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MINISTERIO DE

CIENCIA Y
TECNOLOGA

CENTRO DE CIENCIAS
MEDIOAMBIENTALES (CCMA)
CSIC
Laboratorio de Genotoxicologa y
Mutagnesis Ambiental

EVALUACIN DE
MUTAGENICIDAD
Y GENOTOXICIDAD
scar Herrero Felipe
Eduardo de la Pea de Torres
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

www.csic.es

EVALUACIN DE LA MUTAGENICIDAD/GENOTOXICIDAD
scar Herrero Felipe y Eduardo de la Pea de Torres
Centro de Ciencias Medioambientales CSIC. C/ Serrano 115 dpdo. 28006 Madrid

La evaluacin mutagnica, como parte de la evaluacin de la genotoxicidad, es uno


de los requisitos fundamentales en la caracterizacin toxicolgica de un producto
qumico. El estudio de cambios hereditarios (mutaciones) en el genotipo de las clulas
se lleva a cabo actualmente mediante diferentes ensayos in vitro e in vivo, de
complejidad variable en funcin del mecanismo biolgico que se desee analizar.
Los ensayos de mutagnesis aparecen, de forma obligatoria, en los dos niveles ms
bajos de pruebas toxicolgicas de los tres que el Real Decreto 363/1995 define para los
productos qumicos. As, ya en el nivel bsico, es preciso llevar a cabo ensayos que
detecten mutaciones gnicas en clulas procariontes (Salmonella typhimurium o
Escherichia coli) y aberraciones cromosmicas en clulas de mamfero cultivadas in
vitro. En el nivel 1 se requieren estudios adicionales de mutagnesis que aporten
informacin sobre mutaciones puntuales en organismos ms complejos que las bacterias
y amplen la ya existente sobre la capacidad de una sustancia para inducir aberraciones
cromosmicas.
Los criterios de clasificacin de las sustancias segn su mutagenicidad aparecen
especificados en el anexo VI del Real Decreto 363/1995 (ver Tabla 1), donde se
establecen tres categoras. Hasta el momento no se conocen sustancias que, segn los
criterios de esta clasificacin, sean mutagnicas para el hombre, las cuales estaran
englobadas en la primera categora. S hay sustancias que pueden considerarse como
mutagnicas para el hombre, incluidas en la segunda categora y para cuya
clasificacin es necesario llevar a cabo pruebas de mutagenicidad en clulas germinales;
del mismo modo que se conocen sustancias cuyos posibles efectos mutagnicos en el
hombre son preocupantes, pertenecientes a la tercera categora y que requieren ensayos
de mutagenicidad en clulas somticas para ser clasificadas.
Los ensayos ms complejos implican, por regla general, el uso de animales de
laboratorio. El ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) es
el organismo europeo encargado de validar dichos ensayos de forma que, en la medida
de lo posible, se ajusten a la estrategia de las tres erres (3ERRES):
- reducir el nmero de animales empleados en los experimentos,
- refinar las tcnicas a fin de disminuir el estrs y el sufrimiento de los mismos y/o
- reemplazar dichos animales por otros organismos.

Centro de Ciencias Medioambientales - CSIC

ESQUEMA
1. DEFINICIONES
- TOXICOLOGA
- GENOTOXICOLOGA

MUTAGNESIS
CARCINOGNESIS
TERATOGNESIS

2. EVALUACIN MUTAGNICA
- NIVEL BSICO
- NIVEL 1
- NIVEL 2

3. CLASIFICACIN SEGN MUTAGENICIDAD


4. ECVAM, REMA, GTEMA
5. ENSAYOS DE EVALUACIN MUTAGNICA
- ENSAYO BACTERIOLGICO DE MUTACIN REVERSA
- ENSAYO DE ABERRACIONES CROMOSMICAS
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ESQUEMA
1. DEFINICIONES
- TOXICOLOGA
- GENOTOXICOLOGA

