Agradecimientos

Mi madre y padre:

Familia en general:

Amigos:

A Dios:

DEDICATORIA

A mis padres:

A mi Familia:

A mis amigos:

A Dios:

RESUMEN

Cuatro cepas de Beauveria bassiana fueron estudiadas para evaluar producción de blastoesporas en dos medios líquidos con fuente de nitrógeno limitado, con el fin de determinar una alternativa viable de producción de hongos entomopatogenos a través de cultivos sumergidos. Las cepas Bb2336, 2880, 6000 y 3993 (GHA), llevaron a fermentación en matraces de agitación en dos fases de producción (precultivo y cultivo), las cuales bajo condiciones de temperatura de 26° y rotación de 300RPM se evaluó su producción de C blastoesporas. La producción fue cuantificada después de 72hrs en ambas fases de producción. La producción de blastoesporas fue alta por la cepa Bb2336 en la fase de cultivo tanto para el medio de liquido de remojo de maíz como en el de casaminoacidos, con valores de 4.68 x 108 conidia/mL-1 y 1.28 x 109 conidia mL-1 respectivamente. La morfología encontrada se mantuvo constante, donde se observaron blastoesporas de forma globosa en ambos medios de producción. Todas las cepas mantuvieron una producción significativa en ambos medios de producción con una morfología sin cambios aparentes. La producción de blastoesporas en medios líquidos nos permitió determinar si existe una diferencia significativa entre la producción de las cuatro cepas en los medios líquidos limitados de nitrógeno.

ABSTRACT

Four

strains

of

Beauveria

bassiana

were

studied

to

evaluate

blastospores production in two liquid culture media with limited nitrogen, with the purpose of determining a viable alternative of production of fungus entomopatogenos through submerged cultivations. The strains Bb2336, 2880, 6000 and 3993 (GHA), they went to fermentation in shake flasks in two production phases (precultivation and cultivation), which under conditions of temperature of 26° and rotation of 300RPM was eval uated its blastoesporas C production. The production was quantified after 72hrs in both production phases. The blastoesporas production was high for the strain Bb2336 in the cultivation phase so much for the casaminoacidos media, with values of 4.68 x 108 conidia/mL-1 and 1.28 x 109 conidia mL-1 respectively. The morphology stayed constant, where blastoesporas in a spherical way was observed in both production means. All the strains maintained a significant production in both liquid media with morphology without apparent changes. The blastospores production in liquid media allowed us to determine if a significant difference exists among the production of the four strains in the limited liquid media of nitrogen.

TABLA DE CONTENIDO

Agradeciminetos……………………………………………………………………….2 Dedicatoria……………………………………………………………………………..3 Resumen……………………………………………………………………………….4 Abstract…………………………………………………………………………………5 Tabla de contenido……………………………………………………………………6 Lista de Graficas……………………………………………………………………….9 Lista de Figuras………………………………………………………………………10 Lista de Tablas……………………………………………………………………….11 1.- Introduccón………………………………………………………………………..12 Hipótesis………………………………………………………………………………14 Objetivo general………………………………………………………………………14 Objetivo particular……………………………………………………………………14 2.-Antecedentes………………………………………………………………………15 2.1- Limitantes del uso de agentes químicos para control de plagas …..…17 2.2 – Control Biológico….……………………………………………………….17 2.3.- Hongos entomopatogenos………..…………………………...………….19

2.4.- Mecanismo de infección de los hongos Hyphomycetes……….…....…21 2.5.- Beauveria bassiana (Bals) Vullí……………..….…….…….…………...26 2.6.- Métodos para producción de bioinsecticida…………………....……….27 2.6.1- Medios líquidos para producción de bioinsecticidas………….......28 2.6.2- Formulaciones Desarrolladas……..…………………………………31 3.- Metodología ................................................................................................ 32 3.1.- Activación de las cepas……………………………………………………32 3.2.- Inoculo………………………………………………………………………32 3.3.- Medio de cultivo…………………………………………………………….36 3.3.1.- Líquido de remojo de maíz……………...……………….……….…35 3.3.2.- Casaminoacidos………………………..………………….…..……..35 3.4.- Fase de crecimiento de precultivo…………..………………………..….36 3.5.- Fase de crecimiento de cultivo……………………………………………37 3.6.- Morfología en las fases de crecimiento…..……………………………..xx 3.6.- Filtración y secado…………………………………………………..……..37 3.7.- Viabilidad……………………………………………………………………xx 3.8.- Diseño experimental……………………………………………………….39

4.- Resultados .................................................................................................. 40 4.1.- Producción en el medio líquido a base de líquido de remojo de maíz (LRM)………………………………………………………………………………40 4.2.- Producción en el medio líquido a base de Casaminoacidos……...….46 4.3.- Morfología de la espora en las fases de crecimiento…………………. 4.4.- Viabilidad………………………………………………………………….. 5.- Discusiones ................................................................................................. 52 5.1.- Producción en las fases de crecimiento…………………………………. 5.2.- Morfología del producto de las fermentaciones………………………… 5.3.- Viabilidad del formulado…………………………………………………… 6.- Conclusiones ............................................................................................... 53 Bibliografía…………………………………………………………………………….54

LISTA DE GRAFICAS

Grafica 1.- Rendimiento en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en el medio a base de LRM en la fase de crecimiento de precultivo.

Grafica 2.- Rendimiento en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en el medio a base de LRM en la fase de crecimiento de cultivo.

Grafica 3.- Comparación de la producción de blastoesporas de las diferentes cepas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de LRM.

Grafica 4.- Rendimiento en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en el medio a base de Casaminoacidos en la fase de crecimiento de precultivo.

Grafica 5.- Rendimiento en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en el medio a base de Casaminoacidos en la fase de crecimiento de cultivo.

Grafica 6.- Comparación de la producción de blastoesporas de las diferentes cepas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de Casaminoacidos.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.- Ciclo de vida de Beauveria bassiana

Figura 2.- Placa de cultivo de Beauveria bassiana, su aspecto es de color blanco, colonia elevada y produce pigmentación debajo de la placa cuando lleva un tiempo prolongado de crecimiento.

Figura 3.- Esquema de la morfología de Beauveria bassiana, desde su micelio (I), cuerpo hifal (II) y conidias (III), Alvez 1986.

Figura 4. - Cuadrantes y cámara de Neubauer que se utilizaron para el conteo de esporas y determinar la concentración de blastoesporas en las fermentaciones.

Figura 5.- Se observa en un microscopio compuesto al 40x, una blastoespora de Beauveria bassiana con su tubo germinativo en extensión en el

centro de la imagen.

Figura 6.- Población de conidias sumergidas de Beauveria bassiana en la fase de crecimiento de precultivo en el medio a base de líquido de remojo de maíz (40x).

Figura 7.- Población de blastoesporas de Beauveria bassiana en la fase de crecimiento de cultivo en el medio a base de líquido de remojo de maíz (40x).

Figura 8.- Población de conidias sumergidas de Beauveria bassiana en la fase de crecimiento de precultivo en el medio a base de Casaminoacidos (40x).

