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Finalidade .

Sistema enzimtico para a determinao do colesterol


total em amostras de soro, por reao de ponto final.
[Somente para uso diagnstico in vitro.]

Princpio .

O colesterol total determinado de acordo com as


seguintes reaes:
Colesterol
steres do colesterol

Colesterol + cidos graxos


Esterase
Colesterol

Colesterol + O2

Oxidase

Colest-4-en-ona + H2O2

Peroxidase
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina
Antipirilquinonimina + 4 H2O
Os steres de colesterol so hidrolisados pela colesterol esterase a
colesterol livre e cidos graxos. O colesterol livre oxidado pela colesterol
oxidase a colest-4-en-ona e perxido de hidrognio. Na presena de
peroxidase e perxido de hidrognio, o fenol e a 4-aminoantipirina so
oxidados formando a antipirilquinonimina que tem absortividade mxima
em 500 nm.
A intensidade da cor vermelha formada na reao final diretamente
proporcional concentrao do colesterol na amostra.

Caractersticas do Sistema . Os valores elevados do colesterol,


principalmente o colesterol ligado s lipoprotenas de baixa densidade,
so um dos mais importantes fatores de risco para o desenvolvimento da
doena arterial coronariana. O National Cholesterol Education Program
(NCEP)6 recomenda que os sistemas de medio do colesterol
apresentem caractersticas de desempenho capazes de atingir os
requisitos de exatido e preciso necessrios para que os resultados
tenham utilidade mdica.
Os dados de exatido, repetitividade e reprodutibilidade obtidos com o
sistema Colesterol Liquiform demonstram que o mtodo capaz de
fornecer resultados que superam as exigncias do NCEP, fazendo com
que possa ser considerado como bastante seguro para a medio
confivel do colesterol total nos nveis de deciso mais importantes.
Adicionalmente, a comparao entre as imprecises encontradas na
repetitividade e na reprodutibilidade demonstra que o sistema de medio
bastante robusto nas regies de concentraes significativas para uso
clnico, indicando um desempenho estvel no dia a dia.
O sistema composto de um nico reagente pronto para uso, com
estabilidade que garante desempenho consistente em sua forma lquida
original e manuteno das condies timas da reao.

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Colesterol Liquiform possui um sistema clarificador de alta eficincia que


elimina as interferncias positivas produzidas por valores de triglicrides
at 2600 mg/dL.
O sistema facilmente aplicvel em analisadores automticos e semiautomticos capazes de medir uma reao de ponto final em 500 nm e
pode ser usado para medio do colesterol HDL aps precipitao
seletiva das LDL e VLDL.

Metodologia . Enzimtico-Trinder.
Reagentes
1. 1 - Reagente 1 - Armazenar entre 2 - 8 C.
Contm tampo 50 mmol/L, pH 7,0; fenol 24 mmol/L; colato de sdio
500 mmol/L; azida sdica 15 mmol/L; 4-aminoantipirina 500 mmol/L;
colesterol esterase 250 U/L, colesterol oxidase 250 U/L e peroxidase
1000 U/L .
Para preservar o desempenho, o reagente deve permanecer fora da
geladeira somente o tempo necessrio para se obter o volume a ser
utilizado. Evitar exposio luz solar direta.

2.

- Padro - 200 mg/dL - Armazenar entre 2 - 30 C.


Contm azida sdica 15 mmol/L. Aps o manuseio sugere-se armazenar
bem vedado para evitar evaporao.
Os reagentes no abertos, quando armazenados nas condies
indicadas, so estveis at a data de expirao impressa no rtulo.
Durante o manuseio, os reagentes esto sujeitos contaminaes de
natureza qumica e microbiana que podem provocar reduo da
estabilidade.

Precaues e cuidados especiais


No utilizar o Reagente 1 quando sua absorbncia, medida contra a gua
em 500 nm, for igual ou maior que 0,300 ou quando mostrar-se turvo ou
com sinais de contaminao.
Os cuidados habituais de segurana devem ser aplicados na
manipulao do reagente. O Reagente 1 e o Padro contm azida sdica
que toxica. Deve-se tomar cuidado para evitar a ingesto e no caso de
contato com os olhos deve-se lavar imediatamente com grande
quantidade de gua e procurar auxlio mdico. A azida pode formar
compostos altamente explosivos com tubulaes de chumbo e cobre.
Portanto, utilizar grandes volumes de gua para descartar o reagente.
Os reagentes no abertos, quando armazenados nas condies
indicadas, so estveis at a data de expirao impressa no rtulo.
Durante o manuseio, os reagentes esto sujeitos contaminaes de
natureza qumica e microbiana que podem provocar reduo da
estabilidade.

