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Caracterizacin de Polifenoloxidasa Extrada de Pera (cv.

Packams
Triumph) y Manzana (cv. Red Delicious)
Characterization of Polyphenyloxidase Extracted from Pears (cv. Packams
Triumph) and Apples (cv . Red Delicious)
Estela Gasull y Daniela Becerra
Ctedra de Fisicoqumica Aplicada (Ing. en Alimentos), rea de Qumica Fsica, Facultad de Qumica,
Bioqumica y Farmacia,
Universidad Nacional de San Luis, Ejrcito de los Andes 950 2 Piso, 5700 San Luis-Argentina (email: esgasu@unsl.edu.ar)

Resumen
Se estudiaron las caractersticas de polifenoloxidasa (PFO) extrada de peras Packams Triumph y
manzanas Red Delicious. El pH ptimo y la temperatura ptima fueron 6,5 y 25C para pera, 7 y 30C para
manzana, utilizando 50 mM de catecol en buffer fosfato como sustrato. Los valores obtenidos para
KM fueron 13,24 mM (pera) y 232,80 mM (manzana), mientras que los valores obtenidos para V max fueron
1590 U/mL E (pera) y 5464 U/mL E (manzana), utilizando 50 mM de catecol como sustrato. En este estudio
se probaron tres inhibidores del PFO, resultando ser el ms efectivo el cido ascrbico. Estudios cinticos
demostraron que la inactivacin trmica de PFO sigue una cintica de primer orden. La entalpa de
activacin ( H#) y la entropa de activacin ( S#) para la inactivacin trmica de PFO (pera) fueron 15309
J/Mol y -102 J/K Mol respectivamente. Para PFO (manzana) H# fue 11582 J/Mol y ( S#) fue -196 J/K
Mol.
Palabras clave: polifenoloxidasa, cintica enzimtica, pera, manzana, inactivacin trmica

Abstract
A study was made of the properties of polyphenyloxidase (PPO) extracted from Packams Triumph pears
and Red Delicious apples. Optimum pH and temperature were 6.5 and 25C for pears, pH 7 and 30C for
apples, with 50 mM catechol in phosphate buffer as substrate. K M values were 13.24 mM for pears and
232.80 mM for apples, whereas Vmax values were 1590 U/mL E for pears, and 5464 U/mL E for apples, using
50 mM catechol as a substrate. Three PPO inhibitors were tested in this study with the most effective
inhibitor being ascorbic acid. Kinetic studies showed that the thermal inactivation of PPO followed first-order
kinetics. The activation enthalpy ( H#) and activation entropy ( S#) for PPO heat inactivation in pears was
15309 J/Mol and -102 J/K Mol respectively. In apples the H# was 11582 while the S# was -196 J/K Mol.
Keywords: polyphenyloxidase, enzymatic kinetics, pears, apples, thermal inactivation

INTRODUCCIN
Las polifenoloxidasas (PFO) que se encuentran en las plantas son las responsables de las reacciones de
pardeamiento enzimtico que ocurren durante el almacenamiento, manipulacin y procesamiento de frutas
y vegetales. Las polifenoloxidasas, tambin conocidas como tirosinasas, fenoloxidasasas,
monofenoloxidasas o cresolasas, catalizan la hidroxilacin de monofenoles a ortodifenoles, posteriormente
oxidados a ortoquinonas, las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos que presentan color marrn,
rojo o negro, dependiendo de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales. Estas
reacciones modifican las caractersticas organolpticas y nutricionales del alimento, depreciando su

calidad. (McEvily et al., 1992; Friedman, 1996; Matheis & Whitaker, 1984; Sanchez-Ferrer et al., 1995).
Ocasionalmente, este cambio de color es deseado.
La actividad de las enzimas polifenoloxidasas presentes en frutas y vegetales puede ser inhibida por
calentamiento o por remocin de alguno de sus componentes necesarios: O 2, enzima, Cu2+ o sustrato
(Guerrero-Beltrn et al., 2005). Agentes reductores, antioxidantes e inhibidores enzimticos previenen el
pardeamiento reduciendo qumicamente las ortoquinonas a difenoles coloreados, inhibiendo la actividad de
la enzima por disminucin del pH, o quelando el Cu 2+ en el alimento.
En este trabajo, se aisl y caracteriz la polifenoloxidasa de pera (cv Packams Triumph) y de manzana
(cv. Red Delicious), cosechadas en Argentina, en trminos de activacin y estabilidad trmica, pH ptimo y
estabilidad, inhibidores y parmetros cinticos y termodinmicos, con el objetivo de ayudar a predecir el
comportamiento de la enzima presente en las mencionadas variedades.