MUTAGNESIS
CARCINOGNESIS
TERATOGNESIS

2. EVALUACIN MUTAGNICA
- NIVEL BSICO
- NIVEL 1
- NIVEL 2

3. CLASIFICACIN SEGN MUTAGENICIDAD


4. ECVAM, REMA, GTEMA
5. ENSAYOS DE EVALUACIN MUTAGNICA
- Ensayo bacteriolgico de mutacin reversa (Test de Ames)
- Ensayo de aberraciones cromosmicas (Test de Allium cepa)
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

DEFINICIONES (1/4)
TOXICOLOGA:
Ciencia que estudia las sustancias qumicas y los agentes
fsicos en cuanto son capaces de producir alteraciones
patolgicas en los seres vivos, a la par que estudia los
mecanismos de produccin de dichas alteraciones y los
medios para contrarrestarlas, as como los procedimientos
para detectar, identificar y cuantificar tales agentes y
evaluar su grado de toxicidad. (Repetto, 1981 y 1997)

TOXICOLOGA
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DEFINICIONES (2/4)
GENOTOXICOLOGA:
Disciplina de la investigacin toxicolgica cuyo objetivo
principal es salvaguardar lo mximo posible la reserva
gentica humana de la accin de las distintas sustancias
genotxicas, incluyndose en esta categora todas aquellas
que tengan efectos mutagnicos, carcinognicos y/o
teratognicos. (Vamparys et al., 1996)

TOXICOLOGA
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DEFINICIONES (3/4)
MUTAGNESIS:
Induccin de cambios hereditarios (mutaciones) en el genotipo de
una clula como consecuencia de alteraciones o prdida de genes o
cromosomas (o parte de ellos).
CARCINOGNESIS:
Induccin por agentes qumicos, fsicos o biolgicos, de una
transformacin maligna e incontrolada de clulas, dando como
resultado la formacin de un tumor.
TERATOGNESIS:
Induccin de malformaciones estructurales en embriones o fetos.
(Vettorazzi, 2001)
TOXICOLOGA
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DEFINICIONES (4/4)
MUTAGNESIS, TERATOGNESIS Y CARCINOGNESIS
(Modificado de Wilson, 1972)

TOXICOLOGA
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QUMICA
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DEFINICIONES (4/4)
MUTAGNESIS, TERATOGNESIS Y CARCINOGNESIS
(Modificado de Wilson, 1972)

TOXICOLOGA
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QUMICA
22-25 Marzo 04

TOXICIDAD PARA LA REPRODUCCIN

ESQUEMA
1. DEFINICIONES
- TOXICOLOGA
- GENOTOXICOLOGA

MUTAGNESIS
CARCINOGNESIS
TERATOGNESIS

2. EVALUACIN MUTAGNICA
- NIVEL BSICO
- NIVEL 1
- NIVEL 2

3. CLASIFICACIN SEGN MUTAGENICIDAD


4. ECVAM, REMA, GTEMA
5. ENSAYOS DE EVALUACIN MUTAGNICA
- Ensayo bacteriolgico de mutacin reversa (Test de Ames)
- Ensayo de aberraciones cromosmicas (Test de Allium cepa)
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
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QUMICA
22-25 Marzo 04

EVALUACIN MUTAGNICA (1/9)


- La estrategia de evaluacin se realiza
atendiendo a la cantidad de sustancia
comercializada por ao o en total.
- Se siguen las indicaciones descritas en la
Directiva 92/32/CEE.
- Se establecen tres niveles de evaluacin,
de complejidad adicional y creciente:
- Nivel Bsico - Nivel 1 - Nivel 2 (Barrueco et al., 1999)
TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (2/9)


NIVEL BSICO
Informe de base. Requerido para todo producto qumico.

TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (3/9)


NIVEL 1
La comercializacin anual es de 10-100 toneladas por fabricante o
la comercializacin total es de 50-500 toneladas por fabricante.

TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (4/9)


NIVEL 2
La comercializacin anual alcanza las 1.000 toneladas por
fabricante o la total alcanza las 5.000 toneladas por fabricante.

TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (5/9)


- Obligatoriedad de llevar a cabo estudios de mutagenicidad en el
Nivel Bsico y el Nivel 1.
- Datos de potencial mutagnico imprescindibles en el Nivel
Bsico: mutacin gnica y aberraciones cromosmicas.
- Datos adicionales de potencial mutagnico en el Nivel 1 para:
1. Confirmar resultados del Nivel Bsico
2. Investigar nuevos objetivos
3. Iniciar o ampliar estudios in vivo

TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (6/9)


Nivel Bsico

Nivel 1

Nivel 2

TOXICOLOGA
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QUMICA
22-25 Marzo 04

EVALUACIN MUTAGNICA (6/9)


Nivel Bsico

Nivel 1

Nivel 2

TOXICOLOGA
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22-25 Marzo 04

EVALUACIN MUTAGNICA (6/9)


Nivel Bsico

Nivel 1

Nivel 2

TOXICOLOGA
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22-25 Marzo 04

EVALUACIN MUTAGNICA (6/9)


Nivel Bsico

Nivel 1

Nivel 2

TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (7/9)


Ensayos de Mutagenicidad aceptados por la UE y homologados por la OCDE

TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (8/9)


Pruebas adicionales de mutagnesis del Nivel 1
Si uno de los ensayos del Nivel Bsico result positivo, los estudios
complementarios deben incluir al menos un ensayo capaz de descubrir la
misma alteracin gnica.

Si los dos ensayos requeridos en el Nivel Bsico resultaron negativos,


deben realizarse normalmente, como estudios complementarios, un ensayo
de mutaciones gnicas y otro de aberraciones cromosmicas.

En el segundo caso, quizs sea apropiado obtener tambin datos


complementarios de ensayos indicadores de efectos en el DNA.

TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (9/9)


Pruebas adicionales de mutagnesis del Nivel 1,
agrupadas segn su finalidad gentica (Barrueco et al., 1999)

TOXICOLOGA
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EVALUACIN MUTAGNICA (9/9)


Pruebas adicionales de mutagnesis del Nivel 1,
agrupadas segn su finalidad gentica (Barrueco et al., 1999)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
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22-25 Marzo 04

EVALUACIN MUTAGNICA (9/9)


Pruebas adicionales de mutagnesis del Nivel 1,
agrupadas segn su finalidad gentica (Barrueco et al., 1999)

TOXICOLOGA
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22-25 Marzo 04

ESQUEMA
1. DEFINICIONES
- TOXICOLOGA
- GENOTOXICOLOGA

MUTAGNESIS
CARCINOGNESIS
TERATOGNESIS

2. EVALUACIN MUTAGNICA
- NIVEL BSICO
- NIVEL 1
- NIVEL 2

3. CLASIFICACIN SEGN MUTAGENICIDAD


4. ECVAM, REMA, GTEMA
5. ENSAYOS DE EVALUACIN MUTAGNICA
- Ensayo bacteriolgico de mutacin reversa (Test de Ames)
- Ensayo de aberraciones cromosmicas (Test de Allium cepa)
TOXICOLOGA
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CLASIFICACIN (1/7)
Los criterios utilizados aparecen especificados en el
Anexo VI del Real Decreto 363/1995.
Se establecen tres categoras:
- Primera: sustancias que, se sabe, son mutagnicas
para el hombre.
- Segunda: sustancias que pueden considerarse
como mutagnicas para el hombre.
- Tercera: sustancias cuyos posibles efectos
mutagnicos en el hombre son preocupantes.
TOXICOLOGA
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CLASIFICACIN (2/7)
CATEGORA PRIMERA (R.D. 363/1995, Anexo VI)

Se les asignar el smbolo T, sustancias txicas, y la frase


de riesgo R46, puede causar alteraciones genticas hereditarias.
TOXICOLOGA
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22-25 Marzo 04

CLASIFICACIN (2/7)
CATEGORA PRIMERA (R.D. 363/1995, Anexo VI)

Se les asignar el smbolo T, sustancias txicas, y la frase


de riesgo R46, puede causar alteraciones genticas hereditarias.
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
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22-25 Marzo 04

CLASIFICACIN (3/7)
CATEGORA SEGUNDA (R.D. 363/1995, Anexo VI)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

Se les asignar el smbolo T, sustancias txicas, y la frase


de riesgo R46, puede causar alteraciones genticas hereditarias.

