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GRUPO DE DIAGNSTICO Y

CONTROL DE LA
CONTAMINACIN
-GDCONPseudomonas aeruginosa
Cdigo:
GE-PM-002GDCON

Versin:
01

Fecha de
aprobacin:

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Giardia sp y Cryptosporidium sp
MTODO DE Giardia sp y Cryptosporidium sp (FILTRACION, SEPARACIN
INMUNOMAGNETICA Y FLUORESCENCIA)
EPA Metodo 1623.1
CODIGO MM-XX-YYY-GDCON

Elaborado por: Ana Carolina Cardona


Cargo: Analista Microbiolgica
Firma:

Revisado por: Nancy Pino


Cargo: Coordinadora Microbiologa
Firma:

Aprobado por: Gustavo Peuela


Cargo: Director Grupo
Firma:

Fecha: 13/09/2012

Fecha: 17/09/2012

Fecha:

GE-PM-000-GDCON Giardia y

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Criptosporidium

OBJETIVO

Describir la metodologa para cuantificar unidades formadoras de


Pseudomonas aeruginosa usando filtros de membrana en medio selectivo.

colonias

(UFC)

de

ALCANCE

Este mtodo aplica para agua tratada y natural.

DESCRIPCIN
o

PRINCIPIO Y APLICACIONES

El mtodo de filtracin por membrana es una manera rpida y fcil de estimar poblaciones
bacterianas en el agua. Este mtodo es muy til cuando se estudia grandes volmenes de
muestra o cuando se procesan grandes cantidades de muestras para Pseudomonas de rutina en
el laboratorio.
Un volumen apropiado de muestra de agua es filtrada a travs de una membrana filtrante de
0.45 m que retiene las bacterias presentes en esta y la membrana es transferida a una placa de
Petri, la cual contiene medio de cultivo agar Cetrimide. Este compuesto (cetrimide) es el agente
selectivo contra la flora microbiana acompaante, adems mejora la produccin de pigmentos,
tales como Pseudomonas piocianina y fluorescena , que muestran un caracterstico color azulverde y amarillo-verde, respectivamente.
o

INTERFERENCIAS

La tcnica de filtracin por membrana no es aplicable para agua de alta turbiedad o aguas
residuales por su contenido de metales txicos o compuestos orgnicos.
Debe tenerse cuidado en la homogenizacin de la muestra y en el volumen a filtrar que se elige
de acuerdo a las caractersticas de la muestra.
Desinfeccin de los embudos utilizados en una misma serie.
o

TOMA Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS

Las muestras deben ser tomadas en recipientes estriles y en caso de ser muestras de agua
potable, se debe adicionar tiosulfato de sodio al 10% para inhibir el efecto del cloro sobre los
microorganismos (0.250 ml de tiosulfato de sodio 10% para un volumen de muestra de 250 ml).
Se debe tomar un volumen de muestra no inferior a 200 ml y conservarse refrigeradas en el
transporte hasta el laboratorio (No llene el recipiente por completo para permitir aireacin y
agitacin al momento del anlisis). Se permite almacenar la muestra por un periodo mximo de
24 horas en refrigeracin.
o

EQUIPOS Y CONDICIONES AMBIENTALES

EQUIPOS

Autoclave
Cabina de flujo laminar

Frascos o bolsas estriles de 200 ml de capacidad.

Placas de Petri de 50 x 12mm estriles

Incubadora a 35 1C.
Pipetas de 10 ml estriles
Unidades de filtracin, que incluye los embudos y soportes.

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Criptosporidium

Bomba de vaco.
Membranas filtrantes con cuadricula y tamao de poro 0.45 micras y 47 mm

Agua de dilucin (Tampn fosfato) en un volumen de 90 o 99 ml.


Pinza metlica sumergida en etanol al 70%
Mechero.
Lampara UV
Encendedor.
Agua en ebullicin
Nevera
Estereoscopio
CONDICIONES AMBIENTALES
La incubacin debe desarrollarse a una atmosfera de por lo menos 60% humedad relativa.
o

REACTIVOS Y PREPARACION DE SOLUCIONES

Medio de Cultivo:

Cetrimide: Suspender 44.5 g de agar deshidartado en 1 litro de agua desionizada,


adicionar 10 ml de glicerol y llevar a autoclave 15 min a 121C. El pH despus de la
esterilizacin debe ser de 7.0 0.2

Control calidad: Se realizara un control de crecimiento al medio con una cepa de referencia P.
aeruginosa cada que se inicie un nuevo lote. Los datos deben registrarse en el formato F12-GEPR-002-GDCON
Reactivos

Tiosulfato de sodio
Preparacin: Pesar 10 g de Tiosulfato de sodio y aforar a 100 ml de agua destilada. Esterilizar en
autoclave.