Figura 9.- Población de blastoesporas de Beauveria bassiana en la fase de crecimiento de cultivo en el medio a base de Casaminoacidos (40x).

LISTA DE TABLAS

Tabla 1.- Comparación de medias en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de líquido de remojo de maíz (LRM).

Tabla 2.- Comparación de medias entre las fases de crecimiento en el medio a base de líquido de remojo de maíz (LRM) para cada una de las cepas de Beauveria bassiana.

Tabla 3.- Comparación de medias en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de Casaminoacidos.

Tabla 4.- Comparación de medias en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de Casaminoacidos.

Tabla 5.- Porcentajes de germinación de blastoesporas inicial de Beauveria bassiana, a las 24 h de secado de la muestra formulada del medio a base de líquido de remojo de maíz.

1.- INTRODUCCION

Diversos eventos durante las pasadas décadas han incrementado los esfuerzos en el desarrollo de biopesticidas como un método de protección para los cultivos. El creciente interés de la población en general a cerca del riesgo que representa para el ambiente el uso de pesticidas químicos, ha permitido el desarrollo de alternativas para formular estrategias de control de plagas de cultivos. Esto resulta en el desarrollo de tecnología para utilizar virus, bacterias, protozoarios y hongos para el control biológico de plagas. Además, el incremento del costo del petróleo, el cual forma parte básica para el desarrollo de pesticidas, ha permitido que económicamente los biopesticidas sean viables (Soper and Ward, 1981).

El uso de agentes microbiológicos para el control de insectos plaga se ha convertido en una práctica común en muchos países. Sin embargo, continua siendo un problema la falta de formulaciones adecuadas para la mayoría de los agentes microbiológicos para control de plagas. Aunque se ha progresado en la formulación de Bacillus thuringiensis y muchos entomopatogenos virales. Por otra parte, los hongos permanecen en espera del desarrollo de tecnologías adecuadas para su formulación (Pereira and Roberts, 1990).

Los hongos entomopatogenos indican positivamente que son de un gran valor para el control de insectos plaga, lo cual desecha la duda de que los hongos tienen una alta dependencia de las condiciones ambientales, especialmente de la humedad, para ser manipulados para su uso como control biológico. Evidencia acumulada durante los años 70´s demuestran que la

humedad, la cual aunque es importante en la biología de los hongos que infectan a los insectos plaga, no es siempre una limitante (Soper and Ward, 1981).

El gran impacto de los hongos para el control de insectos plaga se alcanzara cuando aquellos entomopatogenos que sea favorable la producción de esporas a larga escala y por lo tanto su comercialización. Muchos hongos pueden ser cultivados en medios artificiales y son, por lo tanto, candidatos potenciales para el desarrollo de micopesticidas. Beauveria bassiana, Verticillium lecanii, Metarhizium anisopliae and Hirsutilla thompsonii han alcanzado la producción piloto y están actualmente siendo producidos comercialmente. Los principios generales de la fermentación, y más

específicamente aquellos problemas relacionados con la producción in vitro de los hongos, son quizás de importancia para quienes contemplan desarrollar una investigación en producción de estos entomopatogenos (Soper and Ward, 1981).

HIPOTESIS

− Es posible encontrar que una de las cuatro cepas de B. bassiana evaluadas muestre altos rendimientos en producción de blastoesporas en alguno de los dos medios líquidos a probar.

OBJETIVO GENERAL

− Evaluar producción de blastoesporas de cuatro cepas de B. bassiana en dos medios líquidos.

OBJETIVO PARTICULAR

− Evaluar producción de blastoesporas en precultivo y cultivo en los medios líquidos a base de casamino ácidos y glucosa.

− Evaluar producción de blastoesporas en precultivo y cultivo en un medio de cultivo a base de líquido remojo de maíz y glucosa.

− Determinar diferencias entre los dos medios a probar en producción de blastoesporas.

− Determinar si existe alguna diferencia en la producción en fermentación con un inoculo de conidias o de blastoesporas.

2.- ANTECEDENTES

2.1.- Limitantes del uso de agentes químicos para el control de plagas

El método de lucha más generalizado, utilizado para su control, es el químico, que perturba el equilibrio entre el insecto y sus enemigos naturales y hace que adquiera, en cada nueva generación, mayor resistencia a los insecticidas, lo que hace necesario que realicen un mayor numero de aplicaciones y elevar la concentración de la dosis. Además, el uso de estos potentes productos, además de destruir la mayoría de la entomofauna útil y benéfica, representa para los animales salvajes, domésticos, aves, peces y aún para el mismo hombre, un peligro mortal (Landazabal et al., 1973). Bien es sabido que el uso exclusivo de sustancias químicas presenta ciertos inconvenientes como son la selección de nuevas resistencias a los insecticidas en las poblaciones de plagas, el resurgimiento de las poblaciones tratadas, residuos, riesgos y complicaciones legales, destrucción de especies

beneficiosas, costo de fumigantes, en equipo, mano de obra y material (Badii and Abreu, 2006).

2.2. - Control Biológico

El control biológico fue concebido a inicios el siglo XIX cuando algunos naturistas de diferentes países reseñaron el importante papel de los organismos entomófagos en la naturaleza. Con el empleo de la lucha o control

biológico se intenta reestablecer el perturbado equilibrio biológico, mediante la utilización de organismos vivos o sus metabolitos, para eliminar o reducir los daños causados por organismos perjudiciales (Badii and Abreu, 2006).

La evolución natural de los sistemas de producción agraria han derivado en los últimos años hacia métodos de control de plagas y enfermedades más racionales y respetuosos con el medio ambiente y de hecho amigable con la filosofía de desarrollo sustentable y la noción de la conservación de recursos, la biodiversidad y la ética ambiental. Además se ha usado controles biológicos para las malezas, vertebrados, arañas rojas, etc. Estás nuevas técnicas han derivado hacia el nuevo concepto y desarrollo de la producción integrada (Badii and Abreu, 2006).

También se puede hablar de la lucha biológica o lucha natural, que es la manipulación deliberada por el hombre de parasitoides, depredadores y patógenos de las especies plaga, dentro del agrosistema, diseñada o proyectada para reducir la población de plaga a un nivel que no produzca daños económicamente importantes (Badii and Abreu, 2006).

El término parasitoide se refiere a los insectos que parasitan a otros insectos, artrópodos o móluscos, es decir que los toman como hospedantes para vivir a expensa suya durante sus estadios larvarios, pues en su vida adulta se alimentan de néctar, residuos vegetales o animales y viven libremente (Badii and Abreu, 2006).

