LAPORAN PRAKTIKUM PENYAKIT INFEKSIUS

IDENTIFIKASI DAN ISOLASI BAKTERI Escherichia coli

TRINI PURNAMASARI S.
O111 12 255
KELOMPOK 5
Nama Asisten : Meyby Eka Putri
Rozana Pratiwi

PROGAM STUDI KEDOKTERAN HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2014

DAFTAR ISI
Halaman Judul

Daftar Isi

BAB I Pendahuluan
1.1

Latar Belakang

1.2

Tujuan Praktikum

BABII Tinjauan Pustaka

2.1 Penyakit infeksius pada hewan yang disebabkan Escherichia coli

2.2 Teknik isolasi bakteri E. coli: media (Broth, SMAC, EMBA)

yang digunakan

2.3 Pewarnaan gram pada bakteri

2.4 Uji Biokimia untuk identifikasi E. coli: TSIA, SIM, MRVP, Citrat
dan Urea

BAB III Materi dan Metode

3.1

Alat Dan Bahan

3.2

Prosedur Kerja

BAB IV Hasil dan Pembahasan

4.1

Hasil

10

4.2
Pembahasan
BAB V Penutup
5.1

10

Kesimpulan

13

5.2
Saran untuk praktikum selanjutnya
Lampiran Foto.

13
14

Daftar Pustaka

15

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Isolasi
terdapat

di

adalah
alam

mengambil

dan

mikroorganisme

menumbuhkannya

dalam

yang
suatu

medium buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari

mikroorganisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan
mikrobiologis,

misalnya

telaah

dan

identifikasi

mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya

terdiri dari satu macam mikroorganisme saja. Prinsip dari
isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis mikroba
dengan

mikroba

lainnya

yang

berasal

dari

campuran

bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan

menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan
membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya
(Sutedjo, 1996).
E. coli adalah bakteri yang berbentuk batang, gram negatif merupakan
penghuni normal dalam saluran pencernaan manusia dan hewan, namun
demikian serotipe tertentu dapat menyebabkan sakit pada manusia. Salah satu
serotype itu adalah O157, : H7 yang dapat menginduksi sekresi cairan tubuh
secara berlebihan dan terus menerus sehingga terjadi diare dan dapat
menyebabkan meningitis, penularan dan penyebaran agen penyakit ini dapat
melalui tinja dari lingkungan yang tercemar. E. coli juga pernah ditemukan
pada bahan makanan asal hewan seperti daging sapi dan daging ayam segar
(Ewings, 1986).
1.2 Tujuan Praktikum
Mengetahui cara isolasi dan identifikasi bakteri Escherichia coli
sebagai penyebab penyakit infeksius .

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Penyakit infeksius pada hewan yang disebabkan Escherichia coli

Strain pathogen E.coli dihubungkan dengan penyakit pada intestinum
dan dengan septikemia pada hewan muda atau hewan yang baru lahir dan
dengan penyakit respirasi pada unggas. Strain non patogen juga dapat
menyebabkan infeksi tertentu pada ambing, uterus dan bagian tubuh lain. Ada
3 manifestasi enterik kolibasilosis pada babi yaitu: enteritis E.coli neonatal
yaitu enteritis yang terjadi pada anak babi umur 1- 4 hari, babi terlihat normal
selama 12 jam pertama kehidupan dan kemudian mengalami dehidrasi
selama 18 jam. Enteritis pada babi lepas sapih yaitu yang terjadi setelah
penyapihan. Babi yang terinfeksi mengalami diare, depresi, anoreksia dan
demam yang mungkin terjadi selama 2-3 hari. Meskipun seringkali terjadi
kolaps dan kematian setelah periode singkat dari diare, mortalitas pada
hewan lepas sapih lebih rendah daripada hewan neonatal. penyakit edema
yaitu edema pada berbagai jaringan tubuh babi segera setelah disapih.
2.2 Teknik isolasi bakteri E. coli: media (NB, SMAC, EMBA) yang
digunakan
Nutrien Broth
Nutrient broth merupakan media untuk mikroorganisme yang
berbentuk cair. Intinya sama dengan nutrient agar. Sampel feses yang telah
diencerkan terlebih dahulu dengan buffered peptone water (BPW) 0,1%,
sebelum ditumbuhkan pada medium agar atau cair (nutrient broth)
sehingga setelah inkubasi akan diperoleh jumlah bakteri yang dapat
dihitung (Suardana, dkk. 2014).

