You are on page 1of 43

10/29/2012

Cell cycle
¾The cell cycle, is the series of events that takes place in a cell leading to its 
division and the production of two daughter cells each containing chromosomes 
identical to those of the parental cell.
¾In cells without a nucleus (prokaryotic), the cell cycle occurs via a process 
termed binary fission. 
¾In cells with a nucleus (eukaryotes), the cell cycle can be divided in two brief 
periods: interphase and the mitosis (M) phase

EUKARYOTIC CELL CYCLE

¾The eukaryotic cell cycle commonly is represented as 
four stages
¾In somatic cells, cells synthesize RNAs and proteins 
during the G1 phase, preparing for DNA synthesis and 
chromosome replication during the S (synthesis) phase.
h
li ti d i th S ( th i ) h
¾Replication of DNA during S leaves the cell with four 
copies of each type of chromosome. 
¾In the mitotic (M) phase, the chromosomes are evenly partitioned to two daughter cells, 
and the cytoplasm divides roughly in half in most cases.
¾Overall during interphase, which consists of the G1, S, and G2 phases, the cell roughly 
doubles its mass accumulating nutrients needed for mitosis and duplicating its DNA

1

10/29/2012

Overview
of Phases
Cell Cycle
Eukaryotic
Various
ofinCell
Cycle cells

¾During cell division each chromosome is composed of the two daughter DNA 
molecules resulting from DNA replication plus the histones and other 
chromosomal proteins associated with them.
¾The identical daughter DNA molecules and associated chromosomal proteins 
g
p
that form one chromosome are referred to as sister chromatids.
¾Sister chromatids are attached to each other by protein cross‐links along their 
lengths. 
¾In vertebrates, these become confined to a single region of association called 
the centromere as chromosome condensation progresses.
¾During interphase, the portion of the cell cycle between the end of one M 
phase and the beginning of the next, the outer nuclear membrane is continuous 
with the endoplasmic reticulum.
ith th
d l
i ti l

2

10/29/2012

¾With the onset of mitosis in prophase, the nuclear envelope retracts into the 
endoplasmic reticulum in most cells from higher eukaryotes, and Golgi 
membranes break down into vesicles.
¾Cellular microtubules disassemble and reassemble into the mitotic apparatus 
consisting of a football‐shaped bundle of microtubules (the spindle) with a star‐
i ti
f f tb ll h
d b dl f i t b l (th
i dl ) ith t
shaped cluster of microtubules radiating from each end, or spindle pole. 
¾During the metaphase period of mitosis, a multiprotein complex, the 
kinetochore, assembles at each centromere. 
¾The kinetochores of sister chromatids then associate with microtubules coming 
from opposite spindle poles.
¾During the anaphase period of mitosis, sister chromatids separate. 
¾They initially are pulled by motor proteins along the spindle microtubules 
y
y
p
y
p
g
p
toward the opposite poles and then are further separated as the mitotic spindle 
elongates

MITOSIS
Before a eucaryotic cell divides, it must duplicate its centrosome to provide one for each 
of its two daughter cells.

¾In early M phase the centrosomal complex separates 
into two and each centrosome nucleates a radial array of 
microtubules, called an aster. 
¾The two asters, which initially lie side by side and close 
to the nuclear envelope, move apart by a few 
micrometers. 
¾During S phase a daughter centriole
¾During S
phase a daughter centriole begins to grow near 
begins to grow near
the base of each old centriole and at a right angle to it. 
¾By late prophase the bundles of polar microtubules that 
interact between the two asters preferentially elongate as 
the two centers move apart along the outside of the 
nucleus.
¾The elongation of the daughter centriole is usually 
completed by G2 phase. 

3

10/29/2012

Different Stages of Mitosis
The first
five stages of the M phase constitute mitosis (originally defined as the
period in which the

PROMETAPHASE

PROPHASE

MITOSIS
METAPHASE

TELOPHASE
ANAPHASE

Chromosomal Alignment and spindle organization during mitosis
MT
NUCLEUS

Interphase

Prometaphase

MTOC

Centrosome

Metaphase

Prophase
KT Fibre

Metaphase
Prometaphase

Astral
MT
KT MT
Polar MT

4

MBC 5 .10/29/2012 MT Dynamics Play Critical Role In The Formation Of The  Spindle Apparatus Alberts et al.

10/29/2012 The two processes that separate sister chromatids at anaphase ¾In anaphase A the chromatids are pulled toward opposite poles by forces associated with  shortening of their kinetochore microtubules. thereby pushing  the spindle poles apart.  ¾At anaphase the chromatid is released from attachment to its sister at the metaphase  plate and the kinetochore moves rapidly up the microtubule.  two spindle poles move apart. subunits are added to the plus end of a microtubule at the  kinetochore and are removed from the minus end at the spindle pole.  ¾Its attached chromatid is thereby carried to the spindle pole.  ¾There is evidence that two separate forces are responsible for anaphase. overlapping. ¾The minus‐end‐directed motor proteins bind to the cell cortex and to those astral  microtubules that point away from the spindle and pull the spindle poles apart. removing subunits from its  plus end as it goes.  antiparallel polar microtubules and slide the microtubules past each other. ¾The plus‐end‐directed motor proteins of the kinesin family cross‐link adjacent.  ¾In anaphase B In anaphase the the two spindle poles move apart. while the microtubules  subunits occurs while the microtubules maintain a constant length and remain under tension.  ¾Part of the chromatid movement is due to the simultaneous loss of tubulin subunits  from the minus end of the microtubules at the pole. ¾It is likely that the forces driving anaphase B are similar to those that cause the centrosome to split and separate into two spindle poles at prophase.  ¾The force driving this movement is thought to be generated mainly at the kinetochore.  ¾Thus a constant poleward flux of tubulin ¾Thus a constant poleward flux of tubulin subunits occurs. Functions of kinetochore microtubules at metaphase and anaphase  ¾During metaphase. 6 .

 the nucleoli reappear.  ¾The KT microtubules disappear and the Polar MTs  elongate ¾Telophase accounts for approximately 2% of the cell  cycle's duration.10/29/2012 ¾During telophase.  ¾The nuclear envelopes of the daughter cells are  formed from the fragments of the nuclear envelope  of the parent cell. Cytokinesis ¾Initiation of cytokinesis takes place before the end of Anaphase 7 . the effects of prophase and  prometaphase events are reversed.  ¾Two daughter nuclei form in the cell.  ¾As the nuclear envelope forms around each pair of  chromatids.

 the mitotic spindle determines where cleavage occurs as well as when. ¾At this point genetic information is  exchanged between non‐sister exchanged between non sister   chromatids by a process called crossing‐ over. ¾The furrowing invariably occurs in the plane of the metaphase plate. ¾The X‐shaped sites of such cross‐ overs are called chiasmata 8 .  ¾The first visible sign of cleavage in animal cells is a puckering and furrowing of the  plasma membrane during anaphase. ¾Normally.10/29/2012 Cytokinesis ¾During cytokinesis the cytoplasm divides by a process called cleavage. ¾It produces haploid gametes from  diploid parental cells ¾Many things happen during the first  phase of meiosis I called prophase It phase of meiosis I called prophase. It  lasts for over 90 % of time required for  meiosis. at right angles  to the long axis of the mitotic spindle. ¾The contractile ring assembles later and divides the cell in two. ¾During this time homologous  chromosomes come together as pairs in  a process called synapsis to form four  chromatid structure called as tetrad.  ¾It consists of circumferentially oriented filaments bound to the cytoplasmic face of  the plasma membrane by uncharacterized attachment proteins Meiosis ¾Meiosis involves two nuclear  divisions rather than one. ¾Cleavage is accomplished by the contraction of a thin ring composed mainly of an  overlapping array of actin filaments and bipolar myosin‐II filaments.