Material necessrio e no fornecido


1. Banho-maria mantido temperatura constante (37 C).
2. Fotmetro capaz de medir, com exatido, a absorbncia entre 490 e
510 nm.
3. Pipetas para medir amostras e reagente.

Como nenhum teste conhecido pode assegurar que amostras de sangue


no transmitem infeces, todas elas devem ser consideradas como
potencialmente infectantes. Portanto, ao manuse-las, deve-se seguir as
normas estabelecidas para biossegurana.
Para descartar os reagentes e o material biolgico, sugerimos aplicar as
normas locais, estaduais ou federais de proteo ambiental.

4. Cronmetro.
Influncias Pr-analticas .

Interferncias

A postura durante a colheita da


amostra deve ser padronizada porque pode ter efeitos significativos nos
resultados. Se as amostras so obtidas com o paciente na posio
sentada, deve-se padronizar para que o indivduo esteja sentado durante
15 minutos e no mais que 30 minutos.

Valores de bilirrubina at 5 mg/dL, hemoglobina at 180 mg/dL e


triglicrides at 2600 mg/dL no produzem interferncias significativas.
Valores de bilirrubina entre 5 e 38 mg/dL produzem resultados falsamente
diminudos proporcionais concentrao da bilirrubina.

Um garroteamento maior que 1 minuto produz hemoconcentrao, o que


pode aumentar os valores do colesterol em 5,0% aps 2 minutos e 10,0 a
15,0% aps 5 minutos. Portanto, muito importante obter a amostra de
sangue aps liberar o torniquete devendo-se padronizar todo o
procedimento da colheita.

Para avaliar a concentrao aproximada da hemoglobina em uma


amostra hemolisada pode-se proceder do seguinte modo: Diluir 0,05 mL
da amostra em 2,0 mL de NaCl 150 mmol/L (0,85%) e medir a
absorbncia em 405 ou 415 nm acertando o zero com gua deionizada
ou destilada.

A variao biolgica do colesterol, decorrente da variao tambm


biolgica das lipoprotenas transportadoras do colesterol, observada
quando a dosagem do colesterol repetida em um mesmo laboratrio no
espao mnimo de uma semana. Ela ocorre independentemente do erro
analtico e pode variar entre 1,7 e 11,6% com uma mdia de 6,1% devido,
principalmente, variao biolgica da LDL que a principal lipoprotena
transportadora de colesterol.

Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbncia405 x 601


Hemoglobina(mg/dL) @ Absorbncia415 x 467

Nveis elevados de ascorbato (vitamina C) produzem interferncias


negativas por competio com o cromognio na reao da peroxidase.
Se houver suspeita da presena de cido ascrbico deixar o soro em
repouso durante 90 minutos antes de iniciar a dosagem para minimizar a
ao do interferente.

Amostra
Deve ser criado um Procedimento Operacional Padro (POP) que
estabelea procedimentos adequados para colheita, preparao e
armazenamento da amostra. Enfatizamos que os erros devidos amostra
podem ser muito maiores que os erros ocorridos durante o procedimento
analtico.
De modo geral, a amostra de sangue pode ser obtida com ou sem jejum,
mas altamente recomendvel que todos os ensaios dos lpides
sanguneos, incluindo o colesterol, sejam realizados em amostras
colhidas em jejum. As vantagens da utilizao de amostras colhidas em
jejum so decorrentes da padronizao da colheita, pois permitem a
realizao da determinao de outros lpides que requerem o jejum e
minimizam a interferncia da lipemia ps prandial que est
freqentemente presente em amostras obtidas sem o jejum.
Usar soro. Anticoagulantes como citrato, oxalato ou EDTA produzem
resultados falsamente diminudos. O analito estvel 7 dias entre 2 - 8 C
e 6 meses a 20 C negativos6. Homogeneizar bem as amostras lipmicas
antes de iniciar a dosagem. No utilizar amostras fortemente
hemolisadas.
Como o volume de amostra pequeno, deve-se pipetar com cuidado para
minimizar a impreciso do sistema de medio.