Dentro de los principales grupos de insectos tenemos varias especies de trichogramma parasitando huevos de Lepidóptera, Braconidos parasitando áfidos y larvas, moscas Tachinidaes parasitando larvas de Diatraea saccharalis, etc. Las moscas blancas o palomillas (Trialeurodes vaporariorum y Bemicia tabaco) causantes de severos en diversos cultivos ya sea por el daño directo o por transmisión de virus, son controlados por Encarsia Formosa (Hymenoptera: Aphelinidae) que prefiero los estadios ninfales de las plagas. Al parasitoide de pupas de dípteros Pachycrepoideus vinimmiae (Hymenoptera: Peteromalidea) se le considera como una buena opción para el control de moscas de la frutas como Ceratitis y Anastrepha en cítricos y Dasiops en maracuyá. Para tener éxito en el control de la moscas de la frutas se debe de liberar 5.000 a 10.000 parasitoides por hectárea (Badii and Abreu, 2006).

Los insectos y ácaros depredadores de especies plaga suelen alimentarse de varias presas a lo largo de su vida. Las presas suelen ser de menor talla que el depredador. Las larvas y adultos son móviles y pueden ser ambos depredadores. Los depredadores realizan un control biológico natural, necesitan consumir mas de una presa para completar su ciclo de vida, generalmente tienen un tamaño mayor que el de la presa y son fundamentalmente oligófagos o polífagos. Algunos depredadores se alimentan indistintamente de insectos dañinos y benéficos. Por ejemplo Rodalia cardinales es un coccinélido que controla la Icerya purchasi, una plaga de los cítricos; otros coccinélidos como Cycloneda sanguinea e Hippodamia convergens controlan áfidos en diferentes cultivos. Los ácaros fitófagos pueden controlarse mediante liberaciones periódicas de predadores que consumen

huevos, larvas, ninfas y adultos de ácaros dañinos. Un productor excelente es Phytoseiulus persimilis (Acari: Phytoseiidae) ya que controla el ácaro Tetranychus en flores, tomate y cucurbitáceas entre otros cultivos. Las moscas caseras de establo y otras similares se controlan cuando se hacen liberaciones inundativas de Spalangia cameroni (Hymenóptera: Pteromalidae) una avispita que ataca pupas (Badii and Abreu, 2006).

Dentro de los agentes entomopatógenos se incluyen bacterias, hongos, virus, nemátodos y protozoos fundamentalmente. Generalmente se

caracterizan por su escasa toxicidad sobre otros organismos del ambiente, por su aptitud por ser tratados industrialmente, es decir, se cultivan, formulan, empaquetan, almacenan y se comercializan como un insecticida convencional. Estos insecticidas biológicos penetran en el insecto plaga por ingestión, y también por contacto en el caso de los hongos (Badii and Abreu, 2006).

El uso de agentes biológicos, se esta volviendo común en muchos países, para combatir insectos plagas. Sin embargo, la falta de formulaciones adecuadas para muchos agentes entomopatogenos sigue siendo un

inconveniente. Aunque haya un progreso en el uso de Bacillus thuringiensis y en muchos agentes virales para combatir los insectos plaga, los hongos continúan esperando por un serio esfuerzo tecnológico para su formulación. La producción y formulación de hongos entomopatogenos, y específicamente de Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana, han sido sujetos de numerosos estudios referente a la efectividad que tienen en la protección de los cultivos en contra de los insectos plagas (Pereira and Roberts, 1990).

2.3.- Hongos entomopatogenos

Mas de 700 especies de hongos de aproximadamente 90 géneros son patógenas para los insectos. Estos hongos varían ampliamente en la facilidad de producción masiva, rango de hospedero, potencial epizoótico, temperatura y humedad optima, lo cual les provee un amplio espectro de organismos aptos para su uso como agentes de control (Maniania, 1991). Lo que hace muy seguro el uso de hongos entomopatogenos es su unión directa con la fisiología y ecología del hospedero. El rango fisiológico del hospedero puede ser definido bajo condiciones de laboratorio las cuales favorecen al entomopatogeno (Roy et al., 2002). Durante los últimos 20 años, los hongos que han sido objeto de fuerte investigación pertenecen a las clases Zygomycetes e Hyphomycetes, incluyendo los países tropicales, al grado de que los hongos Aschersonia aleyrodis, Beauveria bassiana, Hirsutilla thompsonii, Metarhizium anisopliae y Verticillium lecanii, han sido producidos a gran escala y formulados como micoinsecticidas (Maniania, 1991).

Beauveria bassiana, usada para el control de plagas de coleópteros, como los gorgojos que atacan a la batata (camote) y al plátano común; Verticillium lecanii, para controlar la mosca blanca (Bemisia tabaci), un vector de enfermedades virales en tabaco, tomate, fríjol y otros cultivos; Metarhizium anisopliae , para varias plagas de insectos; y Trichoderma spp, usado como antagonista de los patógenos del suelo en plántulas de tabaco. Entre los bioplaguicidas en proceso de desarrollo a gran escala están Nomuraea rileyei e Hirsutella thonsomii (Rosset and Moore, 1998).

Fargues et al. (2001) menciona que el hongo entomopatogeno Hyphomycete Metarhizium flavoviride esta siendo investigado especialmente para el biocontrol de la plaga de la langosta Schistocerca gregaria y Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae).

Muchas cepas que han sido aisladas de Paecilomyces fumosoroseus y Beauveria bassiana resultan ser agresivamente patógenos para muchas especies de insectos incluyendo especies como Bemisia tabaci y B. argentifolii (Jackson et al., 1997).

Beauveria bassiana es un hongo ampliamente distribuido en la naturaleza y que infecta alrededor de 70 especies de insectos. Este es además el hongo más comúnmente aislado de insectos muertos y moribundos en la naturaleza. Debido a su aplicación potencial contra una gran variedad de insectos, existe un considerable interés en la producción a gran escala de este hongo para la aplicación en campo (Thomas et al., 1986).

2.4.- Mecanismo de infección de los hongos Hyphomycetes

Los hongos Hyphomycetes entomopatágenos como B. bassiana, M. anisopliae, N. rileyi, P. fumosoroseus y F. javanicus presentan un ciclo biológico de dos etapas: parasitaria y saprofitica. Las conidias germinan en la superficie de la cutícula de insecto hospedero emitiendo un tubo germinativo, el cual penetra al insecto mediante dos mecanismos uno físico y otro enzimático

(Samsinakova and Misikova, 1971; Sansinakova and Misikova, 1973; Pekrul and Grula, 1979; Facchinci and Monteiro de Barros, 1991; El-Sayed et al., 1989). Se han descrito formas del tipo apresorial que facilitan el proceso de penetración en M. anisopliae, E. bassiana, N. rileyi y Paecilomyces (Madelin et al., 1967; Zacharuk, 1970; Vey and Fargues, 1977).

Los hongos se caracterizan por producir un complejo de enzimas extracelulares, que les permite degradar la cutícula de los insectos, las más importantes son de los grupos de las lipasas, proteasas, quitinasas y amilasas (Aarnio and Agathos, 1989; El-Sayed et al., 1989; St Legar et al., 1989; Bidochka and Khachatourians, 1992).