e. and telophase II usually  f ll i follow in quick succession. metaphase I. a separate set of kinetochore fibers forms on each  sister chromatid. nuclear membranes re‐form around the  two daughter nuclei and a brief interphase begins. anaphase II. i. but usually  ¾During this period the chromosomes may decondense somewhat but usually they soon recondense and prophase II begins.10/29/2012 ¾In the next phase of meiosis I. after which metaphase II. the spindle and the kinetochore microtubules interact to  separate the homologous chromosomes.  ¾As there is no DNA synthesis during this interval. in some organisms the  chromosomes seem to pass almost directly from one division phase into the  next. telophase differs among species. ¾The final stage. and these two sets of fibers extend in opposite directions. the two sister chromatids are kept together on the metaphase plate  until they are released by the sudden separation of their kinetochores at  anaphase ¾Cytokinesis is completed by the end of telophase II resulting in 4 haploid  daughter cells g ¾Each daughter cell has complete set of chromosomes and each set is unique  because of independent assortment and crossing over during prophase of  meiosis I 9 .  i k i ¾As in an ordinary mitosis...  ¾During this period the chromosomes may decondense somewhat. ¾After the end of meiotic division I.  ¾Moreover. the tetrads move to the  equator of the cell (randomly positioning of the homologues). but instead entire  double‐chromatid chromosomes are moved toward the two poles ¾At this point cytokinesis begins which results in  two cells each with either  the maternal or paternal homologue of each type of chromosome.e.  ¾The centromeres joining sister  chromatids do not split. ¾ The kinetochore microtubules expand from each chromosome in opposite  directions towards the nearest pole ¾Next in anaphase I. i. Meiosis II ¾Meiotic Division II Resembles a Normal Mitosis  ¾In all organisms prophase II is brief: the nuclear envelope breaks down as the  new spindle forms.

 and may result in beneficial new combinations of alleles. and there are 8 different possible gametes. pachytene.  1) The independent assortment of the maternal and paternal  homologues during the first meiotic division produces 2 n different haploid gametes for an organism with n  chromosomes.  ¾The new combinations of DNA created during crossover are a significant source  of genetic variation.  zygotene. called a chiasma (plural chiasmata). DNA is exchanged between homologous chromosomes in a  process called homologous recombination.  ¾This often results in chromosomal crossover. which  have two chromosomes and four chromatids. ¾This prophase is traditionally divided into five sequential stages ‐ leptotene. with one chromosome coming from  each parent. diplotene.  ¾Because of the many small differences in DNA sequence that  always exist between any two homologues both mechanisms always exist between any two homologues.  2) Crossing‐over during meiotic prophase I exchanges segments  of homologous chromosomes and thereby reassorts genes in  individual chromosomes. ¾Here n = 3. corresponds to a  crossover between two nonsister chromatids ¾Many bivalents contain more than one chiasma.10/29/2012 Genetic Reassortment Is Enhanced by Crossing‐over Between Homologous Nonsister Chromatids ¾Two major contributions to the reassortment of genetic material  that occurs during meiosis. 10 . Prophase I ¾During prophase I.  ¾The paired and replicated chromosomes are called bivalents or tetrads which ¾The paired and replicated chromosomes are called bivalents or tetrads. indicating that multiple  crossovers can occur between homologues. and diakinesis defined by these morphological  changes.  ¾The two duplicated homologues (maternal and paternal) are seen to be  physically connected at specific points. both mechanisms  increase the genetic variability of organisms that reproduce  sexually.  ¾Each connection.

 which forms just before pachytene and dissolves just  afterward. and it generally persists for  days.  ¾Pachytene is said to begin as soon as synapsis is complete. individual chromosomes begin to condense into long strands within the  nucleus. until desynapsis begins the diplotene stage.10/29/2012 Different stages of meiosis ¾The first stage of prophase I is the leptotene stage.  and it has been suggested that it may play a part in the recombination process. on opposite sides of which  it f l l dd lik t i it id f hi h the two homologues are aligned to form a long linear chromosome pair. keeps the homologous chromosomes in a bivalent together and closely aligned.  11 . ¾The synaptonemal complex. ¾Diakinesis‐ is the stage of transition to metaphase – in which the chromosomes  recondense and transcription halts.  when a complex structure called the synaptonemal complex begins to develop between the  two sets of sister chromatids in each bivalent. two sets of sister chromatids in each bivalent. in which the chiasmata are first seen ¾Genetic recombination requires a close apposition between the recombining  chromosomes. ¾Th ¾The synaptonemal t l consists of a long ladder like protein core.  ¾The most striking event is the initiation of intimate chromosome synapsis at zygotene. also known as leptonema ¾During this stage.

 which are  very large protein‐containing  assemblies with a diameter of about  90 nm. 12 ." which brings local regions of DNA on the maternal and paternal  chromatids together across the 100‐nm‐wide synaptonemal complex. ¾The active recombination process is  ¾The active recombination process is thought to be mediated instead by  recombination nodules. placed  like basketballs on a ladder between the two homologous chromosomes.10/29/2012 Recombination Nodules ¾Although the synaptonemal complex may provide the structural  framework for recombination events.  ¾They are thought to mark the site of a large multienzyme "recombination  machine. ¾The nodules are distributed along the synaptonemal complex in the same  way that crossover events are distributed Chiasmata ¾The two duplicated homologues (maternal and paternal) are physically  connected at specific points called as chiasma (plural: chiasmata) ¾The chiasma created by each crossover event plays a role analogous to that  of the centromere in an ordinary mitotic division.  it probably is not the engine that  brings them about. some of the chromosome pairs lack chiasmata. ¾The total number of nodules is about equal to the total number of chiasmata  seen later in prophase. holding the maternal and  of the centromere in an ordinary mitotic division holding the maternal and paternal homologues together on the spindle until anaphase I ¾In mutant organisms that have a reduced frequency of meiotic chromosome crossing‐over. ¾Recombination nodules sit at intervals on the synaptonemal complex.

  ¾Note that the four chromatids are arranged as two  distinct pairs of sister chromatids and that the two  chromatids in each pair are tightly aligned along their  entire lengths as well as joined at their centromeres.  ¾The entire unit of four chromatids is referred to as a  bivalent. the nucleoli disappear. Sites of crossing over entangle together. from Greek words meaning  "moving through". the chromosome pairing in  meiosis involves crossing‐over (genetic recombination)  between homologous chromosomes. the rest of the stage closely  resembles prometaphase of mitosis. 13 . and the meiotic spindle begins to form. This is the first point in meiosis where the four parts of the tetrads are  actually visible. Other than this observation.  ¾A single crossover event has occurred earlier in  prophase to create one chiasma. ¾Each chromosome has been  duplicated and exists as attached sister  chromatids before the pairing occurs. Diakinesis Chromosomes condense further during the diakinesis stage. the nuclear membrane  disintegrates into vesicles. ¾Paired homologous chromosomes during the  transition to metaphase of meiotic division I.  ¾As shown by the formation of chromosomes that are  part red and part black. effectively overlapping. making  chiasmata clearly visible.10/29/2012 ¾The pairing of homologous  chromosomes (homologues) is unique  to meiosis.

