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miautnomos denominados plstidos. Los plstidos juegan un papel central para el desarrollo
y diferenciacin de las plantas albergando una
variedad de vas metablicas indispensables, entre las que destacan la fotosntesis y la biosntesis de isoprenoides o terpenos. Los isoprenoides
constituyen una de las familias de compuestos
naturales con mayor potencial de uso biotecnolgico. La biosntesis de isoprenoides en plantas
se realiza por dos vas independientes, una que
ocurre en el citoplasma y otra que tiene lugar en
los cloroplastos. LaY_YbeZ[
va cloroplstica para sntesis
de isoprenoides fue descubierta hace relativa9Wbl_d#8[died
mente poco tiempo y ha sido objeto de estudio
de nuestro grupo de investigacin por varios
aos. Nuestro trabajo en este campo ha sido
importante no slo para la identificacin inicial de la va, sino para la caracterizacin de los
elementos que la regulan. Los avances, logros y
perspectivas de nuestro trabajo sobre esta singular e importante va metablica se presentan
en este captulo.
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tituyen a los animales superiores,
destacan la
existencia de una pared celular, a la que deben
su rigidez y forma geomtrica, y de estructuras
subcelulares de forma ovoide y color verde, los
cloroplastos, organelos muy distintivos presentes
en citoplasma vegetal (figura 1B). A nivel metablico, las clulas vegetales, como unidades estructurales, y las plantas, como organismos, se
distinguen por su capacidad de producir esqueletos carbonados (azcares), a travs del proceso
denominado fotosntesis (figura 1A). La fotosntesis, que consiste de la produccin de materia
orgnica (carbohidratos) a partir de CO2 inorgnico empleando la energa luminosa del sol, es
un proceso biolgico central del que depende
no slo la sobrevivencia de las plantas sino, en
ltima instancia, la de todos los seres vivos que
habitamos el planeta. De hecho, puesto que la
fotosntesis
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de carbono a la bisfera, es innegable que los organismos fotosintticos (productores primarios)
sustentan la vida en la tierra, conformando el eslabn de inicio, de todas las cadenas alimenticias.
En resumen, la fotosntesis es la fuente inagotable de azcares que sirven de alimento para los
organismos consumidores que, como nosotros
mismos, basan su metabolismo en el consumo
de materia orgnica.
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Las clulas vegetales contienen organelos se-
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Figura 1.
Fotosntesis y cloroplasto. A) El diagrama resume la captacin de la energa luminosa proveniente del sol para, mediante la fotlisis del agua, sintetizar energa metablica
(ATP) y poder reductor (NADPH+H), que posteriormente
son empleados para la fijacin de CO2 atmosfrico en el
ciclo de Calvin-Benson, con la subsecuente produccin
de azcares (adaptado de http://www.fai.unne.edu.ar). B)
Clorolasto, organelo donde ocurren todas las reacciones
fotosintticas constituido por tres membranas (externa,
interna y tilacoidal) y tres espacios (intermembranal, estroma y lumen del tilacoide). Las enzimas involucradas en
la cadena de transporte de electrones responsable de la
fotofosforilacin oxidativa son protenas constituyentes
de la membrana tilacoidal. El ciclo de Calvin-Benson tiene
lugar en el estroma, de donde los azcares producidos son
exportados al citoplasma celular para su consumo y transporte a otros rganos de la planta (adaptado de http://
www.linux.ajusco.upn.mx).
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Figura 2.
Desarrollo de plstidos. El diagrama muestra que todos los
plstidos provienen de un proplstido no diferenciado. La
diferenciacin a cada tipo de plstido depende del tejido
y de seales como la luz. Durante el desarrollo del cloroplasto un proplstido pasa transitoriamente por algunos
estadios donde existe diferenciacin membranal parcial
hasta llegar a cloroplasto maduro. En este estadio en ausencia de luz se genera un etioplasto que en presencia de
luz se rediferencia a cloroplasto. Los amiloplastos y oleinoplastos son plstidos almacenadores predominantes en
tubrculos y semillas. Los cromoplastos son responsables
de los colores rojo a amarillo de flores y frutos. El estado de
senescencia de un plstido se conoce como gerantoplasto.
Las flechas indican la potencial interconversin de los diferentes plstidos con excepcin del gerantoplasto, el cual
es un estado terminal.
