2.

Materiales y métodos
2.1. Cultivo de células de la leucemia líneas celulares K562, HEL, HL-60, KG-1a,
NB-4, OCI-AML3 y murino línea celular estromal MS-5 fueron todos obtiene a
partir de la colección alemana de microorga-ismos y Cultivos Celulares (DSZM,
Braunschweig , Alemania). Líneas de células estromales murinas EL08-1D2 y
EL28-1B3 [18] fueron amablemente proporcionados por Robert O ostendorp,
Techni-cal Universidad de Munich. Las líneas celulares se mantuvieron a una
densidad de 2,5 × 105 / ml cada uno en RPMI 1640 que contiene 10% de FCS
(Biochrom, Berlín, Alemania), 2 mM Glu-tamine y 1% de penicilina-estreptomicina
(Life Technologies, Darmstadt, Alemania) .Standard de laboratorio las condiciones
de normoxia (21%) compuesto O2, 5% de CO2, y 37◦C. Para los experimentos en
un ambiente de oxígeno reducido, se utilizó la estación de trabajo INVIVO2400
hipóxica de Tecnología Ruskinn (Bridgend, Reino Unido). Las células se incubaron
en 1% de O2, 5% de CO2, y 37◦C durante 48 h. El número de células vivas se
evalua-ado por tinción con azul de tripano (Life Technologies, Darmstadt,
Alemania). Las células primarias AML fueron obtenidas de la médula ósea o
sangre periférica de consecutivepatients con LMA de acuerdo a criterios de la
OMS después de obtener el consentimiento informado. Células mononucleares de
sangre periférica (PBMC) se obtuvieron a partir fue dado consentimiento donantes
sanos afterinformed. Por las características de las muestras de AML y los
donantes, por favor consulte la Tabla 1
2.3. De células activadas por fluorescencia (FACS)

PBMC aisladas se tiñeron durante 15 minutos a 4◦C en la oscuridad con
anticuerpos FITC etiquetados (Tabla 1, todos de Beckman Coulter, Brea, CA). Las
células fueron lavadas con tampón FACS (D-PBS que contenía 0,1% de BSA y
EDTA 2 mM) y el flujo de datos de citometría fue adquirido usando un citómetro
FACS Calibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Análisis de la expresión se realizó
utilizando software CellQuest Pro BD.

2.4. Los ensayos para la detección de la lisis celular mediada por PBMC

3 × 105target células (blastos AML o células K-562) en 10 ml de RPMI fueron
teñidas con 2 l de un ml de solución de 1 mg / Calceína AM Probe (Life
Technologies, Darmstadt, Alemania). Después de 3 min de incubación a RT, las
células se lavaron dos veces y efec-tor: célula diana (E: T) se generaron

Alemania). se analizó la puerta R2 . izquierda) y la combinación de las células diana y efectoras (Fig. Además. se tiñeron con PI y se analizaron como se ha descrito anteriormente. las células se transfirieron a tubos FACS y desprendimiento de MSC se realizó mediante tripsinización. 2C) y se analizó a través de histogramas. Para los experimentos de co-cultivo con células estromales mesenquimales (MSC). Medición de la lisis mediada por células en un sistema de co-cultivo ByFlow citometría Para investigar la lisis mediada por células con un método no radiactivo que permite que un sistema de co-cultivo de tres celdas.5: 1 a 80: 1 en una placa de 12 pocillos. este sistema podría ampliarse para analizar un sistema triple de células co-cultivo. Las células se lavaron. 2B. células de 3 × 104stromal de líneas celulares murinas MS-5. se usó este marcador para definir puerta R2 que incluye sólo las células CD45 positivas (es decir. las células se lavaron y se tiñeron durante 10 minutos con 2 l de anticuerpo CD45-APC (Tecnología para la Vida-Gies. 3. Las células se lavaron y se resuspendieron en 500 l de tampón FACS y se tiñeron con 10 l de un / ml de solución de yoduro de propidio 50 g (Sigma-Aldrich. Las células lisadas se midieron usando FACS como se describe anteriormente. Alemania) a 4◦C en la oscuridad. las suspensiones celulares fuerontrans preferidos en tubos de FACS. Después de MSCs se combinaron con medios de comunicación en el respectivo tubo de FACS. EL08-1D2 y EL28-1B3 se sembraron en 12 bien y permiten llegar a ser adherente por incubación durante la noche. 2B . derecha). incluyendo células diana (Fig. un ensayo basado en FACS fue desarrollado. Después de 4 h de incubación. MSC quedan fuera de esta puerta y por tanto no se analizan más de lisis (Fig. 2B. Darmstadt. medio). A continuación. blastos AML) se midieron individualmente por FACS y una puerta específica que separa las dos poblaciones por su positividad para calceína fue definida (Fig. PBMCs) y células diana (es decir. Como las células estromales mesenquimales tinción negativa para CD45.proporciones que van desde 2. Los sobrenadantes se dis-cardada y 1 × 104 calceína AM marcada. En una primera etapa. los blastos de AML primarias fueron co-cultivadas con MSC 1 h antes de se añadieron PBMCs en los respectivos ratios. Después de 4 h de incubación a la condición respectiva. 2A izquierda y medio. Taufkirchen. puerta R3) . Mediante la adición de un marcador adicional.3. leucocitos). La cantidad de células lisadas se definió como células PI positivas en la puerta de destino R3 (Fig. las células efectoras (es decir. este método permite el cálculo preciso de la relación de efector a célula diana mediante el cálculo del número de células diana en la puerta R3 en comparación con el número de células totales.