¾The process ends with telophase II. the centromeres contain two kinetochores that attach to spindle  fibers from the centrosomes at each pole. or even years in the first meiotic prophase.  division II of meiosis.  ¾Centrioles move to the polar regions and arrange spindle fibers for the second meiotic  division. where the centromeres are cleaved. 14 .  as in normal mitosis. ¾Meiosis thus consists of two cell divisions following a single phase of DNA ¾replication. each with a haploid set of chromosomes. which is similar to telophase I. as in normal mitosis to produce cells with a haploid DNA content ¾In prophase II we see the disappearance of the nucleoli and the nuclear envelope  again as well as the shortening and thickening of the chromatids. months. without further DNA replication.10/29/2012 Meiosis II ¾Formation of the actual gamete nuclei proceeds simply through a second cell division. to produce cells with a haploid DNA content. depending on the species and on the gamete being formed. and is marked by  uncoiling and lengthening of the chromosomes and the disappearance of the spindle. ¾The preparatory DNA replication during the first cell cycle tends to take much longer than a normal S phase. ¾In metaphase II. allowing  p apart. and cells can then spend days.  p microtubules attached to the kinetochores to pull the sister chromatids ¾The sister chromatids by convention are now called sister chromosomes as they move  toward opposing poles. Meiosis is now  complete and ends up with four new daughter cells. ¾Nuclear envelopes reform and cleavage or cell wall formation eventually produces a  total of four daughter cells.  ¾This is followed by anaphase II. ¾The chromosomes now align on a second spindle and the sister chromatids separate. so that four haploid cells are produced from each cell that enters meiosis.

 and the associated  cyclin determines which proteins are phosphorylated by a  particular cyclin‐CDK complex. while the kinases are the  catalytic subunits y . and the replicated  chromosomes must be segregated into two separate cells g y • Regulation of the cell cycle is critical for the normal  development of multicellular organisms. 15 . But. and loss of control  ultimately leads to cancer • Regulation of cell cycle is achieved by the action of cyclins and  cyclin dependent kinases • The cyclins are the regulatory subunits. as if they were a single chromosome 23 pairs 2N 2N DNA replication 23  chromosomes  h in duplicate First meiotic division 4N 23 pairs in  duplicate N N 23 23 2nd meiotic division 23  chromosomes  in duplicate 2N 23 23 N N Regulation of cell cycle • Cells reproduce by duplicating their contents and then dividing  into two  • The DNA must be faithfully replicated.10/29/2012 The two progeny of this division (division I of meiosis) therefore contain a diploid amount of DNA. and (2) these two copies are inherited as closely associated sister chromatids. • Each CDK can associate with different cyclins. they differ from normal diploid cells in two ways: (1) both of the two DNA copies of each chromosome derive from only one of the two homologous chromosomes in the original cell (except where there has been genetic recombination).

¾ G1 cyclin‐CDK complexes are expressed first.  and mitotic cyclin‐CDK complexes. which all share an approx 150‐amino acid region of homology  called the cyclin box that binds to the N‐terminal end of specific Cdks.  ¾The cyclins are a family of proteins. S‐phase. the G1 cyclin‐CDK complexes induce degradation of  the S phase inhibitors by phosphorylating them and the S‐phase inhibitors by phosphorylating them and  consequently stimulating their polyubiquitination by the  multiprotein. B2.  ¾ The activity of S‐phase cyclin‐CDK complexes is initially held in  check by inhibitors. D2. F. and H.10/29/2012 Cyclins and Cycle‐Dependent Kinases (CDKs) ¾ There are three major classes of cyclin‐CDK complexes that  control passage through the cell cycle: the G1‐phase. are  synthesized and destroyed during each cell cycle. which. G1  and G2. ¾To date. C. B1.  ¾ Late in G1. Cyclins in cell cycle regulation ¾Different cyclins bind specifically to different Cdks to form distinct complexes at  specific phases of the cell cycle and thereby drive the cell from one phase to  another. and B3.  respectively 16 . E1 and E2. ¾ Subsequent degradation of the polyubiquitinated S‐phase  inhibitor by proteasomes releases active S‐phase cyclin‐CDK  complexes. eight cyclins have been described that directly affect cell cycle  progression: cyclins A1 and A2. and D3. ¾ These prepare the cell for the S phase by activating  transcription factors that promote transcription of genes  encoding enzymes required for DNA synthesis and the genes  encoding S‐phase cyclins and CDKs. D1. whereas cyclin H has been shown to form complexes specifically with Cdk7  to produce an enzyme known as Cdk‐activating kinase (CAK) that is involved in the to produce an enzyme known as Cdk‐activating kinase (CAK) that is involved in the activation of CDC2 and Cdk2 kinases by phosphorylating Thr160 and Thr161. as their name suggests. ¾Little information is currently available regarding the recently described cyclins F and G.

 and cyclin A antisense DNA can prevent  DNA replication. Cyclins in cell cycle regulation ¾cyclin E is required to overcome the G1/S checkpoint and commence DNA replication. A number of studies have described the ability of over‐expressed cyclin A to accelerate  the G1 to S transition causing DNA replication. appears to be involved in control of S‐phase and has been  shown to associate with cyclin‐dependent kinase‐2 (Cdk2).  ¾The  other G1 cyclins are identified to be cyclin D.  At late prophase.10/29/2012 Cyclins in cell cycle regulation ¾Expression of cyclins during the mammalian cell cycle cycle. ¾M b ¾Members of the cyclin f h li D family function to regulate phosphorylation D f il f i l h h l i of the  f h retinoblastoma gene product. ¾Cyclin D is absent in quiescent cells but rapidly accumulates after growth factor stimulation. whereas expression of cyclins E. cyclin A may no longer be necessary as cdc2/cyclinB1 becomes active. ¾Upon stimulation of quiescent cells (G0). It accumulates prior to  cyclin B in the cell cycle. ¾cyclin B is required for traversing the G2/M checkpoint to initiate mitosis  ¾Cyclin A seems to be required for both S‐phase and M‐phase.  17 . A and B is related to a specific cell cycle phase. ¾Cyclin D is subsequently expressed constitutively throughout subsequent cell cycles. and cyclin A is required for completion of prophase. different cyclins are expressed in an orderly way. thereby activating E2F transcription factors. Cyclin A availability is apparently the rate‐limiting step for entry into mitosis. and cyclin C.

 Cyclin binding moves the T‐loop to expose the phosphorylation site. CDC2 is the mitotic Cdk and forms complexes with cyclins A and B that function in the  G2‐ and M‐phases of the cell cycle. Cdk2.  ¾The Cdk subunit on its own has no detectable kinase activity and requires sequential  activation by cyclin binding and subsequent phosphorylation by CAK and  dephosphorylation by CDC25 protein phosphatase ¾This activation process occurs in a two‐step manner. in  addition to the TATA box binding protein or TFIIE iv. Cdk3.  ¾To date. Cdk5. thereby bringing together  specific residues involved in orienting ATP phosphate atoms ready for catalysis within  the catalytic cleft. specific cyclins. allowing  full activation of the Cdk. Cdk8. Phosphorylation of the cyclin/Cdk complex is performed by CAK which increases Cdk activity approximately 100‐fold.  i.10/29/2012 Cycle‐Dependent Kinases (CDKs) ¾The Cdks are a family of serine/threonine protein kinases that bind to. 5. Phosphorylation occurs on a conserved threonine residue within the T‐loop region of the Cdk (Thr160 in CDC2 and Thr161 in other  Cdks). These conformational changes also set the stage for subsequent  phosphorylation and full activation.  v. Cdk4. and are activated by.  Cdk6. and 6 complex mainly with the cyclin D family and function during the  G0/G1‐phases of the cycle. at least nine Cdks have been described: CDC2 (Cdk1). The activity of the cyclin T/Cdk9 complex is not cell cycle regulated but is  involved in many processes such as differentiation and basal transcription ¾Specific Cdks bind to specific cyclins to form an active complex that integrates signals  from extracellular molecules and controls progression through the cell cycle.  / p y . Cdk2 can also bind with members of the cyclin D family but more commonly  associates with cyclins A and E and functions during the G1‐ phase and during the G1/  S transition. Cdk8 pairs with cyclin C and is found in a large multiprotein complex with RNA  polymerase II. and CDK9. and histones.  Cdk2. Such substrates include the Rb pocket  proteins. where it is thought to control RNA polymerase II function  vi. ii. Cdk7. Cdk7 is found in association with cyclin H and is able to phosphorylate either CDC2. Cyclin binding  causes a conformational change in the Cdk molecule. the various cyclin/Cdk complexes phosphorylate a number of specific  substrates involved in cell cycle progression. Binding of the cyclin to the Cdk confers partial activity to the kinase. Cdk9 is a serine/threonine kinase related to CDC2 that pairs with T‐type  cyclins. as follows: 1. lamins. Cdks 4. Evidence exists to suggest that cyclins may be involved  in determining the substrate specificity of Cdks 18 . Finally. ¾ Once activated. or the C‐terminal domain of the largest subunit of RNA polymerase II.  iii. 2.

