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Universidad Autnoma del Estado de Mxico

Facultad de Qumica

Programa Educativo Qumico en Alimentos

MANUAL DE PRCTICAS DE LABORATORIO


MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
Quinto Semestre

M. en A.S.S. Bertha Juregui Rodrguez


M. en C.A. Laura Alejandra Snchez Paz

Septiembre 2014

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

NDICE
Pg.

INTRODUCCIN

PROPSITO GENERAL.

PROPOSITOS ESPECIFICOS

REGLAMENTO DEL LABORATORIO

EVALUACION

PRACTICA No. 1 Cuantificacin de Microorganismos Viables

PRACTICA No. 2 Cuantificacin de Hongos y Levaduras

13

PRACTICA No. 3 Recuento de Bacterias Osmoflicas y Proteolticas

17

PRACTICA No. 4 Determinacin de organismos coliformes fecales y


totales por NMP y recuento en placa

21

PRACTICA No. 5 Aislamiento e Identificacin de Salmonella

27

PRACTICA No. 6 Aislamiento y Cuantificacin de S. aureus

32

PRACTICA No. 7 Recuento de Bacillus cereus

36

PRACTICA No. 8 Evaluacin de la efectividad de un desinfectante

40

ANEXO I

Preparacin de diluciones decimales

44

ANEXO II

Composicin de los medios de cultivo

45

BIBLIOGRAFA

53

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

INTRODUCCIN
Los alimentos no solo tienen un valor nutricio para quienes los consumen, stos
adems proporcionan el medio ideal para la supervivencia y el crecimiento microbiano.
La microbiologa de los alimentos cubre una gama muy diversa de microrganismos que
participan de manera determinante en la calidad e inocuidad de un alimento.
Los objetivos principales de la Microbiologa de los Alimentos son la deteccin y el
control de patgenos, as como de los microorganismos responsables de la
descomposicin de los mismos.
El presente manual de prcticas de laboratorio de Microbiologa de Alimentos describe
algunas tcnicas de aislamiento e identificacin de microrganismos principalmente
patgenos, basadas en las normas oficiales mexicanas que se encuentran en los
alimentos y son causantes de enfermedades gastrointestinales.
La determinacin de coliformes por el mtodo del NMP (Nmero ms probable), es un
mtodo normalizado para determinar la inocuidad de un alimento, utilizando a las
bacterias coliformes como indicadores de contaminacin, determina la higiene con la
cual han sido manipulados los mismos.
Mediante la repeticin de las diferentes tcnicas de aislamiento e identificacin se
pretende desarrollar la habilidad en el manejo de los diferentes instrumentos del
laboratorio de microbiologa, la cuantificacin, capacidad de interpretacin de los
resultados y la identificacin de los tipos especficos de microrganismos por sus
caractersticas morfolgicas coloniales y su identificacin bioqumica.
Con las ocho prcticas propuestas se pretende dar un panorama general de los
principales mtodos de identificacin, aislamiento y cuantificacin de los
microrganismos indicadores o patgenos comnmente encontrados en los alimentos.
Complementa de manera prctica y refuerza los diferentes temas comprendidos en la
Unidad de Aprendizaje de Microbiologa de Alimentos del programa educativo de la
licenciatura de Qumico en Alimentos para quinto semestre.
Cabe mencionar que en este manual no aplican ejercicios demostrativos y se incluye
un cuestionario al final de cada prctica como evaluacin.

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PROPOSITO GENERAL DEL CURSO


Aplicar tcnicas microbiolgicas tanto cualitativas como cuantitativas en el rea de los
alimentos, basadas en normas oficiales mexicanas, as como interpretar los resultados
obtenidos para conocer la calidad microbiolgica de los alimentos.

PROPOSITOS ESPECIFICOS
Aplicar las tcnicas de vaciado en placa, extensin en superficie y Miles y Misra en la
cuantificacin de microorganismos viables en alimentos y conocer su importancia
sanitaria.
Cuantificar hongos y levaduras en alimentos por la tcnica de vaciado en placa; as
como diferenciar cualitativamente los gneros anteriores y conocer sus condiciones de
crecimiento.
Cuantificar bacterias proteolticas y osmoflicas en muestras con alto contenido de
protenas y sales respectivamente; as como conocer su incidencia e importancia en el
rea de alimentos.
Cuantificar microrganismos coliformes mediante la tcnica del NMP (Nmero ms
probable), interpretar su presencia sanitaria en los alimentos.
Aislar e identificar las diferentes especies de Salmonella y conocer su importancia
sanitaria en al anlisis microbiolgico de alimentos.
Aislar y cuantificar Staphylococcus aureus, as como describir su importancia sanitaria
en el rea de alimentos.
Aislar y cuantificar Bacillus cereus en alimentos e interpretar su importancia sanitaria.
Evaluar la efectividad de un desinfectante sobre los microorganismos que contiene una
muestra alimenticia (lechuga).

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

REGLAMENTO DE LABORATORIO
No se permitir la entrada al laboratorio al alumno que no tenga puesta la bata.
El alumno que no venga provisto de su material personal no podr permanecer en la
prctica (cubrebocas, guantes, material de laboratorio).
Todos los objetos personales, material y ropa debern colocarse en los cajones de las
mesas de trabajo.
Queda estrictamente prohibido comer, fumar o en general llevarse cosas a la boca
dentro del laboratorio.
Se debe evitar gritar dentro del laboratorio.
Limpiar y desinfectar las mesas del laboratorio antes y despus de usarlas con benzal,
alcohol al 70% o hipoclorito de sodio a 30 ppm.
Todo el material no contaminado como: algodn, papel, cerillos, etc., deben
depositarse en los cestos de basura. No tire basura en el suelo, en los vertederos, ni la
guarde en los cajones.
En caso de romper o derramar material contaminado, vierta benzal y deje actuar por lo
menos 10 minutos antes de limpiar y avise al profesor.
Todo material que va a incubarse o desecharse deber ser colocado en el sitio indicado
por el profesor.
Etiquete todo el material que va a incubar o guardar en el refrigerador (con el nmero
de equipo).
No derrame medio de cultivo con agar en los vertederos, ni en las tarjas. Despus de
esterilizar para ser desechado depositarlo en los botes de basura en bolsas de plstico.
Si utiliza colorantes para hacer tinciones, deber evaporarlos.
Lavarse las manos antes de salir del laboratorio con abundante agua y jabn
desinfectante.
Al encender el mechero, asegurarse de que no haya disolventes flamables.
Para desechar cualquier medio de cultivo o material contaminado, primero se deber
esterilizar por calor hmedo en autoclave (15 libras de presin, durante 15 minutos a
121 C), despus si es agar colocarlo como se menciona en el No. 11, y si es lquido
verterlo en la tarja.
NOTA: Los puntos citados anteriormente debern aplicarse durante el desarrollo de
todas las prcticas.
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QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

EVALUACIN

La calificacin del laboratorio de Microbiologa de Alimentos se llevar a cabo de la


siguiente manera:

Exmenes parciales

50%

Exmenes por sesin

30%

Reportes laboratorio

20%

El reporte de laboratorio deber contener:

Datos: Ttulo y nombre de la prctica / Nombre integrantes y equipo


Resultados

20%

Discusin Resultados

40%

Conclusiones

20%

Cuestionario y bibliografa

20%

El reporte se entregar en la siguiente sesin una vez concluda la prctica.

NOTA:
El alumno deber asistir al 80 % de las prcticas y cumplir al 100 % con el reglamento
del laboratorio.
El Manual de laboratorio ser considerado como bitcora y debern anotarse en l las
observaciones y resultados obtenidos, es individual.
El desempeo dentro del laboratorio ser evaluado en el rubro de Exmenes de
laboratorio

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA No. 1

RECUENTO DE MICROORGANISMOS VIABLES


I.