El insecto reacciona de manera no especifica a todo ataque en la cutícula mediante un proceso de melanización provocado por una actividad fenoloxidásica (Aoki and Yanase, 1970). Se tiene conocimiento que diversas sustancias de los hongos parásitos de insectos, tales como glúcidos y glicoproteínas, pueden activar la feniloxidasa del insecto (Unestam and Soderhall, 1977).

Si la cepa del hongo supera este mecanismo de defensa del insecto y logra llegar al homocele se divide en cuerpos hifales (blastosporas); sin embargo, se ve atacado por otro mecanismo de defensa por parte del insecto, del tipo hemocítico. Los granulocitos se concentran y envuelven a los cuerpos hifales formando un pseudotejido llamado granuloma (Vey and Fargues, 1977)

Por parte los hongos, desarrollan un mecanismo que tiende a frenar la reacción hemocítica, éste consiste en la producción de substancias tóxicas o micotóxinas de diferente peso molecular, y ocasionan, inclusive, la muerte al insecto antes de que éste haya sido enteramente colonizado por el hongo (Kucera and Samsinakova, 1968), eventualmente coloreados por una pigmentación antibacteriana secretada por el hongo, como la oosporina, bassianina o tenellinas, por parte de Beauveria. Finalmente, el micelio emerge del tegumento y si la humedad ambiental es suficiente, esporula en la superficie del cadáver (Figura 1); si no, el hongo puede permanecer en forma dura y cesante hasta que se presentan las condiciones adecuadas para su esporulación y completar el ciclo de infección e iniciar otro (Ferron, 1975).

Figura 1.- Ciclo de vida de Beauveria bassiana

2.5.- Beauveria bassiana (Bals) Vullí

El género Beauveria está compuesto por varias especies: B. bassiana, B. brongniartii ó B. tenella, B. amorpha, B. velata, sin embargo las más frecuentemente estudiadas la especie que ha recibido mayor atención para su desarrollo es Beauveria bassiana (Balsamo) Vuill. (Bartlett and Jaronski, 1988), este hongo es la causa de la enfermedad muscarinica en insectos, ha sido utilizado para el control de una gran variedad de plagas para los cultivo (Bidochka et al., 1987). B. bassiana pertenece a la división de los

Deuteromicetes, él cual posee la característica de tener un amplio rango de insectos hospederos (Bidochka, 1990).

El género se caracteriza por presentar un micelio blanco (Figura 2) y microscópicamente presenta conidióforos sencillos, irregularmente agrupados o en grupos verticilados, en algunas especies hinchados en la base y adelgazándose hacia la porción que sostiene la conidia, la cual se presenta en forma de zig-zag, después de que varias conidias se producen; las conidias son hialinas, redondeadas a ovoides y unicelulares B. bassiana posee conidias de globosas a subglobosas (2-3 x 2.0-2.5 µm) y las estructuras conidióforas forman densos grupos. Su crecimiento óptimo se da a temperatura de 25° C (Figura 3) (Mac Leod, 1954; Hallsworth, 1999).

Figura 2.- Placa de cultivo de Beauveria bassiana, su aspecto es de color blanco, colonia elevada y produce pigmentación debajo de la placa cuando lleva un tiempo prolongado de crecimiento.

Figura 3.- Esquema de la morfología de Beauveria bassiana, desde su micelio (I), cuerpo hifal (II) y conidias (III), Alvez 1986.

Este hongo puede producir tres tipos de esporas dependiendo de su forma de producción: conidias aéreas (cultivo sólido), conidias sumergidas y blastoesporas (cultivo líquido), las cuales varían en su interacción hidrofóbica, viabilidad, virulencia y tamaño. Algunos estudios de germinación entre los diferentes tipos de esporas producidas por Beauveria bassiana han determinado que las blastoesporas germinan a las 12 horas, las conidias sumergidas a las 16 horas, y las conidias aéreas a las 24 horas (Thomas et al., 1987).

2.6.- Métodos para producción de bioinsecticidas

Existen dos métodos principales para la producción del inoculo: sólida (semisólida) y fermentación líquida. Las fermentaciones sólidas se utilizan de forma común en los laboratorios, muchos hongos y bacterias son cultivados de forma sencilla en placas petri. Esporas, células y otros propágulos son sembrados y formulados de forma adicional. En la fermentación sólida también se utilizan granos y paja para la cosechar agentes microbiológicos, y de esta forma después el producto del crecimiento en dicho substratos son utilizados para asperjarse con todo y substrato en el área de interés, por lo cual representa en ciertas ocasiones un inconveniente para las maquinas que se utilizan en la agricultura. Además este tipo de fermentación requiere de espacios grandes para su desarrollo en gran escala, convirtiéndolo en un obstáculo para su uso comercial a través de este tipo de formulación (Fravel.and Lewis, 1992).

La fermentación líquida durante los últimos treinta años ha sido desarrollada para la industria de producción de antibióticos, enzimas, ácidos orgánicos y otros productos microbianos. Actualmente esta es reconocida como la manera más sencilla para la industria de la producción de agentes biológicos usados para el control de plagas. De hecho, antagonistas de hierbas e insectos están siendo desarrollados a través de la fermentación líquida evidenciando que gran parte de nuestros agentes biológicos disponibles crecen muy bien en la fermentación líquida (Fravel and Lewis, 1992).

2.6.1.- Medios líquidos para la producción de bioinsecticidas

La selección del medio es particularmente importante en la producción de biopesticidas y en general. Así que se considera, que a mayor rapidez en la producción del biopesticidas permite que sea factible su desarrollo y contribuye a reducir la posibilidad de contaminación del producto (Fravel and Lewis, 1992).

Básicamente, un medio debe de incluir una fuente de carbono, nitrógeno, sales inorgánicas y posiblemente un factor de crecimiento. La proporción de Carbono/Nitrógeno (C/N) es de considerable importancia en el balance del medio. De otra manera, el cambio de pH se llevaría acabo de manera abrupta durante la fermentación. Durante el desarrollo inicial, muchas combinaciones de ingredientes pueden ser monitoreados en el medio sólido, a través de las mediciones del crecimiento de la colonia y la producción de

esporas. Estos detalles prometedores pueden ser refinados en el medio liquido (Soper and Ward, 1981).

Para el desarrollo de hongos entomopatogenos es necesario generar información sobre rendimiento y toxicidad de estos sobre los insectos. Se realizó un estudio (Solis, 2002) para seleccionar el impulsor más eficiente en la producción de blastosporas de B. bassiana encontrando que el uso por separado de impulsores de flujo radial y axial (Rushton-Maxflo) alcanzaron un rendimiento máximo de 4.3 x 108 conidia mL-1. En otro estudio similar Jackson et al. (2003), reportaron un rendimiento de blastosporas de P. fumosoroseus de 7.9 x 108 conidia mL-1 en fermentador portátil, encontrando un alto potencial para la producción de blastosporas, con muy bajo nivel de contaminación bacterial (Jackson, 2003).