 in response to DNA  damage. and p57 (KIP2). cyclin A/Cdk2. the CDKIs  ¾The CDKIs comprise two structurally distinct families the INK4 (inhibitor of ¾The CDKIs comprise two structurally distinct families. cyclin  D/Cdk4. the entire  cyclin/Cdk complex ¾The tumour suppressor protein p53 also plays an important role in cell cycle  arrest at the G1 and G2 checkpoints subsequent to inducing apoptosis .  ¾A family of negative regulators also exists. p18 (INK4C). the INK4 (inhibitor of  Cdk4) and CIP (Cdk‐interacting protein)/KIP (kinase inhibitor protein) ¾The INK4 family includes p14. it can induce the transcription of the CDKI p21. since  / y p y p y y. cyclin D/Cdk6. p16 (INK4A). p27 (KIP1). cyclin E/Cdk2. which specifically inhibit G1 cyclin/Cdk complexes (cyclin D/CDK4 and  cyclin D/CDK6) and are involved in G1‐phase control. p15 (INK4B). and p19  (INK4D). and inhibit the activity of. members interact with.  which are 38–44% identical in the first 70‐amino acid region of their amino  termini—a region that is involved in cyclin binding and kinase inhibitory function. and cyclin B/CDC2 complexes and also  function throughout the cell cycle ¾Thus. CIP/KIP family members bind to. and inhibit the kinase activities of.10/29/2012 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors ¾The cyclins and Cdks often are referred to as positive regulators of the  eukaryotic cell cycle.  ¾The CIP/KIP family displays a broader specificity than the INK4 family.  ¾The CIP/KIP family includes p21 (CIP1/WAF1/SDI1). which inhibits the  activation of various G1 cyclin/Cdk complexes 19 . ¾Th 53 ¾The p53 protein has a central sequence‐specific DNA binding domain and a  t i h t l ifi DNA bi di d i d transcriptional activation domain at its amino‐terminus.

 but its binding capacity depends on its state of phosphorylation. and p130 ¾The Rb p protein is abundant in the nucleus of mammalian cells. ¾Th ¾These genes are transcribed at a high level in mutant cells that lack a  t ib d t hi h l l i t t ll th t l k functional copy of the Rb gene and at a much lower level in these cells when a  functional copy of the Rb gene is put back into them by transfection. h i ll i ll S h ¾The activation of cyclin D/Cdk4 and cyclin D/Cdk6 complexes is essential for  passage through the G1‐phase.  ¾Growth factors relieve the inhibition exerted by Rb by causing the protein to  become phosphorylated on multiple serines and threonines.  ¾It binds to many other proteins. the  phosphorylation of Rb makes it release these proteins. it binds a set of regulatory proteins that favor cell proliferation. that are required for proliferation. ¾When Rb is dephosphorylated. ¾The Rb family of pocket proteins comprises a group of tumor suppressor  proteins consisting of three members. holding them sequestered and out of action. p107. pRb.  ¾The Rb pocket protein family serves to repress the activity of the E2F  transcription factors that themselves are essential for transcription of genes  necessary for entry into S‐phase. The cells now  begin to express Cdk protein.  G1/S Transition ¾One of the most extensively studied substrates of the cyclin/Cdks is the  retinoblastoma (Rb) family of pocket proteins. 20 . allowing them to act ¾In the G0 cell it contains little phosphate and appears to hinder the transcription of genes. ¾The Ras/MAPK pathway has been shown to control cyclin D gene expression  ¾The Ras/MAPK pathway has been shown to control cyclin D gene expression directly. including several important gene regulatory  proteins.10/29/2012 G1 Regulation ¾Binding of a growth factor molecule to its cell surface receptor stimulate the  Ras‐dependent mitogen‐activated protein kinase (MAPK) pathway  ¾Once cells enter G1. and embark on DNA  synthesis. and they exert their regulation on cell cycle  progression by phosphorylating Rb pocket proteins. allowing cells to enter S‐phase. pass the G1 checkpoint. synthesis of the mRNAs and proteins necessary for DNA  synthesis occurs. such as fos and myc.

also called DNA replication licensing. or pre-RC. 21 . is strictly regulated to ensure that DNA replication occurs only once per cell cycle to maintain genomic stability. assembles at origins of replication (licensing). ¾The first step occurs in late mitosis and early G1.10/29/2012 Initiation of Transcription ¾Pre-replication complex (pre-RC) assembly. when components of the preRC nucleate l t the th fformation ti off a llarger protein t i complex l called ll d th the pre-initiation i iti ti complex. assemblyy in cells re-entering ¾The initiation phase of DNA replication is divided into two distinct steps that occur at different times in the cell cycle. ¾The second step occurs at the onset of S phase. called the prereplicative complex. ¾This complex then unwinds the DNA helix and loads DNA polymerases and other replication enzymes onto the DNA strands. ¾This step is sometimes called licensing of replication origins because initiation of DNA synthesis is permitted only at origins containing a pre-RC. ¾Cyclin E has been shown to have a role in pre-replication complex (Pre-RC) g the cell cycle y from q quiescence. thereby initiating DNA synthesis. when a large complex of initiator proteins.

 and alignment of condensed chromosomes at the  metaphase plate.  that it is fully and correctly replicated. a factor capable of  i i ll id tifi d th t ti ti f t f t bl f inducing M‐phase in immature Xenopus oocytes.  ¾ The G2‐phase is another gap phase in the cell cycle in which the cell assesses  the state of chromosome replication and prepares to undergo mitosis and  cytokinesis.  ¾In addition. ¾Another important event during S‐phase. retraction of the nuclear envelope. mitotic cyclin‐ CDK complexes phosphorylate multiple proteins that promote chromosome CDK complexes phosphorylate multiple proteins that promote chromosome  condensation. other than DNA replication.  causing dissociation from centrosomes and subsequent initiation of centrosome  duplication The G2/M Transition ¾ Mitotic cyclin‐CDK complexes are synthesized during the S phase and G2. ¾ The molecules that regulate cyclin B/CDC2 activity receive signals from the  checkpoint machinery 22 . the S‐phase cyclin‐CDK complexes phosphorylate regulatory sites in  the proteins that form DNA pre‐replication complexes.  ¾Cyclin E/Cdk2 plays an important role in centrosome duplication  ¾Using cell free centriole duplication system it was demonstrated that centrosome ¾Using cell‐free centriole duplication system it was demonstrated that centrosome  duplication was dependent on the presence of cyclin E/Cdk2 complexes. is centrosome  duplication.  ¾ Once activated by dephosphorylation of the inhibitory sites.10/29/2012 S-Phase ¾Once activated. and that replication occurs before cell division. ¾ Cyclin B/CDC2 is the key mitotic regulator of the G2/M transition and was  originally identified as the maturation‐promoting factor. cyclin E/Cdk2 was shown to phosphorylate nucleophosmin in this model. assembly of the mitotic  spindle apparatus. which are assembled on  replication origins during G1 ¾Phosphorylation of these proteins not only activates initiation of DNA replication but  also prevents reassembly of new pre‐replication complexes. each chromosome is replicated just once during passage  through the cell cycle. but  their activities are held in check by phosphorylation at inhibitory sites until  DNA synthesis is completed. ¾A number of checkpoints exist to ensure that DNA is replicated only once per cycle. ensuring that the proper chromosome number is maintained in  the daughter cells. ¾Because of this inhibition.

