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BIOTECNOLOGA DE LOS

PRODUCTOS
AGROINDUSTRIALES

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA
ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADO
ENZIMTICO PURO

PROFESOR:
ALEXANDER
ALUMNA:
ELIZABETH
CICLO:
HORARIO:

ING. SNCHEZ GONZALES, JESS


MARTNEZ SALDAA, YURICO
IX
JUEVES 11-1PM

DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADO


ENZIMTICO PURO

LABORATORIO N06
DETERMINACIN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE UN PREPARADO
ENZIMTICO PURO

I.

INTRODUCCIN

Como es bien sabido, las enzimas son protena. Polmeros de residuos amino acdicos unidos
mediante enlaces peptdicos, que tiene la funcin de ser catalizadores de las reacciones qumicas del
metabolismo celular. La produccin de enzimas, de actividades especficas, es seguida por una
purificacin y una estandarizacin del producto. En la formulacin del producto se agregan diversos
excipientes (otras protenas y azcares, por ejemplo). Por lo que un preparado enzimtico comercial
no es 100% puro .De manera de cuantificar la enzima presente en una formulacin comercial se
realizan determinaciones de su actividad enzimtica y del contenido de protenas.
II.

OBJETIVOS

III.

Desarrollar una curva patrn de calibracin


Determinar la actividad enzimtica en unidades usc (Unidad Street Close)

FUNDAMENTO TERICO

CINTICA DE REACCIONES QUMICAS


La reaccin qumica tiene dos caractersticas de importancia: la posicin de equilibrio (estabilidad de la
concentracin de productos y reactivos) y la velocidad de reaccin (las reacciones tienen por objeto
determinar el mecanismo y la velocidad con que interaccionan las molculas bajo determinadas
condiciones).
La velocidad de una reaccin qumica puede medirse como la velocidad de formacin de uno o ms
de su productos o bien la velocidad de utilizacin de sus reactivos. Intuitivamente podemos suponer
que al aumentar la concentracin de los reactivos la probabilidad de interaccin de los mismos
aumenta conjuntamente con la velocidad que procede tal reaccin. Ambas variables (velocidad de
reaccin y concentracin de los reactivos) son directamente proporcionales, as que matemticamente
debe existir un valor constante, de esta manera podemos escribir:

vr = k. [reactivos]n

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(Velocidad de reaccin) = (constante) . (Concentracin de reactivos)n
El valor del exponente n es el orden de la reaccin. As si n = 1, estamos en presencia de una reaccin
de primer orden donde la velocidad es proporcional a la reaccin de un solo reactivo.

vr = k. [A]

Anlogamente, cuando n = 2, la velocidad es proporcional al producto de las concentraciones de dos


reactivos o al cuadrado de la concentracin de uno solo. Este tipo de reacciones reciben el nombre de
segundo orden. vr = k. [A] [B] = k [A] 2
La importancia de determinar el orden de una reaccin qumica radica en que a partir de ese
parmetro puede obtenerse informacin sobre el mecanismo molecular en que opera.
VELOCIDAD DE REACCIN Y EQUILIBRIO
En estado de equilibrio qumico las velocidades de reacciones directa e inversa son exactamente
iguales. Considerando una reaccin de primer orden:

k1 [A] = k 1 [B]
Este principio nos permite llegar fcilmente a una reaccin entre las constantes de velocidad y de

equilibrio:
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIN: ENERGA DE
ACTIVACIN
Las velocidades de reaccin son generalmente sensibles a la temperatura. En el caso de las
reacciones biomoleculares, un aumento de 10 C incrementa su velocidad entre 1,5 y 5 veces. Para
explicar este hecho se postul que al acrecentar la temperatura aumenta la fraccin de molculas
capaces de tener una energa suficiente para alcanzar un estado activado que luego se transforme
en producto de la reaccin por formacin o ruptura de enlaces qumicos.
Se admite que las nicas molculas que reaccionan son aquellas que al chocar llevan consigo una
energa mayor que un cierto valor mnimo. A este valor de energa necesaria se lo denomina energa
de activacin y es un factor de suma importancia para determinar la magnitud de la velocidad de
reaccin.

