um cresente aumento na produo do H2O2 e consequente aumento
do stresse oxidativo. Por outro lado, na presena de metais de transio e, devido ao aumento
da oxidao de AA em DHA, este efeito citotxico selectivo reforado nas clulas tumorais
(Chen, et al., 2007a; Chen, et al., 2009; Rozanova, et al., 2007).
Estudos para comprovar o potencial teraputico da vitamina C tm seguido duas
vertentes: os efeitos de elevadas concentraes de AA no desenvolvimento e progresso de
tumores e os mecanismos de aco que podero contribuir para o seu efeito anticancergeno.
trabalho abordaremos principalmente a selectividade do AA, tendo em conta que
vrios estudos in vitro demostraram que concentraes farmacolgicas do AA matam
preferencialmente as clulas tumorais e no matam as clulas normais, sendo esta resposta
16
Introduo
4. Medicina Nuclear
A Medicina Nuclear uma tcnica multidisciplinar que utiliza radiofrmacos para estudar
os processos fisiolgicos e diagnosticar de forma no invasiva informaes funcionais de
diversas doenas. Consoante o tipo de emissores, assim os radiofrmacos podem ser usados
para fins de diagnstico, quando os emissores so gama ou de positres, ou para fins
teraputicos, quando os emissores so partculas beta, de electres auger ou de partculas
alfa. Para a obteno de informao funcional imagiolgica necessrio a administrao de
17
4.1.
Radiofrmacos
18
Introduo
desintegrao (tempo necessrio para reduzir a metade a actividade inicial), sendo este
suficiente para preparar, administrar ao doente e adquirir a imagem, e a energia das partculas,
pois essa energia deve situar entre 80 e 300 keV ( Saha, 2003).
Actualmente, cerca de 90% dos radiofrmacos utilizados para diagstico na medicina
nuclear usa como radionucldeo o tecncio-99m (99mTc), pois este apresenta um perodo de
semi-desintegrao (6 horas) curto o suficiente para reduzir o tempo da durao do exame
bem como a irradiao ao doente, sem deixar de referir que a energia dos raios gama emitidos
pelo 99mTc adequada para a deteco pela cmara gamma (140keV). O tecncio um metal
de transio pertencente ao grupo VIIB, tendo 43 como nmero atmico, existindo em 9
estados de oxidao (1- a 7+), sendo que os estados 4+ e 7+ so os mais estveis em soluo
aquosa. Um composto radiofarmacutico marcado com
99m
pode ser vista como uma vantegem, pois podem ser produzidos in loco, numa radiofarmcia.
Esse processo consiste na adio de
99m
gerador 99Mo/99mTc a um kit frio com uma mistura farmacolgica (Stapleton, et al., 1967). O
99m
Tc-pertecnetato de sdio depois de eludo encontra-se com o estado de oxidao 7+, sendo
que necessrio que haja uma reduo deste para que haja a marcao com um ligando, por
isso sempre utilizado um agente redutor na formulao radiofamacutica. Numa tpica
preparao de um radiofrmaco com 99mTc existe sempre a possibilidade de conter impurezas
qumicas recorrentes do processo de marcao, assim sendo a presena do oxignio pode
diminuir a quantidade do agente redutor, pela oxidao atravs do O2, perdendo assim a
capacidade de reduzir o 99mTcO4-. Assim o aumento do 99mTcO4- no kit, aparece como uma uma
impureza qumica. Outra impureza que normalmente est presente numa marcao com o
99m
Tc a sua forma reduzida e hidrolizada (99mTc-RH), que numa soluo aquosa, o tecncio
reduzido reage com a gua formando vrias espcies hidrolizadas (Liu and Edwards, 1999).
19
4.2.
Controlo de Qualidade
99m
Tc,
podem resultar de reaces qumicas entre os compostos usados, o qur permite usar vrios
mtodos para avaliar a presena dessas impurezas. Assim, tm sido desenvolvidos diferentes
mtodos tais como a cromatografia em papel, a cromatografia por gel, a electroforese em
papel ou em gel de poliacrilamida, troca inica, extrao por solvente, e destilao, assim
como, a tcnica de High Performance Liquid Chromatography (HPLC) a qual tem sido usada
20
Introduo
21
fases mveis especficas. Deste mode existem, a cromatografia de fase normal, de fase reversa
e troca inica. de referir que todos eles esto orientados na optimizao do mtodo de
separao clssica pelo aumento da resoluo e velocidade e diminuio do tempo de anlise
(Li and Franke, 2009).
Entre esses tipos de HPLC, usmos o de fase reversa, pois apresenta vantagens
inerentes sua capacidade em discriminar compostos de baixo peso molecular com
caractersticas muito semelhantes. Este mtodo consiste em usar uma fase estacionria no
polar e fases mveis hidro-orgnicas (polares). Assim, a reteno dos componentes qumicos
da amostra devido sua hidrofobia, devido s foras dispersivas interaes de Van der
Walls. As fases estacionrias que geralmente so usadas no HPLC de fase reversa so
constitudas por micropartculas porosas de slica ligadas quimicamente a cadeias alqulicas
hidrofbicas (-CH2-CH2-CH2-CH3), sendo as mais usadas as C4, C8 e C18. As fases mveis que
so combinadas com essas colunas favorece a separao e so contitudas principalmente por
gua, sendo que diferentes concentraes de solventes orgnicos so adicionados, estes
solventes tm de ser miscveis, normalmente os solventes orgnicos mais usados so o
metanol e o acetonitrilo (Kazakevich, 2007, Saha, 2003).
Aps a separao dos diferentes componentes de uma amostra necessrio fazer a
sua deteco, a qual pode ser realizada por espectrofotometria, electroqumica, fluorescncia,
espectrofotometria de massa, deteco de eventos por cintilao, entre outros. A escolha do
tipo de dectector que se usa no HPLC, no tem uma tendncia especfica, pois nenhum
detector possui propriedades que o tornem ideais, por isso, podemos dizer que no h
detectores universais. A escolha deste, depende do tipo de deteco pretendida para uma
certa separao. Na anlise de radiofrmacos, tanto o monitor ultravioleta (UV) como o
detector de radiao so frequentemente usados para medir a concentrao dos diferentes
componentes da amostra. O monitor UV mede a absorvncia de luz do eluato, a qual
proporcional concentrao do soluto presente no mesmo. O detector de radiao usado
22
Introduo
para medir a concentrao dos componentes radioactivos no eluato. A maioria dos detectores
de radioactividade possui cristais cintiladores entre dois fotomultiplicadores de elevada
eficincia de contagem. Os sinais medidos por estes so amplificados e, posteriormente,
quantificados. Esta quantificao efectuada por um processo de integrao grfica das
deteces, por cintilao, obtidas (cromatograma). O cromatograma obtido pela relao
entre o valor real da deteco da substncia e o seu tempo de reteno. Por sua vez, o tempo
de reteno o tempo que o composto leva a percorrer a distncia desde a coluna at ao
detector, o qual se inicia no momento em que a amostra injectada e termina no instante em
que a altura do pico, referente a este composto, mxima. O cromatograma obtido em
contagens por segundo (CPS) em funo do tempo (min) e em milivoltes (mV) em funo do
tempo (min) para a deteco por radioactividade e UV, respectivamente. Na figura 5 possvel
verificar esquematicamente os diferentes contituintes de um aparelho do HPLC (Clark and
Mama, 1989).