  ¾Full activation of CDC2 requires Thr161 phosphorylation by Cdk‐activating kinase (CAK). ¾This particular isoform associates with the Golgi and may play a role in Golgi  remodelling d lli during mitosis  d i it i ¾In contrast to cyclin B2.  ¾It appears that the Thr/Tyr kinase Myt1 is the critical kinase involved here. cyclin B/CDC2 complexes are held in an inactive state by  phosphorylation of CDC2 at Thr14 and Tyr15. cyclin B1 is thought to be responsible for most of the  actions of CDC2 in the cytoplasm and nucleus and it appears to compensate for  the loss of cyclin B2 in B2‐null mice implying that cyclin B1 is capable of targeting  CDC2 kinase to the essential substrates of cyclin B2 ¾Cyclin B/CDC2 complexes are regulated both positively and negatively by  phosphorylation ¾ Phosphorylation p y of CDC2 on the conserved T‐loop region (Thr160) is required  p g ( ) q for activation. ¾During G2. cyclin B1 and B2. Wee1 itself is  phosphorylated and inactivated by  Nim1 and other unidentified  kinases to induce mitosis. as is the case with all Cdks.  with a stronger affinity for Thr14.  ¾Protein phosphatase 1 (PP1) inactivates CDC25 by dephosphorylation of the same residue  that is phosphorylated by CDC2/cyclin B.  ¾Cyclin B/CDC2 becomes fully activated following dephosphorylation of these sites by the  protein phosphatase CDC25C ¾The serine/tyrosine kinase.  ¾Inhibition of CDC2 by wee1 is counteracted by the CDC25 dual‐specificity phosphatases.  Wee1 specifically phosphorylates Tyr15.  ¾Thr14 phosphorylation can be  mediated by Wee1 but only once  Tyr15 has been phospho‐rylated.  ¾Phosphorylation on Thr14 prevents ATP binding . and this phosphorylation event is  mediated by CAK.10/29/2012 Role of the Cyclin B/CDC2 Complex in the G2/M Transition ¾Cyclin B synthesis begins at the end of S‐phase  ¾Two cyclin B isoforms exist in mammalian cells. whereas that on Tyr15  interferes with phosphate transfer to the substrate owing to its positioning in the  ATP binding site on CDC2 Regulation of the CDC2/cyclin B complex ¾These inhibitory phosphorylation events are carried out by the kinases Wee1 and Myt1. and Myt1 phosphorylates both Tyr15 and Thr14.  ¾Studies in cyclin B1‐ and cyclin B2‐null mice have confirmed that cyclin B2 is  non‐essential for normal growth and development.  which then stabilizes CDC2 association with cyclin B. ¾CDC25 is phosphorylated and activated by CDC2/cyclin B (amplification pathway). 23 . Wee1  catalyzes phospho rylation of Tyr15 catalyzes phospho‐rylation of Tyr15  on CDC2.

  condensation of the chromosomes.  although most of these proteins have not yet been identified. the polo‐like kinases ddi i l f ili f i ki h l lik ki and the Aurora kinases. allowing the splitting of sister  chromatids and their delivery to each spindle pole • Activation of specific cyclin‐Cdk complexes drives progression through the  Start and G2/M checkpoints. cells have evolved a surveillance mechanism called the  spindle assembly also known as the mitotic checkpoint which is crucial for  ensuring fidelity in chromosome segregation.10/29/2012 ™Activated cylcin B/cdc2 complex phosphorylates a set of  proteins leading to the events like nuclear envelope breakdown. also make important contributions to the  control of early mitotic events Metaphase/Anaphase transition checkpoint • During mitosis. 24 .  rearrangement of the actin and tubulin cytoskeleton.  ™T ™Two additional families of protein kinases. leading to the final stages of cell division. • It triggers anaphase onset only when all the chromosomes are properly  attached and aligned at the equatorial plane. ™Each of these processes is thought to be triggered when M‐cdk phosphorylates specific proteins involved in the process. re arrangement of Golgi  apparatus. ™M‐Cdk does not act alone to phosphorylate key proteins  involved in early mitosis. progression through the metaphase‐to‐ anaphase transition is triggered not by protein phosphorylation but by  protein destruction. • The spindle assembly checkpoint examines whether prerequisites for  chromosome segregation have been met and thereby determines whether to  g g y execute or to delay chromosome segregation.

 leading to its  degradation through proteosome‐mediated proteolysis degradation through proteosome‐mediated proteolysis. ¾The APC/C catalyzes the ubiquitylation and destruction of two major  proteins. ¾These checkpoint components include Mad1. which normally protects the protein linkages that hold  sister chromatid pairs together in early mitosis. BubR1 functions synergistically with Mad2 in inhibiting Cdc20‐ APC activity.  ¾Once the chromosomes are aligned at the metaphase plate Mad2* is no  longer generated.  ¾After all the chromosomes are properly attached by kinetochore microtubules and aligned at the metaphase plate. and BubR1 does not interact with Cdc20‐APC.  ¾Activated Cdc20‐APC catalyzes the ubiquitination of securin.10/29/2012 ¾The major components involved in the spindle assembly checkpoint were  identified in two similar genetic screens in budding yeast for mutants that fail  to arrest in mitosis in the presence of spindle‐damaging agents. resulting in the  activation of Cdc20‐APC. the spindle assembly  checkpoint is turned off. M‐Phase Regulation ¾Unattached kinenetochores act as catalytic sites for the activation of Mad2. triggering the separation of sister chromatids and  the onset of anaphase.  ¾Destruction of securin at the metaphase‐to‐anaphase transition activates a  protease that separates the sisters and unleashes anaphase.  ¾The S‐ and M‐cyclins are the second major targets of the APC/C. ¾The first is securin which normally protects the protein linkages that hold ¾The first is securin.  ¾In addition.  ¾Activated Mad2 then diffuses and prevents anaphase onset by inhibiting the  activity of Cdc20‐APC. Mad3 (mitotic arrest  deficient) Bub1 and Bub3 (budding uninhibited by benzimidazole) Mps1  (monopolar spindle 1) initially identified as a kinase functioning in  duplication of the spindle pole body ¾This complex is established during DNA replication and maintains the  linkage between sister chromatids. Mad2.  ¾The free separin is then able to cleave the SCC1 subunit of the sister‐ chromatid cohesion complex. 25 .  ¾Degradation of securin in turn causes the release of separin.

¾Later in anaphase and telophase the APC promotes the inactivation of the mitotic cyclin-dependent protein kinase 1 by ubiquitinating its activating subunit cyclin B. including other protein kinases. and inhibitors of DNA replication. APC activators. 3547‐3555 ¾At the metaphase–anaphase transition the APC ubiquitinates proteins whose subsequent degradation by the 26S proteasome is essential for the initiation of sister chromatid separation. ¾The APC also mediates the ubiquitin-dependent proteolysis of several other mitotic regulators. spindle-associated proteins.10/29/2012 Spindle assembly checkpoint signaling Journal of Cell Science 115. ‐End of Cell cycle Regulation‐ 26 .

. The mechanism used by the tissues is unclear It is obvious it must be regulated by a complex network of signals and messages including growth factors. eg. epithelial-mesenchymal interactions) and circulating hormones.10/29/2012 Control of cell numbers in multi.cellular organisms ¾During normal development and throughout adult life. cytokines and hormones. the female germ line and the central nervous system there is little or no cell replacement or capacity for regeneration Control of cell division is important in rapidly growing tissues. and death signals. e. there is continuous loss of cell either by surface abrasion. ¾The number of cells produced by cell division precisely balances cell loss in order for the tissue to maintain its size and mass ¾In tissues such as the liver. 27 . prostate and connective tissues. growth-inhibiting signals. ¾In tissues such as skin.. intricate genetic control systems regulate the balance between cell birth and death in response to growth signals.g. intestine and the hematopoietic system. ¾In some tissues. These signals can be produced by the cells themselves (autocrine regulation) regulation). may be produced by neighboring cell os either similar or unrelated cell types (paracrine. there is little or no replacement p under normal conditions ((takes p place only y when the integrity is compromised). breast. by damage of due to senescence ¾The cell loss has to be compensated for by cell production.