PROPOSITO

Aplicar los diferentes mtodos para aislar y cuantificar microorganismos viables en una
muestra de alimento, as como interpretar los resultados para establecer las
condiciones sanitarias de los alimentos.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Dentro de la evaluacin de la calidad de los alimentos es importante conocer la carga


microbiana, que de alguna manera es un ndice de las condiciones sanitarias con que
se ha elaborado y manejado un producto, refleja tambin la calidad de la materia prima
que se ha empleado para su elaboracin y es un indicativo de la probable vida til que
puede tener el alimento.
El control microbiano permite conservar las caractersticas organolpticas,
nutrimentales, salubres etc. de los alimentos para que as puedan ser consumidos por
el hombre con seguridad.
En la evaluacin de la cuenta de microorganismos viables en un alimento, no se
diferencia si los microorganismos aislados son patgenos o no, con esta determinacin
nicamente se pone de manifiesto a un grupo de microorganismos que comparten la
caracterstica de crecer a una temperatura media de incubacin de 35C por lo que se
les conoce como mesfilos aerobios, cuenta total, cuenta en placa, cuenta estndar,
siendo el termino ms apropiado el primero por lo que implica la definicin.
El recuento total indica el control sanitario ejercido en la produccin, transporte y
almacenamiento de los alimentos; y entre otras razones para la determinacin es que
casi todos los microorganismos patgenos son mesfilos. Las tcnicas ms empleadas
para obtener la cuenta viable son: vaciado en placa y siembra en superficie, aunque
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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

actualmente se ha empleado y desarrollado la tcnica de microfiltracin por membrana


que tiene aplicaciones muy especficas.
El fundamento de estas tcnicas es que cada colonia proviene de una clula viable, sin
embargo la colonia desarrollada puede provenir tanto de una unidad, como de cualquier
otro nmero de ellas en la muestra original, razn por la cual se emplea el trmino de
unidades formadoras de colonia (UFC).

III. EQUIPO Y MATERIAL


Cuenta colonias
Incubadora 35 0,2 C
Autoclave
Mechero
1 pipeta pasteur estril
2 tubos de 16x150 con tapn de rosca con 9 cm 3 del diluyente (agua peptonada)
1 frasco de dilucin con 90 cm3 del diluyente
1 pipeta de 10.0 cm3 y 3 de 1.0 cm3 envueltas para esterilizar
5 cajas Petri estriles desechables
4 cajas Petri estriles desechables traer el da de la prctica
4 varillas de vidrio en L estriles
1 matraz de 250 ml con tapn y gorro para esterilizar
Gradilla, perilla microbiolgica
Toallitas hmedas desinfectantes
Jabn toalla para manos, trapo limpio.

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO


Agar cuenta estndar (PCA) atemperado a 45 C (ver anexo II)
Agua peptonada al 0,1% ( ver anexo II)

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

V.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO
Mtodo de vaciado en placa

1.

Marcar las cajas con el nmero de equipo, el medio de cultivo, la muestra y la


dilucin.

2.

Si es muestra slida debern pesarse 10 g de muestra y licuarse por 15 seg con


agua peptonada (90 ml)

3.

Si es muestra lquida se toman 10 ml y se vacan directamente al frasco de


dilucin que contiene 90 ml de agua peptonada.

4.

Agitar en arco el mismo nmero de veces que los tubos siguientes

5.

Tomar 1.0 cm3 del frasco de dilucin y transferir a un tubo con 9.0 cm 3 de agua
peptonada, agitar y repetir la operacin para tener diluciones sucesivas (1:100,
1:1000).

6.

Tomar una alcuota de 1.0 ml de cada una de las dos ltimas diluciones y colocar
en cajas Petri, realizar por duplicado.

7.

Vaciar en las cajas el medio agar cuenta estndar a 45C e incorporarlo a la


alcuota de la muestra, con 6 movimientos rotatorios y en las cuatro direcciones,
teniendo cuidado de no derramar o salpicar la tapa de la caja, dejar que
solidifique el medio

8.

Incubar las placas invertidas a 35 C +/- 1C durante 24 a 48 h.

9.

Transcurrido el tiempo de incubacin efectuar el recuento de las colonias


desarrolladas, tomar en consideracin las cajas que tengan una cuenta entre 25
y 250 colonias ( ver NOM-092-SSA1-1994).

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

10.

Calcular la cantidad total de la poblacin presente en la muestra multiplicando el


nmero de colonias desarrolladas en la caja por el inverso de la dilucin
correspondiente.

11.

Reportar el nmero de la poblacin encontrada en la muestra como: mesfilos


aerobios, Unidades Formadoras de Colonias por centmetro cbico o gramo de
muestra (segn el tipo de muestra):
No. Colonias x inverso dilucin = UFC / g ml
UFC/cm3 g, incubadas a 35C +/- 1C por 48 h en ACE(Agar Cuenta Estandar)
Extensin en superficie

1.

Vaciar 15 cm3 de agar cuenta estndar en cada una de las cuatro cajas Petri y
dejar gelificar.

2.

Preparar diluciones de la muestra hasta obtener una dilucin 1:1000.

3.

Inocular de las dos ltimas diluciones 0,1 cm 3 sobre la superficie de una placa
por duplicado.

4.

Extender con la varilla el inculo en toda la superficie de la placa, pasando la


varilla repetidas veces, utilizar una varilla para cada dilucin.

5.

Incubar las cajas durante 40 h a 35C +/- 1C.

6.

Seleccionar las cajas que muestren un mximo de 100 colonias para el conteo.

7.

Multiplicar la cuenta por 10 y por la inversa de la dilucin correspondiente.

8.

Reportar como en el caso anterior. Considerar la alcuota tomada:


No. Colonias x inverso dilucin x 10 = UFC / g ml

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Tcnica de Miles y Misra

1.

Preparar diluciones de la muestra como en los casos anteriores.

2.

Vaciar 15 cm de agar cuenta estndar en cada una de las dos cajas Petri y
dejar gelificar.

3.

Utilizando una caja para cada dilucin, dividir el fondo en tres segmentos iguales.
Dejar caer cuidadosamente una gota de cada dilucin por segmento a distancia
suficiente para evitar su confluencia, utilizar una pipeta Pasteur por cada
dilucin.

4.

Incubar a 35C durante 48 h.

5.

Contar las colonias en aquellas que muestren 20 colonias menos.

6.

Obtener la media del recuento y multiplicar por 50 y por el inverso de la dilucin


correspondiente.

7.

Reportar como en los casos anteriores.

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

VII. CUESTIONARIO
1.

Qu importancia tiene en el rea de alimentos determinar microorganismos


viables?

2.

Qu grupos de microorganismos incluyen los mesfilos aerobios?

3.

Cules son los microorganismos viables?

4.

Cul es el fundamento de la Tcnica de Miles Misra?

5.

Para qu otros grupos microbianos son aplicables las tcnicas de recuento


utilizadas en la prctica?

6.

Por qu los resultados se reportan como UFC y no como colonias?

7.

En qu casos es de escaso valor determinar microorganismos mesfilos?

VIII. ACTIVIDAD DE SNTESIS


Hacer un cuadro sinptico mencionando ventajas y desventajas del mtodo de siembra
en superficie comparado con vaciado en placa.
IX.

REFERENCIAS

NOM-092-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias


en placa.

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA No. 2

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIN DE HONGOS Y LEVADURAS


I.

PROPOSITO

Aislar y cuantificar hongos y levaduras en una muestra alimenticia.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Una variedad de hongos microscpicos pueden desarrollarse y contaminar los


alimentos o simplemente permanecer en ellos y adquirir un especial significado desde
el punto de vista econmico o sanitario. Las consecuencias de su actividad en los
alimentos se manifiestan desde tres perspectivas:
La produccin en ciertos casos de sustancias txicas para el hombre y los animales.
La descomposicin o aparicin de alteraciones en el alimento.
Efecto de sus productos metablicos para desarrollar alimentos agradables para el
consumidor y que tienen un sabor, olor y color caracterstico.
El grupo de hongos comparte caractersticas entre sus miembros que los distinguen
muy notoriamente de las bacterias. Algunas especies exhiben una gran diversificacin
de capacidades metablicas y de adaptacin a numerosos sustratos. La importancia de
su estudio esta ampliamente justificado, ya que su presencia es indicativo de prcticas
higinicas defectuosas durante el almacenamiento o la elaboracin de productos como
ocurre con la leche en polvo, la mantequilla, los purs de jitomate, jugos de frutas y
otros. En jugos crudos y pasteurizados, por ejemplo, cuentas elevadas indican un pobre
saneamiento del equipo.
Simultneamente con el recuento de hongos puede realizarse el de levaduras, ya que
el medio de cultivo les proporciona buenas condiciones para su multiplicacin.
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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Las colonias de levaduras pueden aparecer sobre la superficie o en el seno de la


gelosa; en el primer caso son circulares y de dimetro mayor a las bacterias; en el
segundo caso aparecen como colonias estrelladas y algo ms pequeas.

III. EQUIPO Y MATERIAL


Balanza granataria
Licuadora
Cuenta colonias
Incubadora 25 0.2 C
Autoclave
Potencimetro
4 cajas Petri para traer el da de la prctica
3 tubos de 16x150
1 matraz de 250 ml para esterilizar
4 pipetas de 1.0 cm3 y una de 10.0 cm3 envueltas para esterilizar
1 frasco de dilucin

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO


Agar Papa Dextrosa atemperado a 45C ( ver anexo II)
Agua peptonada al 0,1% ( ver anexo II)
cido tartrico al 10%
Buffers de pH 4 y 7

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

V.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO

1.