Antes de qualquer anlise no HPLC temos de ter a certeza que o mtodo funciona e
que o equipamento se encontra em perfeitas condies para o desenvolvimento da mesma.
Para isso temos disposio vrios parmetros para avaliar a integridade do equipamento.
Alm disso, nesse trabalho o HPLC foi usado no s para a realizao da separao analtica
23
como tambm para a quantificao analtica, logo necessrio determinar parmetros como a
resoluo da coluna, a sua eficincia e selectividade. Outras caractersticas ligadas separao
e ao equipamento tambm devem ser conhecidas, como a linearidade, a exactido e a
preciso.
Tendo essas consideraes em conta passo a defenir esses parmetros:
a) Resoluo (R) a resoluo entre dois picos adjacentes definido pela a relao entre
a distncia entre os mximos dos picos, ou seja distncia entre os tempos de reteno,
tr, e a mdia aritmtica das duas larguras do pico, w. O clculo de R obtido atravs
da equao 5 (Snyder, 2002):
=2
Equao 5: Resoluo
a) Eficincia (HETP- Height Equivalent to the Theoretical Plate) a medida que nos d o
grau de disperso do pico numa determinada coluna. Surge a partir da Teoria de
Pratos da coluna e expressa pela razo entre o comprimento da coluna (L) e o
nmero de pratos tericos (N) desta, assim como mostra a equao 6 B. Tendo tr
como o tempo de reteno do pico e w a largura do pico (Meyer, 2004).
b)
(A)
(B)
24
Introduo
25
26
28
Materiais e Mtodos
99m
vitro e in vivo.
1. Estudos de Qumica
1.1.
99m
29
1.2.
Optimizao da Marcao
99m
99m
TcO4Na e da temperatura de
marcao. No mtodo optimizado de marcao foi utilizada uma actividade de 222 MBq de
99m
TcO4Na em 1,5 mL, usando o mesmo agente redutor (0,2 mL de FeCl3). Todo o processo de
marcao foi feito nas mesmas condies relativamente anterior, excepto no facto do kit ser
mantido temperatura ambiente.
Este processo, permitiu que a actividade volmica do kit ficasse mais concentrada,
uma vez que diminumos o volume total final, e pelo facto de no deixarmos o kit no gelo
durante 3 horas a eficincia de marcao observada desde dos 0 minutos aps a marcao at
24 horas manteve-se sempre superior aos 90%.
1.3.
30
Materiais e Mtodos
99m
Tc-AA, e o
99m
99m
31
99m
32
Materiais e Mtodos
Sendo o HPLC uma tcnica baseada na separao de diferentes componentes de uma amostra
essencial que a separao seja feita da melhor forma possvel para que a distino desses
componentes seja feita de uma forma mais credvel. Para isso procedeu-se ao clculo da
resoluo da coluna usada neste equipamento, bem como da sua eficincia e selectividade.
Para tal, atravs de uma anlise as amostras no radioactivas presentes no kit, o AA e o FeCl3
procedeu-se a anlise grfica de um cromatograma, obtido pela deteco UV. Outros
2. Estudos in Vitro
2.1.
Culturas celulares
33
de referir que todo o material de manipulao das culturas celulares foi devida e
previamente esterilizado. Da mesma forma que todos os procedimentos foram efectuados nas
condies de esterilizao e assepsia necessrias.
2.2.
Estudos de captao
Para a realizao dos estudos de captao as cluas, ambas as linhas celulares foram
incubadas com 3 mL de uma soluo de tripsina-EDTA a 0,25% (Gibco 25200) durante trs
minutos, para ocorrer a desagregao celular. Seguidamente, e para inactivar a tripsina, foram
adicionados suspenso celular cerca de 8 mL de DMEM, a qual foi posteriormente
centrifugada a 1000 rotaes por minuto (rpm) durante 5 minutos (Heraeus Multifuge 1L-R;
raio do rotor 18,7 cm). As clulas foram ento ressuspensas em meio de cultura, para
obteno de uma supenso celular com a concentrao de 2x106 clulas/mL. Com o intuito de
recuperarem do stresse causado pela aco enzimtica da tripsina, foram deixadas a repousar
durante 60 minutos, em dois frascos de 25 cm2, temperatura de 37 C e numa atmosfera
contendo 5% de CO2.
Aps a preparao da suspenso celular foi adicionado um volume de 99mTc-AA a cada
um dos frascos, de forma a obter uma concentrao de cerca de 0,925 MBq/mL do
radiofrmaco. Tubos de eppendorf contendo 500 L de uma soluo de tampo fosfato
(Phosphate Buffer Solution PBS 0,5 mg/mL ajustado a pH 7,4), foram previamente
colocados no gelo para que, ao colocar as amostras da suspenso, o metabolismo celular seja
reduzido. Passados 5, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos aps a adio do radiofrmaco,
retiraram-se trs amostras de 200 L da suspenso presente nos frascos. Para permitir a
separao do pellet e do sobrenadante centrifugaram-se as amostras a 10000 rpm durante 60
segundos. O sobrenadante foi ento transferido para um tubo RIA identificado. Adicionaramse mais 500 L de PBS gelado ao tubo de eppendorf contendo o pellet e repetiu-se o
procedimento de centrifugao para obter a completa rentabilizao do sobrenadante.
34
Materiais e Mtodos
100
Para alm deste estudo de captao, foi realizado outro com o mesmo procedimento,
no entanto, com a incubao somente de
99m
2.3.
100
35
ampliao de 100x. Efectuou-se a contagem das clulas vivas (brilhantes) e das clulas mortas
(coradas de azul) nos quatro quadrantes do hemocitmetro. Posteriormente, calculou-se a
viabilidade das clulas de adenocarcinoma colorectal, em percentagem, utilizando a expresso
acima referida.
2.4.
Estudos de citotoxicidade
2.4.1.
foi usado para avaliar a proliferao das clulas de adenocarcinoma colorectal (WiDr) e de
melanoma (A375), sendo este um mtodo colorimtrico baseado na capacidade da enzima
mitocondrial dehidrogenase, presente nas clulas viveis, clivar os anis tetrazlio do MTT e
formar cristais formazan de cor azul escura. Quando as membranas celulares esto ntegras,
estes cristais atravessam-nas, o que induz sua acumulao nas clulas viveis.
Consequentemente, o nmero de clulas vivas proporcional quantidade de cristais de
formazan produzidos (Mosmann, 1983).
Para estes estudos, e semelhana do descrito para os estudos de captao, foi
necessria a preparao de uma suspenso celular com 50000 clulas/mL em meio de cultura.
Esta suspenso foi distribuda por placas de 24 poos, contendo cada poo 500 L da
suspenso, e aps 24h as clulas foram incubadas com diferentes concentraes de AA. A
linha celular WiDr foi incubada com as seguintes concentraes num intervalo de 0,05 a 50
mM. De igual modo as clulas A375 foram incubadas com concentraes do AA a apartir do
0,05 at 10 mM, seguindo os mesmos valores usados na linha celular WiDr. As clulas foram
incubadas com as referidas concentraes durante os tempos apresentados na tabela 1.