Portugus - Ref.: 76

Procedimento
Ver observaes 1, 2 e 3
Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como a seguir:
Branco
Amostra
Padro (N 2)
Reagente 1

Teste

Padro

0,01 mL
1,0 mL

0,01 mL
1,0 mL

1,0 mL

Misturar e incubar em banho-maria a 37 C durante 10 minutos. O nvel de


gua no banho deve ser superior ao nvel de reagentes nos tubos de
ensaio. Determinar as absorbncias do teste e padro em 500 nm ou filtro
verde (490 a 510), acertando o zero com o branco. A cor estvel por 60
minutos.
O procedimento sugerido para a medio adequado para fotmetros
cujo volume mnimo de soluo para leitura igual ou menor que 1,0 mL.
Deve ser feita uma verificao da necessidade de ajuste do volume para o
fotmetro utilizado.
Os volumes de amostra e reagente podem ser modificados
proporcionalmente sem prejuzo para o desempenho do teste e o
procedimento de clculo se mantm inalterado. Em caso de reduo dos
volumes fundamental que se observe o volume mnimo necessrio para
a leitura fotomtrica. Volumes da amostra menores que 0,01 mL so
crticos em aplicaes manuais e devem ser usados com cautela porque
aumentam a impreciso da medio.

Clculos
Absorbncia do Teste
Colesterol (mg/dL) =

x 200
Absorbncia do Padro

Exemplo
Absorbncia do Teste = 0,290
Absorbncia do Padro = 0,345
0,290
Colesterol (mg/dL) =

x 200 = 168
0,345

Devido a grande reprodutibilidade que pode ser obtida com a


metodologia, pode-se utilizar o mtodo do fator.
200
Fator de Calibrao =
Absorbncia do Padro

Materiais de controle devem ser utilizados para avaliar a impreciso e/ou


desvios da calibrao. Sugere-se procurar atender como limites
10
mximos de controle as especificaes propostas por NCEP para
coeficiente de variao 3,00%, erro sistemtico (bias) 3,00% e erro
total 9,0%.
Sugere-se utilizar as preparaes estabilizadas da linha Qualitrol - Labtest
para controle interno da qualidade em ensaios de qumica clnica.

Valores recomendveis ou desejados .

Os valores abaixo
substituem os valores de referncia e foram determinados a partir de
dados epidemiolgicos tratados estatisticamente, que relacionam os
nveis do colesterol com a prevalncia de doena coronariana isqumica
(DCI).

Colesterol (mg/dL) = Absorbncia do Teste x Fator


Classificao ATP III de LDL, Colesterol Total e HDL (mg/dL):

Exemplo
200
Fator =

10

= 580
0,345

Colesterol (mg/dL) = 0,290 x 580 = 168

Calibrao
Rastreabilidade do Sistema
O padro rastrevel ao Standard Reference Material (SRM) 911 do
National Institute of Standards and Technology (NIST).
Calibraes manuais
Obter o fator de calibrao ao usar novo lote de reagentes ou quando o
controle interno da qualidade indicar.
Sistemas automticos
Branco de reagentes: gua deionizada ou destilada, ou soluo de
cloreto de sdio 150 mmol/L (0,85%);
Padres: usar calibradores proticos. As concentraes de
Colesterol nos calibradores da linha Calibra Labtest so rastreveis ao
SRM 1951 do NIST.
Intervalo de calibraes
Deve-se recalibrar o sistema nas seguintes situaes:
Calibrao de 2 ou 3 pontos ao mudar de lote;
Calibrao de 2 ou 3 pontos quando o controle interno da qualidade
indicar.

Linearidade
O resultado da medio linear at 500 mg/dL. Quando for obtido um
valor igual ou maior que 500 mg/dL, diluir a amostra com NaCl 150
mmol/L (0,85%), realizar nova medio e multiplicar o resultado pelo
fator de diluio. Diluir a amostra de tal modo que o valor encontrado se
situe entre 150 e 300 mg/dL. Sugerimos a verificao da linearidade
metodolgica e fotomtrica, no mnimo semestralmente, utilizando
amostras com valores at 500 mg/dL.