MATERIALES Y MTODOS
Preparacin del extracto enzimtico
Las frutas fueron adquiridas en mercados comunitarios y conservadas a 4C por 24 horas. La extraccin
de la enzima para pera y manzana se llev a cabo siguiendo el procedimiento de Gauillard y Richard-Forget
(1997) con algunas modificaciones. Se homogeneizaron a 4C, 100 gramos de la fruta por 5 minutos en
buffer fosfato 50 mM, pH=6,5 conteniendo cido ascrbico 20 mM, etilenglicol 2% y Tritn X-100, 1%. La
mezcla fue agitada a 4C durante 12 horas. La suspensin fue centrifugada a 4000 rpm durante 15
minutos. Luego de separar el slido, el lquido colectado se centrifug nuevamente (15 minutos, 14000
rpm) en una centrfuga refrigerada Beckman J2-HS y el sobrenadante recolectado constituy el extracto de
la enzima utilizado para realizar los ensayos.
Actividad de polifenoloxidasa
La actividad de PFO fue determinada aplicando el mtodo propuesto por Espin et al., (1995) utilizando un
espectrofotmetro Shimadzu UV 160-A, de doble haz, con control de temperatura, equipado con celdas de
cuarzo de 1 cm de camino ptico. Se determin experimentalmente la longitud de onda correspondiente a
la mxima absorcin para ambos pigmentos, formados por la oxidacin de catecol por PFO de pera y
manzana. Estos valores estn de acuerdo con el rango de mxima absorcin (390-480 nm) para quinonas
reportado por Stauffer (1989).
De esta manera, se determin la actividad de la enzima midiendo el aumento de absorbancia a 420 nm
(pera) y a 400 nm (manzana). La velocidad inicial fue calculada a partir de la pendiente de la curva
absorbancia versus tiempo. Se defini una unidad de actividad de PFO como el aumento de 0,001
unidades de absorbancia por minuto y por mL de enzima. Para los distintos ensayos se utilizaron 3 mL de
solucin buffer a los que se adicion catecol, de manera tal que la concentracin del mismo en la mezcla fue
50 mM, y 200 mL (pera) 25 mL (manzana) del extracto de la enzima. Se realizaron medidas de
absorbancia a la respectiva longitud de onda de mxima absorbancia, cada 10 segundos, durante 10
minutos, a 25C.
Estabilidad y pH ptimo
Se determin en primer lugar el pH ptimo para la polifenoloxidasa de pera y de manzana analizadas en el
rango de pH 4-5,5 en 50 mM de buffer acetato, 6,5-7,5 en 50 mM de buffer fosfato y 7,5-9,5 en 50 mM de
Tris-HCl. El sustrato fue 50 mM de catecol, y se utilizaron 200 mL (pera) y 25 mL (manzana).La temperatura
de trabajo fue 25C.
Para determinar el pH de estabilidad de la enzima, se incub el extracto crudo de la misma en 3 mL de
solucin buffer (pH entre 4 y 9,5) durante 24 horas a 4C. La actividad residual de la PFO fue determinada
como porcentaje respecto de la actividad al pH ptimo, utilizando 50 mM de catecol como sustrato.
Actividad y estabilidad trmica