Beauveria bassiana (Balsamo) Vulli. (Deuteromycotina), agente causal de micosis en ciertos insectos, el cual se ha utilizado para el control de pestes de un amplio numero de cultivos. En un estudio anterior se dio una descripción detallada de este crecimiento en superficies sólidas y en insectos: en medios sólidos se forman esporas globosas (las cuales se dispersan a través del viento); las esporas en forma elipsoidal se producen también en la superficie de insectos infectados. Además se observo que en los cultivos líquidos, B. bassiana solo formaba conidias en forma elipsoides (Bidochka, 1987).

Para el uso practico de los hongos entomopatogenos como agentes biológico de control, es posible desarrollar una alta cantidad de propagulos, los cuales son patógenos contra insectos plagas. Se requiere de un amplio estudio

además de la composición y condiciones del medio, para poder evitar que la cantidad y la calidad del propágalo se vea afectado como producto final (Fragues, 2001).

Cuando el medio de cultivo es complejo o definido, como en el caso de Beauveria bassiana produce blastoesporas, el producto obtenido del material sumergido posee ventajas sobre la producción de conidias en medio semisólido. La producción de bioinsecticidas en medios líquidos puede ser llevado acabo de forma masiva en un volumen relativamente pequeño bajo condiciones definidas (Alvés et al., 1987).

2.6.2.- Formulaciones desarrolladas

Beauveria bassiana, fue registrada en 1999 como “Mycotrol” por la agencia de Protección Ambiental (EPA, por sus siglas en inglés) en Estados Unidos, que es utilizado en campo para el control de saltamontes, mosca blanca, thrips, áfidos y muchas otras plagas de insectos. Este producto es estable por más de 12 meses almacenado a 25° C. Exis ten otros dos formulados a partir de B. bassiana comercializados como “BotanicGard” que es recomendado para el uso en casas de cultivos y “Mycotrol O” que contiene ingredientes en la formulación que permite su uso por agricultores en Estados Unidos (Shah and Pell, 2003).

El desarrollo de hongos entomophthorales como micoinsecticidas ha tenido obstáculos principalmente relacionados a la producción masiva y la estabilidad de propágulos para el almacenamiento y formulación (Gray and Markham, 1997). Investigación limitada en varias especies de

Entomophthorales pueden haber superado algunos de estos problemas (Pell et al., 1998) pero hay barreras significativas que involucran la producción a gran escala así como la formulación apropiada y la tecnología de aplicación. Estos problemas requerirían significante inversión financiera en investigación y desarrollo que necesite unirse fuertemente con la identificación de mercados apropiados para cualquier producto eventual basado en un hongo

entomopatogeno (Thomas et al., 1987).

3.- METODOLOGIA

3.1- Activación de las cepas

Se utilizaron cuatro cepas de Beauveria bassiana, las cuales fueron: Bb2336, y Bb2880 (aislados a partir de Schizaphis graminum, en Idaho, U.S.), Bb6000 y Bb3993 (cepa GHA localizada en Murcia, España), las cepas crioconservadas en glicerol al 10% A -60° fueron puestas a atemperar por C, 30-60 minutos a temperatura ambiente (26°C). Poster iormente se tomaron 100 µL y se colocaron sobre placas petri con Agar papa dextrosa, (PDA, Sigma). La gota fue esparcida por toda la placa utilizando una varilla de vidrio para garantizar un crecimiento uniforme en toda la superficie de la placa. Se usaron cinco placas por cada cepa. Posteriormente las placas se llevaron a incubación por un periodo de 14 a 21 días a una temperatura de 26° C.

3.2.- Inoculo

A partir de las placas petri donde se activaron las cepas de B. bassiana, con el uso de una micropipeta se añadieron 1000µl de agua esterilizada sobre la superficie para el raspado con asa bacteriológica obteniendo una suspensión a ser colectada en tubo de ensaye, repitiendo la operación hasta en 4 placas de la misma cepa del hongo, mezclando todas las suspensiones en el mismo tubo de ensaye, esto para el caso del inoculo obtenido a partir de un sustrato sólido, mientras que en a partir del sustrato líquido el inoculo es líquido y se

obtuvo a partir de los matraces de fermentación en la fase de crecimiento de precultivo. Posteriormente se realizan diluciones hasta 10-4, de esta dilución se toman 0,1ml de muestra para realizar conteo en cámara de Neubauer (Figura 4), el resultado del conteo se ajusto a la concentración de 1 x 106 esporas/ml con la formula C1V1=C2V2, el valor que resulta de la formula es el volumen que se agrega del tubo de suspensión para ajustar la concertación en un matraz con 30ml de agua destilada estéril (1 x 106 esporas/ml). A cada matraz se le agrego 10ml de inoculo. Cabe mencionar que el todo el material fue esterilizado por 30 minutos a temperatura de 250-259° a una pre sión de 1-1.5kg/cm2. C

Figura 4. - Cuadrantes (A) y cámara de Neubauer (B) que se utilizaron para el conteo y determinación de la concentración de blastoesporas en las fermentaciones.

A

B

3.3.- Medios de cultivo

3.3.1.-Medio a base de líquido de remojo de maíz

Todas las fermentaciones se hicieron por triplicado por cada cepa de Beauveria bassiana en matraces de agitación de 250ml. La composición del medio líquido de fermentación a base de liquido de remojo de maíz (LRM) modificado (Thomas et al., 1987), para un matraz con una cantidad final fue de 100ml de solución, 2g. de líquido de remojo de maíz (LRM, Sigma), 40ml de Glucosa y 40ml de Sacarosa, en precultivo y cultivo respectivamente, 44ml de una mezcla de sales, las cuales fueron Nitrato de potasio (KNO3 10g/L), Fosfato de potasio (KH2PO4 5g/L), Sulfato de magnesio (MgSO4 2g/L), Cloruro de calcio (CaCl2.2 H2O 0.89g/L) y Sulfato ferroso (FeSO4.7 H2O 12mg/L), y 2ml de cada uno de los metales, los cuales fueron Cloruro de cobalto (COCl2.6 H2O 3.39g/L), Sulfato manganoso (MnSO4.H2O 1.56g/L) y Sulfato de zinc (ZnSO4.7 H2O 1.4g/L).

3.3.2.-Medio a base de Casaminoacidos

El medio liquido para la fermentación de Casaminoacidos (Mark A. Jackson et al., 2000), para un matraz con una solución total de 100ml., estuvo compuesto por un medio basal de 1.5 y 2.5g. casamino ácidos, en precultivo y cultivo respectivamente, y 40ml de sales, las cuales fueron Nitrato de potasio (KNO3 10g/L), Fosfato de potasio (KH2PO4 5g/L), Sulfato de magnesio (MgSO4

2g/L), Cloruro de calcio (CaCl2.2 H2O 0.89g/L) y Sulfato ferroso (FeSO4.7 H2O 12mg/L), 40ml de Glucosa en precultivo y en cultivo (80g/L), y 2ml de cada uno de los metales, los cuales son Cloruro de cobalto (CoCl2.6 H2O 3.39g/L), Sulfato manganoso (MnSO4.H2O 1.56g/L) y Sulfato de zinc (ZnSO4.7 H2O 1.4g/L).