CLASIFICACIN (3/7)
CATEGORA SEGUNDA (R.D. 363/1995, Anexo VI)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

Se les asignar el smbolo T, sustancias txicas, y la frase


de riesgo R46, puede causar alteraciones genticas hereditarias.

CLASIFICACIN (4/7)
CATEGORA TERCERA (R.D. 363/1995, Anexo VI)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

Se les asignar el smbolo Xn, sustancias nocivas, y la frase


de riesgo R68, posibilidad de efectos irreversibles.

CLASIFICACIN (4/7)
CATEGORA TERCERA (R.D. 363/1995, Anexo VI)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

Se les asignar el smbolo Xn, sustancias nocivas, y la frase


de riesgo R68, posibilidad de efectos irreversibles.

CLASIFICACIN (5/7)
En resumen:
Las sustancias se clasifican como mutgenas con respecto a las malformaciones
gnicas heredadas. No obstante, los resultados que implican la clasificacin de
un producto en la tercera categora constituyen una advertencia de la posible
existencia de carcinognesis.
De hecho, los datos de genotoxicidad son tenidos en cuenta a la hora de clasificar
un producto qumico como carcingeno, considerndose como pruebas
complementarias.
En caso de duda, los resultados de los ensayos de genotoxicidad in vivo e in vitro
contribuirn a la inclusin de la sustancia en la segunda categora de
carcingenos (2A-carcingenos probables; 2B-carcingenos posibles), si son
positivos, o en la tercera (sustancias posiblemente no carcingenas), si son
negativos.
TOXICOLOGA
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CLASIFICACIN (6/7)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
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(Tarancn, 2001)

CLASIFICACIN (7/7)

TOXICOLOGA
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QUMICA
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(Tarancn, 2001)

ESQUEMA
1. DEFINICIONES
- TOXICOLOGA
- GENOTOXICOLOGA

MUTAGNESIS
CARCINOGNESIS
TERATOGNESIS

2. EVALUACIN MUTAGNICA
- NIVEL BSICO
- NIVEL 1
- NIVEL 2

3. CLASIFICACIN SEGN MUTAGENICIDAD


4. ECVAM, REMA, GTEMA
5. ENSAYOS DE EVALUACIN MUTAGNICA
- Ensayo bacteriolgico de mutacin reversa (Test de Ames)
- Ensayo de aberraciones cromosmicas (Test de Allium cepa)
TOXICOLOGA
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ECVAM, REMA, GTEMA (1/3)


CENTRO EUROPEO PARA LA VALIDACIN DE
MTODOS ALTERNATIVOS
OBJETIVOS:
Promover la regulacin y la aceptacin cientfica de ensayos sin animales con
importancia biomdica, a travs de la investigacin, el desarrollo de dichos
ensayos, su validacin y el establecimiento de una base de datos especializada.
Coordinar a nivel europeo la evaluacin independiente de la relevancia y
fiabilidad de estos ensayos con propsitos cientficos, de manera que los productos qumicos y de otra ndole puedan ser
manufacturados, transportados y utilizados de una forma ms econmica y segura, a la vez que reducir progresivamente
la actual relevancia de las tcnicas de experimentacin con animales.
EEUU:
Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM).
National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM).
http://iccvam.niehs.nih.gov/home.htm

http://ecvam.jrc.it/index.htm
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ECVAM, REMA, GTEMA (2/3)


