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MICROBIOLOGA GENERAL

CARRERA DE QUMICA FARMACETICA

Sergio Rodrigo Quisberth Barrera M.Sc.


ser_barr@hotmail.com

La Paz Bolivia
16 de marzo del 2015

Metabolismo Microbiano
Conjunto de reacciones o transformaciones qumicas
que tienen lugar en un microorganismo para
mantener su viabilidad
Procesos o reacciones Catablicas
Degradan nutrientes
Liberan energa

Procesos o reacciones Anablicas


Tienden a unir molculas
Reacciones de sntesis que consumen energa

Metabolismo Microbiano

Excepto algunos tomos de C de los nucletidos, la asimilacin del C deriva de 8


intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, piruvato,
acetil-CoA, oxalacetato, -cetoglutarato.

Crecimiento Bacteriano
Aumento de nmero (no de
tamao)
Multiplicacin bacteriana:
fisin simple o binaria
Elongacin
Auto duplicacin de ADN
cromosmico
Tabicado central
Invaginacin membrana
celular
Sntesis de pared

Tiempo de generacin

Tiempo necesario para la duplicacin celular


Distintiva de cada especie
Puede influirse por factores estimulantes
Varan de 20 minutos (Escherichia coli) hasta 24 horas

Tiempo de generacin

Bacteria

Medio

Escherichia coli
Bacillus megaterium
Streptococcus lactis
Streptococcus lactis
Staphylococcus aureus

Glucose-salts
Sucrose-salts
Milk
Lactose broth
Heart infusion broth

Tiempo de Generacin
(minutos)
17
25
26
48
27-30

Lactobacillus acidophilus

Milk

66-87

Rhizobium japonicum
Mycobacterium tuberculosis
Treponema pallidum

Mannitol-salts-yeast extract 344-461


Synthetic
792-932
Rabbit testes
1980

Curva de Crecimiento Bacteriano


Bacteria en medio adecuado
Grfico de coordenadas: nmero de bacterias (logaritmo)
versus lapso de tiempo.
Distinta para cada bacteria
En todas se identifican
cuatro etapas:
Fase Lag
Fase Log
Fase estacionaria
Fase de muerte

Fase de Latencia

El nmero de microorganismos no
vara
Adaptacin al medio, produccin de
enzimas
Tiempo variable: entre una hora a
das.
Tamao relativo aumentado por
divisin

Fase exponencial o de crecimiento


logartmico

Relacin casi lineal entre el tiempo y el


nmero de elementos.
Actividad metablica incrementada
Depende del tiempo de generacin de
cada bacteria
Los antimicrobianos son mas activos
Puede haber variaciones entre el
crecimiento in vitro e in vivo.

Fase exponencial o de crecimiento


logartmico

Ecuacin Cintica de
crecimiento en funcin al
numero de generaciones

Clculo del nmero de


generaciones

Fase exponencial o de crecimiento


logartmico

Ecuacin Cintica de
crecimiento en funcin a
la tasa de crecimiento

[]
+

Clculo de la tasa de
crecimiento

Fase exponencial o de crecimiento


logartmico

Si partimos de 104 ufc/ml en un cultivo


que tiene un tiempo de generacin de
2 h, cuntas clulas tendremos al cabo
de 4, 24 y 48 h de cultivo?

Fase exponencial o de crecimiento


logartmico

La tasa de crecimiento de un cultivo


bacteriano es = 1.5 h-1. Si partimos de
una poblacin inicial de 102 ufc/ml, Qu
nmero de bacterias por mililitro
(ufc/ml) habr despus de un cultivo de
10 h?. Cunto es el tiempo de
generacin del cultivo?.

Fase Estacionaria
En determinado punto el crecimiento
disminuye
La poblacin no aumenta
Clulas nuevas reemplazan a las clulas
muertas
Actividad metablica mas lenta
Produccin de metabolitos secundarios
Antibioticos
Toxinas

Fase de Esporogenesis para las especies


productoras de esporas

Fase de declinacin o muerte


Recuento de clulas disminuye
sensiblemente
El numero de clulas muertas supera al
nmero de clulas vivas
Acumulacin de productos txicos
Disminucin de nutrientes
Aparicin rpida : autolimitar diseminacin
infecciones

Factores relacionados al Crecimiento


Qumicos
Carbono
Nitrgeno
Oxigeno
Azufre
Factores de crecimiento
Iones

Fsicos
Temperatura
pH
Actividad Agua aW
Potencial redox
Presin Osmtica

Efecto de la Temperatura
Todos los microorganismos tienen una temperatura ptima de
crecimiento.
Esto significa que a determinada temperatura la velocidad de
duplicacin o la velocidad de crecimiento poblacional de los
microorganismos es mayor.
Clasificacin