4% de lisis para EL08-1D2. Tomados en conjunto. Las células primarias AML fueron elegidos como células diana (n = 5 .5% de lisis para EL28-1B3 y el 17. La viabilidad de las muestras de AML no se alteró significativamente cuando co -cultivadas con MSC ( 25 × 103 PERASSAY ) durante 48 h (viabilidad 90. Curiosamente.01. estos datos sugieren un efecto relacionado específico de apoyo MSC en lugar de un mero efecto inespecífico.6% de lisis para EL08-1D2. no significativo ) . para la caracterización de los pacientes con LMA favor consulte la Tabla 1 ) .01. p < 0. mientras que no hubo efecto de las células "no partidario" (68.0 % frente a 90.05 . 3. Fig 3A .5% de lisis para EL28-1B3 y 36.7 % .(incluyendo las células diana y efectoras) para la positividad PI como se ha mencionado antes. 4. 1 .8 %. Mecanismos de protección de explosiones ALD por el MSC A continuación. p <0. En consecuencia. Curiosamente. física.5. Discusión . Fig. No tanto. hemos observado que la co. hemos tratado de aclarar aún más los medios de protección de los blastos AML por el MSC en el sistema de co-cultivo.6 % . estos resultados también se pudo confirmar en el modelo K562. 3B). el 31. aunque con menor lisis celular (34. cambiando la proporción E: T u ocultar las células diana) o si MSC factores protectores secretos. la reducción de la lisis 50.5% de lisis sin MSC. 3C).05 %) 3.cultivaron con células diana. p = 0. se aplicó este sistema para investigar los efectos de las células del estroma mesenquimales (MSC) como otro componente pertinentes del microambiente cuando se co. hemos utilizado las líneas celulares estroma EL08-1D2 y EL28-1B3 murinos que son ya sea "partidarios" (EL08-1D2) o "no-partidarios" (EL28-1B3) para el mantenimiento de las células progenitoras hematopoyéticas [18].1% de lisis sin MSC. el 67. sólo la línea celular MSC EL081D2 como una línea celular partidario protegida significativamente blastos AML de lisis mediada por células. Fig. Sobre todo lo que queríamos saber si es el contacto directo célula-célula de blastos leucémicos a MSC que es de protección (por ejemplo. MSC proteger blastos AML contra de células NK mediada por lisis A continuación. p < 0. E : relación de T 10 : 1 de reducción de la lisis 50.4 .cultura de explosiones primarias AML con MSC durante 48 h protegidas significativamente blastos AML desde mediada por células NK lisis ( E : T ratio de 20 : .