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CATALIZADORES
Una reaccin qumica tendr lugar si se debe superar el valor de la energa de activacin.
Una vez vencida esa barrera el sistema evoluciona de forma tal que llegar al estado final
de la reaccin. La velocidad de reaccin podra incrementarse de dos maneras:
aumentando la concentracin del complejo activado o eventualmente disminuyendo la
energa de activacin. Este ltimo mecanismo es el que se pone de manifiesto cuando se
emplea determinadas sustancias llamadas catalizadores. Estas sustancias aceleran las
reacciones qumicas disminuyendo la energa libre de activacin, se combinan con los
reactivos para producir un estrato de transicin de menor energa que el estado de
transicin de la reaccin no catalizada. Cuando los productos de la reaccin se forman, se
regenera el catalizador al estado libre.
ENZIMAS: CATALIZADORES BIOLGICOS
Las reacciones qumicas en sistemas biolgicos raramente ocurren en ausencia de un catalizador.
Estos catalizadores se denominan enzimas y son en su totalidad molculas de naturaleza proteica
(aunque ha habido estudios acerca de enzimas de naturaleza glucosdica).Es razonable pensar en la
necesidad que tienen los seres vivos de poseer estos catalizadores, ya que las funciones vitales de
cualquier clula seran imposibles de mantener si las reacciones que ocurren en ella fueran
extremadamente lentas.
Adems de incrementar la velocidad las enzimas exhiben una elevada especificidad y en algunos
casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos, aumentando y otras veces disminuyendo, de
acuerdo a las necesidades del momento, su actividad.Todas estas propiedades pueden ser cumplidas
por molculas altamente complejas, que al ser molculas orgnicas (macromolculas) comparten
caractersticas con las protenas no enzimticas y difieren de los catalizadores inorgnicos:
a) Son termolbiles y su actividad depende en ciertos casos del pH del medio.
b) El reconocimiento de la enzima con el reactivo a procesar (denominado sustrato) es altamente
especfico.
c) Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran nmero de molculas de sustrato por
unidad de tiempo.
d) Estn sujetas a una gran variedad de controles celulares, genticos y alostricos.
Como todos los catalizadores las enzimas aceleran notablemente la velocidad de una reaccin
qumica y cumplen con las siguientes caractersticas:

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Son efectivas en pequeas cantidades

No sufren modificaciones qumicas irreversibles durante la catlisis. Es decir que luego de la


reaccin enzimtica, las molculas de enzimas que reaccionaron son indistinguibles de las que
no lo han hecho, (la estructura de la molcula se mantiene, al principio y final de la reaccin,
exactamente igual).

No afectan la posicin de equilibrio de la reaccin que catalizan. El estado inicial y final de la


reaccin es el mismo, solo que se llega al equilibrio mucho ms rpidamente.

CINTICA DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS


Las consideraciones generales de la cintica qumica pueden aplicarse a las reacciones catalizadas
enzimticamente, aunque estas ltimas tienen la particularidad de mostrar el fenmeno de saturacin
por el sustrato.
A una concentracin constante de enzima, si vemos el grfico de la velocidad de la reaccin catalizada
enzimticamente en funcin de la concentracin del sustrato, es evidente que a bajas concentraciones
del mismo la velocidad de formacin de producto es proporcional a la concentracin del sustrato. A
medida que se aumenta la concentracin de sustrato se aprecia una prdida de la proporcionalidad,
en esta zona la reaccin es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la
reaccin es independiente de esta.Ya se ha dicho que el sustrato se une a la enzima en una regin
determinada del mismo llamada sitio activo. El fenmeno de saturacin junto con otras evidencias
llevaron a postular la existencia de un complejo enzima sustrato (E S) como etapa previa a la
formacin de productos.
En 1913 LenorMichelis dedujo la relacin entre la velocidad mxima (vm) de una reaccin catalizada
enzimticamente en trminos de la formacin del complejo E S. En base a estas consideraciones es
lgico suponer que a altas concentraciones de sustrato, todos los sitios activos de la enzima estn
ocupados y por lo tanto la velocidad alcanza un mximo. El modelo propuesto sirve de base para
explicar las propiedades de la mayora de las enzimas y como se dijo antes asume la existencia de un
complejo E S como intermediario en la catlisis.