Tampn fosfato

Preparacin: Para preparar la solucin madre disolver 34.0 g de Fosfato de Potasio


Monobsico KH2PO4 en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7.2 0.5 con
Hidrxido de Sodio NaOH 1N y diluir hasta 1 litro con agua destilada. Adicionar 1.25
ml de la solucin madre y 5.0 ml de Cloruro de Magnesio (81.1 g de
MgCl2.6H2O / L de agua destilada) a 1 litro de agua destilada.
Alicuotar 99 2.0 ml en frascos tapa rosca y 9.0 0.2 ml en tubos tapa rosca, despus
autoclavar 15 minutos a una temperatura de 120 C.
Se debe registrar la preparacin y esterilidad de la solucin en los formatos F18-GE-PR-002GDCON Y F15-GE-PR-002-GDCON respectivamente.
o

PROCEDIMIENTO

Se debe filtrar 200 ml o menos de agua natrural y 500 ml de agua de piscinas. En cualquier
caso, siempre se reportar con base a 100 ml.
Marcar las placas de Petri de 50 x 12 mm. Con el nmero correspondiente a la muestra, la
fecha y el volumen filtrado.
Con la pinza esterilizada en la llama y fra, colocar los filtros de membrana sobre el
portafiltros desinfectado y fros, de manera tal que la cuadrcula quede hacia arriba. Por cada
lote de membranas se debe llevar a cabo un control de esterilidad y registrarlo en el formato
codificado como F14-GE-PR-002-GDCON.
Colocar el embudo de filtracin.
Mezclar fuertemente la muestra por aproximadamente 25 veces y dispensar el volumen de
muestra a filtrar.

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Criptosporidium

Colocar las tapas de los embudos de filtracin.


Abrir la llave de salida de la muestra (posicin horizontal cerradas, vertical abiertas).
Encender la bomba de vaco.
Dejar vaciar todo el contenido de los embudos.
Cerrar las llaves de salida de la muestra.
Flamear la pinza con la llama del mechero y luego pasarla por el agua caliente, para evitar
que la membrana se queme.
Aflojar los embudos y tomar las membranas suavemente, colocndolas sobre las cajitas de
petri conteniendo agar cetrimide. En caso de crearse burbujas, deber hacerse presin sobre
la membrana para eliminarlas.
Dejarlas reposar durante unos minutos para que la membrana absorba adecuadamente el
medio, luego se invierten las placas y se colocan en la incubadora a 35 1 C durante 48
horas (colocarla en la incubadora antes de 20 minutos).
Si se va a filtrar otra muestra, se aade al embudo agua hervida y caliente por tres minutos
como mnimo y se acciona el vaco hasta evacuar toda el agua. Se deja enfriar el portafiltros
un minuto y se procede a filtrar la siguiente muestra.
Despus del perodo de incubacin se sacan las placas y se procede a contar las colonias.
Nota: Al comienzo de cada serie de filtraciones, utilizar unidades de filtracin estriles como
mnima precaucin para evitar la contaminacin accidental. Considrese que se interrumpe
una serie de filtraciones cuando transcurre un intervalo de 30 o ms minutos entre la
filtracin de dos muestras. Si se produjera una interrupcin de este tipo, tratar la filtracin
siguiente como si fuera una nueva serie y esterilizar los soportes de los filtros de membrana
que estn utilizndose. Se debe descontaminar los filtros entre filtraciones sucesivas
mediante rayos ultravioleta (UV), chorro de vapor o agua hirviendo. En el caso de empleo de
luz UV, bastar con una exposicin de 2 minutos.
o

CONTROL ANALITICO

Cuando se analice un lote de muestras (definido como muestras analizadas en un da por un


analista), se debe montar un control positivo con P. aeruginosa cepa de referencia, un control
negativo con E. coli, P. mirabilis, S. typhimurium o S. aureus cepas de referencia, un control del
medio de cultivo y un control del medio ambiente durante el tiempo de siembra. Todos los
controles deben consignarse en la captura de datos primarios de microbiologa codificado como
F1-GE-PA-037-GDCON.
o

CLCULO

Las colonias de P. aeruginosa son 0.8 a 2.2 mm de dimetro, producen pigmentos amarillosverdes y fluorescen sobre luz UV.
Compute el conteo usando filtros de membrana con 20 a 80 colonias con la siguiente ecuacin:
P. aeruginosa /100 ml: Colonias contadas x 100
ml de muestra filtrada
Si no se observan colonias reportar el conteo como <1 P. aeruginosa /100 ml
Los resultados deben consignarse en la captura de datos primarios de microbiologa codificado
como F1-GE-PA-037-GDCON.

BIBLIOGRAFIA

CLESERI, Lenore S., GREENBERG, Arnold E. y EATON, Andrew D. Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater. 21 Edition. USA. Ed. United Book Press, Inc. TECNICA DE
FILTRACION POR MEMBRANA PARA P. aeruginosa Pg 9-33
Manual Microbiologa 12th Edicin. Merck

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Criptosporidium

DIAGRAMA DE FLUJO
200 500 ml
muestra

Mezclar vigorosamente mnimo


25 veces

Filtrar el volumen elegido en


las unidades de filtracin
sobre filtros de membrana de
0.45 um

Tomar la membrana y asentarla en la caja de petri que


contiene el medio de cultivo con Agar Cetrimide teniendo
cuidado de que no queden burbujas de aire entre esta y el
medio.

Incubar a 35
0.5 C por 48
horas