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RESUMEN

Suspensiones lavadas de Escherichia coli oxidan succinato cuando se cultiva


previamente en succinato pero no en glucosa. Un ritmo ms lento de la
oxidacin se produjo con bacterias cultivadas con peptona como fuente de
carbono. Estas diferencias se deben a alteraciones en el nivel de actividad de
la succinato deshidrogenasa.
La glucosa reprime la biosntesis de la enzima, mientras succinato actu como
inductor especfico y no aumenta la actividad de fumarato hidratasa, malato
deshidrogenasa o NADH deshidrogenasa.
Crecimiento aerbico tambin aumenta los niveles de succinato
deshidrogenasa unida a membrana
La induccin de la succinato deshidrogenasa por succinato aadido sigui la
cintica esperada. La adicin de glucosa caus una disminucin en la tasa de
biosntesis de la succinato deshidrogenasa. Succinato deshidrogenasa parece
jugar un papel importante, ya que amital (un inhibidor de NADH-oxidasa)
inhibi el crecimiento slo ligeramente cuando se utiliz succinato como fuente
de carbono en comparacin con la fuerte inhibicin del crecimiento cuando se
us glucosa como fuente de carbono.
INTRODUCCIN
Succinato deshidrogenasa es la nica enzima unida a membrana, del ciclo del
cido tricarboxlico en Escherichia coli (Marr, 1960) y, porlo tanto, puede
participar en la respiracin adems de funcionar en el ciclo del cido
tricarboxlico. Los cambios en el medio ambiente en consecuencia pueden
afectar tanto a la actividad respiratoria y el funcionamiento del ciclo del cido
tricarboxlico.
La Influencia de las condiciones de crecimiento en la biosntesis y la actividad
de deshidrogenasas y citocromos de bacterias unidas a la membrana est bien
documentada (Gray, Wimpenny y Mossman, 1966; Cavari, Avi-Dor y
Gressowicz, 1968; Rufz-Herrera & De MOSS, 1969).
Los estudios preliminares (RubHerrera, 1968) han sugerian que el sustrato de
crecimiento de carbono era importante en la regulacin de la sntesis de la
succinato deshidrogenasa en E. coli. Este estudio presenta nuevos datos sobre
los mecanismos que controlan la biosntesis de succinato deshidrogenasa en
esta bacteria.
MTODOS
Organismo y las condiciones de crecimiento: Escherichia coli HfrH, obtenido de
JA de MOSS, Universidad de California, San Diego, EE.UU., se mantuvo en agar
nutritivo (Difco) y se cultivaron en el medio descrito por Sypherd y Strauss
(1963) con 5 pug de thiaminelm1 y, o bien I% de glucosa o 0,5% de succinato.
Este medio se conoce como 'medio sinttico'; para 'medio complejo ", se
aadi caldo nutritivo (Difco) en el 0,4%. Las bacterias se cultivaron a 37 "C
durante 4 a 5 h, el medio se roci con aproximadamente 2 volmenes de aire
estril / volumen de cultivo / min. Para las condiciones anaerbicas, los cultivos
se roci con una mezcla de 95% N2 + 5% COz. La densidadbacteriana se midi
por medio de un fotocolormetro Klett utilizando un filtro verde y el contenido
de protena se calcul a partir de la turbidez con una curva de calibracin
apropiada.