3.4.- Fase de crecimiento de precultivo

En la fase de precultivo en ambos medios líquidos de producción el inoculo se obtuvo a partir de placas petri, las cuales fueron raspadas para obtener en un matraz 30ml de inoculo ajustados a una concentración de 1 x 106 esporas/ml, de los cuales solo se coloco 10ml de inoculo a cada matraz con 90ml de medio basal. Todas las fermentaciones se hicieron por triplicado por cada cepa de Beauveria bassiana en matraces de agitación de 250ml. En los medios la fuente de carbono y de nitrógeno fueron las siguientes: Casaminoacidos (Casamino ácidos y glucosa) y LRM (Liquido remojo de maíz, glucosa y sacarosa). Se colocaron en un agitador lab-line a 300RPM con una temperatura de 26° durante un periodo de 72hrs. (3 días). El conteo de C esporas se realizo al tercer día, en una cámara Neubauer, y un microscopio compuesto a 40x.

3.5.- Fase de crecimiento de cultivo

En la fase de cultivo en ambos medios líquidos de producción el inoculo se obtuvo a partir del matraz con el mejor rendimiento en la fase de crecimiento de precultivo, a partir del cual se tomo una muestra para ajustar en un matraz 30ml de inoculo a una concentración de 1 x 106 esporas/ml, posteriormente vertió 10ml de inoculo a cada matraz de agitación con 90ml de medio basal. Todas las fermentaciones se hicieron por triplicado por cada cepa de Beauveria bassiana en matraces de agitación de 250ml. En los medios la fuente de carbono y de nitrógeno fueron las siguientes: Casaminoacidos (Casamino ácidos y glucosa) y LRM (Liquido remojo de maíz, glucosa y sacarosa). Se colocaron en un agitador lab-line a 300RPM con una temperatura de 26° C durante un periodo de 72hrs. (3 días). El conteo de esporas se realizo al tercer día, en una cámara Neubauer, y un microscopio compuesto Labomed a 40x, los valores se fueron promediados y considerados como la producción de cada cepa y medio.

3.6.- Morfología en las fases de crecimiento

Durante

la

cuantificación

para

determinar

la

concentración

de

blastoesporas en cada una de las fases de crecimiento, se llevo acabo el monitoreo del tipo de espora presente en la población. Después del periodo de fermentación de 72 h, se tomo una muestra de cada uno de los matraces de agitación y se colocó en un portaobjetos y un cubreobjetos por encima de la

muestra, se llevo a observación bajo un microscopio compuesto Labomed a 40x, con un contador de células se cuantifico el tipo de esporas diferenciando entre una conidia típica y una blastoespora. Este procedimiento se llevo acabo en las dos fases de crecimiento y en los dos medios líquidos.

3.6.- Filtración y secado

Después del tiempo de fermentación y conteo de blastoesporas, el cultivo liquido de ambos medios (Casaminoacidos y LRM), se filtraron y secaron. Para eliminar el exceso de micelio, se utilizo un embudo de porcelana y un trozo de tela tipo gasa, y se hizo pasar el líquido del producto de la fermentación, además con la ayuda de una bomba de vacío conectada a un matraz kitasato Pyrex de 1000ml, el proceso se realizo más rápido. Este proceso se llevo acabo en ambas fases de la producción (precultivo y cultivo).

Con los mililitros obtenidos del filtrado se ajusto la concentración de blastoesporas a 1 x 109 blastoesporas/g de soporte inerte (Tierra de diatomeas, sigma) utilizando la siguiente formula: (concentración de esporas) (mililitros del filtrado) / 1 x 109 blastoesporas/g, el resultado representa la cantidad en gramos que se requiere de tierra de diatomeas (soporte inerte) para obtener la concentración de esporas que se desea. Con el mismo sistema de filtrado, solo que con un filtro Watman No. 1, esto para contener la mayor cantidad de esporas sobre el papel y el soporte inerte. Las muestras que se obtuvieron después del filtrado, se llevaron a secado continuo a condiciones de humedad

relativa de 60% y a temperatura constante de 26° p or 24hrs, dentro de una C cámara de secado Drykeeper Sanplatec corp.

Pasadas las 24hrs de secado se determino el porcentaje de humedad de cada una de las muestras, esto mediante la formula de, %HR= peso inicial – peso final/ peso inicial por 100, el formulado se llevo a una humedad relativa menor de 10%. Las muestras recuperadas se almacenaron al vacío en bolsas de plástico, utilizando una empacadora al vació Tor-rey.

3.7.- Viabilidad del formulado

Para determinar el porcentaje de germinación del formulado se coloco un gramo de cada muestra formulada en 50ml de caldo Sabouraud en matraces de agitación de 250ml, se agitó a 300RPM a 26°C. Se realizaron solo pruebas de germinación inicial, con el fin de determinar la viabilidad de las esporas obtenidas (Figura 5).

3.7.- Diseño experimental

El experimento fue planificado con 3 repeticiones en las cuatro fermentaciones para cada una de las cepas de Beauveria bassiana, todos los valores se sometieron a un análisis de varianza estadístico de ANOVA de un factor, con un intervalo de confianza de 95% (P= 0.05).

Figura 5.- Se observa en un microscopio compuesto al 40x, una blastoespora de Beauveria bassiana con su tubo germinativo en extensión en el centro de la imagen.

4. - RESULTADOS

4.1.- Producción en el medio líquido a base de líquido de remojo de maíz

Los datos en promedio de la producción de esporas en la fermentación en el medio a base de remojo de maíz (LRM) para las diferentes cepas de Beauveria bassiana en la fase de crecimiento de precultivo se dieron de la siguiente manera: GHA 2.24 x 108 blastoesporas/ml, Bb2336 2.93 x 108 blastoesporas/ml, Bb6000 4.38 x 108 blastoesporas/ml y Bb2880 2.90 x 108 blastoesporas/ml (Grafica 1 y 3). Mientras tanto en la fase de crecimiento de cultivo en la fermentación liquida los valores en promedio se dieron de la siguiente manera: GHA 2.76 x 108 blastoesporas/ml, Bb2336 4.68 x 108 blastoesporas/ml, Bb6000 2.23 x 108 blastoesporas/ml y Bb2880 2.54 x 108 blastoesporas/ml (Grafica 2 y 3). En el análisis estadístico se encontró que los grupos se mantuvieron homogéneos al efectuar la comparación de medias entre las cepas en las fases de crecimiento de precultivo (f= 1.59 y P= 0.205) y cultivo (f= 2.32 y P= 0.089), esto en base al estudio de análisis de varianza (ANOVA) de un solo factor con un intervalo de confianza P= 0.05 (Tabla 1).

1010

Produccion de blastoesporas (Desvest ±)

109

108

107 BbGHA Bb2336 Bb6000 Bb2880

Cepas

Figura1.- Rendimiento en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en el medio a base de LRM en la fase de crecimiento de precultivo.