Proto-oncogenes are activated to become oncogenes by mutations that cause the gene to be excessively active in growth promotion. which include certain chemicals and ultraviolet radiation. forming secondary tumors that often have the greatest health impact. In some cases cells from the primary tumor migrate to new sites (metastasis).10/29/2012 ¾The losses of cellular regulation that give rise to most or all cases of cancer are due to genetic damage ¾Mutations in two broad classes of genes have been implicated in the onset of cancer: proto-oncogenes and tumorsuppressor genes. does mutation in a single gene lead to the onset of cancer. ¾Eventually the clone of cells grows into a tumor tumor. somatic mutations can combine with inherited mutations to cause cancer. ll giving i i rise i tto a clone l off altered lt d cells. ¾Many of the genes in both classes encode proteins that help regulate cell birth or cell death by apoptosis. ¾Cancer-causing mutations occur mostly in somatic cells. ¾Rarely. however. ¾Most cancers arise after genes are altered by carcinogens or by errors in the copying and repair of genes. division of this cell will ill ttransmitit th the d damage tto th the d daughter ht cells. and somatic cell mutations are not passed on to the next generation. a series of mutations in multiple genes creates a progressively more rapidly proliferating cell type that escapes normal growth restraints. increase the probability that cancer will occur at some time. others encode proteins that participate in repairing damaged DNA. ¾Tumor suppressor genes normally control growth. so damage to them allows inappropriate growth. creating an opportunity for additional mutations. certain inherited mutations. More typically. not in the germ-line cells. ¾Cancer commonly results from mutations that arise during a lifetime’s exposure to carcinogens. 28 . which are carried in the germ line. ¾In a destructive partnership. ¾Even if the genetic damage occurs only in one somatic cell. ¾In contrast.

¾To grow to more than a small size. ¾They fail to sense signals that restrict cell division and continue to live when they should die. ¾When these tumors progress. breaking loose to divide more rapidly. tumors become an abnormal organ. lessharmful tissue without a significant tumors of glial cells).. increasingly well adapted to growth and invasion of surrounding tissue ¾Tumors that are localized and are of small size are called benign tumors ¾In contrast. a tumor of white blood cells). or invade nearby g change g in their p proliferation rate ((e.g.10/29/2012 Properties of Tumor Cells ¾Cancer cells proliferate without an external inducing signal. g . tumors must obtain a blood supply. get into the body’s circulatory system. 29 . rapidly dividing cell. and they often do so by signaling to induce the growth of blood vessels into the tumor.g. and establish secondary areas of proliferation. a process called metastasis. ¾A cancer cell may. ¾As cancer progresses. such as those in the ovary or breast. the cells invade surrounding tissues. chronic lymphocytic leukemia. but the cancer cell and its progeny will exhibit inappropriate immortality. or cancer. usually grow and divide more rapidly than normal. cells composing a malignant tumor. up to a point. resemble a particular type of normal.. ¾They often change their attachment to surrounding cells or the extracellular matrix. fail to die at the normal rate (e. remain localized and encapsulated. at least for a time. ¾Some malignant tumors.

 and then in  only a few mice.  ¾This heightened transcription of c‐myc mimics oncogenic mutations that turn  up c‐myc transcription. however. ¾Ras protein in its GTP-bound form is active and stimulates a cascade of protein phosphorylations in the cell. the normal c‐myc gene is overexpressed in  breast tissue because the promoter is induced by endogenous hormone levels  and tissue‐specific regulators. the c‐myc transgene causes tumors only after 100 days. GDP-bound form. converting the proto‐oncogene into an oncogene.  ¾When linked to this promoter.  ¾Similarly.10/29/2012 ¾Subsequent studies showed that the cloned segment included a mutant version of the cellular ras gene. the protein is in its inactive. Most of the time. clearly only a minute fraction of the mammary cells that  overproduce the Myc protein become malignant. production of the mutant RasD protein alone causes tumors earlier  but still slowly and with about 50 percent efficiency over 150 days but still slowly and with about 50 percent efficiency over 150 days. ¾When the c‐myc and rasD transgenics are crossed.  ¾By itself. Multiple mutations are required for tumor induction  ¾Transgenic mice carrying both the mutant rasD oncogene and the c‐myc protooncogene controlled by a mammary cell–specific promoter/enhancer from  a retrovirus was generated. such that all  mammary cells produce both Myc and RasD. however. tumors arise much more rapidly  and all animals succumb to cancer 30 .

¾Metastasis requires the disruption of local cell–cell interactions. Colonize new site Tumor growth is angiogenesis dependent 31 . Intravasation 3. invasion. Extravasation 4. 1.10/29/2012 Steps in the process of metastasis ¾Metastasis is the escape of cancer cells from a primary site and their re‐establishment at  distant secondary locations.  migration and growth. escape from those vessels (extravasation). Invasion 2. penetration of  blood or lymphatic vessels (intravasation).

 which act as brakes or checkpoints on a cell’s  progression through the cell cycle.  ¾This is the first step on a pathway that can eventually lead to an aggressive. Peyton Rous laid the groundwork for the oncogene theory of cancer. metastatic tumor.  ¾These mutations may be caused by environmental. organisms possess several means of dealing with environmental  insults and genetic alterations. using a filtrate of the tumor.  p p y y gg .  ¾Fortunately.  ¾Seven years later. ¾More than one mutations is required for the development of cancer Oncogenes and the Oncogene Hypothesis ™In 1911.  so that progeny cells also carry the same mutations that allow for uncontrolled  growth.  ¾These early results suggested a transmissible mechanism for tumor initiation 32 .  ¾Loss of regulation occurs when mutations arise in two broad families of genes  th t that regulate growth: Oncogenes.10/29/2012 The conversion of a Normal cell to a Tumor cell ¾A cell becomes converted from a normal to a neoplastic cancer cell when the  regulation of one or more processes is lost. Shope provided further evidence that for  the viral basis of oncogenesis by his demonstration that a papilloma‐like growth  was transmissible from animal to animal. the viral src oncogene. Temin and Rubin showed that cultured chicken fibroblasts  with the Rous sarcoma virus causes neoplastic transformation of the cells. which act as positive signals for growth and  l t th O hi h t iti i l f th d Tumor‐suppressor genes.  ™He identified a spindle‐celled sarcoma in chickens that was transplantable from  one bird to another.  ¾From these extracts. the Gross murine leukaemia virus was isolated.  ¾Gross showed that mice inoculated with leukaemic extracts developed  neoplams. a  theory that became the basis for all modern cellular signaling and genetic  research.  ™The infectious agent responsible for the tumors was later found to be the Rous ™The infectious agent responsible for the tumors was later found to be the Rous  Sarcoma virus. chemical or biological  agents or events that result in irreversible alterations in the genome of a cell.  ¾Building on the early work of Rous.  ¾Martin and others later identified the oncogenic portion of the RSV genome as  v‐src.