Preparacin de extractos libres de bacterias y sobres bacterianas: Las bacterias


se centrifugaron, se lavaron con tampn 0,05 wphosphate, pH 7,3, y se
rompieron con un 10 kHz Branson Sonifier (Heat Systems Ultrasonics,
Plainview, Nueva York, EE.UU.) durante tres periodos sucesivos de 15 s cada
uno. El extracto se centrifug a 4008 durante 15 min y el sobrenadante
utilizado como extracto crudo. Sobres bacterianas se aislaron por resuspensin
de las bacterias en 0,5 ml de tampn-HCl 0,05 M-tris, pH 8,3, que contiene 20%
de sacarosa y 2 mg de lisozima (Sigma Chemical Co. Inc., St Louis, Missouri,
EE.UU.) y se congelaron en Jml una mezcla acetona-C02 slido. Despus de
descongelar a 37 "C, el tratamiento se repiti cuatro veces. Cinco ml de
tampn de fosfato 0,05 M-10 que contienen DNasa pg (Sigma Chemical Co.) Se
aadieron / ml y se mezcl rpidamente hasta que la viscosidad disminuy. El
extracto crudo se centrifug a 50000G durante 10 min, se elimin el
sobrenadante y el residuo se resuspendi en I ml de tampn fosfato y se
centrifug a 5008 en un gradiente lineal de sacarosa (50 a 20%) durante 20
min. sobres bacterianas apareci como una banda opalescente dentro del
gradiente.
Determinacin de la actividad respiratoria: El consumo de oxgeno se midi con
un electrodo de oxgeno Clark (Amarillo Primavera Instrument Co. Inc., Ohio,
EE.UU.),conectado a una cmara cilndrica de metacrilato con una capacidad
de 2.3 ml.
Medicin de la absorcin de succinato: Las muestras (5 ml) de suspensiones
bacterianas en tampn 0,05 Mphosphate, pH 7-3, a una turbidez de 360
unidades Nett (= 1,4 mg bacterialml peso seco) se incubaron con 0-2 ml0.05
M- [I, 4-14Cz] succinato (sp.act. 0.01 pCi / pmol) (Calbiochem Inc., La Jolla,
California, EE.UU.). A intervalos, I ml se retiraron muestras y se mezcla con 0,1
ml I M-KCN (en o "C) y se filtr a travs de filtros de membrana (24:47 dimetro
de poro, Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, EE.UU.). Las bacterias
se lavaron con 5 ml de helado en la I M-KCN. la radiactividad de las clulas se
midi con un contador Geiger Cphillips, se hizo Modelo 4035) que tena una
eficiencia absoluta de 2,5% para 14C. Sin correccin para la auto-absorcin.
Las actividades enzimticas: la succinato deshidrogenasa se midi por el
mtodo de Ells (1959).
Tipos de reduccin dicloro-indofenol se midi con un Maroc V (Jobin et Ivon,
Arcueil, Francia) espectrofotmetro acoplado a un 43 grabadora Photo-Volt
Modelo. La actividad se expres como ser,,,., / Min / mg de protena. Fumarato
hidratasa se midi por el mtodo de Massey (1955), y la actividad expresada
como AE,,, / min / mg de protena. Malato deshidrogenasa se midi como se
describe en las enzimas del folleto, reactivos enzimticos de Worthington
Biochemical Corp., Freehold, Nueva Jersey, EE.UU. actividad se expres como
AE, / mg de protena Jrnin. NADH deshidrogenasa se midi comosigue: 0,2 ml
de 0,0015 M-NADH se mezcl con 2,7 ml de tampn 0,05 M fosfato, pH 7,3, y
0,2 ml de extracto bacteriano. La actividad se midi como se describe para
succinato deshidrogenasa y expresado como AE,, protena Jmin / rng.
La protena se midi por el mtodo de Lowry, Rosebrough, Farr & Randall

(1951).
RESULTADOS
Succinato no era tan buena fuente de carbono como la glucosa para el
crecimiento de Escherichia coli.
Cuando se aadieron ambos sustratos a un medio sinttico, el crecimiento
diauxico ocurri con la glucosa que se utiliza por primera vez. El efecto de la
glucosa se atribuy a alteraciones en la actividad respiratoria pues las
bacterias crecidas con glucosa no oxidan succinato (Tabla I). Las diferencias en
la actividad respiratoria entre las bacterias crecidas con glucosa y succinato
fueron correlacionados con la actividad de la succinato deshidrogenasa en
extractos de los dos tipos de bacterias (Tabla I).
Sin embargo, la permeabilidad a [1,4- 14C2) succinato no se ve muy afectada
por las condiciones dede crecimiento (Fig. I).
Sobres de bacterias aisladas oxidan fcilmente succinato y NADH, pero no
glucosa. La oxidacin del NADH por sobres bacterianos crecidos con glucosa y
succinato era aproximadamente el mismo, pero succinato fue oxidado ms
rpidamente por sobres bacterianos crecidos con succinato.
Estas diferencias se relacionan con la actividad de las enzimas
correspondientes (ver tabla 2).
El efecto de succinato como inductor de la succinato deshidrogenasa era
especfico, ya que suadicin a medio complejo aument significativamente la
sntesis slo de succinato deshidrogenasa, mientras que fumarato hidratasa y
malato deshidrogenasa no se vieron afectados (Tabla 3). La glucosa no reprime
las dos ltimas enzimas tanto como lo hizo con la succinato deshidrogenasa
(Tabla 3).
La ausencia de oxgeno durante el crecimiento tambin afect a la actividad
respiratoria y los niveles de succinato deshidrogenasa. Las bacterias crecieron
poco con succinato como fuente de carbono bajo condiciones anaerbicas y
tubo 25% de la actividad respiratoria con succinato y slo el 8% de la actividad
de la succinato deshidrogenasa en comparacin con bacterias cultivadas
aerbicamente. La cantidad presente de succinato deshidrogenasa en clulas
cultivadas con glucosa fue independiente de la concentracin de oxgeno.
La cintica de la induccin de la succinato deshidrogenasa se midio bajo
condiciones donde succinato no era el factor limitante para el crecimiento (Fig.
2). Despus succinato se aadi al medio de crecimiento, la induccin de la
enzima sigui la cintica clsica descrita por Jacob y Monod (I 961) para un
sistema inducible. Cuando cloranfenicol (50, ug / ml) se aadi
simultneamente con succinato, no se obtuvo ningn aumento en la actividad
de la succinato deshidrogenasa.
Se sugiri un experimento de mayor represin por la glucosa de sistemas de
enzimas bacterianos que crecen en succinato (Fig. 3). La Sntesis de succinato
deshidrogenasa se detuvo inmediatamente despus de que la glucosa se
aadi al medio yla enzima existente decayo rpidamente indicando que o
bien tiene una tasa de rotacin rpida o que la glucosa favorece su
degradacin o inactivacin.