Marcar las cajas con el nmero de equipo, el medio de cultivo, la muestra y la


dilucin.

2.

Si es muestra slida debern pesarse 10 g de muestra y licuarse por 15 seg con


agua peptonada (90 ml). Regresando el homogenado al frasco de dilucin.

3.

Si es muestra lquida se toman 10 ml y se vacan directamente al frasco de


dilucin que contiene 90 ml de agua peptonada.

4.

Agitar en arco el mismo nmero de veces que los tubos siguientes

5.

Tomar 1.0 cm3 del frasco de dilucin y transferir a un tubo con 9.0 cm3 de agua
peptonada, agitar y repetir la operacin para tener diluciones sucesivas (1:100,
1:1000).

6.

Acidificar el medio de agar papa dextrosa fundido y enfriado con solucin de


cido tartrico hasta pH 3.5 previo a su empleo. (aprox. 1.0 ml)

7.

Colocar por duplicado en cajas petri 1 cm3 de las dos ltimas diluciones y vaciar
de 12 a 15 cm3 de medio de cultivo atemperado.

8.

Incorporar la dilucin en el medio de cultivo realizando movimientos circulares y


laterales evitando derrames y salpicaduras en la tapa.

9.

Dejar solidificar e incubar a 25C, durante 5 das.

10.

Sin destapar las cajas efectuar el examen de las placas a los 3 das y realizar un
recuento, si no existiera un nmero apreciable de colonias, practicar nuevamente
la cuenta a los 5 das.

11.

Reportar el nmero de UFC/ml g consultando la norma correspondiente.

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

VII. CUESTIONARIO
1.

Cul es la importancia de la determinacin de hongos y levaduras en


alimentos?

2.

Cmo se realiza la determinacin cualitativa de hongos y levaduras?

3.

Qu condiciones favorecen el crecimiento de hongos y levaduras?

4.

Mencione tres gneros de hongos que puedan causar alteraciones en los


alimentos:

5.

Por qu es necesario acidificar el medio PDA en esta determinacin?

VIII. ACTIVIDAD DE SNTESIS


Escribe 5 diferencias entre hongos y bacterias en cuanto a su crecimiento en los
medios de cultivo.
IX.

REFERENCIAS
NOM-111-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y
levaduras en alimentos.

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA No. 3

RECUENTO DE BACTERIAS OSMOFLICAS Y PROTEOLTICAS


I.

PROPOSITO

Aislar y cuantificar bacterias osmoflicas y proteolticas de diferentes alimentos con alto


contenido de lpidos y protenas.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Los alimentos que contienen cantidades significativas de azcar son susceptibles a


sufrir contaminacin principalmente por levaduras.
Estos microorganismos osmoflicos pueden crecer a altas concentraciones de azcar,
son los causantes de la contaminacin en miel, chocolates, jugos concentrados de
frutas. Las bacterias osmodricas toleran altas concentraciones de azcar pero no
crecen en ellas. Entre los microorganismos osmoflicos tenemos a Saccharomyces
rouxii, S. rouxii variedad polymorphus y S. mellis.
Algunos microorganismos utilizan las protenas como fuente de nitrgeno y carbono,
por ejemplo las bacterias proteolticas pueden crecer en caldo nutritivo, en este medio
los carbohidratos se encuentran ausentes o en pequea cantidad. Las bacterias que
tienen enzimas proteolticas rompen peptonas, aminocidos, el orden que se sigue en
la degradacin es: protena a proteosa a polipptidos a pptidos y a aminocidos, el
grupo amino se elimina del aminocido por desaminacin.
Las bacterias proteolticas degradan carnes rojas, pollo y pescado principalmente.
Los organismos proteolticos constituyen un grupo muy heterogneo en el cual se
pueden encontrar bacterias de los gneros: Clostridium, Bacillus, Proteus,
Pseudomonas, como proteolticos activos. Los microorganismos que efectan hidrlisis
de protenas y fermentacin se les conoce como cido-proteolticos por ejemplo
Staphylococcus faecalis var licuefaciens y Micrococcus caseolyticus.

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Entre los hongos proteolticos activos encontramos: Aspergillus, Penicillium, Mucor, etc.
que en algunos casos se utilizan en la industria alimenticia por su capacidad de formar
proteasas.

III. EQUIPO Y MATERIAL


Cuenta colonias
6 pipetas de 1 y 2 pipetas de 10 cm3
8 cajas Petri para entregar
8 varillas de vidrio en L
2 frascos de dilucin
4 tubos de 16 x 150 con tapn de rosca
Frascos de dilucin

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO


Traer leche descremada en polvo por grupo (100 g)
Agar Papa dextrosa
Agar leche descremada
Agua peptonada al 0,1%

V.

PROCEDIMIENTO
Bacterias osmoflicas

1.

Pesar 10 g de muestra proveniente de un alimento que contenga azcar en


abundancia

2.

Adicionar 90 cm3 de diluyente.

3.

Licuar u homogeneizar durante 15 seg y regresar al frasco de dilucin si es


slido mezclar con movimientos en arco si es lquida la muestra.

4.

Efectuar diluciones

5.

Inocular 0,1 cm3 de las diluciones por siembra en superficie en cajas que
contengan agar Papa Dextrosa.
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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

6.

Incubar a 32C durante 24 a 48 h si se sospecha de bacterias y a 25C durante


72 h si se sospecha de presencia de hongos y levaduras.

7.

Contar las colonias osmoflicas

8.

Reportar UFC por gramo o cm3 de alimento, reportar morfologa colonial y


microscpica.
Bacterias proteolticas

1.

Pesar 10 g de la muestra.

2.

Adicionar 90 cm3 de diluyente.

3.

Licuar u homogeneizar como en el caso anterior.

4.

Efectuar diluciones decimales.

5.

Inocular 0,1 cm3 de las diluciones sobre la superficie de las cajas que contienen
agar leche descremada (ALD).

6.

Sembrar por extensin en superficie utilizando varillas de vidrio

7.

Incubar una serie de cajas en refrigeracin a 4-8 C durante 10 das y la otra


serie a 30C durante 24 a 48 h.

8.

Contar las colonias tpicas que son aquellas con halo transparente.

9.

Reportar UFC por gramo o cm3 de alimento.

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

VII. CUESTIONARIO
1.

Por qu se utiliza el mtodo de extensin en superficie para stos recuentos?

2.

Cul es la importancia de estas determinaciones en alimentos?

3.

Dos ejemplos de bacterias proteolticas y osmoflicas ms comunes en alimentos

4.

Por qu en el medio de cultivo se observa un halo transparente en las colonias


caractersticas?

VIII. ACTIVIDAD DE SNTESIS


Menciona las caractersticas morfolgicas de las bacterias osmoflicas y proteolticas en
los medios de cultivo selectivos.
IX.

REFERENCIAS

ICMSF. Microrganismos de los alimentos 1. Tcnicas de Anlisis Microbiolgico. Acribia


Espaa.

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA No.4

DETERMINACIN DE ORGANISMOS COLIFORMES FECALES Y


TOTALES POR NMP Y RECUENTO EN PLACA

I.

PROPOSITO

Determinar cuantitativamente la cantidad coliformes en un alimento.

II.

FUNDAMENTO TERICO

El grupo de los organismos coliformes es el ms utilizado en la microbiologa de los


alimentos como indicador de contaminacin fecal o de prcticas higinicas
inadecuadas; esta determinacin se ha utilizado desde 1892.
Los organismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordial
intestinal para la mayora de las especies que involucra. A fin de simplificar el manejo
en el laboratorio, se ha establecido una definicin en base a las caractersticas ms
constantes que exhibe la especie del grupo, Escherichia coli. Los microorganismos
coliformes son bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o facultativamente
anaerobios, que fermentan la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 h de
incubacin a 35C.
Para la determinacin de coliformes una de las tcnicas ms utilizadas es la del
nmero ms probable, esta tcnica descansa en una base estadstica, matemtica
inobjetable, para expresar cuantitativamente la densidad de microorganismos en un
material. La prueba consiste en inocular una serie de tubos con un medio de cultivo y
algn dispositivo o indicador que permita poner de manifiesto un microorganismo o un
grupo particular de ellos. (Para el caso de coliformes el dispositivo utilizado es la
campana Durham para observar la produccin de gas). Un cierto nmero de tubos se
inocula con volmenes definidos de la muestra, despus de la incubacin el nmero de
tubos positivos se consulta en las tablas estadsticas.