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Caractersticas moleculares
Dado su origen endosimbitico, los plstidos
son organelos que contienen un genoma propio que los hace parcialmente independientes. El genoma plastdico, que est altamente
conservado en diferentes especies vegetales y
an en algas, codifica para un centenar de genes involucrados tanto en funciones bsicas de
transcripcin, traduccin y replicacin, como
para varias protenas de los complejos fotosintticos. Sin embargo, debido a que durante su
evolucin la mayora de los genes inicialmente
codificados en el genoma del endosimbionte se
han perdido y/o transferido al ncleo de la clula que los alberga, actualmente los plstidos
son incapaces de sobrevivir de forma autnoma. As, ms de 90% de las protenas estructurales, biosntticas y regulatorias requeridas
para la funcin y desarrollo actual de los diferentes plstidos estn codificadas en el ncleo,
traducidas en el citoplasma y posteriormente
importadas al organelo para realizar su funcin. Estas protenas son indispensables para
que los plstidos puedan realizar sus funciones,
dividirse y aumentar su nmero a niveles que
les permitan sustentar las necesidades de los
diferentes tejidos de la planta. De tal manera,
el proceso de diferenciacin de los plstidos,
junto con la regulacin de la expresin de los
genes plastdicos, depende tanto de protenas
codificadas por el genoma organelar, como del
importe continuo, coordinado y regulado de
protenas codificadas en el ncleo.
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Los isoprenoides
Los isoprenoides (o terpenos) forman la familia
ms amplia y diversa de sustancias naturales
conocida (ms de 40 000 compuestos diferentes). Se sintetizan en prcticamente todos los
seres vivos, desde bacterias hasta humanos,
siendo las plantas las que producen ms del
80% (>30000) de ellos.
Qumicamente los terpenos son hidrocarburos (nicamente contienen en su estructura carbono e hidrgeno), clasificados
como lpidos; es decir, sustancias insolubles
en agua y solubles en distintos solventes orgnicos como la gasolina y la acetona. Entre
algunos de los ejemplos de esta familia de
compuestos se incluyen a la clorofila, el aceite del limn (atrayente natural de insectos,
explotado industrialmente en la fabricacin
de aditivos de alimentos y aromas), los carotenos y la vitamina E (antioxidantes requeridos en nuestra dieta diaria), el colesterol
(cuya acumulacin en el interior de los vasos
sanguneos da lugar a la arteroesclerosis, una
de las principales causas de muerte en los
pases desarrollados) y el caucho (con el que
se fabrican las llantas de los automviles).
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Figura 3.
Estructura qumica de isoprenoides. Se muestra la estructura de los precursores universales (isopentenil pirofosfato y dimetilalil pirofosfato) y ejemplos representativos de
cada uno de los subgrupos de compuestos isoprenoides
constituidos por diferentes nmeros de carbonos.
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de los diferentes organismos. De hecho, se postula que el origen de la va MVA proviene del
grupo procariote ancestral relacionado con las
arqueobacterias, quienes ms tarde al parecer
dieron lugar a las clulas eucariotes. Por su parte, la va MEP parece tener su origen en organismos del tipo de las eubacterias, algunas de las
cuales dieron origen a los plstidos.
El descubrimiento reciente y la caracterizacin de la va MEP, representa uno de los mejores
ejemplos de los beneficios de un anlisis multidiciplinario que incluye estudios bioqumicos,
moleculares, genticos, bioinformticos y de genmica comparativa. Para el caso particular de
plantas, nuestro equipo ha hecho importantes
contribuciones basadas en la caracterizacin de
mutantes afectadas en diferentes genes de la
va. La historia del descubrimiento e importancia de la va MEP, resaltando nuestras contribuciones al respecto, se describe en la siguiente
seccin. Sin embargo, como punto de comparacin empezaremos por hacer una breve descripcin de la ruta mevalnica que utilizan muchos
organismos para la sntesis de isoprenoides.
La va mevalnica
La va mevalnica (MVA) (figura 4) fue caracterizada hace casi 50 aos y durante mucho tiempo se le consider como el nico camino para
la sntesis de IPP y DMAPP en todos los organismos vivos. Desde 1958 se report en animales
y levaduras que la sntesis de IPP y DMAPP se
realizaba a partir de la condensacin de dos
molculas de acetil-coenzima A (CoA) que a
travs de la accin de tres enzimas producen el
primer intermediario comprometido de la va,
el cido mevalnico (figura 4), del cual deriva
su nombre. El cido mevalnico, por la accin
subsecuente de tres reacciones adicionales, es
convertido a IPP. Finalmente, el IPP, por accin
de la enzima IPP isomerasa (IDI), da lugar a su
ismero, el DMAPP.
La va mevalnica ha sido sujeto de extensos
estudios bioqumicos, genticos y moleculares.