Rango

Optima

Termfilos

25 - 80 C

50 - 60 C

Mesfilos

10 - 45 C

20 - 40 C

Psicrfilo

-5 - 30 C

10-20 C

Efecto de la Temperatura
Temperatura mnima de crecimiento
Temperatura ptima de crecimiento
Temperatura mxima de crecimiento

Efecto de la Temperatura
Bacteria
Listeria monocytogenes
Vibrio marinus
Pseudomonas maltophilia
Thiobacillus novellus
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Clostridium kluyveri
Streptococcus pyogenes
Streptococcus pneumoniae
Bacillus flavothermus
Thermus aquaticus
Methanococcus jannaschii
Sulfolobus acidocaldarius
Pyrobacterium brockii

T Mnima
1
4
4
5
10
10
19
20
25
30
40
60
70
80

T Optima
30-37
15
35
25-30
30-37
37
35
37
37
60
70-72
85
75-85
102-105

T Mxima
45
30
41
42
45
45
37
40
42
72
79
90
90
115

Condiciones de pH
La mayora de los microorganismos crecen en pH cercanos
a la neutralidad, entre 5 y 9, cosa que no excluye que
existan microorganismos que puedan soportar pH
extremos y se desarrollen.
Clasificacin

pH externo

pH interno

Acidfilos

1.0 - 5.0

6.5

Neutrfilos

5.5 - 8.5

7.5

Alcalfilos

9.0 - 10.0

9.5

Condiciones de pH
pH < 6,5 cido
pH > 8,5 bsico o alcalino
pH 6,5 8,5 neutro Mas adecuado para crecimiento
bacteriano

Condiciones de pH
Organismo
Thiobacillus thiooxidans
Sulfolobus acidocaldarius
Bacillus acidocaldarius
Zymomonas lindneri
Lactobacillus acidophilus
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Clostridium sporogenes
Erwinia caratovora
Pseudomonas aeruginosa
Thiobacillus novellus
Streptococcus pneumoniae
Nitrobacter sp

pH Mnimo
0.5
1.0
2.0
3.5
4.0-4.6
4.2
4.4
5.0-5.8
5.6
5.6
5.7
6.5
6.6

pH Optimo
2.0-2.8
2.0-3.0
4.0
5.5-6.0
5.8-6.6
7.0-7.5
6.0-7.0
6.0-7.6
7.1
6.6-7.0
7.0
7.8
7.6-8.6

pH Mximo
4.0-6.0
5.0
6.0
7.5
6.8
9.3
9.0
8.5-9.0
9.3
8.0
9.0
8.3
10.0

Presin Osmtica
Los solutos disueltos se desplazan a zonas de menor
concentracin.
El agua se desplaza a zonas de mayor concentracin
de solutos
Una presin osmtica alta causa prdida de agua y
plasmlisis de la clula
Halfilas: bacterias que toleran altas concentraciones
salinas.
Halfilas facultativas: toleran hasta un 5 % de sales.

Actividad Agua aW
La disponibilidad de agua se mide por un parmetro
llamado actividad de agua o potencial de agua,
indicativo del agua libre, y que se expresa como
aW= PS/PW
donde PS es la presin parcial de vapor de agua en la
solucin problema y PW es la presin parcial de vapor
del agua destilada.

Actividad Agua aW
Organismo

aw mnima para crecer

Caulobacter

1.00

Spirillum

1.00

Pseudomonas

0.91

Salmonella/E. coli

0.91

Lactobacillus

0.90

Bacillus

0.90

Staphylococcus

0.85

Halococcus

0.75

Presin Osmtica y Actividad Agua


aW

Potencial de Oxido-Reduccin
El Potencial de Oxido-Reduccin es una medida de la
tendencia del medio a donar o recibir electrones.
Es crtico para el crecimiento de los microorganismos
generalmente asociado con la presencia de oxgeno
disuelto en el medio.
En medios con oxgeno, el potencial redox vara entre 0,2 y
0,4 Voltios.
Los anaerobios estrictos necesitan una atmsfera sin
oxgeno, deben crecer en medios reductores donde el
potencial no sea mayor a -0,2 Voltios.

Condiciones atmsfricas

Potencial de xido-reduccin o Redox (Eh)


Respiracin bacteriana : reacciones de xidoreduccin, en cadena
El aceptor final de electrones o hidrogeniones es
variable

Aerobios

Requieren oxgeno, aceptor final de hidrgeno


Formacin de H2O y CO2
Produccin de enzima Catalasa : desdoblamiento del
Perxido de hidrgeno (H2O2) en H2O y oxgeno
Prueba de Catalasa para diferenciar microroganismos
(Staphylococcus de Streptococcus)

Anaerobios

Viven en ausencia de oxgeno atmosfrico


Aceptor final de hidrgeno : compuesto inorgnico
(NO3 o SO4)
Fermentacin: la fuente de carbono provee energa,
el donador de hidrgeno y el aceptor final (un
compuesto orgnico como cidos o alcoholes)
Muy frecuente en microorganismos orales