pero en general reflejan nuestra pobre comprensión de los complejos mecanismos involucrados. El componente mejor identificados y caracterizados son las células estromales mesenquimales y recientemente. Por lo tanto . Mientras una gran incertidumbre radica en el conocimiento imperfecto de los antígenos diana pertinentes sobre los blastos leucémicos . lo que sugiere un tipo muy específico de la respuesta de estas células inmunocompetente hacia la hipoxia. donde sobrevivieron el tratamiento inicial y. ofrece un santuario específico o microambiente que consta de ciertos componentes. se encontró que la hipoxia de 1% de O2 activa las células NK. la presión parcial de oxígeno ha sido identificado como un jugador crítico en el compartimiento de células madre. Curiosamente. pero en nuestro modelo de estimulación de las células NK con IL-2. para las células T se ha descrito un efecto diferente de la hipoxia. finalmente. estuvimos incapaz de observar cualquier lisis significativa de los blastos de AML primarias por las células NK en nuestro sistema. Por lo tanto. que pueden no ser evidentes al observar las explosiones o células efectoras solas . nos centramos en las células NK y no investigar más a fondo los efectos de la hipoxia en las células T. las células NK eran significativamente más activo y la lisis de las células diana se aumentó durante condiciones de hipoxia cuando se aplica una línea celular modelo. se iniciará la proliferación de nuevo para causar la recaída clínica . células madre leucémicas ) residen en la médula ósea . hipoxia con la inhibición de la respuesta inmune hacia tumores sólidos [17]. La médula ósea . Sin embargo. Aquí. El área de aplicación putativo para terapias dirigidas inmunes en AML será la terapia de mantenimiento y / o el tratamiento de la enfermedad residual mínima . por ejemplo se demostró que en los pacientes con LMA con células NK activos supervivencia libre de recaída fue significativamente mayor que en los pacientes con células NK inactivos [19]. que se conoce para activar las células NK de una manera significativa. las células NK han demostrado ser las células efectoras en AML tanto in vitro como in vivo. Consistente con este hallazgo. En primer lugar. podría ser útil para investigar los efectos de la médula ósea en la respuesta inmune de células efectoras contra explosión AML. puede haber otros factores involucrados . las células diana ( es decir. pero no las células T. o mejor el ( células madre ) espacio pequeño . Sin .Las razones de los resultados decepcionantes para muchos enfoques inmunoterapéuticos en la LMA son en gran parte desconocido . De hecho . Una limitación significativa sin embargo es que los datos no eran obtenido en un entorno autólogo con células PBMC y AML del mismo paciente . la hipoxia podría influir innata mediata de células NK pero deja inmunidad de células T mediada por MHC más específica afectada. DID también no mejora celular lisis. Sin embargo.

los factores solubles secretadas por el MSC podrían ser pertinentes que sin embargo aún no se han definido. donde alorreactivas células T del donante ataque del anfitrión . inactivar las células NK [ 5 ] . y los mecanismos propuestos incluyen la supresión de la proliferación de células T . el MSC podría proteger blastos AML por la inhibición de las células T NK o .13] antiapoptóticos. En segundo lugar. Curiosamente. la alteración de los perfiles de citoquinas de las células T y NK o la inducción de células T reguladoras [ 2225 ]. . el intestino o la piel. Este mecanismo podría ser más relevante en el contexto de la protección microambiente mediada . Por lo tanto . debido principalmente a sus efectos conocidos de quimioprotección en blastocitos de la AML . Por lo tanto . MSC se sabe que tienen capacidades de moduladores inmunes tanto in vitro como in vivo. hemos sido capaces de identificar en este contexto otra población -ción de células mieloides " " ( que se derivan de la médula ósea ) que protegen las células de AML cuando se co. que son presentas células espectadoras en muestras primarias AML . Ellos han demostrado que influyen positivamente injerto agudo y crónico frente al anfitrión de enfermedad ( GvH .D [ 21 ] .cultivadas con células efectoras : células estromales mesenquimales ( MSC ) . posiblemente a través de generación de especies de oxígeno radicales [ 20 ] . En cambio . en cambio. anautoimmune como el trastorno después de un trasplante alogénico de células madre . que tenía una fuerte efecto protector sobre blastos leucémicos. la lisis celular mediada está relacionada con la inducción de la apoptosis puede ser cuestionado . Diversos mecanismos se han descrito . MSC han cosechado un gran interés en los últimos años .embargo . ya que el contacto directo célula a célula no era necesario para la protección. ya que eran principalmente relacionado con una disminución de la capacidad para la apoptosis en blastos de AML por ejemplo. misbalancing de proteínas o metabolicchanges [12. el MSC clínicamente podría mejorar GvH . la protección de los blastos AML por la disminución de su capacidad para someterse a la apoptosis parece poco probable en nuestro contexto. la observación de que las células NK lisis mediada disminuye cuando se utilizan muestras primarias AML está en línea con los hallazgos previos de los llamados " células mieloides ".D ) . En este contexto .tóxicos directos están involucrados. los mecanismos cito. dando lugar a daños orgánicos graves como en el hígado. pero ninguno de ellos puede ser realmente aplicada a la protección contra la lisis mediada por células . Ya sea a corto plazo.