PRACTICA N 08

COLORACION DE GRAM EN LAS

BACTERIAS

INTRODUCCION
La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio
bacteriolgico y con el que el estudiante debe estar perfectamente familiarizado. Su
utilidad prctica es indiscutible y en el trabajo microscpico de rutina del Laboratorio
de Microbiologa las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos,

positivos, negativos, etc.) se basan justamente en la tincin de GRAM Esta tincin se

denominada as por el bacterilogo dans Christian Gram, quien la desarroll en 1844.
Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo
no tiene nada que ver con carga elctrico, sino simplemente designan dos grupos
morfolgicos distintos de bacterias).Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus
paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al
organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular
bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de la clula Grampositiva es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como
algo de cido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la clula Gram-positiva
es peptidoglicano. La pared de la clula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa
mucho ms delgada, nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana
exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacridos, y lipoprotenas. Slo10% - 20%
de la pared de la clula Gram-negativa es peptidoglicano. Debido a su importancia en
taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las
distintas bacterias, describiremos aqu con algn detalle la tincin de Gram y las
interpretaciones que actualmente se hacen sobre el porqu de su funcionamiento. Las
clulas Gram positivas, a causa de sus paredes celulares ms espesas (tienen ms
peptidoglicano y menos lpido), no son permeables al disolvente ya que ste deshidrata
la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared
celular.

TINCIN DE GRAM
Una tincin Gram en la que se observa un mezclado de Staphylococcus aureus (coco
Gram positivo) y Escherichia coli (bacilo Gram negativo).
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en
bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su
nombre al bacterilogo dans Christian Gram (1853-1938), que desarroll la tcnica en

1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose
bacterias Gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias Gram
negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.

EXPLICACIN
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto
Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un
compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Si
(Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula
bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa
con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que
en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no
se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de
contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina.
Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras
que las Gram positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una
tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del
protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern
rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).

TEORAS
Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo
microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve Gram
negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del
colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca
insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidratan las
paredes de los microorganismos Gram positivos, tratados con mordiente, y forma una
barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas Gram negativas, los lpidos de la
pared (ms abundantes que en las clulas Gram positivas) se disuelven por este
tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos
autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular.
Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn
(1923) bas la suya en una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las
bacterias, Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad
de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en

soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las
bases. De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias
obedece en gran parte a su contenido protenico; estos microorganismos se conducen
como cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y con
los bsicos en medio alcalinos. La combinacin con ambos tipos de colorante no se
produce en el punto isoelctrico. Como los microorganismos contienen ms de una
protena, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye ms bien
una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los
microorganismos Gram positivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los
microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las
siguientes conclusiones:

Los microorganismos Gram positivos pueden hacerse gramnegativos al

aumentar la acidez.

Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse Gram positivos al

aumentar la alcalinidad.

Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden

hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.

Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden

hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.

En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia

a retener cualquier colorante.

Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples,
sino ms bien una dbil combinacin de sustancias protenicas con otras
lipoideas o grasas.

La materia grasa extrada de los microorganismos Gram positivos difiere de la

obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una
proporcin mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por
los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la
coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la
sustancia oxidada un carcter ms cido. Esto aumenta la afinidad de un
microorganismo por los colorantes bsicos.

El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre

todo, de los microorganismos dbilmente Gram positivos cultivados en los
medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se
vuelve cida en el curso del desarrollo.

Gianni (1952) comprob que los microorganismos Gram positivos Bacillus subtilis y
Bacillus anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a
tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia Gram positiva debajo de la pared celular,
para invertir la reaccin. Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible
existencia de una capa exterior alrededor de un ncleo gramnegativo. Liben son y

McElroy, han comunicado que si la reaccin Gram positiva depende de que se forme
una combinacin compleja entre los componentes de la coloracin de Gram y las
protenas de la pared celular, sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios
fsicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podra cambiar el carcter
qumico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los grmenes Gram positivos
desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman
negativamente el Gram.
La pared celular de los microorganismos Gram positivos y gramnegativos es permeable
al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y
colorante formado en el interior de la clula. Los resultados experimentales obtenidos
con una difusin celular exenta de protenas, y la escasa solubilidad del complejo de
yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinin de que la
reaccin Gram positiva consiste esencialmente en la formacin, dentro de la clula, de
una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difcil de eliminar con el
disolvente. La pared celular de los microorganismos Gram positivos, a diferencia de la
de los gramnegativos, sera prcticamente impermeable al violeta cristal. Los
microorganismos aparecern teidos despus de tratarlos con violeta cristal, por ser
absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente
eliminar sin dificultad el complejo formado despus del tratamiento con yodo.
Ni los grupos sulfhdrico ni las protenas bsicas han influido especficamente en el
mecanismo del colorante de Gram. Liben son y Mcllroy han sostenido que la
permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de
yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo
constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa
coloracin.