SMAC
Koloni positif E. coli dari media EMBA yang ditanam pada media
nutrien agar miring, selanjutnya diinokulasikan pada media selektif
sorbitol MacConkey agar (SMAC). Setelah diinkubasikan pada suhu 37
C selama 20-24 jam, serotipe E. coli O157 dideteksi dari terlihatnya koloni

jernih atau tidak berwarna dan dianggap bersifat sorbitol negative

(Suardana, dkk. 2014).

EMBA
Sebanyak 15 ml media eosin methylene blue agar (EMBA)
dimasukkan ke dalam setiap cawan petri untuk disterilisasi dengan
autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit. Setelah sterilisasi media
diambil dari strerilisator untuk selanjutnya didiamkan pada suhu kamar
agar media menjadi padat. Dari pengenceran sampel yang dikehendaki,
sebanyak 0,1 ml larutan tersebut dimasukkan ke dalam cawan petri dengan
metode sebar menggunakan gelas bengkok. Inkubasi dilakukan pada suhu
37o C selama 18-24 jam. Setelah akhir inkubasi, koloni yang tumbuh dan
berwarna hijau metalik dengan titik hitam pada bagian tengahnya dihitung
sebagai koloni E. coli. Koloni yang tumbuh dikoleksi dengan cara
diinokulasikan pada media nutrien agar miring untuk pemeriksaan
selanjutnya (Suardana, dkk. 2014).

2.3 Pewarnaan gram pada bakteri

Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu atau kristal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri
gram positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan
alcohol, sementara bakteri gram negative tidak. Pada uji pewarnaan gram,
suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metal ungu atau
crystal violet, yang membuat semua bakteri gram negative menjadi berwarna
merah

atau

merah

muda.

Pengujian

tersebut

berguna

untuk

mengklasifikasikan kedua tipe bakteri tersebut berdasarkan perbedaan

struktur dinding sel mereka (Karmana, 2008).
2.4 Uji Biokimia untuk identifikasi E. coli: TSIA, SIM, MRVP, Citrat dan
Urea
TSIA (Three Sugar Iron Agar)
Dengan menggunakan ose steril diambil biakan dari EMBA, lalu
ditaman pada media TSIA dengan cara ditusukkan sampai ke dasar tabung,
kemudian digores secara zig-zag pada permukaannya. Diinkubasikan pada
suhu 37oC selama 24 jam. Diamati perubahan pada media. Prinsip TSIA,

bakteri

yang

tergolong Enterobacteriaceae dapat

memfermentasi

karbohidrat (Glukosa, Laktosa, Sukrosa). Hasil : Berwarna kuning

(bersifat asam ) pada bagian tegak dan miring sehingga bakteri dapat
memfermentasi karbohidrat, berwarna hitam dapat memproduksi H 2S (+),
dan terbentuk gas didasar tabung (Murni. 2014).