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Una enzima E se combina con un sustrato S para formar el complejo E S, con una constante de
velocidad k1. Este complejo E S puede seguir dos caminos: a) puede proceder para formar el
producto con una constante de velocidad k3; b) el camino alternativo es disocindose, generando
nuevamente E y S con una constante de velocidad k2.
En base al modelo, la velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente ser:
v = k3 [E S]
El valor [E S] no es fcilmente estimable de modo que se necesita una expresin equivalente con
valores conocidos. Mediante desarrollo matemtico se ha desarrollado la siguiente ecuacin:

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIN


CATALIZADA ENZIMTICAMENTE. OBTENCIN DEL KM Y LA VMAX
Si se mantiene la concentracin de la enzima constante y variamos la concentracin de substrato se
obtiene una curva hiperblica como la de la figura (arriba izquierda). Al principio un aumento de la
concentracin de substrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue
aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir; vemos que
a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reaccin, se dice
que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reaccin que se
obtiene a esa alta concentracin de substrato se define como la velocidad mxima (vm) de la reaccin
enzimtica bajo las condiciones especificadas. La concentracin de substrato [S], a la semivelocidad
mxima de reaccin ( v ) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o
km, la cual es una caracterstica para cada enzima. La inversa de km, o 1/ km, mide aproximadamente la
afinidad de la enzima por el substrato. Mientras ms pequeo sea el valor de km, mayor ser la
afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo
substrato, ste ser transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.
As tendremos:

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(Simplificando)
Si reordenamos la ecuacin tendremos que:
[S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S]
Esto significa que la concentracin del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad es el
valor de km de la enzima.
La expresin de Michelis Menten puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son
ms tiles para la expresin de los datos experimentales. Una de esas formas consiste en tomar los
recprocos (inversa) de ambos miembros de la ecuacin.

Esta expresin conocida con el nombre de ecuacin Lineweaver Burk, corresponde a una recta de
ecuacin:
y = a.m + b

Midiendo las velocidades para distintas concentraciones de sustrato y representando grficamente (al
lado) obtendremos una grfica del tipo lineal.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS

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a) Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin
hasta cierta temperatura ptima, ya que despus de aproximadamente 45C se comienza a
producir la desnaturalizacin trmica. Las enzimas de muchos mamferos tienen una
temperatura ptima de 37C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se
destruyen Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas
termales y en el otro extremo ciertas bacterias rticas tienen temperaturas ptimas cercanas a
0C.
b) Efecto Del pH Sobre La Actividad Enzimtica: El pH no afecta la actividad enzimtica
directamente sino que modifica la concentracin de protones. Los protones adems de alterar
la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar tambin en la reaccin como
substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la
velocidad de la reaccin.Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son
protenas, puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie
proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede
producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin.
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
Con respecto a la determinacin de la actividad de la enzima, debemos recordar que la actividad
enzimtica:

Indica el mximo potencial cataltico de una enzima y est dado por la velocidad inicial de la

reaccin
La velocidad de reaccin se mide, cuantificando la evolucin del producto o del sustrato de
reaccin en el tiempo, pero este ltimo es ms dificultoso ya que se utiliza en exceso y las

variaciones en corto tiempo no son notorias.


Se determina en las mejores condiciones para la enzima (T y pH ptimo) y a concentraciones

saturantes de sustrato.
La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de enzima que permite catalizar 1

mol de sustrato por minuto de reaccin a las condiciones antes mencionadas.


La medicin de actividad se ve afectada por los siguientes factores:
Denaturacin de la enzima (por temperatura)
Reversibilidad de la reaccin enzimtica.
Inhibicin de la enzima (por producto o inhibidor externo)
Desaturacin de la enzima (baja concentracin de sustrato)
Para evitar los tres primeros factores, la medicin se realiza a tiempos cortos; el ltimo factores

evita ala utilizar una concentracin saturante de sustrato.


Al evitar tales problemas la velocidad de reaccin slo est condicionada por la cantidad deenzima

utilizada en la reaccin.

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IV.

MATERIALES Y MTODOS
A. Materiales y Equipos
Materiales

Pulpa

(Extraccin de amilasa)
Solucin yodada.

de

papaya

20g

PEC
HCl 0.1N
Sustrato almidn
Agua destilada

Gradillas
Balanza analtica
Bao mara
Centrfuga
Espectrofotmetro.

Equipos
Matraces
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml
Probeta de 200 ml
Tubos de ensayo.
Mortero
Piln.
B. Metodologa
C. Preparacin del Preparado Enzimtico Puro (PEC)

Pesar 20 gramos de muestra (pulpa de papaya).