 where  radiolabelled v‐src DNA was found to bind.  ¾These normal genes are termed proto‐oncogenes.  ¾Similar studies eventually led to the identification of a family of viral  oncogenes which can be transmitted by either DNA or RNA viruses oncogenes. conferring on the gene tumorigenic properties. ¾Ensuing infection of a normal cell by an RNA tumor virus carrying such an oncogene causes malignant transformation of that cell. which can be transmitted by either DNA or RNA viruses Oncogenes ¾Several lines of evidence indicate that viral oncogenes arise when an RNA virus  integrates its genome near the coding sequence for a proto‐oncogene and incorporates  the proto‐oncogene’s DNA into its own genetic material during the virus replication cycle. that are  carried by tumor‐inducing viruses have normal counterparts that are present in  the genomes of all vertebrate cells. deletions and other  mutations occur in the proto‐oncogene. or oncogenes. Example of human oncogenes 33 . to its complementary  counterpart (c‐src) in normal avian cellular DNA.  ¾Evidence for this hypothesis came from hybridization studies.  ¾These phosphorylations have profound effects on cell growth. or hybridize.  ¾The v‐src and c‐src genes encode a tyrosine kinase. an enzyme that transfers  phosphate from ATP to the amino acid tyrosine found in cellular proteins. ¾Through multiple rounds of infections and genome replication.10/29/2012 Oncogene Hypothesis ¾The best‐known theory of oncogenesis was put forward by Bishop and Varmus  who have hypothesized that cancer‐causing genes.

 transmit cellular growth signals by binding guanine  nucleotides in the form of GTP or GDP.  carcinomas of the breast.  ¾DCC was mapped to chromosome 18 and is deleted in 73% of colon cancers.  enzymes that are able to phosphorylate substrate proteins on tyrosine residues  and that are known to be essential for controlling the siganaling cascades that  regulate mitosis. ¾APC and DCC code for proteins that play roles in regulating cell adhesion in  normal cells normal cells. or mutation promotes oncogenesis.  ¾Others such as Ras. ¾Serine‐threonine kinaes.10/29/2012 Proto-Oncogenes ¾Proto‐oncogenes can be classified as either cytoplasmic or nuclear. depending  on where in the cell they are localized. which causes the molecule to be constitutively active. are the targets of Ras kinaes are the targets of Ras and constitute another family of  and constitute another family of proto‐oncogenes that regulate proliferation.  ™It is mutated or deleted in over 70% of human cancers including osteosarcomas. ¾Other tumor suppressor genes include.  ¾The MCC which is also located in the same chromosome is mutated in 55% of all  colon cancers.  the ‘deleted in colon cancer’ (DCC) gene and the ‘mutated in colon cancer’ (MCC)  gene. lung and prostate  34 . ‘adenomatous polyposis coli’ (APC) gene.  ¾Many of the cytoplasmic proto‐oncogenes code for tyrosine kinase molecules. colon.  ¾APC maps to chromosome 5q21 and is mutated in 70% of patients with a  hereditary form of colon cancer.  expression inactivation.  ¾It is speculated that loss of these genes can lead to increases in cell motility.  ¾Ras is often found mutated at single sites such that it is constantly bound to  GTP. a  key characteristic of metastasis ™p53 – is involved in sensing DNA damage and regulating cell death.  ¾Mutations in Ras are found in approximately 30% of human cancers. Nuclear oncogenes such as myc regulate gene transcription Tumour suppressor genes ™Tumour suppressor genes (TSGs) encode proteins whose absence. repression. ¾Retinoblastoma (Rb) gene was the first tumor suppressor gene to be identified.

4.  ¾Loss of chromosome 17q had long been known to occur in familial breast cancer.  ¾The resulting colocalization of kinases facilitates PDK (PH‐domain‐containing kinase)  phosphorylation (activation) of PKB. Tumor suppressor gene and their functions and associated cancers 35 .5)P3 and subsequent recruitment of both  PKB (Akt/RAC) and PDKs to the plasma membrane. ¾ ¾PTEN mutations occur in many tumour types and are associated with different stages of  d d h d ff f tumorigenesis. a stop codon and a missense substitution.  ¾BRCA 1 gene codes for a protein called breast cancer type 1 susceptibility protein.  ¾Many heritable mutations were identified in BRCA1 from breast cancer patients and  include an 11‐bp deletion. also known as  MMAC1 (mutated in multiple advanced cancers) and TEP1 (TGF‐regulated and epithelial  cell‐enriched phosphatase) was first identified as a tumours uppressor gene localized on  chromosome 10q23. which in turn phosphorylates substrates involved in  cell growth and survival.  ¾BRCA1 is expressed in the cells of breast and other tissue. where it helps repair  p . p p damaged DNA. damaged DNA is not repaired properly and this increases  risks for cancers.  responsible for repairing DNA. ™PTEN gene ¾PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten). or destroy cells if DNA cannot be repaired. phosphoinositide 3 kinase (PI3K)  activation leads to the production of PtdIns(3.10/29/2012 ™BRCA1 and BRCA2 ¾BRCA1. ¾In response to mitogen or cytokine stimulation. a 1‐bp insertion.  ¾If BRCA1 itself is damaged. was found to be linked to an increased risk of hereditary breast cancer.

 leading to overproduction of the encoded  protein Cancer-Causing Viruses Contain Oncogenes or Activate Cellular Protooncogenes 36 . or activation.e... abnormal DNA replication) of a DNA segment including a proto‐ oncogene. unlike that of the parent proteins.10/29/2012 The Genetic Basis of Cancer Conversion. often is  constitutive • Chromosomal translocation that brings a growth regulatory gene under the control  of a different promoter that causes inappropriate expression of the gene p pp p p g • Amplification (i.  ¾At least four mechanisms can produce oncogenes from the corresponding proto‐ oncogenes: • Point mutation (i. change in a single base pair) in a proto‐oncogene that results in  a constitutively active protein product • Chromosomal translocation that fuses two genes together to produce a hybrid gene  encoding a chimeric protein whose activity.e. so that numerous copies exist. of a proto‐oncogene into an oncogene generally involves a  gain‐of‐function mutation.

  ¾It is characterized by distinct changes in cell volume. Dietary‐related factors. membrane‐bound apoptotic  bodies. The nucleus decreases in size. Occupational carcinogens. nuclear organization and the  topology of the cell membrane topology of the cell membrane. Environmental pollution. bodies. Apoptosis is a process whereby cells die in a controlled. nuclear chromatin. The cleaved DNA forms a  characteristic “ladder” pattern of fragments of 100 + n(100) base pairs in size (1 < n < 8)  that can be readily visualized by agarose gel electrophoresis.10/29/2012 The causes of cancer could be anything like the following Tobacco. At about this time. the apoptotic bodies bud off of the cell and are degraded as they are  “ingested” by phagocytes and neighboring epithelial cells. programmed manner in response  to specific stimuli. Radiation. Mutagens Apoptosis Cell death: Cells can die by either of two major mechanisms: necrosis or apoptosis.  ¾In the third stage. ¾Apoptosis generally occurs one cell at a time and typically takes several hours to  complete 37 . and cell volume decreases by about  one third. Genetic predisposition. Reproductive and hormonal  factors. both the  nucleus and the cytoplasm begin to break apart into small. an  endonuclease (or endonucleases) begins to cleave DNA. which is a complex of nucleic acids and proteins in the cell  nucleus.  ¾There are three stages of apoptosis that are best described by morphological criteria  ¾First. In this phase. Infections. Medical carcinogens (non‐ radiation).” which  means the cell membrane forms folds and becomes invaginated.  ¾The second stage of apoptosis involves characteristic membrane “blebbing. condenses.

