You are on page 1of 14


PhD Thesis MTF General Introduction

Chapter 1
General introduction
From: Flikweert M.T. (1999) Physiological roles of pyruvate decarboxylase in Saccharomyces
cerevisiae. PhD thesis, Delft University of Technology, Delft. ISBN 90­9013020­9
The yeast Saccharomyces cerevisiae is best known for its characteristic physiological property: the
rapid fermentation of sugars to ethanol and carbon dioxide. This feature has been exploited for
millennia in the leavening of d ough and in brewing (Chen & Chiger, 1985). Nowadays S. cerevisiae
is used for many diverse purposes and it has become one of the economically most important micro­
organism that are used in large­scale biotechnological processes. 
The commercial applications of S. cerevisiae can be grouped in two major classes (Table 1). One class
comprises applications that are aimed at production of low­molecular­weight metabolites (ethanol,
carbon dioxide, glycerol, flavour compounds). This class involves processes such as the production of
alcoholic beverages, the production of CO2 for the leavening of bread and the production of fuel
ethanol. The second class is aimed at production of yeast biomass or at the production of compounds
that are directly derived from biomass. Examples of the latter class are the production of bakers' yeast
and the production of yeast extracts. Furthermore, its eukaryotic nature and GRAS (Generally
Recognised As Save) status have made S. cerevisiae a popular host for the large­scale industrial
production of heterologous proteins (Burden and Eveleigh, 1990; Romanos et al., 1992).
Table 1. Industrial applications of Saccharomyces cerevisiae (Partly taken from: Burden and Eveleigh, 1990).
Production of alcoholic beverages (beer, wine, sake)
Metabolite directed

Production of bio­alcohol
Dough fermentation
Production of specialty chemicals

Production of baker's yeast

Production of (heterologous) proteins
Production of yeast extracts
Production of yeast's as a nutritional supplement

The fact that S. cerevisiae is still one of the most important industrial yeasts is to a large extent due to
its long history in the bakers' yeast process. Because of this early application, great effort has been put
in the development of fermentation technology and strain improvement, both by classical methods as
well as by genetic engineering. This research has been aimed at improving various critical product
parameters, including fermentative capacity, productivity in the biomass production phase, storage
stability and minimisation of byproduct formation. Additional research has been aimed at extending
the range of applications of this multi­purpose, flexible industrial micro­organism. 
Compared with the tremendous deepening of fundamental knowledge on the genetics and molecular
biology of S. cerevisiae the understanding of its physiology and metabolism has somewhat lagged
behind (Walker, 1998). This is elegantly underlined by Gancedo & Gancedo (1994); "A century after
Buchner's report (1897), regulation of glycolysis is still not completely solved". Further investigations
to extend fundamental knowledge on the regulation of sugar metabolism in S. cerevisiae is not only of
scientific interest but may also be profitable for industrial applications. Furthermore, insight in the
physiology of S. cerevisiae, a popular laboratory model for 'the' eukaryotic cell, can in many cases be
extrapolated to other important eukaryotic organisms, including Homo sapiens.