Entre dichos estudios destacan los realizados
con la enzima HMGR, cuya actividad se ha de-
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Descubrimiento de la va MEP
Los trabajos pioneros de la sntesis de isoprenoides llevaron a concluir que la va MVA era
responsable de la biosntesis de isoprenoides
en todos los organismos vivos. Sin embargo, estudios posteriores sobre la sntesis de algunos
isoprenoides especficos produjeron resultados contradictorios que sugeran la existencia
de una ruta de biosntesis diferente a la MVA.
Entre dichos resultados destacan los de las sntesis de hoponoides (derivados triterpenoides
que modulan la fluidez y permeabilidad de la
membrana plasmtica) y ubiquinonas en bacterias, en los que, basados en la incorporacin
de acetato radioactivo (13C), se demostraba
que el acetato no pareca ser el precursor de
dichos compuestos. Por otra parte, experimentos en plantas siguiendo la incorporacin de
carbono radioactivo (14C) proveniente de CO2,
mevalonato y acetato en diversos isoprenoides
sintetizados en plstidos, tambin produjeron
resultados que contradecan la idea de la va
MVA como nica responsable de la biosntesis
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Figura 4.
Rutas de biosntesis de isoprenoides. Se muestran los intermediarios y las enzimas que catalizan cada paso. A) Va mevalnica (MVA): CoA (coenzima A), HMG-CoA (hidroxi metil
glutaril CoA), MVA (cido mevalnico), MVA 5-P (mevalonato
5 fosfato), MVA 5-PP (mevalonato 5 difosfato), IPP (isopentenil
pirofosfato), DMAPP (dimetilalil pirofosfato), AACT (aceto acetil CoA tiolasa), HMGS (HMG-CoA sintasa), HMGR (HMG-CoA
reductasa), MVK (mevalonato cinasa), PMK (fosfo mevalonato
cinasa), PMD (fosfo mevalonato descarboxilasa), IDI (isopentenil pirofosfato isomerasa). B) Va MEP: GA3P (gliceraldehdo 3
fosfato), DXP (deoxi-D-xilulosa 5-fosfato ), MEP (2-C-metil-eritritol 4-fosfato), CDP-ME (4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol),
CDP-MEP (CDP-ME 2-fosfato), ME-cPP (metil eritritol-2,4-ciclodifosfato), HMBPP (hidroxi metil butenil difosfato), DXS (DXP
sintasa), DXR (DXP reductoisomerasa), CMS (CDP-ME sintasa),
CMK (CDP-ME cinasa), MCS (ME-cPP sintasa), HDS (HMBPP
sintasa), HDR (HMBPP reductasa). Entre parntesis se muestra
el nombre de los genes vegetales/bacterianos correspondientes; al lado izquierdo de las flechas se indica el nombre de las
mutantes de Arabidopsis thaliana identificadas y caracterizadas en nuestro grupo.
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Ruta de biosntesis
Organismo
Eubacterias
Arqueobacterias
Protozoarios
Algas
Plantas superiores
Cloroplasto
Citoplasma
Hongos
Animales
MVA
+
+
+
+
+
+
+
y/o
MEP
+
+
+
+
-
La identificacin de todas las enzimas y genes para cada uno de los pasos de la va MEP,
as como la elucidacin de sus mecanismos de
reaccin, se obtuvo en un lapso de aproximadamente diez aos (gracias al uso de estrategias multidiciplinarias que incluyeron gentica,
biologa molecular y genmica comparativa).
Esto representa un rcord en la caracterizacin
de cualquier va de biosntesis conocida hasta
ahora. As, se identificaron para la ruta MEP
siete genes y sus correspondientes enzimas
como las responsables de la sntesis de IPP y
DMAPP a partir de los precursores gliceraldehdo 3-fosfato y piruvato (figura 4). Los genes
correspondientes para cada una de las enzimas
de la va MEP se han aislado en diferentes especies vegetales y en bacterias. A travs de la
caracterizacin molecular de estos genes se ha
avanzado de manera importante en los mecanismos de regulacin de la va, conocimiento
que resulta esencial para su futura manipulacin biotecnolgica.
para la sntesis de IPP y DMAPP, sin divergir hacia otras rutas biosintticas. Esto contrasta con
el DXP, que al parecer tambin se utiliza como
precursor en la sntesis de las vitaminas B6 y B1,
aunque estudios recientes en plantas sugieren
que sntesis de vitaminas parece provenir de una
ruta biosnttica no relacionada.
Posteriormente, como se muestra en la figura 4, el MEP es transformado en HMBPP por
la accin subsecuente de las enzimas CMS,
CMK, MCS y HDS. En el ltimo paso de la va, la
enzima HDR convierte el HMBPP en IPP y DMAPP que son los productos finales de esta ruta
biosinttica. Hasta ahora en plstidos no se ha
demostrado la existencia de una enzima responsable de la interconversin de IPP a DMAPP, semejante a la que existe para la va MVA,
por lo que se especula que ambos productos
resultan directamente de la accin de la enzima HDR, como de hecho se sabe que ocurre en
Escherichia coli.
