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PRACTICA #

ACTIVIDAD RESPIRATORIA ASOCIADA A LA MADURACION DE FRUTOS


Introduccin
La respiracin es el proceso mediante el cual la materia orgnica
(carbohidratos, protenas, grasas) se descompone para dar lugar a productos
finales simples con la liberacin de energa: sustrato + O 2 CO2 + H2O + ATP y
calor. La respiracin consume oxgeno del medio ambiente y sustrato del rgano
vegetal.
El estado de desarrollo de la planta u rgano vegetal ejerce un efecto muy
pronunciado sobre la actividad respiratoria y metablica del tejido vegetal. Por lo
general, las clulas jvenes, de crecimiento activo tienden a tener una mayor tasa
de actividad respiratoria que las clulas senescentes o ms maduras.
Atendiendo a los cambios en la actividad respiratoria que ocurren en los frutos
cosechados durante las etapas finales de la maduracin del rgano, stos se
pueden clasificar tpicamente en dos grupos, climatricos y no climatricos. Los
frutos clasificados como climatricos exhiben una elevacin marcada en su
actividad respiratoria hacia el final de la fase de maduracin. La etapa climatrica
representa una transicin entre la maduracin y la senescencia. Los frutos no
climatricos no exhiben dicha elevacin en la actividad respiratoria, sino una
disminucin progresiva y lenta hasta la senescencia (Fig. X1).

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Fig. X.1. Cambios en la respiracin durante el crecimiento, desarrollo y


maduracin de los frutos climatricos y no climatricos (modificada de Kays,
1991).

Existen factores internos y externos que determinan la actividad respiratoria;


entre los internos se encuentran la especie, la variedad o cultivar, el tipo de
rgano vegetal, tamao, composicin qumica, condicin (infecciones, dao
mecnico) y estado de desarrollo o madurez. Los factores externos o del medio
ambiente incluyen la temperatura, la humedad relativa y los niveles de O 2, CO2 y
de etileno (C2H4) en el ambiente.

Mtodos para cuantificar la actividad respiratoria.

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Para cuantificar la respiracin de un producto usualmente se emplean dos


mtodos:
Mtodos Estticos.- Se coloca el producto en un contenedor hermtico cerrado y
se determina la disminucin en los niveles de O 2 o el aumento en la concentracin
de CO2 o la concentracin de ambos gases despus de un tiempo determinado
tomando muestras de la atmsfera encerrada en el contenedor (Fig. X.2.A). En
este sistema cerrado se debe tener cuidado de no dejar el producto encerrado por
ms de 1-2 horas, ya que la disminucin excesiva de los niveles de O 2 y la alta
acumulacin de los niveles de CO 2 afectarn subsecuentemente la tasa de
respiracin. No se recomienda permitir una acumulacin de CO 2 mayor o igual al
0.5% (Kays, 1991).
Mtodos Dinmicos.- Emplean un flujo continuo de aire de composicin conocida
que fluye a travs del contenedor en el que est encerrado el producto (Fig.
X.1.B). En el momento en que se colocan los productos en el contenedor se
exponen al aire durante una hora. Se conecta la manguera de entrada (parte
superior del contenedor) en la fuente de aire y se ajusta el flujo de aire a 450-500
mL/min para el caso de los frutos climatricos y a 300-400 mL/min para los no
climatricos. Un flujo de aire excesivo proporciona diferencias extremadamente
bajas entre los gases entrantes y salientes del contenendor, resultando muy difcil
cuantificar con un nivel aceptable de precisin. Cuando los flujos de aire son muy
lentos entonces ocurre una acumulacin inapropiada de CO 2 o la disminucin
inadecuada de O2, lo cual tambin afecta los clculos de la tasa de respiracin.
Por otro lado se debe permitir suficiente tiempo al sistema para alcanzar un
equilibrio (momento en el que dos determinaciones sucesivas no cambien).
Para fines de clculos se debe conocer la velocidad de flujo a travs del
contenedor y el peso del producto, adems de la diferencia en la concentracin de
O2 y CO2 de entrada y salida del contenedor (Kays, 1991) (Fig.X. 2.B).

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Fig. X.2. Sistema esttico (A) y sistema dinmico (B) para colectar las muestras de
gases de los frutos.

Factores a considerar antes de realizar la cuantificacin de la actividad


respiratoria.