Passados os tempos de incubao, os meios de cultura contendo a molcula foram retirados e
acrescentado 500 L de meio novo a cada poo. A proliferao celular foi avaliada s 24 e 48
horas de forma a obter as curvas de dose-resposta. Depois de passado o respectivo tempo de
repouso (24 e48 horas), o meio de cultura foi retirado, adicionou-se 500 L de PBS para
36
Materiais e Mtodos
lavagem e, posteriormente, 200 L de uma soluo de MTT (M2128, Sigma) dissolvida em PBS
foi adiconada a cada poo e as clulas ficaram a incubar por 3 horas. Passado esse tempo,
acrescentou-se 200 L de uma soluo de isopropanol cido, com 0,04 M de cido clordrico
(37 % fumante), e as clulas foram colocadas numa placa de agitao durante 30 minutos. O
contedo de cada poo foi transferido para uma placa de 96 poos e a absorvncia foi
quantificada a 570 nm com um filtro de referncia de 620 nm, usando o espectrofotmetro
ELISA (SLT - Spectra).
Tabela 1: Resumo dos tempos de incubao e respectivos tempos de repouso
WiDr
1
4
24
48
4
1
A375
24
4
1
48
CO2, durante 10 dias com troca de meio no 5 dia. Aps os 10 dias verificam-se formao de
colnias macroscpicas. Cada colnia corresponde a uma clula semeada que aderiu placa e
se multiplicou posteriormente. Para proceder contagem das colnias formadas, melhorou-se
a visualizao destas. Com esse objectivo, os poos foram lavados duas vezes com 1 mL de PBS
e, de seguida, as clulas foram incubadas com 2 mL de metanol (Merck - K35192409) durante
5 minutos, tendo sido este procedimento repetido duas vezes. Passados os 5 minutos as placas
ficaram a secar por mais 5 minutos, logo a seguir foi adicionado 2 mL do corante violeta de
cristal (Sigma- C3886) (0,5 % diludo em metanol), o qual actuou durante 5 minutos.
Posteriormente o corante foi aspirado, as placas lavadas em gua tpida at a eliminao total
do excesso do poos, sendo que para 6 poos, 3 so controlo. Destes resultados foi possvel
calcular o factor de sobrevivncia das clulas [SF surviving factor (%)] e a eficincia da placa
[PE plate efficiency (%)], atravs das seguintes equaes:
100 (A)
100 (B)
2.5.
Materiais e Mtodos
Amostras
Concentrao
DMEM+AA
24
48
72
96
10 mM
DMEM+DHA
24
48
72
96
10 mM
DMEM
24
48
72
96
---------
2.5.1.
39
injectadas no HPLC para obteno dos respectivos cromatogramas. Amostras de meio, sem
tratamento com o AA e DHA, com os mesmos tempos de incubao e na presena de
metabolismos celular foram injectadas para servir de controlo.
Tabela 3: Amostras injectadas no HPLC na presena de metabolismo celular para avaliar o meio
extracelular.
Amostras
Concentrao
AA+Meio
24
48
72
96
3 mM
AA+Meio
24
48
72
96
7 mM
AA+Meio
24
48
72
96
10 mM
DHA+Meio
24
48
72
96
3 mM
DHA+Meio
24
48
72
96
7 mM
DHA+Meio
24
48
72
96
10 mM
Meio
24
48
72
96
3 mM
Meio
24
48
72
96
7 mM
Meio
24
48
72
96
10 mM
3. Estudos in Vivo
Com vista a avaliar a eficincia do mtodo usado para o controlo de qualidade bem como
o potencial imagiolgico do 99mTc-AA e de certa forma confirmar os resultados observados
40
Materiais e Mtodos
nos estudos in vitro, foram realizados estudos em ratinhos Balb/c nu/nu. A escolha destes
animais justifica-se pelo facto de serem animais atmicos e deficientes em clulas T, pelo que
permitem o desenvolvimento de tumores aps a implantao de clulas tumorais. Pelo
desconhecimento do comportamento biolgico da molcula em estudo, levou a que tivssemos de realizar estudos de biodistribuio em animais normais. Estes estudos permitiramnos inferir acerca das vias de excreo assim como dos rgos-alvo do 99mTc-AA. Os
resultados farmacocinticos obtidos serviram para anlise comparativa com os obtidos em
animais com xenotransplantes.
3.1.
99m
Tc-AA de cerca de 1,64 MBq por injeco intravenosa (iv) na veia dorsal da
41
99m
Tc-AA injectado/grama de rgo, tecido ou fluido. Este clculo traduzido na equao 13.
100
3.2.
Desenvolimento de Xenotransplantes
3.3.
99mTc-AA
42
Materiais e Mtodos
Com o objectivo de estabelecer uma relao entre as captaes observadas in vivo do 99mTc-AA
foram calculadas as razes tumor/osso, que consistem na razo entre a % de actividade administrada/grama do tumor e a % de actividade administrada/grama do osso e a razo
tumor/sangue, que consiste na razo entre a % de actividade administrada/grama do tumor e
a % de actividade administrada/grama do sangue.
3.4.
Imagens
Zoom
Matrizes (pixels)
N de Imagens
Durao
Dinmicas
128X128
10
300
Estticas
256X256
120
43
99m
Tc-O4- se d ao nvel da
tiride e estmago, e que, por sua vez, a acumulao de 99mTc-RH se verifica ao nvel do fgado
e bao, tornou-se possvel inferir e comprovar os valores de pureza radioqumica do 99mTc-AA
obtidos por HPLC. Por outro lado, as ROIs foram tambm desenhadas em zonas de maior
actividade, para permitir a anlise das vias de metabolizao e excreo do complexo injectado.
3.5.
AA
Ratinhos Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes, foram usados para desenvolver
esse estudo. Aps sete dias de injeco de aproximadamente 4X106 clulas por rato, sendo
que foi reallizada uma monitorizao contnua do peso e do volume dos ratinhos diariamente,
a terapia com 150mg/Kg de AA, comeou-se quando o volume do tumor atingiu os 300 a
350 mm3. O protocolo de tratamento consistiu numa injeco diria da referida soluo do AA
intraperitonealmente. Esse perodo foi de 12 dias em que as injeces tiveram dois dias de
descanso a cada 5 de injeco. Os ratinhos que serviram de controlo tambm foram pesados
diariamente e o volume dos seus tumores medidos. Aps os 12 dias de tratamento os ratinhos
foram sacrificados, e os tumores foram retirados, medidos e pesados.
4. Anlise estatsca
Atravs dos precedimentos descritos anteriormente obteve-se resultados em que para
aumentar o seu rigor interpretativo procedeu-se a anlise usando aplicaes do SPSS
(Statistical Package for Social Sciences), verso 16.
Nos estudos de captao e estudos clonognicos foram feitos testes no paramtricos visto
44
Materiais e Mtodos
45
46
48
Resultados
1. Estudos de qumica
1.1.
99m
Tc-AA consistia em
adicionar, 222 MBq de pertecnetato de sdio (em 3mL de NaCl 0,9%) e 0,2 mL de FeCl3 0,1 N
(em HCl 0,1 N) a 200 mg de AA, acertando o pH a 6,5 - 7 (com uma soluo de NaOH 1M), a
temperatura de 0C durante 3 horas e mantida em atmosfera de rgon e protegido da luz.
Procedeu-se a realizao do controlo de qualidade para determinar a pureza radioqumica, por
HPLC, do composto
99m
99m
TcO4- foram
Grfico 1 : Cromatograma da amostra do AA (10mM) injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
determinado por integrao grfica.
Grfico 2: Cromatograma da amostra de FeCl3 (0,1N) injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
determinado por integrao grfica.