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MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Con frecuencia en la aplicacin de la tcnica de NMP para un grupo particular de


microorganismos involucra dos etapas aunque para la determinacin completa se
llevan a cabo tres:
a) Prueba presuntiva: los tubos positivos pueden ser el resultado de la actividad
de los microorganismos en cuestin, pero tambin de otros con comportamiento
similar. Lo que viene a ser la prueba presuntiva en la investigacin de
organismos coliformes, consiste en inocular alcuotas de la muestra de tubos de
fermentacin con caldo lactosado. En ello estos microorganismos proliferan
fcilmente fermentando la lactosa y liberando anhdrido carbnico que en gran
cantidad se acumula en la campana o tubo de Durham. Un efecto semejante
puede ocurrir en ausencia de organismos coliformes como resultado de la accin
sinrgica de dos tipos de bacterias; una capaz de fermentar la lactosa hasta
cido lctico y pirvico; y otra que metaboliza estos cidos generando un gas
aldehdico y algunos cidos menores.
b) Prueba confirmativa: En la cual los organismos coliformes en caso de existir,
proliferan activamente en tanto que los falsos positivos sern inhibidos por la
presencia de substancias selectivas antibacterianas adicionadas al medio de
confirmacin.
c) Prueba completa: La finalidad de esta etapa es identificar el gnero de
coliforme presente en la muestra; lo anterior es posible gracias al metabolismo
bacteriano especfico de cada cepa y se lleva a cabo inoculando en cajas Petri
con medios como el EMB y otras pruebas como son movilidad, citrato, indol y
Voges Proskauer (VP).

III. EQUIPO Y MATERIAL


Incubadora 35-37 0.2 C
Bao Mara a 44.5 0.2 C
4 pipetas de 1 cm3 y 1 pipeta de 10 cm3
1 matraz de 250 ml para esterilizar
3 tubos de 16x150 c/tapn rosca (agua peptonada)
9 tubos de 16x150 c/tapn rosca y campana Durham (caldo lactosado)
6 tubos de 16x150 c/tapn rosca y campana Durham (caldo bilis verde brillante)
5 tubos de 16x150 c/tapn rosca y campana Durham (caldo EC)
1 frasco de dilucin
2 cajas Petri para entregar
4 cajas Petri traer el da de la prctica
22

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

8 tubos de 13x100 con tapn rosca (pruebas bioqumicas)

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO


Agua peptonada al 0,1%
Caldo lactosado
Caldo bilis verde brillante
Caldo EC
Agar rojo bilis violeta (RVBA)
RM-VP, Agar SIM, Agar Citrato

V.

PROCEDIMIENTO
Determinacin cuantitativa de coliformes por NMP

Prueba presuntiva
1.

Efectuar diluciones decimales de las muestras en agua peptonada utilizando 10


g de muestra y de manera que las diluciones sean secuenciales.

2.

Pipetear un centmetro cbico de cada una de las diluciones del homogenizado


del alimento en tubos de caldo lactosado, utilizar tres tubos para cada dilucin.

3.

Incubar los tubos a 35 C +/- 1C durante 24 y 48 h.

Prueba confirmativa
1.

Inocular 1 cm3 de caldo de los tubos positivos de la prueba presuntiva en caldo


EC para coliformes fecales e incubar a 44.5 C+/- 0,2C; registrar tubos positivos
a las 24 y 48 h.

2.

Inocular 1 cm3 de caldo de los tubos positivos de la prueba presuntiva en caldo


Bilis Lactosa Verde Brillante (BLVE) para coliformes totales e incubar a 35 C +/0,5C, registrar tubos positivos a las 24 y 48 h.

3.

Anotar el nmero de tubos confirmados como positivos de organismos coliformes


totales y fecales en cada dilucin.

4.

Consultar en la NOM-112-SSA1-1994 las tablas de NMP y buscar las diluciones


correspondientes a los tubos positivos, anotar el NMP que corresponde a dichos
tubos.
23

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Determinacin de coliformes por vaciado en placa doble capa


1.

Colocar en cajas Petri por duplicado 1 cm 3 de la muestra lquida directa o de la


dilucin primaria, utilizando una pipeta estril.

2.

Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se requiera


sembrar, utilizando una pipeta estril diferente para cada dilucin.

3.

Verter de 15 a 20 cm3 del medio RVBA fundido y mantenido a 45 C en bao de


agua. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el
momento en que se vierte el medio de cultivo no debe exceder de 20 minutos.

4.

Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio. Permitir que la mezcla


solidifique dejando las placas reposar sobre una superficie horizontal y fra.

5.

Preparar una caja control con 15 cm3 de medio.

6.

Despus de que la mezcla gelific, verter aproximadamente 4 cm3 de medio


RVBA a 45 C en la superficie del medio. Dejar solidificar.

7.

Incubar a 35 +/- 1 C por 24 h.

8.

Realizar el conteo y multiplicar por el inverso de la dilucin. Las colonias tpicas


son de color rojo oscuro, generalmente rodeadas de un halo de precipitacin
debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa es
semejante a lentes biconvexos con dimetro de 0,5 a 2,0 mm.

9.

Reportar los resultados como UFC por cm3 de muestra.

Prueba completa
Diferenciacin de coliformes
1. Inocular las placas de agar EMB con los tubos positivos de la prueba
confirmativa.
2. Incubar a 35 +/- 1 C durante 24 h.
24

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

3. A partir de las colonias aisladas, preparar frotes y teir por Gram, las colonias
sospechosas de coliformes.
4. Inocular con las cepas de bacilos Gram negativos los tubos que contienen los
medios de las pruebas del IMViC.
5. Leer las reacciones de cada prueba.
6. Revisar en las tablas y reportar las pruebas bioqumicas, de acuerdo a los
siguientes tiempos.
Rojo de metilo

3-5 das / 35-37C

SIM

24 h. /35-37C

Citrato

5-7 das / 35-37C

VP

48h / 35-37C

Las reacciones tpicas de los coliformes en las pruebas IMViC son las siguientes:
Microorganismo
Escherichia coli
Klebsiella
Enterobacter
Citrobacter

I
+
-

M
+
-

V
+
+
+

C
+
+
+

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS


OBSERVACIONES

RESULTADOS

CT- UFC/g ml en Agar rojo violeta bilis, incubados a


35 +/- 1oC por 24 +/- 2h

CT- NMP/g ml en caldo verde brillante a 35 +/- 0,5oC


por 48 h
CF NMP/g ml en caldo EC a 44,5 +/- 0,2oC por 48

25

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

VII. CUESTIONARIO
1.

Mencione los cuatro gneros considerados como coliformes as como sus


caractersticas principales.

2.

Por qu es importante realizar tanto la prueba presuntiva como la confirmativa


en la determinacin de coliformes?

3.

Escriba algunos parmetros que controlaras en un proceso industrial para evitar


la contaminacin por coliformes.

4.

Por qu en la determinacin de coliformes por vaciado en placa se utiliza doble


capa?

5.

Porqu los coliformes fecales en la prueba confirmativa se incuban a 44,5 +/0,2 C y los totales a 35 +/- 0,5C?

VIII. ACTIVIDAD DE SNTESIS


Investiga algunas enfermedades provocadas por microorganismos coliformes en
alimentos.
IX.

REFERENCIAS

NOM-112-SSA1-1994. Bienes y servicios. Determinacin de bacterias coliformes.


Tcnica del nmero ms probable.
NOM-113-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la cuenta de microorganismos
coliformes totales en placa.
NOM-180-SSA1-1998. Salud ambiental. Agua para uso y consumo humano. Equipos
de tratamiento de tipo domstico. Requisitos sanitarios. Apndice informativo B.
Determinacin de bacterias coliformes totales y coliformes fecales-mtodo de filtracin
por membrana.

26

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA No. 5

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE Salmonella

I.

PROPOSITO

Aislar e identificar Salmonella en diferentes muestras de alimentos.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Salmonella spp es un gnero bacteriano, perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,


integrado por grmenes de forma bacilar, no esporulados, habitualmente mviles, Gram
negativos, aerobios-anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con produccin de
gas, no fermentan la lactosa, reducen nitratos a nitritos y son citocromo-oxidasa
negativos.
Todas las Salmonella pueden ser consideradas como potencialmente patgenas para
el hombre. La nica va de entrada de estos microorganismos en el cuerpo humano es
la oral, por lo que es de suma importancia el anlisis de los alimentos para detectar su
presencia. A pesar de todos los estudios realizados por diferentes investigadores, an
no ha sido posible desarrollar ningn mtodo que pueda garantizar la recuperacin de
todos los serotipos de Salmonella a partir de los diferentes productos alimenticios
sometidos a las variadas condiciones de preparacin y conservacin.
Los mtodos para el aislamiento e identificacin de Salmonella a partir de los alimentos
pueden considerarse divididos en cinco etapas sucesivas:
1.