Controle interno da qualidade . O laboratrio deve manter um


programa de controle da qualidade que defina claramente os
regulamentos aplicveis, objetivos, procedimentos, critrios para
especificaes da qualidade e limites de controle, aes corretivas e
registro das atividades.

Portugus - Ref.: 76

Adultos

Colesterol Total (mg/dL)


Desejvel
Limiar elevado
Elevado

<200
200 - 239
240

Colesterol HDL (mg/dL)


Baixo
Elevado (Desejvel)

<40
60

Colesterol LDL (mg/dL)


timo
Limiar timo
Limiar elevado
Elevado
Muito Elevado

<100
100 - 129
130 - 159
160 - 189
190

Crianas e Adolescentes
Colesterol Total (mg/dL)
2 a 19 anos

Colesterol HDL (mg/dL)


<10 anos
10 a 19 anos

Desejvel
Limtrofe
Elevado

<170
170 - 199
200

Desejvel
Desejvel

40
35

Desejvel
Limtrofe
Elevado

<110
110 - 129
130

Colesterol LDL (mg/dL)


2 a 19 anos

Converso: Unidades Convencionais (mg/dL) x 0,026 = Unidades SI


(mmol/L).

11

Caractersticas do desempenho

Exatido . Em duas amostras com concentraes de colesterol iguais


a 146 e 245 mg/dL foram adicionadas quantidades diferentes do analito,
obtendo-se recuperaes entre 94 e 110%. O erro sistemtico
proporcional mdio obtido em um valor de 200 mg/dL foi igual a
4,0 mg/dL ou 2,0%.

Especificidade . O mtodo proposto foi comparado com um mtodo


similar utilizando 60 amostras com valores situados entre
96 e 495 mg/dL. A comparao resultou na equao da regresso:
y = 6,92 + 0,96x e um coeficiente de correlao (r) igual a 0,996.
O erro sistemtico total (constante e proporcional) verificado no nvel de
deciso (200 mg/dL) foi igual a 1,08 mg/dL ou 0,54%. Como as amostras
foram selecionadas aleatoriamente em pacientes de ambulatrio e
pacientes hospitalizados, pode-se inferir que o mtodo tem uma
especificidade metodolgica adequada.

Repetitividade - Impreciso intra-ensaio


Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3

N
10
10
10

Mdia
175
255
357

DP
2,69
3,08
4,23

CV (%)
1,5
1,2
1,2

Reprodutibilidade - Impreciso total


Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3

N
10
10
10

Mdia
173
253
353

DP
4,23
5,77
8,46

Nveis diminudos so encontrados no hipertireoidismo, doenas


consumptivas e desnutrio crnica.
Alm do nvel do colesterol srico, a hipertenso e o fumo constituem
fatores de risco de aterosclerose e DAC.

Observaes
1.

A limpeza e secagem adequadas do material utilizado so fatores


fundamentais para a estabilidade dos reagentes e obteno de resultados
corretos.

2. A gua utilizada no laboratrio deve ter a qualidade adequada a cada


aplicao. Assim, para preparar reagentes e usar nas medies, deve ter
resistividade 1 megaohm ou condutividade 1 microsiemens e
concentrao de silicatos <0,1 mg/L (gua tipo II). Para o enxge da
vidraria a gua pode ser do tipo III, com resistividade 0,1 megaohms ou
condutividade 10 microsiemens.
No enxge final utilizar gua tipo II. Quando a coluna deionizadora est
com sua capacidade saturada ocorre a produo de gua alcalina com
liberao de vrios ons, silicatos e substncias com grande poder de
oxidao ou reduo que deterioram os reagentes em poucos dias ou
mesmo horas, alterando os resultados de modo imprevisvel. Assim,
fundamental estabelecer um programa de controle da qualidade da gua.

CV (%)
2,4
2,2
2,1

Sensibilidade metodolgica . Uma amostra protica no


contendo colesterol foi utilizada para calcular o limite de deteco do
ensaio tendo sido encontrado um valor igual a 1,04 mg/dL, equivalente a
mdia de 20 ensaios mais dois desvios padro. Utilizando-se a
absorbncia do padro como parmetro verificou-se que o limite de
deteco fotomtrica de 0,06 mg/dL, correspondendo a uma
absorbncia igual a 0,0001.
Efeitos da diluio da matriz .