PASOS PARA REALIZAR LA TINCIN

Los pasos que se han de seguir para realizar la tincin son los siguientes:
1) Se fija la muestra mediante calor.
2) Violeta cristal (tie todas las bateras, Gram positivas y Gram negativas) durante 1
minuto.
3) Se fija con Lugol, 1 minuto.
4) Se decolora con una mezcla de alcohol y cetona (los Gram negativos se decoloran).
5) Safranina (colorante de contraste, que tie a los Gram negativos), 1 minuto.
Los tiempos para aplicar cada colorante son orientativos. En la tincin, las Gram
positivas se observarn de color azul-violeta, y las Gram negativas de color rosa.

Cristal violeta durante 1mn

Yodo lugol durante 1mn

Se vaco acetona para limpiar el cristal violeta hasta que ya no escurriera ms de este.

Se vaco safranina durante 1mn

Se lav con agua corriente para limpiarlo de la safranina y se sec al aire libre.

Sele acho una pequea gota de aceite de palo (aceite de inmersin) para su vista en el
microscopio.

Se observ atraves del microscopio con objetivo 100x

Se observaron bacilos, de color rojo y por lo tanto los microorganismos son

gramnegativos.

TRABAJO EN EL LABORATORIO
Materiales:
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio ptico
Solucin de cristal violeta al 1 %
Solucin de azul de metileno al 1 %
Solucin de safranina al 1 %
Solucin decolorante (alcohol etlico y acetona 1:1)
Solucin de I2 / I- (yodo / yoduro al 0.1 %)
Cultivo (caldo o agar) a teir.
Ansa de punta y ansa de aro.

 Mecheros
Alcohol etlico
Gasa

PREPARACIN DEL EXTENDIDO PREVIA A LA COLORACIN

Se toma un portaobjetos previamente desengrasado y se coloca en el centro del mismo
una gota del cultivo lquido, mediante ansa de platino.
Si el cultivo es slido, se coloca primero una gota de solucin fisiolgica o agua
destilada estril sobre el portaobjeto. Luego, con ansa de platino se toma una colonia del
medio slido y se emulsiona con la solucin fisiolgica. Se extiende con el ansa en
forma de capa delgada y uniforme.
Se procede a la fijacin del extendido. Para ello se pasa lentamente el portaobjeto, en
forma horizontal, sobre la llama del mechero manteniendo el extendido hacia arriba.
La operacin se repite hasta sequedad total, cuidando evitar la combustin del
extendido.

TINCIN
TINCIN SIMPLE:
_ Sobre el extendido seco se colocan unas gotas de azul de metileno y se deja
actuar unos minutos.
_ Se elimina el exceso de colorante lavando con agua de forma suave, con
ayuda de piseta. Se seca el extendido de la forma descripta en 3.2.
_ Se observa al microscopio.
3.3.2. Tincin diferencial. Mtodo de Gram
Sobre el extendido realizado en el punto 3.2., se realiza el siguiente tratamiento.
El mecanismo de la tincin Gram es la reseado en el siguiente esquema:

Productos
que se
utilizan

Reaccin y coloracin de las bacterias

GRAM +

GRAM -

1) Cristal
violeta

Clulas color violeta

Clulas color violeta

2) Lugol
solucin
iodada

Se forma el complejo CV-I.

Las clulas continan teidas
de color violeta.

Se forma el complejo CV-I.

Las clulas continan teidas
de color violeta.

3) Alcohol

Se deshidratan las paredes

celulares. Se contraen los
poros. Disminuye la
permeabilidad. El complejo
CV-I no sale de las clulas que
continan teidas de color
violeta.

Eliminacin por extraccin de

grasas de las paredes
celulares. Aumenta la
porosidad. El complejo CV-I
se separa de la clula.

4)
Safranina

Clulas no decoloradas;
quedan teidas de color
violeta.

Clulas decoloradas; se tien

de color rosado.

TINCIN DE GRAM

BIBLIOGRAFIA
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram
http://erik2693.blogspot.com/2009/06/practica-6-tincion-de-gram.html
http://es.scribd.com/doc/43696269/Tincion-de-gram-Introduccion-desarrollo-einterpretacion-de-resultados-Practica-2#scribd