1010

Produccion de blastoesporas (Desvest ±)

109

108

107 BbGHA Bb2336 Bb6000 Bb2880

Cepas

Grafica 2.- Rendimiento en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en el medio a base de LRM en la fase de crecimiento de cultivo.

Tabla 1.- Comparación de medias en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de líquido de remojo de maíz (LRM).

Producción (blastoesporas/ml) Cepas
GHA Bb2336 Bb6000 Bb2880

Precultivo
2.24 x 108 ± 0.17* A 2.93 x 10 ± 0.28 A 4.38 x 10 ± 0.31 A 2.90 x 108 ± 0.21 A
8 8

Cultivo
2.76 x 108 ± 0.16 A 4.68 x 10 ± 0.46 A 2.23 x 10 ± 0.5 A 2.54 x 108 ± 0.11 A
8 8

Nota: Los valores en las columnas seguidos de la misma letra no difieren significativamente según el estudio estadístico de ANOVA de un solo factor con un intervalo de confianza de P= 0.05 (95%). Las unidades de las medias están dadas por blastoesporas/ml. * Desviación estándar (±).

En la comparación de la producción de blastoesporas de las diferentes cepas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de LRM se observó una diferencia significativa por parte de la cepa Bb6000 (f= 5.77 y P= 0.025), donde en su fase de crecimiento de precultivo la media de su producción de blastoesporas fue de 4.38 x 108 blastoesporas/ml y mientras tanto en la fase de crecimiento de cultivo su media en rendimiento disminuyo a 2.23 x 108 esporas/ml, mientras que las cepas GHA, Bb2336 y Bb2880 se mantuvieron homogéneas en las medias de la producción de blastoesporas (Tabla 2 y Grafica 3).

Tabla 2.- Comparación de medias entre las fases de crecimiento en el medio a base de líquido de remojo de maíz (LRM) para cada una de las cepas de Beauveria bassiana. Cepas de Beauveria bassiana

Fases
Precultivo Cultivo

GHA
8

Bb2336
8

Bb6000
8

Bb2880
8

2.24 x 10 ± 0.17 A 2.76 x 108 ± 0.16 A

2.93 x 10 ± 0.28 A 4.68 x 108 ± 0.46 A

4.38 x 10 ± 0.21 B 2.23 x 108 ± 0.5 A

2.90 x 10 ± 0.21 A 2.54 x 108 ± 0.11 A

Nota: Vea tabla 1

1010 Precultivo

Producción de blastoesporas (Desvest ±)

Cultivo

109

108

107
A GH A GH 2 Bb 6 33 23 Bb 36 60 Bb 00 0 00 b6 B 0 88 b2 B 0 88 b2 B

Cepas

Grafica 3.- Comparación de la producción de blastoesporas de las diferentes cepas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de LRM.

4.2.- Producción en el medio líquido a base de Casaminoacidos

Los datos en promedio de la producción de esporas en la fermentación en el medio a base de Casaminoacidos para las diferentes cepas de Beauveria bassiana en la fase de crecimiento de precultivo se dieron de la siguiente manera: GHA 2.62 x 108 blastoesporas/ml, Bb2336 3.48 x 108

blastoesporas/ml, Bb6000 2.80 x 108 blastoesporas/ml y Bb2880 3.35 x 108 blastoesporas/ml (Grafica 4 y 6). Mientras tanto en la fase de crecimiento de cultivo en la fermentación liquida los valores en promedio se dieron de la siguiente manera: GHA 3.54 x 108 blastoesporas/ml, Bb2336 1.28 x 109 blastoesporas/ml, Bb6000 7.03 x 108 blastoesporas/ml y Bb2880 8.78 x 108 blastoesporas/ml (Grafica 5 y 6). En el análisis estadístico se encontró que los grupos se mantuvieron homogéneos al efectuar la comparación de medias entre las cepas en las fases de crecimiento de precultivo (f= 0.64 y P= 0.595) y cultivo (f=1.84 y P= 0.153), esto en base al estudio de análisis de varianza de un solo factor con un intervalo de confianza P= 0.05 (Tabla 3).

1010

Produccion de blastoesporas (Desvest ±)

109

108

107 BbGHA Bb2336 Bb6000 Bb2880

Cepas

Grafica 4.- Rendimiento en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en el medio a base de Casaminoacidos en la fase de crecimiento de precultivo.

1010

Produccion de blastoesporas (Desvest ±)

109

108

107 BbGHA Bb2336 Bb6000 Bb2880

Cepas

Grafica 5.- Rendimiento en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en el medio a base de Casaminoacidos en la fase de crecimiento de cultivo.

Tabla 3.- Comparación de medias en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de Casaminoacidos.

Producción (blastoesporas/ml) Cepas
GHA Bb2336 Bb6000 Bb2880

Precultivo
2.62 x 10 ± 0.15 A 3.48 x 108 ± 0.15 A 2.80 x 10 ± 0.23 A 3.35 x 10 ± 0.16 A
8 8 8

Cultivo
3.54 x 10 ± 0.26 A 1.28 x 109 ± 1.4 A 7.03 x 10 ± 0.77 A 8.78 x 10 ± 0.1 A
8 8 8

Nota: Lea nota de la tabla 1.

En la comparación de la producción de blastoesporas de las diferentes cepas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de Casaminoacidos se observó una diferencia significativa por parte de la cepa Bb2336 (f= 4.94 y P= 0.037), donde en su fase de crecimiento de precultivo la media de su producción de blastoesporas fue de 3.48 x 108 blastoesporas/ml y mientras tanto en la fase de crecimiento de cultivo su media en rendimiento aumento a 1.28 x 109 blastoesporas/ml, mientras que las cepas GHA, Bb6000 y Bb2880 se mantuvieron homogéneas en las medias de la producción de blastoesporas (Tabla 4 y Grafica 6).

Tabla 4.- Comparación de medias en la producción de blastoesporas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de Casaminoacidos.

Cepas
Fases

GHA
8

Bb2336
8

Bb6000
8

Bb2880
8

Precultivo Cultivo

2.62 x 10 ± 0.15 A 3.54 x 10 ± 0.26 A
8

3.48 x 10 ± 0.15 A 1.28 x 10 ± 1.4 B
9

2.80 x 10 ± 0.23 A 7.03 x 10 ± 0.77 A
8

3.35 x 10 ± 0.16 8.78 x 10 ± 0.1 A
8

Nota: Vea tabla 1

1010

Producción de blastoesporas (Desvest ±)

Precultivo Cultivo

109

108

107
A GH A GH 6 33 b2 B 6 33 b2 B 0 60 Bb 0 60 Bb 00 28 Bb 80 28 Bb 80

Cepas

Grafica 6.- Comparación de la producción de blastoesporas de las diferentes cepas de Beauveria bassiana en las fases de crecimiento en el medio a base de Casaminoacidos.