Enriquecimiento no selectivo o pre-enriquecimiento.

2.

Enriquecimiento selectivo.

3.

Siembra en placa de medios slidos selectivos y diferenciales.

4.

Estudio de las caractersticas bioqumicas de las colonias sospechosas en los


medios adecuados.

5.

Anlisis antignico, somtico y flagelar.


27

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Existen factores que favorecen la salmonelosis como son: alto consumo de alimentos
preparados principalmente en las calles, inadecuado almacenamiento de los alimentos,
ingesta de alimentos crudos o mal cocidos como carnes y huevo principalmente.
Los medios de cultivo selectivos para Salmonella pueden ser ligeramente selectivos
(EMB), moderadamente selectivos (Agar Salmonella-Shigella) o fuertemente selectivos
(Agar sulfito de bismuto).

III. EQUIPO Y MATERIAL


1 Pipeta de 1.0 cm

1 matraz de 500 ml para esterilizar


2 tubos de 16x150 (caldo Selenito Rappaport)
6 cajas Petri para entregar
8 tubos de 13x100 etiquetados con MIO, TSI, LIA, Malonato (por duplicado)

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO


Medio de pre-enriquecimiento:

Caldo lactosado

Medios de enriquecimiento:

Caldo Rappaport Vasiliadis


Caldo tetrationato

Medio de aislamiento:

Agar Sulfito de Bismuto


Agar entrico Hecktoen
Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD)

Pruebas bioqumicas

Agar triple azcar hierro (TSI) Lactosa, Sacarosa y glucosa


Agar lisina hierro (LIA)
Agar MIO (Movilidad, indol, ornitina)
Caldo malonato

28

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

V.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO

Pre-enriquecimiento
1.

Homogenizar 25 g de muestra con 225 cm 3 de caldo lactosado.

2.

Incubar de 18-24 h a 35-37C.

Enriquecimiento
1.

Pipetear 1 cm3 del cultivo de pre-enriquecimiento en 10 cm3 de caldo Rappaport


Vasiliadis y 1 cm3 en 10 cm3 de caldo tetrationato.

2.

Incubar 18-24 horas a 35 +/- 1C, para alimentos fuertemente contaminados a


42C

Siembra en placa en medios selectivos y diferenciales


1.

Sembrar con una asa de los medios enriquecidos (Rappaport Vasiliadis y


tetrationato) sobre la superficie de las diferentes placas de medios selectivos y
diferenciales (XLD, Agar sulfito de bismuto y Agar entrico Hecktoen), con el fin
de obtener colonias aisladas.

2.

Incubar las placas de 35-37 C durante 24-48h

3.

Observar las placas y escoger dos colonias sospechosas de cada medio.

Salmonella en Hektoen

Salmonella en XLD

Salmonella en Sulfito Bismuto

Identificacin bioqumica para Salmonelas.


1.

Sembrar las colonias sospechosas de Salmonella en los medios para la


identificacin bioqumica: TSI, LIA, MIO y Caldo Malonato.

2.

Incubar a 35-37 C
29

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

3.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Leer las reacciones bioqumicas.

Los cultivos sospechosos de Salmonella presentan las siguientes reacciones tpicas:


TSI: En el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la
glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio
original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa; puede existir o no
produccin de H2S que da lugar al ennegrecimiento del agar.
LIA: Se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por descarboxilacin
de la lisina. Son negativos aquellos tubos que produzcan color amarillo en el fondo del
tubo. Al igual que en el caso anterior puede existir o no produccin de cido sulfhdrico.
La reaccin en caldo Malonato es negativa, es decir sin cambio de color. Una prueba
positiva presenta un color azul.
En MIO la reaccin de indol es negativa (sin cambio de color al agregar el reactivo de
Kovacs) y la descarboxilacin de la ornitina es positiva.

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS


Informar presencia o ausencia de Salmonella por g ml de muestra.

VII. CUESTIONARIO
1.

Escribe la clasificacin de Salmonella segn su adaptacin a huspedes.

2.

Cuntos serotipos diferentes de Salmonella se conocen? Menciona algunos.

3.

Por qu es importante determinar los serotipos de Salmonella?

4.

Crees que puede haber presencia de Salmonella en una muestra de carne con
baja cantidad de mesfilos y ausencia de coliformes fecales, SI - NO, por qu?

5.

Menciona algunas caractersticas particulares del gnero Salmonella que las


diferencia de los dems microorganismos.

30

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

VIII. ACTIVIDAD DE SNTESIS


Investiga otros medios de cultivo que pueden utilizarse como medios de
enriquecimiento y de aislamiento para Salmonella
IX.

REFERENCIAS

NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Aislamiento e identificacin de Salmonella

31

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA No. 6

AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIN DE Staphylococcus aureus

I.

PROPOSITO

Evaluar diferentes medios selectivos y diferenciales para el aislamiento y la


cuantificacin de Staphylococcus aureus en diferentes alimentos.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Para el recuento de S. aureus se han propuesto diversos medios especficos. Estos


medios difieren principalmente en los agentes selectivos que contienen, entre los que
destacan el telurito de potasio, el cloruro de litio, la azida sdica, la glicina y la
polimixina B. Tambin se utilizan concentraciones elevadas de cloruro de sodio, pero
diversos investigadores han puesto de manifiesto que en medios conteniendo este
agente se recupera un nmero bajo de S. aureus, especialmente si las clulas han
sufrido algn tipo de stress tal como congelacin, calentamiento o desecacin.
En la actualidad gozan de gran aceptacin los medios que contienen yema de huevo
junto a uno o ms de los agentes selectivos antes mencionados. En estos medios la
mayora de las cepas de S. aureus utilizan la lipoprotenas de la yema de huevo
conocida como lipovitelina lo que da lugar a que, en torno y debajo de las colonias,
aparezcan reas de aclaramiento. Otro carcter propio de las reacciones en yema de
huevo es la aparicin de un precipitado blanco en las reas total o parcialmente
aclaradas que es debido a la formacin de sales de calcio y magnesio de los cidos
grasos liberados. La mayora de las cepas de S. aureus son coagulasa y
termonucleasa positivos; pero a pesar de que estas reacciones son caractersticas de
S. aureus hay cepas de estafilococos coagulasa positivos que no las presentan.

32

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

III. EQUIPO Y MATERIAL


1 matraz 250 ml para esterilizar
2 tubos de 16x150 tapn rosca
7 cajas Petri para entregar
6 varillas de vidrio en L
1 pipeta de 10 cm3 y 3 pipetas de 1,0 cm3
2 tubos de 13x100 con tapn rosca envueltos para esterilizar
Traer 2 huevos por grupo

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO


Agar Baird Parker
Agar Chapman o Estafiloco 110
Agar Sal y Manitol
Agar DNAsa
Plasma de conejo
Agua peptonada al 0,1%

V.

PROCEDIMIENTO

1.

Pesar 15 g de muestra y mezclarla con 135 cm 3 de agua peptonada. Realizar


diluciones decimales y colocar 0.1 cm3 de cada dilucin sobre una de las placas
de cada uno de los medios Baird Parker, sal y manitol y Chapman y extenderla
con la varilla de vidrio sobre la superficie. (Usar una varilla para cada dilucin).

2.

Incubar las placas invertidas a 35 C durante 45-48 h

3.

Despus de 24 h seleccionar las placas que muestren entre 50 y 150 colonias


aisladas, contar y marcar aquellas con caractersticas diferenciales del
Staphylococcus aureus. Las colonias tpicas en Baird Parker y Chapman son
negras con un halo transparente y uno blanco despus del rea de
transparencia.

33

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

S. aureus en Chapman

S aureus en Baird Parker

4.

Incubar las placas 24 h ms e incluir en el cmputo las colonias nuevas que


renan las caractersticas de S. aureus.

5.

Seleccionar la caja que contenga entre 50 y 150 colonias tpicas, efectuar un


frote y teir por Gram las colonias escogidas (segn siguiente tabla) y practicar
las pruebas de coagulasa y termonucleasa.

No. de colonias No. de colonias


sospechosas
a probar
0-50

51-100

101-150

Prueba de coagulasa
1.

Sembrar las colonias a aprobar en 0,5 cm 3 de caldo BHI, e incubar a 35C por
24h

2.

A una serie de tubos agregar 0,5 cm3 de plasma de conejo.

3.

Inocular los tubos de plasma con una asada del caldo BHI.

4.

Incubar en bao de agua a 35C y observar la formacin de cogulo a las 2 y 4


horas, los tubos negativos descartarlos hasta las 24 h

5.

Reportar positiva la prueba si hay formacin de cogulo pequeo pero bien


constituido o una coagulacin total de la mezcla.

34

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Prueba de DNAsa
1.