Grfico 3: Cromatograma da amostra do 99mTcO4- injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
determinado por integrao grfica.
49
De referir que no foi possvel visualizar o pico referente ao 99mTc-RH, uma vez que este fica
retido na pr-coluna (sendo que o poro da pr coluna s deixa passar partculas com dimetro
igal ou menor a 0,1nm e o
99m
Tc-O4
3,85 0,03
UV
2,75 0,01
UV
4,36 0,03
Radioactividade
Baseado nos dados do grfico foi ento possvel determinar os diferentes constituintes
do composto marcado por comparao dos tempos de reteno. Tambm foi possvel calcular
a eficincia de marcao pela relao entre as reas do 99mTcO4-, cujo tempo de reteno j era
conhecido, e do 99mTc-AA. Por excluso de partes, o pico do 99mTc-AA aquele que aparece aos
3,05 minutos (3,05 0,12 minutos). O grfico 4 representa um cromatograma obtido a partir
da deteco por radioactividade de uma formulao obtida com o protocolo de marcao
supra citado. A partir deste podem observar-se claramente os tempos de reteno dos
diferentes compostos radioactivos presentes no complexo, distinguindo-se claramente o 99mTcAA do 99mTc-O4-. Os compostos no radioactivos (deteco UV) e os radioactivos (deteco por
radioactividade) esto representados no grfico 4A e grfico 4B, 4C e 4D, respectivamente. O
controlo de qualidade foi realizada logo aps a marcao bem como aos 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h,
2,5 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h e 24 h aps a marcao.
50
Resultados
99m
51
de marcao ao longo do tempo e manteve-se sempre acima dos 90% durante todo o tempo
que foi feito o controlo de qualidade.
52
Resultados
53
97,46 1,48
6,5 - 7
0,50
95,76 2,49
6,5 7
1,00
97,26 1,39
6,5 7
3,00
96,97 2,19
6,5 7
4,00
97,72 1,30
6,5 7
6,00
98,36 1,07
6,5 - 7
Sendo assim, o HPLC aparece como o mtodo escolhido por excelncia para a
realizao do controlo de qualidade do nosso composto, contudo fica por desenvolver um
mtodo complementar para a determinao da presena do 99mTc-RH no 99mTc-AA.
Antes de considerar os resultados obtidos no HPLC, vlidos procedeu-se a anlise de
parmetros de avaliao da integridade da coluna, para que tenhamos a certeza que a
separao dos componentes da amostra feita de forma a poderem ser distinguveis.
mV
Tempo (min)
Grfico 7: Cromotograma refente aos picos de AA (pico B) e FeCl3 (pico A) detetados por UV.
A resoluo da coluna foi calculada tendo em conta os dados do grfico 7, referente a uma
deteco UV de um controlo de qualidade.
Sendo assim a resoluo da coluna :
54
Resultados
=2
=2
3,85 2,75
= 1,83333
0,6 + 0,6
3,85
= 1,4
2,75
Uma coluna apresenta uma boa selectividade quando esta superior a 1, para que a
separao seja boa, pois a selectividade depende das propriedades do analito e das interaes
deste com a coluna (Kazakevich, 2007).
Tambm os valores de eficincia foram calculados para cada um dos picos (AA e FeCl3),
baseada na teoria dos pratos, em que a coluna dividida num nmero hipottico de pratos de
altura finita (HETP- height of effective theoretical plate). E a maior eficincia observa-se
quando maior o numero de pratos ou quanto menor a altura o prato (HETP). Deste modo
uma boa eficincia caracteriza-se quando o valor do HETP for menor que um (Kazakevich,
2007).
Nmero de pratos:
= 16
= 16
3,85
0,6
= 658,78
= 16
= 16
2,75
0,6
55
= 336,11
= 0,03
= 0,059
Sendo os valores de HETPAA e HETPFeCl3 menores que a unidade podemos confiar nos
resultados obtidos no HPLC, pois os parmetros que influenciam a separao analtica esto
todos dentro do considerado ptimo
2. Estudos in vitro
Aps a realizao dos estudos de qumica pocedeu-se realizao dos estudos in vitro de
modo a estudar a estabilidade do nosso composto marcado em culturas celulares de WiDr e
A375, estudando o seu influxo nestas, pelos estudos de captao, bem como avaliar a
citotoxicidade da forma reduzida da vitamina C (AA) pela avaliao da proliferao e
sobrevivncia celular, tambm efectou estudos no HPLC para avaliar a estabilidade do AA e do
DHA in vitro.
2.1.
Estudos de captao
99m
Tc-AA,
99m
Tc-Livre (99mTcO4-),
99m
excepto aos 5 e aos 120 minutos sendo, no entanto, esta diferena pouco significativa (p >
0,05). Ao longo do tempo o 99mTc-AA comporta-se de forma semelhante ao 99mTc-livre, sendo
que o seu pico de captao ocorre aos 120 minutos com um valor de 0,45%, enquanto o do
99m
Tc-livre ocorre aos 60 minutos com um valor 0,64%. Como evidenciado no grfico, os
99m
56
Resultados
obtidos para o
99m
Captao (%)
99mTc-AA
0,80
99mTc-livre
0,60
0,40
0,20
0,00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (min)
90
100
110
120
130
Grfico 8: Captao do 99mTc-AA e do 99mTc-livre nas WiDr. As clulas foram incubadas com a mesma
99m
99m
concentrao de
Tc-AA e do
Tc-livre e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os
dados expressam a mdia de oito experincias intependentes
Por outro lado as A375, ao contrrio das WiDr, apresentam um aumento na captao
do 99mTc-AA em realco captao do 99mTc-livre excepto durante os primeiros vinte e cinco
minutos do estudo, como evidenciado no grfico 9. De notar que aos 90 minutos a captao
99m
do
Tc-AA semelhante do
99m
podemos observar que o pico de captao do 99mTc-AA ocorre aos 120 minutos com um valor
de 0,36%, bem como o do 99mTc-livre com um valor de 0,26%. A captao das A375 varia entre
0,22 e 0,36%. Verifica-se que aos 45, 60 e 120 minutos existem diferenas entre a captao do
99m
Captao (%)
0,60
99mTc-livre
0,40
0,20
0,00
0
10
20
30
40
50
60
70
Tempo (min)
80
90
100
110
120
130
Grfico 9: Captao do 99mTc-AA e do 99mTc-livre nas A375. As clulas foram incubadas com a mesma
concentrao de 99mTc-AA e do 99mTc-livre e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os
dados expressam a mdia de oito experincias intependentes.
57
Ao comparar a captao do 99mTc-AA nas duas linhas celulares verificamos que as WiDr
tm uma maior captao do que as A375, como se pode observar no grfico 10, excepto aos
45 minutos em que a captao semelhante. Essa diferna estatisticamente significativa
(p<0,05) para 15, 30, 60 e 90 minutos, com valor p igual a 0,028, 0,015, 0,010 e 0,021
respectivamente. Por outro lado, de notar que ambas as linhas celulares tm o mesmo
comportamento ao longo do tempo, excepto no intervalo entre os trinta e os quarenta e cinco
minutos. O pico de captao das WiDr e A375 ocorre aos 120 minutos e tm o valor de 0,45% e
0,36%, respectivamente. De notar ainda que, ao compararmos a captao das duas linhas
celulares com a captao do Tc livre, conclui-se que estas possuem uma baixa captao.