4.3.- Morfología de la espora en las fases de crecimiento En cuanto la tipos de esporas del hongo Beauveria bassiana en los medios líquidos se encontraron: conidias sumergidas y blastoesporas. En la fase de crecimiento de precultivo para el medio a base de líquido de remojo de maíz (LRM) el tipo de espora encontrada en la población pertenece en su mayoría a blastoesporas (Figura 6). Mientras tanto en la fase de crecimiento de cultivo en le medio a base de LRM la población predominante, de igual forma, fueron las blastoesporas (Figura 7).

En el medio a base de Casaminoacidos las poblaciones de esporas del hongo B. bassiana en la fase de crecimiento de precultivo en el medio a base de Casaminoacidos predominaron las blastoesporas (figura 8). Por otra parte, en la población de esporas en la fase de crecimiento de cultivo en el medio a base de Casaminoacidos, no se presento cambio alguno y las blastoesporas fueron las predominantes en el campo de visión (Figura 9).

Figura 6.- Población de conidias sumergidas en la fase de crecimiento de precultivo en el medio a base de líquido de remojo de maíz (40x).

Figura 7.- Población de blastoesporas en la fase de crecimiento de cultivo en el medio a base de líquido de remojo de maíz (40x).

Figura 8.- Población de conidias sumergidas en la fase de crecimiento de precultivo en el medio a base de Casaminoacidos (40x).

Figura 9.- Población de blastoesporas en la fase de crecimiento de cultivo en el medio a base de Casaminoacidos (40x).

4.4.- Viabilidad

La viabilidad inicial del producto de la fase de crecimiento de precultivo se midieron en porcentajes y se registraron de la siguiente manera: GHA 82%, Bb2336 75%, Bb6000 69% y Bb2880 72%. Mientras tanto, en la fases de crecimiento de cultivo al porcentaje se mantuvo de la siguiente manera: GHA 85%, Bb2336 77%, Bb6000 63% y Bb2880 73%. No se obtuvo viabilidad en el medio de cultivo a base de Casaminoacidos debido a una contaminación persistente en cada ensayo para obtener los porcentajes.

Tabla 5.- Porcentajes de germinación de blastoesporas inicial, a las 24 h de secado de la muestra formulada del medio a base de líquido de remojo de maíz.
Fases de crecimiento Precultivo Cultivo Cepas GHA Bb2336 Bb6000 Bb2880 82% 75% 69% 74% 85% 77% 63% 73%

Nota: Las muestras tienen un porcentaje de humedad menor al 10%

5. – DISCUSIONES

5.1.- Producción en las fases de crecimiento

Thomas et al., (1987) realizo un estudio en el que menciona que la producción de Beauveria bassiana en cultivo líquido, con una agitación de 150RPM a 27°C e inoculo de 5 x 10 4 y 1 x 105 esporas/ml, obtuvo una producción final de blastoesporas de 5 x 108 blastoesporas/ml. Sin embargo, en un estudio realizado por Jackson et al., (2003) comparo diferentes medios líquidos utilizando al hongo Paecilomyces fumosoroseus como inoculo. La inoculación de los medios líquidos fue con una concentración de esporas de al C menos 1 x 106 esporas/ml, con una agitación de 300RPM a 28° y p or un periodo de 3 días, resulto en la producción final de blastoesporas de 1 x 109 blastoesporas/ml.

Se observo en nuestro estudio que con una combinación de dos fuentes de carbono y una fuente de nitrógeno, en el caso en particular del medio a base de líquido de remojo de maíz (LRM), bajo las condiciones de 300RPM, 26°C, con un inoculo de al menos 1 x 106 blastoesporas/ml y un periodo de 72 h, la mejor producción que se registro en la fase de crecimiento de cultivo fue por la cepa Bb2336 con 4.68 x 106 blastoesporas/ml (f= 2.32 y P= 0.089), cabe

mencionar que estadísticamente no hay diferencia significativa entre las cepas en cuanto la producción de blastoesporas (P= 0.05). Por otra parte, en el medio a base de Casaminoacidos el cual contaba con una sola fuente de carbono (glucosa), bajo las mismas condiciones de producción, 300RPM, 26° con un C, inoculo de 1 x 106 blastoesporas/ml y en un periodo de 72 h, la producción final

con mejor rendimiento se registro en la cepa Bb2336 con

1.28 x 109

blastoesporas/ml (f= 1.84 y P= 0.153), aunque estadísticamente no difiere entre las demás cepas en sus valores de producción de blastoesporas (P= 0.05).

5.2.- Morfología del producto de las fermentaciones

En un estudio efectuado por Thomas et al., (1987), se observo que el rendimiento de crecimiento y la proporción de dos tipos de esporas en el medio variaba con la naturaleza de la fuente de carbono. Con glucosa, fructosa, y lactosa la población de esporas era del tipo de conidia, mientras que con la fuente de carbono de sorbitol, maltosa y almidón la población en su mayoría era de blastoesporas. En nuestro estudio se encontró que con una fuente de carbono como la glucosa y fructosa, esto en el medio a base de líquido de remojo de maíz la población de blastoesporas en el medio se mantuvo predominante en el campo de visón, tanto en la fase de crecimiento de precultivo y cultivo. Es el mismo caso en la producción de blastoesporas en el medio a base de Casaminoacidos, donde la fuente de carbono fue la glucosa, la cual fue la misma fuente en la fase de crecimiento de precultivo y cultivo.

5.2.- Viabilidad del formulado

Algunos

estudios

realizados

para

determinar

el

porcentaje

de

desecación de Paecilomyces fumosoroseus han reportado hasta el 90% (Jackson et al., 1997) de germinación de la blastoespora en un periodo de 6 h, esto bajo una condición estándar de fermentación líquida, mientras tanto la germinación de la conidia de P. fumosoroseus le toma hasta 16 h de incubación para obtener un 90% de germinación. En nuestro estudio se observo una germinación de hasta 85% para la cepa de Beauveria bassiana de 85% de germinación en un periodo de 12 h, esto en el medio a base de líquido de remojo de maíz. No se reporto en nuestro estudio ningún resultado para el medio a base de Casaminoacidos.

6.- CONCLUSIONES

1. No observo estadísticamente diferencia significativa entre las cepas en la fase crecimiento de precultivo y cultivo en el medio a base de líquido remojo de maíz.

2. No se observo estadísticamente diferencia significativa entre las cepas en la fase de crecimiento de precultivo y cultivo en el medio a base de Casaminoacidos.

3. Se observo estadísticamente una diferencia significativa entre las fases de crecimiento de precultivo y cultivo en la cepa Bb6000 en le medio a base de líquido de remojo de maíz.

4. Se observo estadísticamente una diferencia significativa entre las fases de crecimiento de precultivo y cultivo en la cepa Bb2336 en el medio a base de Casaminoacidos.

5. El tipo de morfología presente en las fases de crecimiento (precultivo y cultivo), en los medios a base de Casaminoacidos y líquido remojo de maíz, fue de una población predomínate de blastoesporas.

6. El mejor medio a base de Casaminoacidos es el mejor para la producción de blastoesporas, con las cepa de Beauveria bassiana Bb2336.

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