Se tritura en el mortero con el piln.
Al triturado lo homogenizamos al agregar KCl 10 ml a 0.154M a 4C.
Disolver bien el triturado y luego filtrar.
El filtrado llevar a centrifugacin (4000 rpm x 10 min).
Obtenemos el Preparado enzimtico Crudo (PEC).

D. Determinacin de la Actividad Cataltica


E. Mtodo de Street - Close

Preparar los tubos blanco y problema.


Agregar 2.5 ml de solucin de almidn al tubo problema.
Agregar 0.4 ml de agua destilada al tubo problema y 2.9 ml de agua destilada al tubo

blanco.
Agregamos 0.1mL de PEC al tubo blanco y 0.1 ml al tubo problema.
Llevar a incubacin 35C por 5 minutos, ambos tubos
Se agregar 2.5 ml de HCl 0.1N a los dos tubos.
Se agregar 0.1 ml de solucin de iodo a los dos tubos.

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F. Preparacin de tubos para la curva de calibracin

Preparar los tubos blanco, 1; 2; 3; 4 y 5del mismo modo que el tubo problema
Agregar 0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5 ml de solucin de almidn (400ppm) en cada uno de

los tubos respectivamente. Menos en el tubo Blanco


Agregar 3.0; 2.5; 2.0; 1.5; 1.0; 0.5 ml de agua destilada a cada uno de los tubos

respectivamente.
Agregar 2.5 ml de HCl 0.1N a cada uno de los tubos respectivamente.
Agregar solcuion iodada 0.1; 0.1; 0.1; 0.1; 0.1; 0.1 a todos los tubos.
Dejar reposar por tiempo de 5 minutos y llevar a medir la observancia a una longitud de

onda de 550 nm en el espectrofotmetro.


Esto se puede ver eb el sgte cuadro:
G.
Cuadro 1. Datos previos a la curva de calibracin.
H. g
almid
n
O. COMP
ONENT
ES
V. Sol.
Almido
n
solubl
e
AC. H2O
destila
da
AJ. HCL
0,1N

V.

J.

K.

L.

M.

N.

0,

0,

0,

0,

P.
BL

Q.
M

R.
M

S.
M

T.
M

U.
M

W.
0.

X.
0.

Y.
1.

Z.
1.

AA.
2.

AB.
2.

AD.
3.

AE.
2.

AF.
2.

AG.
1.

AH.
1.

AI.
0.

AK.
2.

AL.
2.

AM.
2.

AN.
2.

AO.
2.

AP.
2.

I.

AQ. Sol.
AR.
AS.
AT.
AU.
AV.
AW.
Yodad
0.
0.
0.
0.
0.
0.
a
AX.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
AY.Tabla 1. Cantidad de almidn y Absorbancia para la obtencin de Curva de
Calibracin
AZ.

CANTIDA
D DE
ALMIDN
BB.
0

BD.

0.2

BF. 0.4
BH.

0.6

BA.

ABSOR
BANCIA

BC.

BE.

0.322

BG.

0.519

BI. 0.755

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BJ. 0.8

BK.

1.018

BL.1

BM.

1.281

BN.

1.4
1.3
f(x) = 1.25x + 0.03
R = 1

1.2
1.1
1
0.9
0.8
0.7

Absorbancia

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95 1 1.05
Almidn (mg)

BO.

Figura 1. Cantidad de Almidn y Absorbancia


BP.

BQ.

Tabla 2.Clculos de las unidades Street Close en tubos Problema y Blanco


BR.

BS.
T

BT.

BU.

BV.

BW.

AL

BX.

BY.

usc

us

BSO

BS

LMI

MID

RBA

OR

NCI

BA

HIDR

NC

RE

OLIZ

IA

SID

ADO

CO

UA

(mg)

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RR

EG
ID

g)

A
BZ.
B

(m

CA.
0
.001
CC.
CB.

CG.
P

CH. 0
.116

0
.11
5

0
.07
217
321
6

CD. 0.9
27826
784

CE.
0.0
4
6
3
9
1
3
3
9

CF.
46.

CM.
.

CN.
CO.