RED ESPAOLA DE MTODOS ALTERNATIVOS
OBJETIVOS:
El objetivo fundamental de la Red ser servir de nexo de conexin entre personas,
grupos y entidades interesados en estos mtodos, independientemente del campo
cientfico en el que habitualmente se encuentren (bioqumico, farmacolgico,
toxicolgico, ambiental etc.). Con dichos vnculos de conexin se pretende
fomentar el intercambio de ideas, facilitar la formacin de profesionales, impulsar
la investigacin en este campo, favorecer la comunicacin bidireccional con la
administracin y con la industria y, en general, aumentar la masa crtica espaola en cuantos foros europeos e
internacionales sean de inters para nuestro pas. En definitiva se trata de informar, formar y desarrollar actividades
sobre los mtodos alternativos que se estn realizando, tanto en Espaa como en el extranjero.
OBJETIVOS PRECISOS:
- Actividades informativas.
- Actividades formativas.

http://tox.umh.es/rema/index.html
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Sobre REMA

Actividades

Novedades

Inicios / Documentos
Comisin / Entidades

Jornadas
Congresos / etc.

ECVAM
Comisin Europea / Links

ECVAM, REMA, GTEMA (3/3)


GRUPO DE TRABAJO ESPECIALIZADO EN MTODOS
ALTERNATIVOS (Asociacin Espaola de Toxicologa)
OBJETIVOS:
1. Fomentar la cooperacin y la coordinacin de las actividades cientficas para
contribuir al desarrollo de nuevos mtodos experimentales, tanto in vivo como in
vitro, que conduzcan a las tres erres (3ERRES):
- reducir el nmero de animales empleados,
- refinar tcnicas que disminuyan el estrs y sufrimiento de stos,
- o reemplazar el uso de animales
2. Estimular la participacin de investigadores espaoles en programas de prevalidacin o validacin de ensayos
3. Promover la aceptacin reguladora de los mismos.

http://tox.umh.es/aetox/grupos/GTEMA/index.html
Sobre GTEMA
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Inventario
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ESQUEMA
1. DEFINICIONES
- TOXICOLOGA
- GENOTOXICOLOGA

MUTAGNESIS
CARCINOGNESIS
TERATOGNESIS

2. EVALUACIN MUTAGNICA
- NIVEL BSICO
- NIVEL 1
- NIVEL 2

3. CLASIFICACIN SEGN MUTAGENICIDAD


4. ECVAM, REMA, GTEMA
5. ENSAYOS DE EVALUACIN MUTAGNICA
- Ensayo bacteriolgico de mutacin reversa (Test de Ames)
- Ensayo de aberraciones cromosmicas (Test de Allium cepa)
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
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ENSAYOS (1/16)

- TEST DE AMES -

- Cepas TA98 y TA100 de Salmonella typhimurium.


- Trabajar en esterilidad.
- Crecer las cepas mediante cultivos de noche:
500l de congelado bacteriano + 50ml de medio NB

bao con agitacin a 37C durante 16 horas y en oscuridad

- Preparar diluciones de la muestra.


- Filtrar las diluciones por Millipore 0,45m; conservar en nevera.
- Preparar agar mnimo para placas Petri.
- Preparar agar lquido.
- Aadir 100l de diluciones y controles a tubos con agar lquido.
- Aadir esta mezcla a las placas Petri con agar mnimo.
- Incubar placas Petri a 37 C, durante 48h. y en oscuridad.
- Contar colonias revertientes.
TOXICOLOGA
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ENSAYOS (2/16)

- TEST DE AMES -

Caractersticas de las cepas bacterianas:

uvr : deleccin de un gen que codifica para el sistema de reparacin de la


escisin del DNA, y produce un aumento de la sensibilidad en la deteccin de
mutgenos. La deleccin incluye tambin genes de la biotina y de la nitrato
reductasa.
rfa : mutacin que causa prdida parcial de la barrera lipopolisacrida de la pared
bacteriana, aumentando la permeabilidad a grandes molculas que no atraviesan
paredes celulares normales.
pKM 101 : Factor R. Confiere resistencia a ampicilina y aumenta la mutagnesis
espontnea e inducida porque incrementa el sistema de reparacin con error.
TOXICOLOGA
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ENSAYOS (3/16)