Captao (%)
WiDr
A375
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100 110 120 130
Tempo (min)
Grfico 10: Captao do 99mTc-AA nas WiDr e A375. As duas linhas celulares foram incubadas com a
mesma cancentrao do 99mTc-AA e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os dados
expressam a mdia de oito experincias intependentes.
2.2.
99m
Estudos de citotoxicidade
2.2.1.
O efeito da forma reduzida de vitamina C na proliferao celular das WiDr e A375 foi
feita atravs do mtodo colorimtrico do MTT. Foram analizadas diferentes concentraes do
58
Resultados
AA nas duas linhas celulares bem como o tempo de exposio e o tempo de repouso das
clulas aps a exposio, podendo esse tempo ser crucial para a recuperao ou no das
clulas.
Aps efectuados os estudos, as curvas de dose-resposta foram feitas de modo a determinar o
IC50 para cada linha celular, sendo esta a concentrao que inibe a proliferao celular em 50%
das clulas da amostra. De notar que a proliferao calculada em relao ao controlo em que
no foi-lhe adicionado nenhuma concentrao do AA.
No grfico 11A e 10 B esto representadas as curvas dode-resposta referente a linha celular
WiDr, para 24 e 48 horas, respectivamente, sendo este tempo o de repouso. Os resultados
foram tratados utilizando a ferramenta OriginPro verso 8, em que se avaliou-se a tendncia
dos dados tendo feito uma aproximao sigmoidal, em que posterirmente se calculou o IC50 de
para cada linha, tendo em conta o tempo de exposio e o tempo de repouso.
Grfico 11: Curvas de dose-resposta do AA nas WiDr. A Grfico representando o efeito do AA com
uma e quatro horas de exposio com 24 horas de descanso. B Grfico representando o efeito do AA
com uma e quatro horas de exposio com 48 horas de descanso. Os resultados expressam a mdia de
seis experincias independentes.
Pela anlise dos grficos e recorrendo aos dados da aproximao sigmoidal, foi
possvel verificar que para 24 horas o IC50 para 1 e 4 horas de 22,734 mM e 23,98 mM
respectivamente. Enquanto que para 48 horas e 1 hora de exposio o IC50 observa-se aos
25,09 mM, e para quatro horas houve uma diminuio do IC50 apresentando o valor de
12,2 mM. Podendo estar implicito o papel do tempo de repouso aps a exposio com o AA,
59
nesses resultados, contudo o IC50 observada aos 48 horas com 1 hora de exposio inferior
ao observado aos 24 horas com uma hora de exposio.
Em relaco avaliao da proliferao das A375, os grficos tambm foram feitos
comparando os dois tempos de exposio (1 e 4 horas) para 24 e 48 horas de descanso,
representados no grfico 12.
Grfico 12:Curvas de dose-resposta do AA nas A375. A Grfico representando o efeito do AA com uma
e quatro horas de exposio com 24 horas de descanso. B Grfico representando o efeito do AA com
uma e quatro horas de exposio com 48 horas de descanso. Os resultados expressam a mdia de seis
experincias independentes
O que pode tirar da anlise do grfico 12, que o comportamento dessas clulas
semelhante independente do tempo de repouso, mas no que diz respeito ao tempo de
exposio essa semelhana no se verifica. Essa concluso pode ser comprovada pela anlise
dos IC50, que mostra que para 1 hora igual a 2,42 mM para 24 e 48 horas. O mesmo se
verifica para a exposio de 4 horas em que o IC50 ao 1,06 mM tanto para 24 e 48 horas.
Comparando a percentagem de proliferao entre as WiDr e as A375, observa-se que o IC50
maior para as WiDr, assim sendo de salientar que o AA evidenciou um efeito antiproliferativo
mais cedo nas A375 visto que o IC50 aparece antes dos 5 mM. Para ambas as linhas celulares
baixas doses do AA leva a um aumento significativo na proliferao celular, sendo que essas
doses diferem entre essas duas linhas.
60
Resultados
2.2.2.
Factor de sobrevivncia
(%)
100,00
WiDr
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
0
0,5
2
Concentrao do AA (mM)
Grfico 13: Relao entre a percentagem do factor de sobrevivncia e a concentrao do AA, nas WiDr e
A375. As linhas celulares foram tratadas com as concentraes referidas no grfico. Os resultados so a
mdia de trs estudos independentes.
61
entre 37,4% a 99,58% e nas WiDr entre 44,88% a 98,74% quando a concentrao vai de 0,5 a 5
mM. Na figura 6 podemos observar a diferena entre o nmero de colnias observadas nas
placas de WiDr e A375 tratadas com AA e nos poos controlos. visvel a reduo do nmero
de colnias formado entre o controlo e o poo com 2mM.
Figura 6: Visualizao das colnias formadas. Controlo visualizado no microscpio ptico - A375 (A) e
WiDr (C) e o nmero de colnias formadas aps a exposio das clulas a 2 mM de AA - A375 (B) e WiDr
(D). Visualizao macroscpica das colnias referentes ao controlo - A375 (E) e WiDr (G) e colnias
formadas aps exposio das clulas a 2 mM de AA A375 (F) e WiDr (H).
2.3.
62
Resultados
Grfico 14: Cromatogramas das amostras padro injectadas no HPLC. A Amostra do DHA (10 mM). B
Amostra DMEM. C Amostra do AA (10mM).
63
Amostras
Tempos de reteno
Deteco
AA
3,990,05
UV
DHA 1
2,330,02
UV
DHA 2
2,920,01
UV
DHA 3
11,640,06
UV
DMEM 1
2,520,13
UV
DMEM 2
4,340,68
UV
DMEM 3
8,110,82
UV
DMEM 4
14,691,71
UV
A determinao dos referidos tempos de reteno foi de extrema importncia para a distino
entre cada composto presente na amostra injectada. A anlise da estabildade das duas formas
da vitamina C foi feita incubando clulas de WiDr com 10 mM de AA e DHA, em que os seus
resultados foram obtidos aps 1, 24, 48, 72 e 96 horas de incubao. O pH das amostras foi
determinado para todos os tempos, assim podemos verificar se o pH do meio leva a oxidao
do AA em DHA ou a reduo deste em AA. No grfico 15 esto representados os
cromatogramas das amostras de todos os tempos de incubao com o AA. De igual modo o
DMEM foi incubado para todas as horas que foram feitas o estudo, contudo os cromatogramas
foram todos semlhantes com o passar do tempo pelo que se apresentou um deles, somente
para comparao.
64
Resultados
65
2.3.1.
66
Resultados
representados no quadro 2. Para deferenciar os picos desses estudos foram identificados com
C (de controlo) e enumerados conforme o nmero de picos observados.
Quadro 2: Mdia dos tempos de reteno (com n=6) referentes amostras controlo analisadas no HPLC.
Amostras Controlo
C1
2,610,11
C2
4,040,25
C3
5,770,67
C4
12,441,49
67
Grfico 18: Estudo comparativo para a valiao do meio extracelular aps incubao com AA. A WiDr
foram tratadas durante 1, 24, 48, 72 e 96 na presena do AA e na ausncia (C) com trs concentraes
referidas no grfico. Aps injeco no HPLC os respectivos tempos de reteno foram comparados bem
como as reas por integrao grfica.