Identificacin y caracterizacin
de enzimas y genes
Si bien es cierto que varios de los genes de la
va MEP se han identificado y caracterizado ya
en algunos organismos, la contribucin de los
estudios en la bacteria Escherichia coli fueron
centrales para la elucidacin inicial de esta va.
Sin embargo, cabe mencionar que alguno de
los genes, como el DXS, que codifica para la
primera enzima de la va, fue inicialmente identificado en la planta dicotilednea Arabidopsis
thaliana por nuestro grupo de trabajo.
Desde que en 1993 se public la existencia
de la va MEP, varios grupos de investigacin se
dedicaron a la identificacin de los intermediarios moleculares y de sus enzimas correspondientes tanto en bacterias como en plantas. En
1998, utilizando E. coli como modelo, se encontr el mecanismo de reaccin de las enzimas
responsables de los dos primeros pasos de la
va, la DXS y la DXR. En el transcurso de los siguientes dos aos, y con el uso de tcnicas de
bioinformtica y genmica comparativa sobre
organismos cuyo genoma se encontraba total-
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Figura 5.
Mutantes albinas. A) Silcua de una planta heterciga donde segregan embriones albinos. B) Fenotipo de plantas del
tipo silvestre (Wt) y albino (Alb). C) Fenotipo de la mutante
cla1-1 y planta de tipo silvestre (Wt). D) Fenotipos de mutantes clb y sus correspondientes tipos silvestres.
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Figura 6.
Acumulacin de clorofila en embriones albinos. Reconstruccin por microscopa confocal de la fluorescencia de
la clorofila en embriones inmaduros del tipo silvestre wt
(A), en mutantes albinas cla1-1 (B) y en diferentes mutantes clb (C-H). Los niveles de clorofila se aprecian por el
color rojo en los embriones. Hay dos grupos de mutantes,
las que acumulan clorofila en el embrin (no-autnomas
celulares) y aquellas que no acumulan clorofila a niveles
detectables (autnomas celulares). Todas las no-autnomas celulares estn afectadas en protenas de la va MEP.
A la derecha se aprecian los embriones tipo silvestre (wt) y
mutante (alb) sobre los cuales se realiz la microscopa.
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La va MEP, esencial
para la supervivencia de las plantas
La mayora de las protenas responsables tanto de la regulacin como del funcionamiento
de los cloroplastos son codificadas por genes
nucleares. Estudios recientes basados en anlisis de protemica y genmica estiman que
se requieren ms de 3000 protenas nucleares
para los diversos procesos realizados en plstidos, aunque an se desconoce la identidad y
funcin de una cantidad importante de dichas
protenas. Por otro lado, una estrategia que ha
sido utilizada con xito para identificacin y
aislamiento de nuevas protenas requeridas en
el proceso de desarrollo y funcin de plstidos
es la seleccin y caracterizacin de mutantes
incapaces de acumular pigmentos. A pesar de
que este tipo de mutantes son letales y mueren
rpidamente despus de su germinacin, en la
planta modelo Arabidopsis thaliana su identificacin y aislamiento resulta factible a travs
de la seleccin de plantas hetercigas viables
que segreguen el fenotipo mutante de carencia de pigmentos en los embriones inmaduros
durante la maduracin de la semilla, como se
muestra en la figura 5. De hecho, una parte importante de la caracterizacin de la va MEP en
plantas superiores se realiz en nuestro grupo,
como el caso de la mutante cla1-1, cloroplastos
alterados (figura 5C). Esta mutante est afectada en el desarrollo del cloroplasto y presen-
La va MEP en plantas
est sujeta a mltiples regulaciones
En general, dentro de cualquier ruta biosinttica algunas de sus enzimas limitan el flujo de
la va. De ellas dependen en gran medida los
niveles de actividad y eficiencia con que trabaja la va. En consecuencia, muchas de las enzimas limitantes de una va biosinttica estn
sujetas a diversos mecanismos de regulacin
que modulan sus niveles o su actividad. Estas
regulaciones por ende tienen un efecto directo sobre los niveles de los productos finales
generados en dicha va. En nuestro grupo la
caracterizacin funcional del gen CLA1/DXS1,
a travs de la manipulacin de sus niveles en
plantas transgnicas, permiti establecer a la
enzima DXS como limitante para la sntesis de
IPP y DMAPP en plantas. Adicionalmente, en la
planta modelo Arabidopsis thaliana nuestros
11/14/07 5:02:44 PM
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