- TEST DE AMES -

Cepa TA98 Mutacin his D3052


Se encuentra en el gen his D, que codifica para la
histidinol deshidrogenasa.
Mutacin de tipo frameshift, consistente en una
adicin de un par de bases prxima a una cadena de
ocho restos de -GC- repetidos.
Esta cepa responde a mutgenos que originan un
desplazamiento en la lectura del DNA, que ocurre
preferentemente en regiones del DNA que poseen
secuencias de bases repetidas en tndem.
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
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QUMICA
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ENSAYOS (4/16)

- TEST DE AMES -

Cepa TA100 Mutacin his G46


-

G A G -

G G G -

C T C -

C C C -

Leucina
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
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Prolina
Para detectar mutgenos que causan
sustitucin de pares de bases G-C

ENSAYOS (5/16)

- TEST DE AMES -

Esquema
del
mtodo

TOXICOLOGA
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(Laborda et al., 1986)

ENSAYOS (5/16)

- TEST DE AMES -

Esquema
del
mtodo

Espontnea

TOXICOLOGA
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QUMICA
22-25 Marzo 04

(Laborda et al., 1986)

ENSAYOS (5/16)

- TEST DE AMES -

Esquema
del
mtodo

Producto

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

(Laborda et al., 1986)

ENSAYOS (5/16)

- TEST DE AMES -

Esquema
del
mtodo

Disolvente

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

(Laborda et al., 1986)

ENSAYOS (5/16)

- TEST DE AMES -

Esquema
del
mtodo

Mutgeno

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

(Laborda et al., 1986)

ENSAYOS (6/16)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

- TEST DE AMES -

Monografas del IARC (International Agency for Research on Cancer)

(Waters et al., 1987)

ENSAYOS (7/16)

- TEST DE AMES -

TA98
Control Nutrient Broth
TA100

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
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QUMICA
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Bao con agitacin a 37C

ENSAYOS (8/16)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

- TEST DE AMES -

Cultivos de noche

ENSAYOS (9/16)

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

- TEST DE AMES -

Campana de flujo

ENSAYOS (10/16) - TEST DE AMES -

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

Estufa a 37C

ENSAYOS (11/16) - TEST DE AMES -

TA100
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
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A.- R. Espontnea
B.- R. Mutgeno
C.- Toxicidad

ENSAYOS (12/16) - TEST DE AMES -

TOXICOLOGA
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SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ENSAYOS (13/16) - TEST DE AMES N Revertientes en TA 100


1400

1191

1200

1034

1000
800
600
264

400
200

93

91

R.E.

R.S.

100

99

C1

C2

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

MMS

C3

C4

ENSAYOS (13/16) - TEST DE AMES N Revertientes en TA 100


1400

1191

1200

1034

1000
800
600
264

400
200

93

91

R.E.

R.S.

100

99

C1

C2

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

MMS

Mutagnico

C3

C4

ENSAYOS (14/16) - TEST DE AMES N Revertientes


1400
1200
1000
800
600
400
200
0

1191

20

93

R.E.

18

91

R.S.

128

R.M.

1034

100

29

C1
TA98

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

30

99
C2

TA100

264
67
C3

174

C4

ENSAYOS (14/16) - TEST DE AMES N Revertientes


1400
1200
1000
800
600
400
200
0

1191

20

93

R.E.

18

91

R.S.

128

R.M.

1034

100

29

C1
TA98

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

30

99
C2

TA100

Mutagnico

264
67
C3

174

C4

ENSAYOS (15/16) - TEST DE AMES -

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ENSAYOS (16/16) - TEST DE AMES -

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ENSAYOS (16/16) - TEST DE AMES -

NDICES
3,35 M1
Mutagnico muy dbil

8,7 M3
Mutagnico

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ENSAYOS (16/16) - TEST DE AMES -