Factores Internos que afectan la actividad respiratoria


En general, la actividad respiratoria es especfica en intensidad segn la
especie de que se trate e incluso dentro de cultivares.

El estado de desarrollo.- Los frutos se caracterizan por exhibir una alta


actividad respiratoria en estados jvenes que disminuye en estados
posteriores, con la excepcin de los frutos climatricos, que al madurar,
presentan un resurgimiento de la respiracin.

Composicin qumica de los tejidos.-

La relacin entre la actividad

respiratoria y la composicin qumica vara segn el sustrato (carbohidratos,


lpidos, protenas, cidos orgnicos) empleado en el proceso respiratorio
del producto que se considera, esto es, el cociente respiratorio.

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Tamao del producto.- Los frutos chicos por unidad de peso o volumen,
presentan mayor superficie expuesta a la atmsfera y, por lo tanto, la
actividad respiratoria es mayor.

Factores Externos que influyen sobre el climaterio respiratorio

Temperatura.-

Este factor tiene un efecto directo en la velocidad de la

actividad respiratoria: a mayor temperatura, mayor actividad respiratoria, lo


que acelera el proceso de maduracin. En el caso particular de los frutos
climatricos las temperaturas superiores a 30-35C o inferiores a las
recomendadas para el almacenamiento refrigerado, pueden suprimir el
climaterio respiratorio. As tambin en este tipo de frutas, a medida que la
temperatura de almacenamiento disminuye desde alrededor de 25C, la
duracin del aumento climatrico se prolonga y se abate la tasa de
respiracin en el pico climatrico.

Composicin Atmosfrica.- Las concentraciones del oxgeno y del dixido


de carbono ambientales modifican la velocidad de la actividad respiratoria,
esto es, si los niveles de oxgeno son ms bajos (<21%) y los de dixido de
carbono ms altos (>0.03%) que los del aire entonces la respiracin se
reduce y consecuentemente se prolonga la vida de almacenamiento. Si se
rebasan los niveles recomendados se manifiestan daos metablicos. En
el caso de los frutos climatricos las bajas concentraciones de O 2 (3-5%) y
altas concentraciones de CO2 (hasta aproximadamente el 10%) pueden
prolongar el tiempo en alcanzar el pico climatrico, extendiendo as su vida
de almacenamiento.
Tambin se puede disminuir la actividad respiratoria en los frutos y otros
tejidos vegetales no climatricos

mediante bajos niveles de O 2 y altos

niveles de CO2.

Etileno.- Estimula la respiracin de tejidos y rganos vegetales. Sin


embargo, esta respuesta difiere entre los tipos de frutos climatricos y no
climatricos, as, la exposicin de frutos climatricos a concentraciones
fisiolgicas de etileno (0.01-0.1 ppm L/L) acorta el tiempo en que ocurre

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el climaterio estimulando la maduracin sin un efecto sustancial en la


intensidad respiratoria. Una vez que se ha iniciado la maduracin la
remocin del etileno no tiene ya efecto sobre el patrn respiratorio
subsecuente ya que cuentan con el sistema I y II de sntesis autocataltica
de etileno. En el caso de los frutos no climatricos la respiracin es
estimulada por el etileno de manera proporcional a la concentracin
aplicada; sin embargo, al retirar el etileno la tasa de actividad respiratoria
regresa al valor base encontrado antes de dicho tratamiento ya que slo
cuentan con el sistema I de sntesis de etileno.

Daos mecnicos y microorganismos.- Provocan un aumento en la


actividad respiratoria. La intensidad de la respuesta depende en gran parte
de la severidad de los daos y de la variedad de los frutos (probablemente
debida tambin al desencadenamiento de la produccin de etileno).
Tericamente, los cambios en cualquiera de los productos resultantes de la

respiracin se pueden usar como medida de este proceso.


C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + ATP + calor
En vista de que las reacciones involucradas en la respiracin se llevan a cabo en
un medio acuoso, la pequea cantidad de agua producida en relacin con el
volumen total de agua presente en el tejido no se puede medir exactamente.
La produccin de energa, ya sea atrapada qumicamente o liberada en
forma de calor, es tambin difcil de medir con exactitud, aunque existen mtodos
para determinarla (medidas calorimtricas, rayos infrarrojos). Como consecuencia,
la utilizacin de O2 o la produccin de CO2 se usan casi invariablemente para
monitorear la respiracin.