Segn Wiseman (1986);la Unidad Amiloltica (UA) es la cantidad de enzima contenida en

100 ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidn en 30 minutos, en las condiciones


de la reaccin. En esta tcnica se incuban 10 l de muestra con 0.25 mg de almidn
contenidos en 0.5 ml de solucin de sustrato durante 7 minutos y medio, lo que equivale a
incubar 100 ml de muestra con 10.000 mg de almidn durante 30 minutos. Si todo el almidn
fuera hidrolizado, la actividad amilsica de la muestra sera de 1000 UA/dl. Para obtener las
unidades de actividad amilsica, la fraccin de almidn digerido se multiplica por 1000. En
nuestro prctica para la detreminacion de la actividad enzimtica, utilizamos la unidad Street
Close (esta unidad no especifica el tipo de enzima solo la cuantifica) lo cual se puede observar
en la Tabla 2.
CP.Segn Doran (2998); la curva de de referencia construida con cantidades conocidas de
una sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina que vimos antes) que se utiliza para
determinar la cantidad de esta sustancia (protenas) presente en una muestra incgnita. En
muchas determinaciones se cumple una relacin proporcional entre la magnitud o
intensidad de color que da una reaccin y la cantidad del reactivo que la provoca. Por
ejemplo: si la presencia de 10 ug de protenas en una solucin genera la aparicin de un
color azul plido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de
protena dar lugar a que la solucin se torne azul ms oscuro y as sucesivamente. En
nuestro caso esto se puede observar en los datos obtenidos en nuestra Tabla 1 la cual
ayud para la obtencin de la curva de calibracin en Figura 1, la cual nos dio una recta y
un coeficiente de determinacin de 99.69% en lo cual vemos que esta relacin debe estar
dado por la magnitud y la intensidad de color dado en el espectrofotmetro.

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CQ.

Segn VanDer (1975); la Curva de Calibracin esta dado con datos reales, los grficos

que se obtienen no son tan ideales, pero esta situacin no es un obstculo ya que dentro
de ciertos valores es posible trazar la recta ms probable que une una serie de puntos, con
el uso de los programas de clculo de las computadoras. Hay que advertir que una
respuesta lineal no se obtiene en todo el rango de concentraciones posibles sino dentro de
un conjunto de valores que dependen de numerosos factores dependientes del mtodo de
medicin. Por otra parte, este tipo de curvas no se limita solamente a la determinacin de
un elemento o compuesto qumico sino que tiene mltiples aplicaciones. Lo e4xpuesot por
el autor se verifica en la figura 1, donde vemos la linealidad de la lnea recta de la cantidad
de almidn con la Absorbancia ya que como dice el autor sta curva est dada por una
serie de factores.
CR.

Segn VanWeel (1959); la espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms

usado en las investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que


permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una
cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia.Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de
cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. El espectro de absorcin es un
grfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abscisas la longitud de
onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la
espectrofotometra de absorcin. Dicho espectro de absorcin se nota en la Figura 1, donde
vemos una relacin entre la cantidad de absorbancia la cual depender de su cantidad de
almidn. Y en la Tabla 2 vemos que la absorbancia corregida (se obtiene disminuyndole la
absorbancia del tubo Blanco)sirve para llevarla a la grfica y hallar la cantidad de almidn
residual que queda en el tubo problema y en el tubo testigo.
VI.

CONCLUSIONES
CS.
Se desarroll la curva patrn de calibracin donde el coeficiente de determinacin es de

99.69%.
Se lleg a determinar la actividad enzimtica en unidades usc (Unidad Street Close), en la
cual la absorbancia corregida se obtiene disminuyndole la absorbancia del tubo Blanco; a
la vez sirve para llevarla a la grfica y hallar la cantidad de almidn residual que queda en

VII.

el tubo problema y en el tubo testigo.


CT.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

CU. DORAN, P. (1998). Principios de Ingeniera de los bioprocesos. Editorial acribia SA. Zaragoza

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ENZIMTICO PURO
(Espaa).
CV. WISEMAN, A. (1986). Principios de Biotecnologa. Editorial ACRIBIA S.A. ZARAGOzA
(Espaa).
CW.VANDER M. (1975). The enzymatic hydrolysis of agar by CytophagafIevensLF sp. nov.TThesis,
niversity of Groningen, Netherlands, 80 pp.
CX. VANWEEL.P. (1959). The effect of special diets on the digestion processes (enzyme production
and resorption) in the african giant snail AchatinafilicaBowdich. 2. vergl. Physiol. 42: 433-448.
CY.ANEXOS
CZ.
DA.
DB.
DC.
DD.
DE.
DF.
DG.
DH.
Figura
2. Tubos de ensayo
durante la calibracin

DI.

Figura 3. Tubos de ensayo


durante la calibracin Tubo Blanco
y Tubo 1.