 It can be  complement mediated. occasional small fragments of DNA are  produced. the other common pathway for cell death.  ¾Necrosis typically occurs in groups of cells. when cells are too damaged  to survive. and takes many hours or days to  complete.  g p g g ¾Over a period of hours to days. is characterized  by a gradual dissolution of cell structure and eventual rupture of the cell  membrane. Necrosis in organisms is typically accompanied  by acute inflammation and secondary scarring.  ¾Necrosis begins with an initial phase of generalized cell swelling.  ¾DNA is not fragmented in a patterned way. meaning it is caused by an external insult. Necrosis is never physiological. or caused by high levels of various toxic compounds Hallmarks of the apoptotic and necrotic cell death process. it  is always pathological.  ¾Necrosis generally occurs after major toxic insult.10/29/2012 Necrosis In contrast.  38 . ¾caused by severe hypoxia.  ¾If degradation of DNA occurs. there is gradual dissolution of organelles and  rupture of the plasma membrane. necrosis. but some DNA degradation may  occur. resulting in a “smeary” ladder pattern when the DNA is  d d lti i “ ” l dd tt h th DNA i electrophoresed on agarose gels.

 one of the earlier steps in apoptosis  was attributed to a “protease resembling ICE” ¾PARP‐1 cleavage produces an 89 kDa C‐terminal fragment (containing the  catalytic domain).10/29/2012 Molecular Mechanisms of Apoptosis ¾Apoptosis is a tightly regulated process  ¾It requires highly efficient cell death program which requires the interplay of a  multitude of factors ¾Apoptosis is an active. although it cannot be stimulated by DNA strand breaks. The 89  kDa fragment retains the basal enzymatic activity due to the presence of the  catalytic domain. ¾Caspase activation occurs in a cascade like way. ‐6.  ¾Such enzymes with cysteine protease activity Polymerase‐1 cleavage during  apoptosis have been designed as “caspases”. ¾Caspases may be divided into “initiator” caspases with long prodomains (caspases‐8. in  eukaryotic cells. ¾To date. but it is not  known precisely which of these caspase(s) are activated in vivo and which are  responsible for the cleavage of particular substrates. ¾Poly(ADP‐ribosylation) is a post‐translational modification of proteins that. After  cleavage. energy‐dependent process p p ¾It has been proposed that the ATP intracellular level is the crucial condition to  make decision of activating the energy‐dependent apoptotic pathway or the  passive necrosis. this name being composed by “c”  (cysteine) and “aspase” (ability to cleave after an aspartic acid). which in turn cleave intracellular  substrates. NAD+ consumption is prevented. and ‐10). plays a crucial role in DNA repair and replication. and ‐7). and represents a cellular emergency reaction ¾The cleavage of PARP‐1 during apoptosis. ¾PARP‐1 loses the nick‐sensor function and is inactive towards DNA damage. transcription  and cell death. a family of at least 10 caspases have been identified. which activate “effector” caspases with short  prodomains (caspases‐3. The proteolytic cleavage of a  regulator caspase activates downstream effector caspases to promote the  cleavage of a number of substrates. and the 24 kDa N‐terminal fragment with the DBD. Caspases ¾Later several proteases of the ICE family such as CPP32/ YAMA/Apopain were  found to cleave PARP‐1 during apoptosis.  Therefore. ‐9. resulting in the dramatic morphological and biochemical changes of  apoptosis.  39 .

 caspase . which induce apoptosis when over expressed ¾ The family members form both homodimers and heterodimers ¾ In both the pathways activation of caspases play an important role in the execution of apoptosis A model for p53-mediated apoptosis ¾p53.  ¾FAS and DR get activated by binding of their corresponding ligands. Bik etc. p 6 and caspase p 7 40 . Bcl-W. mutated or lost in . Activation  of FAS and DR activates the procaspase 8 which in turn activates the effector caspases p like caspase p 3. FAS and DR (death receptor). in response to stress or DNA damage transcriptionally activates the  checkpoint proteins like p21 and arrests the cell cycle to facilitate DNA repair  involving the nucleotide excision repair and base excision repair ¾If the damage is beyond repair it activates apoptosis by the transcriptional  activation of its effector ti ti f it ff t genes like PUMA. Bak. Bfl-1. p53 activates the expression and trafficking of the  membrane receptors. Bad. ¾p53 was widely recognized as a tumor suppressor gene. which act as pro-survival proteins and ¾ The pro-apoptotic members such as Bax. Mcl-1.  d Bid ¾p53 induces apoptosis both by extrinsic pathway and intrinsic pathway  involving the mitochondria  ¾In the extrinsic pathway. Bcl-XL.50% of all human cancer cases worldwide ¾ The Bcl-2 family includes the anti-apoptotic members such as Bcl-2... Bax lik PUMA NOXA B and Bid. etc.10/29/2012 Pathways of Apoptosis ¾There are two major pathways of apoptosis ¾ The p53 dependent pathway and a p53 independent pathway involving the apoptotic regulators like the Bcl-2 family of proteins. NOXA.

10/29/2012 Model for p53 Induced Pathway of Apoptosis TRAIL Extrinsic Pathway Y FAS-L FAS DR5 p53 p53 Caspase 8 Caspase-8 Noxa Cyt c p53 Puma Apaf 1 Mitochondria Apoptosome Bax-Bax Caspase-9 Intrinsic Pathway Caspase-6 Caspase-3 Caspase-7 Apoptosis Haupt et al 2003. Noxa. and a transmembrane domain. BH2 BH2. ¾Family members are classified on the basis of structural similarity to the Bcl-2 ¾homology (BH) domains (BH1 (BH1. Bid. Hofseth et al 2004 Intrinsic Pathway ¾The intrinsic apoptotic pathway is dominated by the Bcl-2 family of proteins. which are structurally similar to Bcl-2 and Bcl-XL and antagonize their pro-survival functions. is the minimum domain required for the proapoptotic function ¾The Bcl-2 family is divisible into three classes: prosurvival proteins. PUMA and the most recently identified. whose members are most structurally similar to Bcl-2. Bax and Bak. BH3 and BH4) BH4). including Bax. and the pro-apoptotic ‘BH3-only’ proteins. which governs the release of cytochrome c from the mitochondria . such as Bcl-XL. ¾A key subset of the Bcl-2 family genes are p53 targets. which is present in all members and is essential for heterodimerization among members. ¾The BH3 domain. 41 . ¾The Bcl-2 family comprises anti-apoptotic (pro-survival) and pro-apoptotic members. ¾Pro-apoptotic proteins.

bcl-W. ¾Upon phosphorylation of bcl-2. bcl-XL. bax is released from the bcl-2-bax complex and undergoes bax-bax homodimerization. bcl-2 forms a complex with bax and phosphorylation of bcl-2 inhbits the formation of bcl2-bax complex. bad. In the unphosphorylated form. ¾Hence. ¾This Bax-Bax homodimer integrates into the mitochondrial membrane and alters its membrane potential leading to release of cytochrome c and activation of apoptosis as mentioned above. ¾This leads to the activation of bcl2 specific kinase which causes phosphorylation of bcl2. bak and the antiapoptotic proteins like bcl2. a balance between bcl2-bax heterodimer and bax-bax homodimer is required to maintain the cell survival 42 . ¾The bcl2 family of proteins has the tendency to form homodimers or heterodimers. and Bfl-1. p53 activates the expression of the effector proteins like bax which upon binding to mitochondria cause release of cytochrome c (cyt c) from the mitochondria ¾Cytochorme c binds to the apoptosis activating factor 1(Apaf 1(Apaf-1) 1) and caspase 9 and this complex activates the downstream effector caspases leading the execution of apoptosis The Bcl2-Bax pathway of apoptosis ¾The bcl2 pathway involves the bcl2 family of proteins consisting of the proapototic proteins like bax. bid.10/29/2012 ¾In the Intrinsic pathway. ¾Microtubule targeted agents suppress the microtubule dynamics and block the cell cycle progression at mitosis.

10/29/2012 Model for Bcl2-Bax Pathway of Apoptosis Activation of Bcl2specific Kinase Microtubule targeted drugs Mitotic block P P Bcl2 Bcl2 Bax Bax Bax Bcl2 Bax Bcl2 P Bcl2 P P Bax Bcl2 Bcl2 Bcl2 Bax Bcl2 Bax Bax Bax Bax P Bcl2 Bcl2 hyper-phosphorylation Dissociation of bcl2-bax Activation of Caspase cascade Apoptosis Mitochondria Bax-Bax Bcl2 Bax Release of Cyt c Increased ratio of bax-bax homodimer Basu and Haldar 1998. Oltvai et al 1993 43 .