Cromatgrafo de gases
El principio de funcionamiento del cromatgrafo de gases se describe en el
captulo 1 del Manual de prcticas de qumica analtica II (Verde, et al., 2012).

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Objetivos

El alumno ser capaz de determinar la actividad respiratoria de frutos


climatricos y no climatricos en varios estados de madurez, utilizando
el mtodo esttico.

El alumno ser capaz de determinar los cambios fsicos (firmeza, color,


patrn ptico de contenido de almidn) y qumicos (Brix, acidez, pH)
en los diferentes estados de madurez de frutos climatricos y no
climatricos.

El alumno ser capaz de asociar la actividad respiratoria con los


cambios de maduracin correspondientes a los frutos climatricos y no
climatricos.

Materiales y reactivos

Material biolgico:

1 kg de pltanos de cada uno de los estados de madurez indicados en la


figura X.3.

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Fig.X 3. Carta de estados de madurez del pltano.

1 kg de limn mexicano (Citrus aurantifolia, Swingle) en los estados de madurez


indicados en la figura X.4. Un estado de madurez por equipo de alumnos segn lo
indique el (la) profesor(a)

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Figura X.4 Estados de madurez del limn Mexicano


Reactivos

Patrn estndar de CO2 de concentracin conocida (1 a 5%, balance


nitrgeno) en un bulbo de vidrio para muestreo de gases.

Solucin de lugol (yodo-yoduro de potasio al 10%) en goteros.

Solucin de NaOH 0.1N.


Consultar medidas de seguridad (anexo X).
Material de vidrio (por equipo de alumnos):

Contenedor de vidrio o acrlico de 5 - 10L. de capacidad. Pueden


utilizarse desecadores adaptados con tapones de hule para tomar
muestras del espacio de cabeza (pueden ser frascos grandes de
mayonesa cuya tapa sea perforada y se le coloquen 1 a 2 tapones de
hule).

1 Bureta

1 Soporte universal

Pinzas para bureta

2 Pipetas graduadas de 10 mL

1 Pipeta graduada de 1 mL

6 Vasos de precipitados de 250 mL

6 Matraces Erlenmeyer de 125 mL

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1 Batidora de inmersin

3 Embudos de cuello corto

Tela de organza

Utensilios (por equipo de alumnos):

2 Jeringas desechables de 3 5 mL (al menos 2 por equipo)

3 Agujas desechables de 21X32mm (1 ) (al menos 3 por equipo)

1 Extractor de jugos

1 Exprimidor de ctricos

1 Cuchillo

1 Tabla de madera o plstico


Equipo de laboratorio

1 cromatgrafo de gases con detector de conductividad trmica, gas


acarreador Helio de preferencia (puede utilizarse nitrgeno tambin).

Potencimetro

Refractmetro (escala 0-32Brix).

Penetrmetro Effe-Gi.

Desarrollo experimental. Mtodo Esttico


1.- Colque 1kg de material biolgico en un contenedor de vidrio o acrlico,
asegrese de que quede bien cerrado y permita que el producto permanezca
una hora.
2.- Estabilice el cromatgrafo de la siguiente manera:
Abra la llave del gas acarreador del cromatgrafo.
3.- Encienda el control principal del cromatgrafo, espere 20-30 minutos con el
gas fluyendo para que el equipo se estabilice.

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4.- Encienda el detector de conductividad trmica. Espere a obtener la lnea base


en el integrador (1-2 horas despus de que ha sido encendido el detector del
cromatgrafo).
Nota:

Los pasos 2 a 4 ya se habrn realizado por parte de los


instructores, por practicidad, para evitar prdida de
tiempo de sesin de laboratorio.

5.- Encienda la computadora y vase el instructivo para manejar el software del


integrador.

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Instructivo de Uso del Programa Clarity para el Uso en Conjunto con el


Cromatgrafo de Gases
1. Se carga el programa Clarity que se encuentra en el centro del escritorio.

2.- Se da click en el cono y se despliega la siguiente pantalla

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3.- Se da click en el login del 350 TCD 580FID y se despliega la siguiente pantalla

4.- Se da click en OK sin cambiar nada y se despliega la siguiente pantalla

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5.- Aparece el diagrama de operacin del equipo, al posicionarse en la imagen del


cromatgrafo la figura se divide en cuatro imgenes, dar click en la imagen de la
columna.