La actividad de PFO de pera y manzana fue obtenida a distintas temperaturas comprendidas entre 14 y
48C al pH ptimo de cada una de ellas. La mezcla de buffer y sustrato fue incubada por 15 minutos hasta
lograr la temperatura deseada. La actividad de PFO a la temperatura especfica fue determinada
espectrofotomtricamente por adicin del extracto de la enzima a la mezcla tan rpidamente como fue
posible.
A los efectos de determinar la estabilidad trmica de PFO, se incub a las temperaturas 30, 40, 50, 60 y
70C la solucin de la enzima en 50 mM de buffer fosfato al pH ptimo de las enzimas analizadas durante 5,
10, 20 y 30 minutos. Luego la mezcla fue enfriada en bao de hielo, y una vez alcanzada la temperatura
ambiente, se agreg el sustrato y finalmente se determin la actividad leyendo absorbancia a 25C.
Los datos obtenidos a partir de los perfiles de actividad trmica se utilizaron para analizar parmetros
termodinmicos relacionados con las reacciones de pardeamiento. Los datos para la inactivacin trmica de
la enzima fueron calculados comparando los cambios en la actividad luego del calentamiento a las distintas
temperaturas respecto de la enzima sin calentar.
Cintica enzimtica
Los datos cinticos fueron representados como la inversa de la actividad versus la inversa de la
concentracin del sustrato, de acuerdo al mtodo de Lineweaver y Burk (Lineweaver y Burk, 1934).
Utilizando catecol como sustrato, trabajando a la temperatura de 25C, y al pH ptimo de cada enzima, se
determinaron los parmetros cinticos: la constante de Michaelis-Menten (K M) y la velocidad mxima (Vmx),
variando las concentraciones del mismo en la mezcla de la reaccin entre 10-90 mM para pera y 21-350 mM
para manzana.
Efecto de los inhibidores
Se analiz el efecto inhibitorio de cido ascrbico (0,03-0,17 mM para pera y 0,03-0,31 mM
para manzana), cido benzoico (0,21-0,82 mM para pera y 0.20-0.80 mM para manzana) y cloruro de sodio
(0,32-10,00 mM para pera y 0,32-2,20 mM para manzana) sobre la actividad de PFO de pera y manzana,
frente a catecol como sustrato. Para tal fin, se realizaron experiencias utilizando 3mL de buffer pH ptimo,
el extracto enzimtico (200 mL - 25 mL) y catecol 50 mM como sustrato, en presencia de las distintas
concentraciones de cada uno de los inhibidores, a 25C.

RESULTADOS Y DISCUSIN
Estabilidad y pH ptimo
En la figura 1 se muestra el perfil de pH versus actividad para el extracto enzimtico de las muestras
analizadas. Las curvas obtenidas muestran que la actividad de PFO de pera Packams Triumph es
mxima a pH 6,5, mientras que PFO de manzana Red Delicious presenta su mxima actividad a pH 7. De
acuerdo con los valores informados por la literatura, el rango de pH mas usual para la actividad ptima de
PFO de ambas frutas es entre 5 y 7 (Rocha y Morais, 2001; Weemaes et al., 1998). Se observa tambin
que, a pH muy alcalinos, mayores que 8,5, la actividad de la enzima presente en ambas frutas analizadas
es prcticamente nula.
En la figura 2 se presenta el perfil de actividad respecto del pH de incubacin de la enzima. Los resultados
estn expresados como actividad residual respecto de la actividad que posee la enzima al pH ptimo. Como
se observa en la grfica, el pH de mxima estabilidad de la enzima es 6,5 para PFO de pera y el intervalo
6,5-7,5 para PFO de manzana.
Efecto de la temperatura sobre la actividad de PFO
En la figura 3 se muestra el comportamiento enzimtico respecto de la temperatura. Los datos se
representan como actividad residual porcentual respecto de la actividad a la temperatura ptima de la
enzima para ambos extractos. Como se puede apreciar, la temperatura ptima para la actividad de PFO de

pera es 25C, mientras que para manzana, la enzima muestra una actividad mxima a 30C, pero la misma
desciende bruscamente a los 35C, y a los 40C, permanece prcticamente inactiva. Se han reportado
temperaturas ptimas de durazno (Jen y Kahler, 1974), uva (Cash, et al., 1976), ciruela (Siddiq et al., 1992)
y nspero (Dincer et al., 2002) en 20, 25, 37 y 35 C respectivamente.

Fig. 1: Actividad de PFO de pera y manzana en


funcin del pH. Condiciones del ensayo: 50 mM de
catecol, 25C. Pera, Manzana

Fig. 2: Incubacin de PFO a distintos pH.