Duas amostras com valores


iguais a 330 e 400 mg/dL foram utilizadas para avaliar a resposta do
sistema nas diluies da matriz com NaCl 150 mmol/L (0,85%). Usando
fatores de diluio que variaram de 2 a 8 encontraram-se recuperaes
entre 99 e 113%.

Significado clnico . O grande dilema da aterosclerose que ela


um processo silente. Est ativa em todos os indivduos e permanece sem
qualquer manifestao por dcadas e, subitamente se manifesta atravs
de dor torcica, infarto agudo do miocrdio ou morte sbita. Estudos
populacionais longitudinais como os de Tecumset, Albany, Framinghan,
Evans, Chicago, Oslo entre outros, e tambm dados epidemiolgicos e
estudos experimentais em animais, demonstraram uma correlao
positiva entre os nveis do colesterol, mais especificamente do colesterol
LDL e o risco de doena arterial coronariana (DAC). Ao mesmo tempo foi
evidenciado que os nveis de colesterol HDL so inversamente
proporcionais ao risco de DAC.

Portugus - Ref.: 76

Valores aumentados de colesterol so encontrados na nefrose,


hipotireoidismo, doenas colestticas do fgado e nas
hiperlipoprotenemias dos tipos IIa, IIb e III.

3. Para uma reviso das fontes fisiopatolgicas e medicamentosas de


interferncia nos resultados e na metodologia sugere-se consultar Young
DS. Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3 edio, Washington:
AACC Press, 1990.

Referncias
1. Alain CA, Poon LS, Cahn CSG, Richmond W, Fu PC. Clin Chem
1974;20:470.
2. Bergmeyer HU. Methods of Enzymatic Analysis, 3 edio, Verlag
Chemie:Weinhein, 1984;8:141-8.
3. Bull Org Mond Sant. 1970;43:891.
4. Fredrickson DS, Levy RJ, Lee RS. New Engl J Med 1967; 276:24, 94,
148, 215, 276.
5. Good NE, Winger GD, Winter W, Connoly TN, Izawa S, Singh RMM.
Biochemistry 1966;5:467.
6. Rifai N, Warnick GR, Dominiczak MH. Handbook of lipoprotein testing.
AACC Press: Washington, 1997:75-97.
7. Tonks DB. Quality Control in Clinical Laboratories, Warner-Chilcott
Laboratories, Diagnostics Reagents Division, Scarborough, Canada,
1972.
8. Westgard JO, Barry PL, Hunt MR, Groth T. Clin Chem 1981;27:493501.

9. Leite PF, Martinez TLR, Halpern A, Cendoroglo MS, Novazzi JP, Fonseca
FAH, Dias JCA. Risco cardiovascular: fatores metablicos e
nutricionais: diagnstico e tratamento. So Paulo: Loyola, 1994. P.56.

Informaes ao consumidor

10. Executive Summary of the Third report of the National Cholesterol


Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation and
Treatment of High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel
III). JAMA 2001;285:2486-97.

A Labtest Diagnstica garante o desempenho deste produto dentro das


especificaes at a data de expirao indicada nos rtulos desde que os
cuidados de utilizao e armazenamento indicados nos rtulos e nestas
instrues sejam seguidos corretamente.

[Termos e Condies de Garantia]

11. Labtest: Dados de arquivo.

Apresentao
Produto
Colesterol
Liquiform

Referncia
76-2/100
76-2/250

Contedo
1

2 X 100 mL
1 X 5 mL
2 X 250 mL
1 X 5 mL

Labtest Diagnstica S.A.


CNPJ: 16.516.296 / 0001 - 38
Av. Paulo Ferreira da Costa, 600 - Vista Alegre - CEP 33400-000
Lagoa Santa . Minas Gerais Brasil - www.labtest.com.br
Servio de Apoio ao Cliente
e-mail: sac@labtest.com.br

0800 031 34 11 (Ligao Gratuita)

Esto disponveis aplicaes para sistemas automticos.


O nmero de testes em aplicaes automticas depende dos
parmetros de programao.

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Reviso: Julho, 2014


Ref.: 041114

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