Anaerobios

Anaerobios obligados: no utilizan O2


Anaerobios moderados: toleran de un 2 a un 8 % de
O2
Anaerobios aerotolerantes: sobreviven un tiempo en
presencia de O2
Anaerobios facultativos: aceptan indistintintamente
una situacin u otra

Microaerfilos
Requieren bajas concentraciones de O2 para crecer
Utilizan el O2 como fuente de energa pero a
concentraciones < 15 %
Susceptibles a radicales superxido
Enzima Superxido Dismutasa (SOD) : transforma
radicales superxido en H2O2
Capnofilas: desarrollan mejor con concentraciones de
CO2 elevadas
La cavidad oral presenta todas estas variantes
Las especies capnfilas aumentan en personas con
alteraciones periodontales.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
MTODOS DIRECTOS
Recuento en cmara
Determinacin del peso hmedo
Determinacin del peso seco

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Recuento en cmara
Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un
equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de
microbiologa.
Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de
recuentos
Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de PetroffHausser.
La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con
objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se
realizan con objetivos secos.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Recuento en cmara

Tipo de cuadro

Area [cm2]

Volumen [ml]

Factor [1/Volumen]

Cuadrado total

1.00 x 10-2

2.00 x 10-5

5.00 x 104

Cuadrado grande

4.00 x 10-4

8.00 x 10-7

1.25 x 106

Cuadrado pequeo

2.50 x 10-5

5.00 x 10-8

2.00 x 107

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Determinacin del peso hmedo
Se tara un tubo de centrfuga
Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante
se determina el peso del sedimento
Inconvenientes: Grandes errores, debido al lquido intercelular
retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de
agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento,
etc.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Determinacin del peso seco
Como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser
pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante.
Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los
valores de peso hmedo.
Inconvenientes: Mtodo tedioso y con bastantes errores:
Difcil pesar menos de 1 mg con exactitud.
1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Determinacin del peso hmedo y seco

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
MTODOS INDIRECTOS
Recuento en placa
Recuento en filtro
Determinacin del nitrgeno total
Mtodos turbidimtricos (pticos)
Espectrofotmetro
Nefelmetro
Escala de Mac. Farland

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Recuento en placa
Los mtodos de recuento directos no distinguen entre clulas
vivas y muertas.
En muchos casos conviene contar las clulas vivas.
El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas
alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre
placas de Petri con medio slido.
Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del
tiempo adecuado de incubacin.
Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin
de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil
deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Recuento en placa

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Recuento en Filtro
Se usa para suspensiones diluidas de bacterias.
Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una
membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles.
Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un
medio de cultivo slido.
Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas
retenidas.
Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin
original de viables en funcin del volumen de suspensin que
se hizo pasar por el filtro.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Recuento en Filtro

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Determinacin del nitrgeno total
Permite determinar
indirectamente la masa de una
poblacin bacteriana.
Existen distintas tcnicas para
determinar la cantidad de
nitrgeno.
Puede analizarse:
El nitrgeno no proteico mediante
el NO2-, NO3-, NH4+
El nitrgeno proteico mediante
absorcin en UV, Reaccin de
Biuret, Reaccin de Lowry, o el
nitrgeno total mediante Kjeldahl.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Mtodos turbidimtricos (pticos)
Muy usados en la prctica cotidiana del laboratorio.
La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la
cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo
bacteriano.
Recordemos que las suspensiones bacterianas dispersan la luz,
al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua
(efecto Tyndall).

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Mtodos turbidimtricos (pticos)

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Espectrofotmetro
Equipo de uso habitual en laboratorio de Microbiologa o
Bioqumica.
Mide la densidad ptica (D.O.).
Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para
relacionar los valores de Absorbancia con la masa bacteriana
en una muestra problema.
Comentarios: La proporcionalidad entre Absorbancia y masa
bacteriana slo es vlida para >107cls/ml.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Nefelmetro
Es un aparato similar al
anterior, pero el dispositivo
sensor est situado en ngulo
recto respecto de la direccin
de la luz incidente, y se mide
la luz dispersada directamente
por la preparacin.
Posee mayor sensibilidad que
el espectrofotmetro.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Escala de Mac Farland
Los estndares de turbidez de Mac Farland se usan como referencia
para saber el nmero de bacterias por mililitro, segn una escala que
va de 0.5 a 10.
Estos estndares son creados al mezclar soluciones de cloruro de
bario al 1% con cido sulfrico al 1% en volmenes especficos.
Los estndares pueden ser visualmente comparados con
suspensiones de bacterias en salina estril o en caldos.
La desventaja de este mtodo es que no discrimina bacterias vivas o
muertas en la solucin, por lo que se puede sobreestimar la
poblacin de bacterias.

Tcnicas para determinar el nmero y


viabilidad de las clulas
Escala de Mac Farland

Preguntas??