Sembrar las colonias sospechosas en las placas de Agar DNAsa.

2.

Incubar a 35C durante 24 h

3.

Observar un halo transparente alrededor de las colonias positivas al agregar HCl


0,1N

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS


Calculo para reportar:
No. Colonias en placa x No. Colonias positivas

x dilucin x 10

No. Colonias probadas

VII. CUESTIONARIO
1.

Qu tipos de alimentos son susceptibles a contaminacin por S. aureus?

2.

Si tiene menos de 50 colonias sospechosas de S. aureus, Cuntas debe


probar?

3.

Por qu es importante el recuento de S. aureus en alimentos?

VIII. ACTIVIDAD DE SNTESIS


Escriba las caractersticas que presentan las colonias de S. aureus en cada medio de
cultivo utilizado en la prctica, as mismo mencione si el medio de cultivo es selectivo o
diferencial y que compuesto lo hace ser del tipo que elegiste.

IX.

REFERENCIAS

NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de


Staphylococcus aureus en alimentos.

35

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA No. 7

RECUENTO DE Bacillus cereus

I.

PROPOSITO

Aislar y cuantificar B. cereus en una muestra de alimentos.

II.

FUNDAMENTO TERICO

Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo formador de esporas, es mvil, aerobio,


aunque tambin es capaz de crecer anaerbicamente en medios complejos, la
temperatura mnima de crecimiento es de 10 a 20 C, la ptima de 30 a 35 C y la
mxima de 35- 45 C. Crece en un intervalo de pH de 4,9 a 9,3 y en una actividad
acuosa mnima de 0,95.
Este microorganismo est ampliamente distribuido en la naturaleza, se encuentra en el
suelo y en el polvo, se ha aislado de frutas, cereales, verduras, harinas, almidones,
productos para pastelera, sopas, especias, leche cruda, pasteurizada y en polvo,
cremas y budines, papas, salsas, entre otros. En la primera mitad del siglo diferentes
informes en la literatura europea, mencionan a bacilos formadores de esporas en
enfermedades trasmitidas por alimentos, sin embargo a partir de 1950 ha existido un
incremento en el nmero de informes, en los cuales se establece a B. cereus como
responsable de enfermedades trasmitidas por alimentos. En Europa es uno de los
principales microorganismos causantes de gastroenteritis, en Estados Unidos se han
reportado pocos brotes y en nuestro Pas se carece de datos en cuanto a la frecuencia
con que se asla de los alimentos, as como si ha causado o no brotes de
gastroenteritis.
La gastroenteritis se manifiesta por un cuadro emtico severo o un cuadro diarreico. El
cuatro tpico emtico se presenta de 1 a 5 horas despus de ingerir el alimento y se
caracteriza por un ataque agudo de nuseas y vmito, dolor abdominal, diarrea
ocasionalmente y no hay fiebre. El cuadro tpico diarreico se presenta despus de 6 a
12 horas de la ingestin del alimento y se caracteriza por la presencia de dolor
36

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

abdominal, diarrea profusa acuosa, tenesmo rectal, nauseas moderadas, con rara
sensacin de vmito, la fiebre no es comn teniendo una duracin de 12 a 18 h.
Las esporas de B. cereus sobreviven al procedimiento de coccin de los alimentos y
sus clulas vegetativas pueden desarrollar rpidamente.
Se ha visto que se requiere un nmero elevado de microorganismos viables para
causar la enfermedad (de 1010) lo cual se favorece en sitios donde se preparan
alimentos en grandes cantidades (como guarderas, restaurantes, hospitales, centros
de trabajo etc.) y se cocinan en recipientes muy grandes que dificultan la refrigeracin,
adems de calentarse y recalentarse inadecuadamente. Cuando se encuentra presente
el microorganismo en los alimentos y ste se encuentra en condiciones ptimas para su
desarrollo en 10 h puede llegar a alcanzar el nmero adecuado para causar la
enfermedad.

III. EQUIPO Y MATERIAL


1 frasco de dilucin
4 cajas de Petri
4 varillas de vidrio en L
3 pipetas de 1,0 cm3 y 1 pipeta de 10 cm3
8 tubos de 13x 100 con tapn de rosca etiquetados como dice abajo *
2 tubos de 16x150 con tapn de rosca

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO


Agua peptonada al 0,1%
Agar glucosa peptona de casena
*Rojo de fenol ms glucosa
*Rojo de fenol ms sacarosa
*Rojo de fenol ms glicerol
*Rojo de fenol ms manitol
*Rojo de fenol ms salicina
*Caldo nitratos
*Gelatina nutritiva
*Voges Proskauer
37

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

V.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO

1.

Pesar 10 gramos de muestra y colocarlos en un frasco con 90 cm 3 de agua


peptonada al 0.1%

2.

Preparar las diluciones decimales hasta 10-5 en tubos con 9 cm3 de agua
peptonada.

3.

Inocular 0,1 cm3 de cada dilucin sobre la superficie del medio de cultivo agar
glucosa peptona de casena , y extender con varilla de vidrio.

4.

Incubar a 30-32 C durante 24 h

5.

Seleccionar para el recuento las placas que contengan un nmero de colonias


que permitan observar con claridad las colonias caractersticas de este
microrganismo.

6.

Seleccionar algunas de las colonias caractersticas y sembrar en agar nutritivo.

7.

Confirmar la presencia de ste microorganismo con pruebas bioqumicas.

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

38

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

VII. CUESTIONARIO
1.

Mencione otros dos medios de cultivo en los cuales es posible el aislamiento de


Bacillus cereus.

2.

Escriba las principales pruebas bioqumicas para la identificacin de B. cereus,


indicando como las presenta dicho microorganismo.

3.

Porqu B. cereus puede resistir los tratamientos trmicos?

4.

En qu alimentos podemos encontrar B. cereus.

VIII. ACTIVIDAD DE SNTESIS


Describa la importancia toxicolgica de la determinacin de de B. cereus en alimentos
IX.

REFERENCIAS

NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de B. cereus


en alimentos.

39

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PRACTICA No. 8

EVALUACION DE LA EFECTIVIDAD DE UN DESINFECTANTE

I.

PROPOSITO

Determinar la eficacia de un desinfectante sobre los microorganismos en una muestra


de lechuga.

II.

FUNDAMENTO TERICO

La higiene de los alimentos implica una variedad de acciones, entre las cuales, el
evitar la contaminacin ocupa un lugar relevante. Cada fuente de contaminacin que
puede actuar sobre los alimentos presenta sus propias peculiaridades y por ello
requiere de mtodos especiales para lograr su control. As ocurre con el agua, la tierra,
la fauna, con los manipuladores o con el equipo y envase que finalmente habrn de
contenerlos.
Existen procesos de lavado y desinfeccin, que utilizan sustancias y condiciones de
tratamiento propio para cada necesidad en las distintas ramas de la industria de
alimentos. Cuando las normas o recomendaciones para su aplicacin se siguen con
acierto, los resultados son claramente satisfactorios.
La desinfeccin consiste en la reduccin en nmero de microorganismos y se requiere
en las operaciones de la planta de alimentos en las cuales las superficies renen
condiciones favorables para el crecimiento de microorganismos, los cuales a niveles
significativos pueden ocasionar enfermedades y/o alteraciones de los productos.
Un desinfectante es el agente fsico o qumico capaz de reducir el nmero de
microorganismos presentes en una superficie o alimento a un nivel que no de lugar a
contaminacin nociva.

40

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Es importante que todo saneamiento sea precedido por una buena limpieza; de no ser
as se limita la accin y eficacia de los desinfectantes. Se entiende por limpieza la
eliminacin de los residuos de alimentos, suciedad, grasa y otros materiales objetables,
utilizando detergentes limpiadores y medios mecnicos apropiados para su eliminacin.
Para que una desinfeccin sea efectiva la superficie a desinfectar debe estar limpia, el
desinfectante debe entrar en contacto directo con la superficie, debe utilizarse la
concentracin adecuada de desinfectante y se debe proporcionar el tiempo suficiente
para que acte el desinfectante.
Los mtodos de desinfeccin normalmente se encuentran dentro de los siguientes
grupos:
Fsicos: Vapor, agua caliente, UV, aire caliente.
Qumicos: Cloro, yodo, perxidos, compuestos cuaternarios de amonio.
El laboratorio proporciona un valioso recurso que permite evaluar satisfactoriamente la
eficacia de la desinfeccin.

III. EQUIPO Y MATERIAL


12 cajas Petri
3 frascos de dilucin
2 matraces 250 ml para esterilizar
6 tubos 16x150
10 pipetas 1.0 cm3
Recipiente grande de plstico
Lechuga picada sin lavar
Desinfectante diferente por cada equipo

IV. REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO


Agar cuenta estandar
Agar rojo violeta bilis
Agua peptonada al 0,1%

41

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

V.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

PROCEDIMIENTO

1.