Grfico 19: Estudo comparativo para a valiao do meio extracelular aps incubao com DHA. A WiDr
foram tratadas durante 1, 24, 48, 72 e 96 na presena do DHA e na ausncia (C) com trs concentraes
referidas no grfico. Aps injeco no HPLC os respectivos tempos de reteno foram comparados bem
como as reas por integrao grfica.
Resultados
concentrao versus rea aproxima-se de uma equao linear igual a y=85,17x+ 4,7927, sendo
o valor de R2 = 0,998.
rea (mV*s)
1000,0000
800,0000
600,0000
400,0000
200,0000
0,0000
0
4
5
6
7
Concentrao (mM)
9
10
11
y = 85,17x + 4,7927
R = 0,9988
Grfico 20: curva de calibrao para determinar a linearidade da deteco UV. Foram injectadas cinco
amostras de AA com as concentraes apresentados no grfico.
Grfico 21: Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 3 mM.
Aps integrao grfica dos cromatogramas evidenciados nos grficos 17, 18 e 19, foi feita a anlise
comparativa entre as reas dos picos do AA e DHA ao longo do tempo.
69
Grfico
22 : Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 7 mM. Aps
integrao grfica dos cromatogramas evidenciados nos grficos 17, 18 e 19, foi feita a anlise
comparativa entre as reas dos picos do AA e DHA ao longo do tempo.
Grfico 23: Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 10 mM.
Aps integrao grfica dos cromatogramas evidenciados nos grficos 17, 18 e 19, foi feita a anlise
comparativa entre as reas dos picos do AA e DHA ao longo do tempo.
Pelo que foi observado nos cromatogramas do grfico 19, o pico DHA1 aparece
sobreposto ao do controlo (C1). Pelo que se confirma, a partir da anlise dos grficos 21, 22 e
23, visto que para todas as concentraes a rea do pico identificado como DHA1+C1
apresenta sempre um valor mximo superior a deteco correspondentes ao controlo, o que
nos leva a crer que realmente os DHA1 e C1 aparecem sobrepostos. Alm disso verifica-se
uma ligeira diminuio nas reas doDHA2 e DHA3, para todas as concentraes ao longo do
tempo, e essa mesma diminuio verifica tambm para o pico DHA1+C1, podendo ser a
diminuio do DHA1 o responsvel. Assim podemos dizer que houve consumo celular do DHA
70
Resultados
ao longo do tempo. De notar que nesses grficos o controlo s relevante para a comparao
com a rea do A1+C1.
Por outro lado ao comparar a rea dos picos do AA, verifica-se que para todas as
concentraes a rea do pico permanece semelhante ao longo do tempo, podendo estar a
incapacidade que as clulas tumorais apresentam em transportar essa forma da vitamina C
envolvida
3. Estudos in vivo
A realizao dos estudos in vivo foi com o intuito de comprovar/esclarecer os resultados
obtidos tanto no controlo de qualidade do composto marcado como os obtidos nas estudos de
captao realizados in vitro. Nesta via procedeu-se ao desenvolvimento do modelo de
xenotransplante de clulas de adenocarcinoma de clon (WiDr) em ratinhos atmicos Balb/c
nu/nu, fez-se tambm estudos de biodistribuio e farmacocintica do 99mTc-AA, em ratinhos
normais e portadores de xenotransplantes. Alm disso, a avaliao da inibio do crescimeto
tumoral pela aco da forma reduzida da vitamina C (AA), foi realizada.
3.1.
Para uma melhor anlise e compreenso dos resultados obtidos a partir da biodistribuio do
radiofrmaco em ratinhos Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes fundamental
conhecer a sua biodistribuio em ratinhos Balb/c nu/nu normais para poderem apreciar
eventuais diferenas nos modelos. Alm disso, estes estudos fornecem-nos a informao
acerca das vias de excreo do radiofrmaco.
De acordo com o grfico 24(A e B), obtido aps os estudos de biodistribuio com 99mTc-AA e
respectiva quantificao de dose injectada por grama de rgo, mostra, essencialmente,
excreo por via urinria (rim, urina e bexiga) e, tambm, via ciclo entero-heptico (fgado,
vescula biliar e blis).
71
Grfico 24: A - Biodistribuio do 99mTc-AA. Depois de passados os tempos, descritos nos grficos, da
administrao do radiofrmaco, os ratinhos foram sacrificados, os rgos colhidos e a percentagem de
dose injectada por grama de tecido quantificada. B - Fraco percentual do grfico A.
3.2.
72
% Dose injectada/g
Resultados
600,0
500,0
400,0
300,0
200,0
100,0
0,0
30 minutos
60 minutos
90 minutos
120 minutos
180 minutos
240 minutos
300 minutos
360 minutos
150 minutos
Tecido
% Dose injectada/g
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
Tecido
99m
Contudo os rgos com maior captao continuam a ser os responsveis pela excreo.
Estes resultados puseram em causa a veracidade do valor da eficincia de marcao obtida no
controlo de qualidade, pois um radiofrmaco tendo o tecncio como radionucldeo, ao ter uma
baixa eficincia de marcao, ou seja presena de
99m
bioditribuio, vai preferencialmente para a tiride, plexus e estmago. Contudo essa hiptese
foi posta de lado porque com a mesma formulao farmacutica, apresentando uma elevada
eficincia de marcao obtido no HPLC, foi realizada um estudo de biodistriibuio em ratinhos
Balb/c nu/nu normais e com xenotransplantes e os resultados permaneceram iguais.
Deste modo e como os ratinhos Balb/c nu/nu normais e os atmicos podero ter
diferenas que influenciam a biodistribuio da vitamina C, procedeu-se a realizao de
73
estudos de biodistribuio do
99m
Tecido
Balb/c nu/nu
Razo
Urina
96,3281
472,0481
4,900418
Sangue
3,3046
5,4023
1,634809
Fgado
1,8336
1,4215
0,775278
Bao
0,4859
0,8312
1,71077
Pulmo
1,0057
2,6575
2,642326
Corao
0,6140
1,7214
2,803415
Int. delgado
0,7688
1,4915
1,940118
Int. grosso
0,8462
1,8590
2,196964
Tiride
0,5844
2,5816
4,417282
Crebro
0,0559
0,1396
2,496118
Cerebelo
0,0675
0,2123
3,146048
Bexiga
10,4954
33,6897
3,20995
Genitais
0,8081
5,9786
7,398365
Osso
0,6846
5,2630
7,688063
Cartilagem
0,8797
3,3600
3,819301
Estmago
1,1783
2,7918
2,369302
Msculo
0,3043
3,4582
11,36341
Rim
4,1172
12,4359
3,020515
Vescula biliar
1,6798
1,7258
1,02735
Blis
0,4019
0,4455
1,108548
74
Resultados
99m
Tc-AA em
ratinhos Balb/c nu/nu, uma vez que os dados no foram influenciados pela qualidade do nosso
composto, mas sim pelo prprio metabolismo do animal.
Para a avaliao da captao do
99m
percentagem de captao por grama de tecido tumoral, sendo que o seu valor foi sempre
inferior 1,5 % excepto aos 150 minutos tendo como a captao 5,3% por grama do tecido
tumoral, de acordo com o grfico 26.
75
a captao tumoral consideravelmente superior do osso aos 90, 150 e 300 minutos, sendo
que aos 150 minutos ela de cerca de 5 vezes superior.