Y en el dibujo de la columna se despliega la siguiente pantalla

6.- En donde dice Method Setup se escribe el nombre del mtodo, abajo aparecen
los datos sobre el tipo de columna, fase mvil, el flujo, la presin el detector y la
temperatura de trabajo (los cuales ya estn predeterminados para los propsitos
de esta prctica, no se deben modificar). Se da click en OK
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7.- Se da click en el dibujo de la jeringa

Y se despliega la siguiente pantalla

8.- En donde se escribe la identificacin (ID) de la muestra y su nombre,


posteriormente se da click en OK.

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9.- Extraiga 3 mL de gas del espacio de cabeza del bulbo de vidrio para muestra
de gases que contiene la concentracin conocida de CO 2. inyecte la muestra y
presione el botn que est en el extremo del cable de encendido y apagado de
captura de informacin (vase la figura).

10.- Se da click en donde dice data acquisition (adquisicin de datos)

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Y aparece la siguiente pantalla, en donde se observa el movimiento de la lnea


base y la aparicin de los picos del cromatograma.

11.- Al terminar la corrida del cromatograma se vuelve a apretar el botn del


extremo del cable para que el programa deje de tomar datos y se genere el
reporte correspondiente con las tablas de reas, los tiempos de retencin, etc.,
como se puede observar en la siguiente figura.

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12.- Se oprime File, y posteriormente Print para imprimir el reporte resultante


con los datos obtenidos.
13- Al cumplirse 1 hora de permanencia de los frutos en el interior del contenedor,
transprtelo al lugar donde se encuentra el cromatgrafo.
14.-

Extraiga 3 mL de gas del espacio de cabeza del contenedor despus de

bombear 3 veces el aire con la jeringa. Se recomienda empezar por los frutos
no climatricos y despus por los frutos climatricos empezando por los ms
verdes (sazones), los ms senescentes, y por ltimo los intermedios maduros.
15.-

Inyecte los 3 mL de la muestra en el puerto B de inyeccin del cromatgrafo

y siga las instrucciones en los pasos 8-12 del programa Clarity arriba
mencionadas.
16.-

Para propsito de los clculos, utilice los datos de las reas bajo la curva de

cada pico resultante indicadas por el (la) profesor(a) y comprelos con los del
estndar. Registre sus datos en % de CO2 por kilogramo de fruta.
17.-

Grafique una curva de respiracin vs grado de madurez de los frutos de

cada serie bajo estudio.

Clculos para la determinacion de la actividad respiratoria de los productos


hortofrutcolas (Kays (1991).
El estndar utilizado para calibrar el cromatgrafo de gases tiene una
concentracin de CO2 conocida en porcentaje. Con el objeto de que los resultados
obtenidos sean comparables con los de la literatura, el porcentaje de CO 2 se debe
transformar a mL de CO2 / kg/ h de la siguiente manera:
Para propsitos prcticos se puede considerar que la concentracin de CO 2 en el
tiempo 1 (inicial) equivale a la contenida en el aire (0.03%).
CO2 = concentracin de CO2 en el tiempo 2 - concentracin de CO2 en el tiempo 1

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para un sistema cerrado:


mL de CO 2 kg h
( CO2 X 10) x (volmen delespacio libre del contenedor en litros)

( peso fresco del producto en kg) x (tiempo que estuvo cerrado el contenedor en horas )

-1

para un sistema abierto:


peso fresco del producto en kg
(1000)
mL de CO2/kg hr-1

( CO 2 X 10)(velocidad de flujo del aire en

mL
X 60)
min

Los mililitros de CO2 se convierten normalmente en miligramos para eliminar el


efecto de la temperatura sobre el volumen de gas de manera que se puedan
realizar comparaciones directas; para lo cual se debe usar una correccin por
temperatura.
Una mol de gas es igual a 22.4L a 0C a 1 atmsfera, por lo tanto, su volumen
(V1), a la temperatura del producto, se puede calcular con la siguiente ecuacin:
V1 22.4 (1+ la temperatura del producto en C/ 273 Kelvin)
Por ejemplo, el volumen de 1 mol de CO 2 a 25C es igual a 24.45L. El volumen de
gas por gramo se calcula dividiendo su volumen correcto por el peso molecular del
gas (CO2 =44), es decir, 24.45L/44=0.556 L/g 556mL/1000 mg (el volumen de
CO2 a 25C dividido por su peso molecular). Posteriormente se puede calcular el
peso del gas de la muestra de respiracin mediante la siguiente ecuacin:
556mL/1000mg = mL determinados de la muestra/X
Peso del gas de la muestra de respiracin en mg: X = mL determinados de la
muestra / 0.556
Correcciones para las temperaturas ms comnmente usadas:
0C = 509 mL CO2/ 1000mg
5C = 518 mL CO2/ 1000mg
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10C= 528 mL CO2/1000mg