Se pica una lechuga sin lavar y se pesan 10 g en un frasco de dilucin con 90


cm3 de agua peptonada (dilucin 1:10), realizar diluciones hasta 1:100000 en
tubos con 9 cm3 de agua peptonada.

2.

A la misma lechuga se le enjuagar con agua estril, escurriendo el agua y se le


agrega 90 cm3 de agua peptonada (dilucin 1:10) ; se harn diluciones hasta
1:1 000. Se adicionar un desinfectante comercial en cantidad y tiempo de
acuerdo con las indicaciones del fabricante del producto.

3.

Se escurre la solucin y se le adicionan nuevamente 90 cm 3 de agua peptonada


(dilucin 1:10).

4.

En cada uno de los casos se utilizarn las diluciones siguientes:


Mesfilos
Lechuga sucia

Lechuga lavada
Lechuga desinfectada

8.

1:10
1:1000
1:100000
1:10
1:1000
1:10

Organismos
Coliformes
1:10
1:1 000
1:100 000
1:10
1:1 000
1:10

5.- Inocular 1 cm3 de cada dilucin de las tres muestras en cajas Petri y agregar
de 12 a 15 cm3 de medio de cultivo Agar Cuenta Estndar. Dejar solidificar e
incubar a 35 C 48 h.

VI. OBSERVACIONES Y RESULTADOS

42

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

VII. CUESTIONARIO
1.

Cul es la importancia de evaluar la actividad de un desinfectante?

2.

Piensas que ste mtodo se puede aplicar para evaluar el desinfectante sobre
una superficie, porqu?

3.

Cul es la diferencia entre un sanitizante y un desinfectante?

4.

Qu factores se deben tomar en cuenta para la eleccin de un desinfectante?

5.

De qu manera influye la composicin de los alimentos en la desinfeccin?

VIII. ACTIVIDAD DE SNTESIS


Escribe la clasificacin de los desinfectantes.
Define los siguientes trminos brevemente: limpieza, desinfeccin, detergente,
surfactante, sanitizacin.
IX.

REFERENCIAS

Brook. 2003. Microbiologa de los microrganismos. Mc Graw Hill.

43

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

ANEXO I
Preparacin de diluciones decimales: tiene como objeto efectuar diluciones progresivas
que permitan realizar recuentos microbianos posteriores.
Tcnica
Pesar aspticamente una porcin representativa de la muestra, multiplicar los gramos
obtenidos por 9 y el resultado dar los centmetros cbicos de diluyente que tenemos
que aadir. Esta corresponde a la solucin madre (SM, 1:10, 10 1).
3

Para realizar las diluciones decimales, tomamos con pipeta estril 1 cm de la SM y la


trasferimos a un tubo de ensayo que contiene 9 cm 3 del mismo diluyente que hemos
utilizado para la preparacin de la SM, obtenemos as la dilucin 1:100, (10 2).
Con una pipeta nueva tomamos 1 cm 3 de la dilucin 1:100 y lo trasferimos a otro tubo
con 9 cm3 de diluyente, obtenemos as la dilucin 1:1 000 (10 -3) as sucesivamente
hasta obtener las diluciones deseadas.
De esta forma se obtiene la serie de diluciones decimales que servirn para las
determinaciones en las que es necesario obtener recuentos y para los cuales existen
cantidades apreciables de microorganismos.

44

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

ANEXO II
Composicin de los medios de cultivo
1.

Caldo selenito cistina


INGREDIENTES
Polipeptona peptona
Lactosa
Na3PO4
Seleniato cido de sodio
L-cistina
Agua destilada

CANTIDADES (g)
5
4
10
4
0,01
3
1 000 cm

Ajustar pH final a 7.
Suspender 23 g de medio deshidratado en 1000 cm 3 de agua destilada y disolver.
Esterilizar por exposicin del medio a flujo de vapores por 15 minutos.
2.

Agar sulfito de bismuto


INGREDIENTES
Polipeptona peptona
Extracto de carne
Dextrosa
Na2HPO4
FeSO4
BiSO4 (indicador)
Verde brillante
Agar
Agua destilada

CANTIDADES (g)
10
5
5
4
0,3
8
0,025
20
3
100 cm

pH final de 7,5. Disolver 52 g del polvo en 1 L de agua destilada. Cuando se haya


obtenido una suspensin uniforme calentar con agitacin frecuente por 1 minuto, enfriar
a 45C.
3.

Agua peptonada 0.1%


INGREDIENTES
Peptona
Cloruro de sodio
Agua

CANTIDADES (g)
1
8,5
3
1 000 cm

Disolver los componentes en 1 L de agua. Ajustar pH con NaOH 1N. Distribuir en


porciones de 99, 90 y 9 cm3 o en cualquier mltiplo de 9 segn se requiera, esterilizar
por 15 minutos a 121 C.
NOTA: Para las soluciones de 1 y 10 % se agregar 1 y 10 gramos respectivamente
de la solucin de cido tartrico y se aforar a 100 cm 3.
45

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

4.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Caldo lactosado
INGREDIENTES

Extracto de carne
Peptona de gelatina
Lactosa
Agua destilada

CANTIDADES (g)
SIMPLE
DOBLE
CONCENTRACION
CONCENTRACION
3
6
5
10
5
10
3
3
1 000 cm
1 000 cm

Disolver los ingredientes en 1 L de agua, calentar si es necesario. Ajustar pH final, de


tal manera que despus de la esterilizacin sea de 6,9 a 25 C, distribuir en tubos, cada
uno de los cuales debe tener una campana de fermentacin. Esterilizar.
5.

Caldo lactosa bilis verde brillante


INGREDIENTES
Peptona
Lactosa
Sales biliares
Verde brillante
Agua

CANTIDADES (g)
10
10
20
0,0133
3
1 000 cm

Disolver los componentes en el agua, calentar si es necesario, ajustar el pH de tal


manera que despus de la esterilizacin sea de 7,2 a 25 C, distribuir el medio en
cantidades de 10 cm3, conteniendo una campana de fermentacin, esterilizar.
6.

Agar triptona-extracto de levadura (Agar para Cuenta Estandar)


INGREDIENTES
Extracto de levadura
Triptona
Agar
Agua

CANTIDADES (g)
2,5
5,0
1,0
3
1 000 cm

Suspender los componentes del medio deshidratado en 1 L de agua. Hervir hasta total
disolucin. Distribuir en recipientes y esterilizar.
7.

Agar papa-dextrosa
INGREDIENTES
Infusin de papa
Dextrosa
Agar
Agua

CANTIDADES (g)
200
20
15
3
1 000 cm

Suspender 39 g del medio deshidratado en 1000 cm 3 de agua y calentar hasta


ebullicin; distribuir en recipientes adecuados y esterilizar. Enfriar a 40-45 C y acidificar
a pH de 3,5 con una disolucin de cido tartrico al 10 % (aproximadamente 1,4 cm 3 de
cido por cada 100 cm3 de medio).
46

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

8.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Caldo tetrationato
INGREDIENTES
Proteosa peptona o triptona
Sales biliares
Carbonato de calcio
Tiosulfato
de
sodio
pentahidratado
Agua destilada

CANTIDADES (g)
5
1
10
30
1 000 cm

pH final: 7,0 0,1. Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada estril..
Distribuir, agitando constantemente, en porciones de 10 cm 3, en recipientes estriles.
Guardar en refrigeracin. Antes de usar el medio, agregar 20 cm3 de una solucin
yodo-yoduro por 1000 cm3 de caldo y si se desea 10 cm3 de una solucin al 1% de
verde brillante por 1000 cm3 de caldo. El medio una vez adicionado de yodo no debe
calentarse y debe usarse el mismo da de su preparacin.
9.

Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)


INGREDIENTES
Xilosa
L-lisina
Lactosa
Sacarosa
Cloruro de sodio
Extracto de levadura
Rojo de fenol
Agar
Desoxicolato de sodio
Citrato frrico-amnico
Tiosulfato de sodio
Agua destilada

CANTIDADES (g)
3,75
5
7,5
7,5
5
3
0,08
15
2,5
0,8
0,8
3
1 000 cm

pH final: 6,9 0,2. Suspender los ingredientes en un litro de agua destilada, y calentar
en bao de agua a 55C, agitando frecuentemente, hasta disolucin completa. Ajustar
el pH. Enfriar a 50C y verter en cajas de Petri estriles. No se esterilice. El
sobrecalentamiento produce una precipitacin; la reactividad del medio puede ser
satisfactoria, pero las colonias suelen ser muy pequeas. El aspecto del medio es claro
y de color rojo brillante.
10.