% da dose injectada/g
Tumor/Osso
Tumor/Sangue
6,0000
5,0000
4,0000
3,0000
2,0000
1,0000
0,0000
30
60
90
120
150
180
240
300
Tempo (min)
Grfico 27: Razo entre as captaes tumor/osso e tumor/sangue.
360
3.3.
99m
uma escala de cores apropriada, permitiram identificar o tumor xenotransplantado, bem como
as vias de excreo atravs de uma imagem de um ratinho Balb/c nu/nu normal, como pode
ser observado na figura 7 A e 7 B respectivamente.
76
Resultados
Figura 7: Imagens obtidas atravs da cmara de raios gama. A - Imagem esttica aos 60 minutos aps a
99m
injeco do Tc-AA, de um ratinho com xenotransplante. A seta aponta para a localizao do tumor. B
Imagem esttica aos 30 munitos aps a injeco do 99mTc-AA, de um ratinho normal, onde podem ser
vistos os dois rins. Todas as imagens esto referenciadas mesma escala de cores mostrada.
Estes estudos ao fim ao cabo veio confirmar os estudos de captao realizados in vitro
relativo s clulas WiDr, visto que a captao tumoral in vivo do tecido tumoral considerada
baixa e pela visualizao da figura 7A, o radiofrmaco no captado o suficiente para a
evidente visualizao deste.
3.4.
AA
Aps a avaliao da citotoxicidade da vitamina C in vitro que apresentou alguma
funo antineoplsica, diminuindo a proliferao celular, logo despertou a curiosidade para
avaliar essa citotoxicidade in vivo. Para isso, fez-se um estudo durante um perodo de vinte
dias em que se procedeu ao tratamento com AA de ratinhos Balb/c nu/nu portadores de
xenotransplantes.
Ao fim desse tempo foi possvel traar-se uma curva da taxa de crescimento tumoral
comparando o grupo controlo, em que no recebeu tratamento e o grupo que recebeu
tratamento. Os resultados esto apresentados no grfico 28.
77
Animais controlo
Animais terapia
20
15
10
5
0
0
5
6
7
8
Dias aps incio da terapia
10
11
12
13
Grfico 28: Resposta in vivo das WiDr ao tratamento com o AA. O resultado uma mdia de n=6 para
cada grupo.
Como se observa no grfico 28, a partir do 3 dia aps o tratamento comeou uma
atenuao no crescimento tumoral do grupo com tratamento, mas essa atenuao no
crescimento tumoral s significativa a partir do 8 dia aps o incio de tratamento.
78
Captulo IV Discusso
79
80
Discusso
99m
99m
Tc. S
posteriormente, quando adicionado o AA, que ir ocorrer a oxidao do cloreto de ferro (III)
com a formao de cloreto de ferro (II). Por sua vez, o cloreto de ferro (II) cede electres ao
99m
Tc(VII) reduzindo-o a
99m
Tc(III) ou
99m
possvel a formao do complexo de 99mTc-AA, que poder, ou no, incluir o cloreto de ferro na
sua constituio. Assim, necessrio ter as quantidades ptimas de todos os constituintes do
81
kit, principalmente entre o agente redutor e o ligando, tendo sido estas optimizadas e
chegando s quantidades de 0,2 ml de FeCl3 e 200 mg do AA. Para alm disso, a temperatura
em que se realiza a marcao e o tempo de incubao do kit importante ter em conta. Nesse
sentido, a primeira tentativa foi de marcao a 0C o que revelou uma baixa estabilidade da
soluo em que a maior eficincia se observou 24 horas aps a marcao, o que invivel
quando se trata de um composto de tecncio, por ter 6 horas de perodo de semidesintegrao. Por cauda desta particularidade do tecncio, espera-se que uma marcao
radiactiva com ele tenha um tempo de incubao entre 10 a 30 minutos e que a sua
estabilidade seja de pelo menos 6 horas (Liu and Edwards, 1999). Contudo, quando a marcao
passou a ser feita a temperatura ambiente o tempo de incubao diminuiu para 30 minutos, e
o kit manteve-se estvel at 24 horas aps a marcao. A relativa complexidade da reaco de
formao do complexo
99m
99m
Tc-RH. Isso
deve-se ao facto do equipamento ter uma pr-coluna que tem poros com 0,1 nm de dimetro
no deixando passar partculas de tamanho superior como o caso dos constituintes de
agregados coloidais, como por exemplo o 99mTc-RH.
82
Discusso
Para alm do controlo de qualidade tambm foram realizados estudos in vitro e in vivo a fim
de estudar a estabilidade do
99m
99m
Tc-AA apresenta valores superiores captao do 99mTcO4- em alguns tempos (45, 60 e 120
99m
Tc-AA e
99m
99m
83
sendo essa a funo fundamental para o seu potencial teraputico (Verrax and Calderon,
2008).
Assim sendo, verificamos que ao expor clulas tumorais ao AA em diferentes concentraes,
variando o tempo de exposio e o tempo de repouso destas, a molcula apresenta uma
citotoxicidade j que inibe a proliferao nas duas linhas celulares a altas concentraes,
sendo estas concentraes diferentes para cada linha celular.
Em relao s clulas do clon (WiDr), existem diferenas visveis quando o tempo de
exposio e o tempo de repouso variam. Quando as clulas foram expostas durante 1 e 4
horas e estiveram a repousar durante 24 horas a diferena entre os IC50 no significativa,
sendo portanto possvel de aferir que o tempo de exposio no seria relevante. No entanto,
para os mesmos tempos de exposio, mas com 48 horas de repouso as clulas mostraram um
comportamento diferente (grfico 11). Na exposio de uma hora houve um ligeiro aumento
do IC50, podendo estar relacionada com o tempo de repouso onde as clulas podero ter
desenvolvido um mecanismo de defesa, no entanto, quando expostas as 4 horas e tendo 48 de
repouso o IC50 diminuiu de cerca de 50% do observado com 24 horas de repouso para o
mesmo tempo de exposio o que leva a crer que, tanto o tempo de exposio como o tempo
de repouso preponderante para desencadear reaces pr-oxidantes nestas linhas celulares.
Em relao s A375, estas apresentam um comportamento igual quando varia o tempo de
repouso, mas nas 4 horas de exposio verifica-se maior citotoxicidade (grfico 12).
Para alm dos estudos de proliferao celular, uma avaliao mais exaustiva foi feita para
avaliar a sobrevivncia das clulas aps 12 dias de repouso com duas horas de exposio ao AA.