Condiciones del ensayo: 50 mM de catecol, 25C.
Pera Manzana
Se obtuvieron adems los parmetros de activacin para pera: H#= 15309 J/Mol, S#= -102 J/K Mol,
G#298= 45705 J/Mol, mientras que para manzana los valores obtenidos fueron: H#= 11582 J/Mol, S#= -196
J/K Mol, G#298= 69990 J/Mol. En general, se considera H# como una medida del nmero de enlaces no
covalentes destruidos para formar el estado de transicin que conduce a la inactivacin de la enzima, y
S# est relacionado con el cambio que acompaa la formacin del estado de transicin entre la enzima neta
y el desorden del solvente.
La figura 4 presenta la actividad de PFO de pera como funcin de la temperatura de incubacin, para
distintos tiempos de calentamiento. Se observa que la inactivacin trmica de la enzima sigue una cintica

de primer orden. De la grfica se desprende que incubando la enzima durante 30 minutos a 30C, la
misma permanece inalterada, pero al calentar la enzima durante 20 minutos a 50C, la actividad de la
misma disminuye un 40 %, y se encuentra prcticamente inactivada calentando durante 10 minutos a
70C.

Fig. 3: Temperatura ptima de PFO de pera y


manzana. Condiciones del ensayo: 50 mM de buffer
fosfato (pH ptimo), 50 mM de catecol.
Pera Manzana

Fig. 4: Incubacin de PFO de pera. Condiciones del


ensayo: 50mM de buffer fosfato pH 6,5, 50 mM de
catecol. T=30, 40, 50, 60 y 70C.
En cuanto a la PFO de manzana, en la figura 5 se observa que la enzima es estable a 30C, disminuye un
40% calentando durante 20 minutos a 50C, pero, a diferencia de lo ocurrido con la PFO de pera, la
inactivacin prcticamente total se produce calentando 30 minutos a 70C.
Cintica Enzimtica
Los parmetros cinticos obtenidos son: KM=13.27 mM y Vmx=1590 U/mL E para pera Pakams Triumph;
KM = 232.80 mM y Vmx= 5464 U/mL E para manzana Red Delicious. Este ltimo dato coincide con el valor

KM= 230 mM, informado por Rocha y Morais (2001) para otra variedad de manzana, utilizando catecol como
sustrato.

Fig. 5: Incubacin de PFO de manzana. Condiciones


del ensayo: 50 mM de buffer fosfato pH 6,5, 50 mM de
catecol. T=30, 40, 50, 60 y 70C.
Los valores determinados para KM indican que PFO de pera tiene mayor afinidad por catecol que PFO de
manzana. Adems, si tenemos en cuenta que la relacin V mx/KM mide la eficiencia de la enzima frente a un
determinado sustrato, los resultados obtenidos nos permiten afirmar que, en nuestro caso, PFO de pera
(Vmx/KM= 119,8) present mayor capacidad de pardeamiento que PFO de manzana (V mx/KM= 23,5).
Efecto de los inhibidores sobre la actividad de PFO
El anlisis de los datos obtenidos al determinar el efecto inhibitorio, muestra que el inhibidor ms potente
para PFO de las frutas analizadas es cido ascrbico, que presenta un I50% de 0.319 mM para pera y
0.500 mM para manzana, mientras que cido benzoico y ClNa no mostraron efecto inhibitorio en el rango
de concentraciones utilizadas. El cido ascrbico acta ms como un antioxidante que como un inhibidor
enzimtico porque el mismo reduce la quinona formada inicialmente por la enzima al difenol original, antes
que se produzcan las reacciones secundarias, las cuales dan lugar a la formacin de los pigmentos. El
cido ascrbico tambin ha sido reportado como causa irreversible de inhibicin enzimtica (Golan et al.,
1984).

CONCLUSIONES
Las modificaciones realizadas a la tcnica de extraccin utilizada por Gauillard y Richard-Forget (1997),
fundamentalmente el agregado de tritn X-100, permitieron obtener un mejor rendimiento en la extraccin
PFO de las frutas analizadas. Los parmetros cinticos obtenidos demuestran que PFO de manzana
presenta una menor capacidad de pardeamiento frente a catecol que PFO de pera, mientras que los
parmetros termodinmicos para las reacciones de pardeamiento resultaron ser del mismo orden. Estos
datos, al igual que los valores de pH ptimo y estabilidad, como as tambin los de estabilidad y actividad
trmica, contribuyen a predecir el comportamiento de la enzima presente en ambas frutas.