SIM (Sulfide Indol Motility)

Inokulasikan 1 ose dari Plate Count Agar (PCA) miring ke dalam
tryptone Broth inkubasi selama 24 jam 2 jam pada suhu 35 oC +1oC.
Uji Indoldilakukan

dengan

menambahkan

0,2

ml

0,3

ml

pereaksi Kovacs. Reaksi positif jika terbentuk cincin merah pada lapisan
bagian atas media dan negatif bila terbentuk cincin warna kuning. Prinsip
SIM adalah mengetahui motilitas organisme, adanya pembebasan H2S
(sulfide) dan mengetahui adanya pembentukan indol. Hasil : Adanya H3S
ditunjukkan dengan perubahan warna menjadi hitam pada bagian dasar.
Motilitas diketahui dari keruhnya media dan adanya penyebaran ke atas
( mirip pohon cemara terbalik ). Adanya indol terlihat berupa cincin merah
beberapa detik sampai 5 menit setelah penambahan 1 ml chloroform dan
beberapa tetes reagen Kovac (Murni, 2014).

MRVP (Metyl Red Voges Proskauer)

Inokulasikan bakteri ujipada media MRVP dan inkubasikan pada pada
suhu 37C selama 24 jam. Setelah inkubasi media menjadi keruh lalu di
tambahkan peubah atau reagen dengan urutan sebagai berikut : Uji MR
dengan cara menambahkan 2 tetes reagen methyl red lalu kocok beberapa
kali. Reaksi positif di tandai perubahan warna menjadi merah. Uji VP
dengan media yang sama setelah uji MR di lanjutkan dengan uji VP
dengan menambahkan 0,6 ml alpha naphtol soln dan 0,2 ml KOH 40% aq
soln, kemudian kocok sedikit reaksi di tunggu mulai 20 sampai 30 menit,
lihat perubahan warna, reaksi positif di tandai perubahan warna menjadi
merah. Prinsip MR adalah mengetahui terbentuknya asam kuat. Hasil :
Terbentuknya asam ditunjukkan dengan terjadi perubahan warna dari
orange menjadi merah setelah ditetesi ragen MR. Prinsip VP adalah
mengetahui terbentuknya asetil methil karbinol. Hasil : Terbentuknya

asetil methil karbinol terlihat dengan adanya perubahan dari orange

menjadi merah setelah ditetesi KOH dan -naftol (Murni, 2014).

Citrat
Goreskan 1 ose dari PCA miring ke permukaan Simmon Citrat Agar.
Inkubasi selama 96 jam + 2 jam pada suhu 35oC +1oC. Reaksi positif jika
terjadi pertumbuhan dan media berubah warna menjadi biru, reaksi negatif
jika tidak ada pertumbuhan dan media tetap hijau. Prinsip : Mengetahui
kemampuan organisme untuk menggunakan sitrat sebagai sumber karbon
utama. Hasil : pertumbuhan bakteri dapat terlihat dengan adanya
perubahan warna dari hijau menjadi biru (Murni. 2014).

Urea
Prinsip : Sebagian bakteri menghasilkan enzim urease yang dapat
menguraikan urea sehingga bersifat alkalis atau basa (berwarna
merah). Hasil : Terjadi perubahan warna dari merah mudah ke merah
keunguan (Murni. 2014).

BAB III
MATERI DAN METODE

III.1 Alat dan Bahan

Alat yang digunakan pada praktikum ini antara lain :

Ose
Bunsen
Rak tabung
Tabung
Korek gas
Object glass
Cover glass
Mikroskop
Pipet tetes

Bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain :

NaCl suspensi
Koloni bakteri E.coli
Crystal Violet
Lugol
Alkohol 90%
Safranin
Minyak emersi

III. 2 Prosedur Kerja

o Isolasi Staphylococcus
1. Isolat bakteri diinokulasikan pada media SMAC secara streak.
2. Media yang berisi isolat bakteri diinkubasi selama 20 - 24 jam pada suhu
370 celcius.
o Media Uji Biokimia
a. Media Triple Sugar Iron (TSI) Agar
65 g serbuk media Triple Sugar Iron Agar dilarutkan dengan 1 liter
air suling, lalu dipanaskan hingga mendidih, setelah itu dimasukkan ke

dalam tabung reaksi sebanyak 10 mL, kemudian disterilkan selama 15

menit pada 121 C tekanan 15 lbs, dibiarkan membeku pada posisi miring.
b. Medium Sulfit Indol Motility (SIM)
30 g serbuk media SIM dilarutkan dengan 1 liter air suling,
dipanaskan hingga melarut, setelah itu dimasukkan ke tabung reaksi
sebanyak 10 mL, disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu
121 C tekanan 15 lbs.