Agar entrico Hektoen


INGREDIENTES
Proteosa peptona
Extracto de levadura
Lactosa
Sacarosa
Salicina
Sales biliares

CANTIDADES (g)
12
3
12
12
2
9
47

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Cloruro de sodio
Tiosulfato de sodio
Citrato amnico frrico
Azul de bromotimol
Fuscina cida
Agar
Agua

5
5
1,5
0,064
0,1
13,5
3
1 000 cm

pH final: 7,5 0,2. Suspender los ingredientes en agua destilada, hervir con
agitacin hasta completa disolucin del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar a
55-60C y distribuir en cajas de Petri estriles en condiciones aspticas.
11.

Agar de tres azcares y hierro (TSI)


INGREDIENTES
Peptona de carne
Peptona de casena
Cloruro de sodio
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Agar
Rojo de fenol
Sulfato ferroso amnico
pentahidratado
Tiosulfato de sodio
Agua destilada

CANTIDADES (g)
1
1
0,5
1
1
0,1
1,3
2,5 mg
20 mg
20 mg
3
100 cm

pH final: 7,3 0,2. Suspender los ingredientes en 100 ml de agua destilada. Calentar a
ebullicin, agitando ocasionalmente, hasta disolucin completa. .Enfriar a 60C y
ajustar el pH. Distribuir en volmenes de 3 cm3 en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a
121C 1C durante 15 min. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el
fondo alcance una altura de 3 cm y una profundidad de 4 cm. El medio es de color rojo.
12.

Agar de hierro y lisina (LIA)


INGREDIENTES
Peptona de gelatina
Extracto de levadura
Glucosa
L-lisina
Citrato frrico-amnico
Tiosulfato de sodio anhidro
Prpura de bromocresol
Agar
Agua destilada

CANTIDADES (g)
0,5
0,3
0,1
1
50 mg
4 mg
2 mg
1,5
3
100 cm

48

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

pH final: 6,7 0,2. Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien,
calentar hasta ebullicin con agitacin frecuente hasta conseguir la disolucin
completa. Ajustar el pH. Distribuir en volmenes de 3 cm 3 en tubos de 13 x 100 mm,
con tapn de rosca. Esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 12 min. Dejar que
los tubos se enfren en posicin inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de
medio de 4 cm y una superficie inclinada de 2 cm. El medio ya preparado es de color
prpura.
13.

Caldo MR-VP (Rojo de Metilo-Voges Proskauer)


INGREDIENTES
Peptona
Dextrosa
Difosfato de potasio
Agua destilada

CANTIDADES (g)
7
5
5
3
1 000 cm

pH final: 6,9 0,2.


Suspender los ingredientes en el agua destilada, calentar a ebullicin agitando
frecuentemente hasta lograr una disolucin completa. Ajustar el pH. Distribuir el medio
en volmenes de 3 cm3 en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar en autoclave a 121C
1C durante 15 minutos.
14.

Caldo Malonato
INGREDIENTES
Extracto de levadura
Sulfato de amonio
Fosfato dipotsico
Fosfato monopotsico
Cloruro de sodio
Malonato
Glucosa
Azul de bromotimol
Agua

CANTIDADES (g)
1
2
0,6
0,4
2
3
0,250
0,250
3
1 000 cm

pH final: 6,7 0,2


Suspender los ingredientes en agua, mezclar y ajustar el pH. Distribuir en tubos de 13 x
100 mm en cantidades de 3 cm3. Esterilizar en autoclave a 121C 1C durante 15
minutos.
15.

Agar-Rojo- Violeta-Bilis-Lactosa (RVBA)


INGREDIENTES
Peptona
Extracto de levadura
Lactosa
Sales biliares
Cloruro de sodio

CANTIDADES (g)
7
3
10
1,5
5

49

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

Rojo neutro
Cristal violeta
Agar
Agua

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

0,03
0,002
15
3
1 000 cm

Mezclar los componentes en el agua y dejar reposar durante algunos minutos. Mezclar
perfectamente y ajustar el pH a 7,4 con cido clorhdrico 0,1N o con hidrxido de sodio
0,1N a 25 C, de forma que despus del calentamiento se mantenga en este valor.
Calentar con agitacin constante y hervir durante 2 minutos. Enfriar inmediatamente el
medio en un bao de agua hasta que llegue a 45C. Evitar el sobrecalentamiento del
medio No debe esterilizarse en autoclave. Usar el medio dentro de las tres primeras
horas despus de su preparacin.
16.

Medio base de Baird-Parker


INGREDIENTES
Triptona
Extracto de levadura
Extracto de carne
Glicina
Cloruro de litio
Piruvato de sodio
Agar
Agua

CANTIDADES (g)
10
1
5
12
5
10
20
3
1 000 cm

pH final 10
Disolver los ingredientes o el agar base en agua y calentar con agitacin constante y
hervir durante 1 min. Esterilizar a 121C 1 durante 15 minutos. Enfriar y mantener el
medio a 45C.
17.

Solucin de Telurito
INGREDIENTES
Telurito de potasio
Agua

CANTIDADES (g)
1
3
100 cm

Disolver el telurito de potasio en agua y esterilizar. La solucin puede ser almacenada


por varios meses a temperatura de 0 a 5C.
18.

Plasma de conejo

Emplear plasma de conejo deshidratado o rehidratado siguiendo las instrucciones del


fabricante y agregar cido etilendiaminotetractico (EDTA) en solucin al 0,1% en
plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado diluir con agua estril en
proporcin de 1:3.

50

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

Puede emplearse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe


emplearse sangre citratada.
19.

Agar DNAsa
INGREDIENTES
ADN
Peptona tripticase
Peptona Phytona
Cloruro de sodio
Agar
Agua destilada

CANTIDADES (g)
2
15
5
5
15
3
1 000 cm

pH final 7.3 .
Mezclar, calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto. Distribuir y
esterilizar.
20.

Agar de Sal y Manitol


INGREDIENTES
Extracto de carne de res
Peptona Polipeptona
Cloruro de sodio
D-Manitol
Agar
Rojo de fenol
Agua destilada

CANTIDADES (g)
1
10
75
10
15
0.025
3
1 000 cm

pH final 7.4. Mezclar los ingredientes; calentar agitando frecuentemente, hervir durante
un minuto, distribuir y esterilizar.
21.

Agar Chapman Stone


INGREDIENTES
Extracto de levadura
Peptona tripticase
Gelatina
D-Manitol
Cloruro de sodio
Sulfato de amonio
Fosfato dipotsico
Agar
Agua destilada

CANTIDADES (g)
2
10
30
10
55
75
5
15
3
1 000 cm

pH final 7.

51

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

22.

Caldo EC
INGREDIENTES
Peptona Tripticase
Lactosa
Mezcla de sales biliares
Fosfato dipotsico
Fosfato monopotsico
Cloruro de sodio
Agua destilada

23.

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

CANTIDADES (g)
20
5
1,5
4
1,5
5
3
1000 cm

Base de Caldo Rojo de Fenol


INGREDIENTES
Peptona Tripticase
Cloruro de sodio
Rojo de fenol
Agua destilada

CANTIDADES (g)
10
5
0,018
3
1 000 cm

NOTA: Los ingredientes se mezclan y para pruebas especficas se le puede


agregar de 5 a 10 g de algn carbohidrato.
24.

Gelatina Nutritiva
INGREDIENTES
Peptona Gelysate
Extracto de carne de res
Gelatina
Agua destilada

25.

CANTIDADES (g)
5
3
120
1 000 cm3

Caldo de Nitrato Trypticase (Indol Nitrito)


INGREDIENTES
Peptona trypticase
Fosfato disdico
Dextrosa
Agar
Nitrato de potasio
Agua

CANTIDADES (g)
20
2
1
1
1
1 000 cm3

52

MANUAL DE LABORATORIO
QUINTO SEMESTRE

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

BIBLIOGRAFA
1.

Manual de laboratorio de Microbiologa Sanitaria. Escuela Nacional de Ciencias


Biolgicas. IPN. 2 Edicin 2000.

2.

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ICMSF. Ecologa microbiana de los alimentos Vol. I. Editorial Acribia. 1980.

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Vol. Editorial Acribia 2 edicin, 1982.

5.

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6.

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Fernndez Escartin Eduardo. Microbiologa Sanitaria. Vol. I Universidad de


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Normas Oficiales Mexicanas indicadas en cada practica.

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Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Fac. Qumica


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12.

Camacho A. , M Giles, et. al. Tcnicas para el anlisis microbiolgico de


alimentos. 2 ed. Fac. Qumica UNAM. 2009.

53