Cuando la glucosa se elimin del medio que contia succinato, la sntesis de la


enzima se restaur inmediatamente despus, siguiendo una cintica similar a
la mostrada en la Fig. 2.
El papel de la succinato deshidrogenasa en la respiracin de la bacteria se
investig mediante la observacin del efecto de amital en el crecimiento.
Amytal inhibe NADH deshidrogenasa de las mitocondrias (Probabilidad y
Hollunger, 1963) y tambin NADH oxidasa de Agrobacterium tumefaciens
(Kurup, Vaidyanathan y Ramasarma, I 966). Con un sobre preparado de
Escherichia coli 0,6 mM-amital inhibe la oxidacin del NADH en un 40%, pero
no tuvo ningn efecto sobre la oxidacin de succinato. Si amital inhibe la
oxidacin del NADH, pero no la oxidacin de succinato, la adicin de amital a
un medio con sustratos que se oxida a travs de NAD provocara una inhibicin
ms fuerte que cuando se aadi a un medio en el que el sustrato respiratorio
fue succinato. As 0,1 mM de amital inhibi el crecimiento de E. coli en medio
complejo en un 30% cuando la glucosa estaba presente, pero slo en un 10%
cuando se aadi succinato en lugar de glucosa.
Cuando I mM de amital fue utilizado, la inhibicin de crecimiento fue del 60% y
20% respectivamente.
DISCUSIN
La formacin de la succinato deshidrogenasa en Escherichia coli est
controlada por las condiciones ambientales. Su represin por la glucosa es
otroejemplo de una enzima sujeto a represin catablica (Magasanik, 1961). La
glucosa tuvo poco efecto sobre la sntesis de malato deshidrogenasa y el
sistema de permeabilidad para succinato. Glucosa hace reprimir la sntesis de
la succinato deshidrogenasa en Haemophilm paraintuenzae (White, I 967) y
Staphylococcus aureus (Collins & Lascelles, 1962). Con E. coli crecido en medio
complejo, la formacin de enzimas del ciclo del cido tricarboxlico tambin es
reprimida por la glucosa (Gray et al. 1966).
Encontramos un efecto ms especfico de la glucosa desde que fumarato
hidratasa no fue reprimida por los hidratos de carbono.
La induccin de la succinato deshidrogenasa en Escherichia coli HfrH por
succinato es similar a la reportada por Cavari et al. (1968), quien encontr que
la actividad de la succinato deshidrogenasa aument aproximadamente seis
veces cuando E. coli se cultiva en un medio que contiene succinato-en
comparacin con la actividad mostrada por bacterias cultivadas en un medio
que contiene fumarato o manitol.
Nuestros datos sobre los niveles de succinato deshidrogenasa en clulas
crrecidas aerbicas y anaerbicas coinciden con los reportados por Gray et al.
(1966), Hino y Maeda (1966), y Cavari et al. (1968). La Ubicacin dentro de la
membrana confiere caractersticas especiales a succinato debydrogenase,
como se ha discutido por Cerletti, Gioveno, Testolin y Binotti (I 968); De
especial inters es que succinato deshidrogenasa puede tener un papel
respiratorio de acuerdo con nuestros resultados.Fig. I. La captacin de [1,4-W,]
succhate en Escherichiu coli. Las bacterias se hicieron crecer durante 4 h en
medio complejo solo o con succinato o glucosa aadidos. La captacin de
[1,4J'Caj succinato fue seguido como se describe en Mtodos. 0. bacterias

cultivadas-succinato; 0, bacterias glucosa crecido; x, las bacterias cultivadas en


medio complejo solo.
Tabla I. efecto de fuente de carbono en las vas respiratorias y actividades de
SDH