c. Media Metil Red-Voges Proskauer (MR-VP)

17 g serbuk media MR-VP dilarutkan dalam 1 liter air suling, lalu
dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10 mL, kemudian
disterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121 C tekanan 15
lbs.
o Pewarnaan Gram
1. Fikasi ose dan objek glass dengan menggunakan bunsen
2. Homogenkan satu ose biak bakteri dengan NaCl fisiologis yang telah di
teteskan pada gelas objek. Buat Apus setipis mungkin.
3. Keringkan dan fiksasi diatas bunsen
4. Preparat apus diteteskan pewarna : (a) Crystal violet selama kurang lebih 2
menit kemudian dibilas dengan menggunakan air mengalir. (b) Teteskan
lugol selama kurang lebih 20-30 detik kemudian dilunturkan dengan
menggunakan alkohol 90% selama 1 menit. (c) Setelah itu alkohol dibuang
dan dicuci dengan air mengalir. (d) Teteskan safranin kurang lebih 2 menit
kemudian dibersihkan dengan air mengalir dan dikeringkan. Lihat dibawah
mikroskop
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil
o Isolasi Escherichia coli

Pertumbuhan pada media SMAC diamati. Koloni bakteri Escherichia coli

O157 menunjukan tidak adanya perubahan warna pada media.
o Uji Biokimia
TSIA (Triple Sugar Iron Agar) MR-VP (methyl red-voges
proskauer)
- Glukosa : kuning (+)
- Laktosa : kuning (+)
- Sukrosa : kuning (+)

- MR : merah (+)
- VP : negatif (-)

SIM (Sulfide Indol Motility)

-

H2S : negatif (-)

Indol : positif (+)
Motil : positif (+)
o Pewarnaan Gram
Pada uji pewarnaan gram yang terlihat dibawah mikroskop yaitu bakteri

Escherichia coli berwarna merah.

IV.2 Pembahasan
o Isolasi Escherichia coli
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapat di
alam dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan.
Prinsip dari isolasi mikroba adalah memisahkan satu jenis
mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat sel-sel mikroba akan
membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya
(Sutedjo,

1996).

SMAC

merupakan

media

selektif

untuk

mengetehui apakah Escherichia coli yang di kultur itu pathogen atau tidah.
Pertumbuhan Escherichia coli pada media SMAC yang patpgen akana memiliki
koloni bakteri Escherichia coli O157 menunjukan tidak adanya perubahan warna
pada media, karena Escherichia coli O157 tidak memfermantasikan sorbitol
sehingga tidak mengubah warna media.
o Uji Biokimia
10

- Triple Sugar iron Agar (TSIA)

Media Triple Sugar Iron Agar (TSIA) merupakan salah satu metode yang
digunakan untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasikan gulagula,selain itu melihat pula kemampuan bakteri dalam menghasilkan gas dan H2S
dari

proses

fermentasi

tersebut.