15C= 537 mL CO2/ 1000mg
20C= 546 mL CO2/ 1000mg
25C= 556 mL CO2/ 1000mg
30C= 565 mL CO2/ 1000mg

Determinacin de los Parmetros Fsicos y Qumicos de la Calidad de los


Frutos
Una vez terminadas las determinaciones de respiracin se proceder a
evaluar los principales parmetros fsicos y qumicos de calidad.
En el caso del pltano, manzana, pera, se proceder a evaluar el color
mediante las cartas de color, la firmeza mediante un penetrmetro. Tambin se
aplicar lugol a rebanadas del fruto para determinar los estados de madurez.
En el caso de los ctricos se proceder a determinar los parmetros
qumicos

de calidad mediante la medicin del pH y la acidez titulable (ver

instrucciones en la prctica de aplicacin de parmetros de calidad en productos


hortofrutcolas).
Manejo de residuos

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R1 = Enviar a composteo
R2 = Solucin neutra, desechar en drenaje con suficiente agua

Informe tcnico
El informe de los resultados se redactar considerando un formato de artculo de
investigacin (Anexo) u otro formato de informe acorde con las indicaciones del
profesor.
Cuestionario
1. Cul es el fundamento de la cromatografa de gases?.
2. Indique los principales pasos para operar el cromatgrafo de gases y
especifique las condiciones de operacin.
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3. Explique el funcionamiento del detector de conductividad trmica.


4.Qu otros parmetros diferentes al CO2 se pueden usar para medir la
respiracin en productos vegetales?, Cules seran sus ventajas y desventajas?
5.- Qu efectos tiene sobre el producto hortofrutcola rebasar los niveles de O 2 y
CO2 sugeridos para su almacenamiento o su exposicin ms all del tiempo
recomendado para determinar su actividad respiratoria?

Bibliografa
Burton, W.G. 1982. Post-Harvest Physiology of Food Crops. Edit. Longman, U.S.A.
Douce, R. 1985. Mitochondrial oxidative activities in relation to in vivo metabolism.
Cap. 4 en: Mitochondria in Higher Plants Ed. Academic Press, Inc. U.S.A. pp. 227232.
Gnther, H.O. 1973. Mtodos Modernos de Anlisis Qumico de Carnes y
Productos Crnicos. Ed Acribia, Espaa. pp56-77.
Kader A. A. 1992. Postharvest biology and technology: an overview en: Kader A.
(ed). Postharvest Technology of Horticultural Crops. Cap. 3. 2a. Ed. University of
California. Division of Agriculture and Natural Resources. Pub. 3311. p.15.
Kays, S.J. 1991. Postharvest Physiology of Perishable Plant Products. Ed. AVI,
U.S.A. pp75-95.
Verde C.J.R., Escamilla H.M.L., Reyes D. A. y Malpica S.F. 1999. Manual de
Prcticas de Qumica Analtica II. 1 Ed. Universidad Autnoma Metropolitana,
Iztapalapa, Mxico. 126pp.
Para accesar al manual en lnea, utilice la liga siguiente:
http://virtuami.izt.uam.mx/aulas/apresencial/login/index.php

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Manejo de tanques (anexo 3)


Los tanques que proporcionan el gas acarreador deben estar sujetos en
forma vertical con cadenas para impedir su movimiento. Debe haber manejo
adecuado de presiones y es conveniente trabajar con ellos en un lugar ventilado.
Al recibir los cilindros e instalar sus respectivas vlvulas se debe revisar con agua
jabonosa la presencia de fugas, en caso de que las haya, se debe colocar cinta
tefln a su alrededor y se volver a probar con agua jabonosa las zonas de las
vlvulas cerciorndose de que no haya ms fugas. Los gases acarreadores son
inertes, por lo que no son inflamables. Una vez consumidos los gases se cierran
las vlvulas y se cambian los cilindros con el proveedor.

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