NDICES
NDICES
3,35 M1
Mutagnico muy dbil

2,83 M1
Mutagnico muy dbil

11,11 M4
Mutagnico alto

8,7 M3
Mutagnico

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ENSAYOS (1/10) - TEST DE A. cepa - Pelar, decapar y lavar bulbos para eliminacin de restos qumicos.
- Excitar mediante una muesca el meristemo radicular.
- Cultivar Allium cepa en cabina a 25 0.5C y en oscuridad.
- Oxigenar el agua mediante burbujeo de 10-20 ml/min.
- Controlar crecimiento radicular e ndices tras 24-48 horas.
- Tincin de Feulgen.
- Calcular ndices Mittico y de Fases a las 48h. de
tratamiento (72-96 horas totales de ensayo).
- Calcular la Inhibicin del Crecimiento Radicular a las 72h. de
tratamiento (96-120 horas totales de ensayo).
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ENSAYOS (2/10) - TEST DE A. cepa -

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

Monografas del IARC (International Agency for Research on Cancer)

(Waters et al. 1987)

ENSAYOS (3/10) - TEST DE A. cepa -

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

Cmara de incubacin a 25C

ENSAYOS (4/10) - TEST DE A. cepa Fotografas cedidas por la Dra. M.J. Hazen
(Lab A-110) Dpto. de Biologa de la U.A.M.

Control

Muestra

0h.

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

72h.

ENSAYOS (5/10) - TEST DE A. cepa Longitud de Races (cm) tras 72h


8

9
8
7
6
5
4
3
2
1
0

7,3

6,75

6
4,25
2,3

11
00
cm

2/
l
22
00
cm

2/
l

2/
l
11
0c
m

2/
l
1c
m

2/
l
0,
5c
m

2/
l
0,
1c
m

Ag
u

1,05

% Inhibicin del Crecimiento Radicular


86,88

100
71,25

80
46,88

60
40
20
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

8,75

15,63

25

0
0,1cm2/l

0,5cm2/l

1cm2/l

110cm2/l 1100cm2/l 2200cm2/l

ENSAYOS (6/10) - TEST DE A. cepa ndices Mitticos


12,00

11,40

10,90

10,00

7,80

8,00

ndice 0h

6,00
2,93

4,00

ndice 48h

2,00
0,00
0,1cm2/l

0,5cm2/l

% Inhibicin de ndice Mittico

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%

74%

28%

0,1cm2/l

0,5cm2/l

ENSAYOS (7/10) - TEST DE A. cepa Fotografa cedida por la Dra. M.J. Hazen (Lab A-110) Dpto. de Biologa de la U.A.M.

Control
Clulas tras 24h.
de crecimiento
en agua filtrada

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ENSAYOS (8/10) - TEST DE A. cepa Fotografas cedidas por la Dra. M.J. Hazen (Lab A-110) Dpto. de Biologa de la U.A.M.
Tincin con orcena

Tincin de Feulgen

C-Metafases
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

Indican riesgo de aneuploida y pueden ser reversibles

ENSAYOS (9/10) - TEST DE A. cepa Fotografas cedidas por la Dra. M.J. Hazen (Lab A-110) Dpto. de Biologa de la U.A.M.

Rotura y Microncleos
La rotura indica efecto clastognico y
los microncleos efecto clastognico y/o aneuploida
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

ENSAYOS (10/10) - TEST DE A. cepa Fotografa cedida por la Dra. M.J. Hazen (Lab A-110) Dpto. de Biologa de la U.A.M.

Rotura y Puente con


cromosomas rezagados
La rotura indica efecto
clastognico y
los cromosomas rezagados
indican riesgo de aneuploida

TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

MINISTERIO DE
CIENCIA Y
TECNOLOGA

CENTRO DE CIENCIAS
MEDIOAMBIENTALES (CCMA)
CSIC
Laboratorio de Genotoxicologa y
Mutagnesis Ambiental

EVALUACIN DE
MUTAGENICIDAD
Y GENOTOXICIDAD
scar Herrero Felipe
Eduardo de la Pea de Torres
TOXICOLOGA
AMBIENTAL:
SEGURIDAD
QUMICA
22-25 Marzo 04

oscar.herrero@ccma.csic.es