Nesse estudo o objectivo no s de avaliar o poder anti-proliferativo da vitamina C, mas
tambm verificar se as clulas que foram expostas ao AA, mesmo no apresentando sinais de
leso ao fim de poucas horas, so capazes de sobreviver. O que se verificou que para
concentraes inferiores ao IC50, obtido nos estudos de proliferao, para as WiDr houve
84
Discusso
diminuio na sobrevivncia de cerca de 80% (grfico 13), enquanto que para as A375 essa
diminuio ocorre para valores prximos do IC50 observado. Neste caso, podemos reforar a
concluso anterior na citotoxicidade do AA nas A375 no depende do tempo de repouso das
clulas, mas nas WiDr o efeito pr-oxidante maior quanto maior for o tempo que clulas tm
para repousar. Contudo, o efeito pr-oxidante ocorre por dois processos, dentro da clula pela
oxidao do AA em DHA, e fora das clulas na presena de metais de transio, e pelo pH, em
que forma o radical ascorbil que ao reagir com o H2O2 e leva formao de espcies reactivas
de oxignio (ROS)(Li and Schellhorn, 2007; Zhao, et al., 2005). Para verificar qual dos mtodos
prevalece foram realizados estudos no HPLC a fim de avaliar indirectamente o mecanismo de
entrada das duas formas da vitamina C nas clulas tumorais, bem como o processo
oxidao/reduo das mesmas em cultura. Verificmos que, em meio de cultura sem
actividade metablica das clulas, o AA no oxida para o DHA e nem este reduz para o AA,
nem mesmo pela aco do pH. Assim, nas clulas tratadas com AA, detectmos a existncia de
um pico referente ao AA, mas nenhum relativo ao DHA (grfico 18). Estes resultados esto de
acordo com os estudos realizados que sugerem que o AA no capaz de atravessar a
membrana das clulas tumorais, o que justifica a sua permanncia no meio extracelular
(Verrax and Calderon, 2008). Por outro lado, nas clulas tratadas com DHA no detectmos a
presena de AA (grfico 19), o que nos leva a concluir, como seria de esperar, que no ocorre
formao de AA por reduo do DHA no meio extracelular. No entanto, apesar dos
cromatogramas apresentarem os picos de reteno do DHA, as reas destes diminuram ao
longo do tempo, sendo este o facto resultado das clulas tumorais possurem uma elevada
expresso dos GLUTs e, consequentemente, so capazes de transportar o DHA atravs da
membrana pelos GlUT1 e 3. Contudo, a presena do DHA nos cromatogramas um indicador
da saturao ao nvel dos transportadores de membrana que, na presena de elevadas
concentraes do composto, deixam de o poder transportar (Corpe, et al., 2005; Fransson and
Mani, 2007; Verrax and Calderon, 2008). Deste modo, poder hipoteticamente ser explicado o
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efeito citotxico observado nas clulas devido a presena extracelular do AA sendo esta
responsvel pelo maior efeito pr-oxidante.
O efeito pr-oxidante do AA foi tambm verificado in vivo avaliando a taxa do
crescimento tumoral em ratinhos Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes confirmando o
efeito pr-oxidante do AA em concentraes farmacolgicas. Ao fim do 3 dia do incio de
tratamento observou-se uma diminuio no crescimento tumoral sendo esse crescimento
considervel quando comparado com o crescimento tumoral do grupo controlo, o que nos leva
a inferir que a vitamina C poder ter um papel importante no tratamento do determinados
tipos de cancro (grfico28).
Observamos a partir dos estudos de biodistribuio que o tecido tumoral no
apresentou uma captao de forma a ser evidenciado numa imagem de diagnstico. Essa
captao observada in vivo considerada de m qualidade pois apresenta valores muito
inferiores aos apresentadas pelo sangue (grfico 27). Contudo, os estudos de biodistribuio
permitiram identificar as vias de excreo e metabolizao do radiofrmaco, sendo a excreo
feita essencialmente pela via renal e hepatobiliar (grfico 24 A e figura 7B). Aps anlise dos
resultados obtidos e verificando-se diferenas na biodistribuio em ratinhos Balb/c nu/nu
normais e atmicos possvel concluir que a presena ou no do timo no nosso modelo animal
influencia na captao do AA marcado com 99mTc.
Sendo assim, certo dizer que a marcao do AA com o 99mTc, pode no ser til como
traador para imagem uma vez que no captada pelas clulas tumorais in vitro nem in vivo,
sendo por isso considerado um fraco agente imagiolgico para diagnstico. Essa considerao
pode ser resultado do desconhecimento da esterioqumica molecular do 99mTc-AA, pois no se
sabe a que carbono do AA que o 99mTc se liga, sendo essa caracterstica muito importante, na
medida em que os carbonos 2 e 3 so os responsveis em doar os electres que esto
envolvidos na funo redutora do AA, bem como na oxidao do AA em DHA (Deutsch, 1998).
86
Discusso
Se por acaso o
99m
99m
Tc-AA no apresentar as
mesmas funes do AA. O ideal seria uma ligao ao carbono 6 da molcula do AA.
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Concluso
A partir da anlise dos resultados obtidos neste trabalho possvel retirar as seguintes
concluses:
No que diz respeito marcao radioactiva do cido ascrbico (AA) com o tecncio99m, podemos dizer que o protocolo desenvolvido, se mostrou eficiente tendo em conta os
elevados valores de eficincia de marcao obtidos assim como a alta estabilidade da
formulao farmacutica. Tambm o protocolo de controlo de qualidade no HPLC foi eficiente
na medida em que a separao dos compostos constituintes do radiofrmaco foi feita em
condies de alta resoluo e sensibilidade do equipamento. Contudo, uma outra tcnica
complementar ao HPLC deve ser desenvolvido para a deteco do 99mTc-RH.
Aps a marcao, os estudos in vitro revelaram que o composto desenvolvido (99mTcAA) apresenta fraca captao em clulas tumorais, comprovando assim, o pressuposto de que
as clulas tumorais, por terem uma baixa expresso dos SVCT, no transportam o AA atravs
da membrana e consequentemente no transportam o 99mTc-AA.
Foi comprovado que a reaco de oxidao/reduo do AA em DHA e do DHA em AA,
no se verifica in vitro, nem mesmo pela aco das alteraes do pH.
Comprovou-se tambm que o AA no atravessa a membrana das clulas tumorais ao
contrrio do DHA, isto deve-se ao facto da sobrexpresso dos GLUTs nestas clulas e ao
transporte ser feito por difuso facilitada estando sujeito saturao dos transportadores com
o aumento da concentrao do DHA extracelular.
Concentraes fisiolgicas (0,5 mM) do AA tem efeito proliferativo nas clulas
tumorais e concentraes farmacolgicas apresentam uma aco anti-proliferativa pelo
aumento da produo de ROS extracelular, visto que o AA no entra na clula.
88
Discusso
99m
99m
89
Prespectivas futuras
Os resultados obtidos neste trabalho despertou a curiosidade em descobrir mais
potencialidades da vitamina C no tratamento de cancro, que de certa forma as tcnicas
existentes actualmente so deficientes. Assim, j que a marcao radioactiva do AA com 99mTc
apresenta deficincias em termos de aplicao, poder ser desenvolvido um protocolo de
marcao com istopos naturais pertencentes aos tomos que fazem parte da molcula do AA,
(por exempolo carbono-11) de modo a no haver modificao nos grupos funcionais da
molcula que podero interferir na farmacocintica desta.
No seguimento deste trabalho podero ser realizados estudos de captao do 99mTc-AA
em clulas normais a fim de verificar se a captao neste caso seria superior nestas estas
clulas pelo facto de possurem SCVTs o que no se verifica nas tumorais. Assim, poder ser
feita a anlise por HPLC dos mecanismos de entrada das duas formas da vitamina C, em clulas
normais. Para alm de todos este experimentos, estudos de proliferao em clulas normais
seria importante tambm a fim de comprovar a citotoxicidade selectiva do AA nas clulas
tumorais.
Por fim, a procura de novas metodologias teraputicas para o tratamento do cancro
tem levado muitos autores a publicarem estudos em que combinam frmacos antineoplsicos
com doses farmacolgicas do AA. Assim e com o objectivo de aprofundar ainda mais as
potencialidades podem ser realizados estudos nesse sentido do efeito do AA (Heaney, et al.,
2008; Kuroiwa, et al., 2008).
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Discusso
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