tergolong Enterobacteriaceae dapat

Pada

prinsipnya

memfermentasi

bakteri

karbohidrat

yang

(Glukosa,

Laktosa, Sukrosa).
Pada uji fermantasi gula-gula kali ini dengan menggunakan media TSIA,
E coli memberikan hasil positif asam pada bagian lereng dan dasar (media
berwarna kuning) pada bagian tegak dan miring sehingga bakteri dapat
memfermentasi karbohidrat,. Hal tersebut bisa terjadi karena bakteri E. coli
memiliki enzim betagalaktosidase dan sukrase yang dapat memecah laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa serta memecah sukrosa menjadi glukosa dan
fruktosa. Selain itu juga terbentuk gas namun negative H 2S karena tidak mampu
mendesulfurasi asam amino dan methion yang akan menghasilkan H2S.
- Sulfide, Indol, Motility (SIM)
Pada uji SIM, terlihat bahwa bakteri E. coli H3S karena tidak adanya
perubahan warna menjadi hitam pada bagian dasar Pada uji indol memberikan
hasil positif dimana terlihat berupa cincin merah, bakteri E.coli menghasilkan
enzim triptopanase sehingga mampu mengubah asam amino triptopan menjadi
senyawa indol. Pada uji motility, bakteri E. coli menghasilkan motilitas yang
positif, motilitas diketahui dari keruhnya media adanya penyebaran ke atas
( mirip pohon cemara terbalik ).

Methyl red- voges proskauer ( MR-VP)

a.

Uji MR
Hasilnya positif, terjadi perubahan warna menjadi merah setelah

ditambahkan methyl red. Artinya, bakteri ini mengahasilkan asam campuran

(metilen glikon) dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam medium
MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan pH sampai
5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metil ditambahkan pada biakan

11

tersebut dengan pH seredndah itu maka indikator tersebut menjkadi merah. Hal ini
menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran.
b. Uji VP
Hasilnya negatif, karena tidak terbentuk warna merah pada medium
setelah ditambahkan -napthol dan KOH, artinya hasil akhir fermentasi bakteri ini
bukan asetil metil karbinol (asetolin)
o Pewarnaan Gram
Pada pengecatan ini digunakan bakteri Escerhia coli, pengecatan ini juga
menggunakan 4 (empat) jenis larutan yaitu Kristal violet, sebagai cat utama,
larutan iodium sebagai pengintensifan, alcohol asam untuk pencucian dan safranin
sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Escerchia coli bersifat
gram negatif karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh
cat lawan yakni merah dari pewarna safranin. Hal ini sesuai dengan pendapat
Pelczar (2006) menyatakan bahwa bakteri gram negatif akan kehilangan zat
pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat
pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan
tampak berwarna merah. Dengan demikian hasil pengamatan dengan literatur
sama hasil warnanya yaitu berwarna merah. Escherichia coli termasuk dalam
famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang
fermentatif.

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Escherichia coli dapat diisolasi dan diidentifikasi dengan berbagai
metode seperti pengisolasian Escherichia coli pada media-media seperti
Nutrien Broth, SMAC, EMBA, pewarnaan gram, serta uji TSIA, SIM,

12

MRVP, citrat dan urea untuk dapat meningkatkan presentasi penemuaan

Escherichia coli, bukan bakteri jenis lainnya.
5.2 Saran Untuk Praktikum Selanjutnya
Pengadaan penuntun praktikum untuk praktikum selanjutnya baik
berupa hardcopy maupun softcopy untuk memudahkan praktikan dalam
menjalankan praktikum.

LAMPIRAN FOTO

Media Isolasi

13

Uji Biokimia

Pewarnaan Gram

14

DAFTAR PUSTAKA

Ewings, W.H, 1986 . Edward and Ewing . Identification of enterobacteriacea 4' h

Ed.Elsevier, New York
Karmana, O, 2008. Biologi. Grafindo Media Pratama : Bandung
Murni, D. 2014. Isolasi dan Identifikasi Escherichia Coli pada Hewan Coba.
Pelczar, M. J. And E. C. S. Chan. 1986. Elements of Mycrobiology.
New York : Mc grow-Hill Book Company.
Suardana. IW., dkk. 2014. Identifikasi Escherichia coli O157:H7 dari Feses Ayam
dan Uji Profil Hemolisisnya pada Media Agar Darah. Jurnal Keokteran
Hewan. UGM
Sutedjo, M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta.
http://elisa.ugm.ac.id/user/archive/download/37952/555eb1eb6dcac9eeb0e9f7155
3107a33. Diakses pada tanggal 11 November 2014, pukul 20:30 WITA.

15