 cerevisiae genome encode proteins of which the function remains unknown.. including the 'Pasteur effect'. The best­documented environmental factors are the availability of glucose and oxygen. cerevisiae belongs to the physiological group of facultatively fermenting yeasts. 1989). due to imperfect mixing in large­ scale bioreactors local sugar concentrations often exceed the respiro­fermentative threshold (Sweere et al. Even more recently.. 1983; Van Urk.htm   Respiro­fermentative 2/14 . Verduyn et al. At this point the carbon flux is distributed among respiration and fermentation. molecular genetics. In industry a low sugar concentration is maintained by aerobic sugar­limited fed­batch cultivation at growth rates below the critical growth rate (Reed. absence/presence of oxygen. The functional analysis of the entire yeast genome will require a concerted effort of scientist from different relevant disciplines (e. tight control of the sugar concentration is needed. Local high sugar concentrations trigger alcoholic fermentation within seconds. 1983; Postma et al.. 1986).  The external environment and changes within this environment strongly influence the physiological behaviour of yeast. Regulation of alcoholic fermentation S. 1986). However.  Formation of fermentation byproducts such as ethanol. this has led to the development of techniques for genome­wide gene expression studies (De Risi et al. 1 mM. This rapid response is called the short­term Crabtree effect (Petrik et al. type or concentration of sugar) and on the strains used (Table 2). resulting in a local ethanol production and thus in a decrease of the biomass yield.1989). In facultatively fermenting yeasts. the 'Kluyver effect' and the 'Crabtree effect'. These yeasts exhibit alcoholic fermentation under oxygen­limited conditions (Van Dijken & Scheffers.xs4all. cerevisiae has been obtained in the last decades. Table 2. cerevisiae. is located at an important branch point in sugar metabolism. cerevisiae. A short explanation of these effects is given below. Several regulatory phenomena reflecting the distribution of pyruvate over respiratory and fermentative dissimilation have been the maintenance of aerobic cultivation conditions is not sufficient to avoid the occurrence of alcoholic fermentation. 1984) or when the specific growth rate is higher than the so­called critical growth rate (usually ca. To prevent alcoholic fermentation. In cases where optimisation of industrial cultivation methods has reached its limits. Even under fully aerobic conditions a mixed respiro­fermentative metabolism is observed when the sugar concentration exceeds a certain threshold value (ca. which can produce ATP either by respiration or by fermentation.home. 1996; Goffeau et al. the end product of glycolysis. 1996). 1987; Hensing et al. microbial physiology and process engineering). 1995).. cerevisiae at high biomass densities is hampered by this yeast's strong tendency towards alcoholic fermentation..16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction A high level of knowledge about the genetics and biochemistry of S. the 'Custers effect'. this integrated approach is a prerequisite for rational application of recombinant­DNA techniques ('metabolic pathway engineering') to improve the cellular properties of yeasts and in particular S. For S. The resulting flux distribution depends on the environmental conditions (i. 1997). cerevisiae genome­sequencing project in 1996 as an important milestone (Bradbury. Industrial cultivation of S.   Many of the open reading frames in the S. with the completion of the S. these processes compete for pyruvate and NADH. 1988). acetic acid and glycerol not only reduces the biomass yield but also affects the formation of biomass­related products. The key intermediate pyruvate. Conditions Type of metabolism Batch culture   Aerobic growth Carbon­ limited http://marcelf. two­thirds of the maximum specific growth rate on glucose; Petrik et al. 1982; Barford. Example of types of glucose metabolism in Saccharomyces cerevisiae depending on the availability of oxygen and carbon source (taken from Käppeli & Sonnleitner.g.e.

 1984; van Dijken & Scheffers 1986)..htm 3/14 . The NADH formed in other processes (biosynthesis. In sugar­limited chemostat cultures the growth rate and the glucose uptake rate is low due to a low sugar concentration; in resting cells the glucose uptake rate is low due to an inactivation of the sugar transport system. 1986).. 1986).xs4all. 1940; Wijsman et al. 1986). The mechanism which underlies this phenomenon is probably the higher affinity for one of the intermediates pyruvate. The addition of an electron acceptor during anaerobic conditions abolished the inhibition of alcoholic fermentation and this led to the hypothesis that the Custers effect is caused by a redox imbalance. Under aerobic conditions the respiratory chain reoxidizes this NADH. Lagunas (1986) identified e this observation as an artefact due to the absence in Pasteur's experiments of the extra nutrients (unsatured fatty acids and sterols) required for growth of S. the Pasteur effect is only observed under special experimental conditions. http://marcelf. Custers effect The Custers effect is the inhibition of alcoholic fermentation when a yeast culture is transferred from oxygen­limited to anaerobic conditions (Bruinenberg et al.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction Oxygen­ limited Anaerobic growth Respiro­fermentative Fermentative   Chemostat culture Aerobic growth at low dilution rates     Carbon­ limited Respiratory Oxygen­ limited Respiro­fermentative Aerobic growth at high dilution rates   Carbon­ limited Respiro­fermentative Oxygen­ limited Respiro­fermentative Anaerobic growth Fermentative Pasteur effect The definition of the Pasteur effect is the inhibition of sugar consumption by aerobiosis (Lagunas. acetate production) cannot be reoxidized in this This occurs in Brettanomyces species when they are grown on glucose (Custers. due to their inability to form glycerol or other reduced metabolites under anaerobic conditions (Custers. In S. cerevisiae.. In her excellent review on the Pasteur effect. 1982; Lagunas. 1983; Van Dijken & Scheffers.home. Conversion of glucose into ethanol involves a closed redox balance.This physiological behaviour or effect was named after Pasteur because of his observations in 1861 on experiments with cultivated brewers' yeast in the presence and absence of air. acetaldehyde and NADH of the respiratory system over the fermentative route (Lagunas et al. notably at very low dilution rates in the chemostat and in resting­cell suspensions. cerevisiae under anaerobic conditions. 1940).

 The yeast Candida utilis does show the Kluyver effect: it is able to ferment glucose under oxygen­limited conditions but it cannot ferment maltose under these conditions . 1989). with may contribute to a lower flux through glycolysis (Sims & Barnett.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction Under anaerobic conditions glucose has to be partly converted to glycerol as a redox sink at the expense of ATP (Scheffers 1966).. 1978; Weusthuis.. Kluyver effect The Kluyver effect has been described as follows: '.. 1986). When a culture of S. Several differences were revealed between Crabtree­positive and Crabtree­ negative yeasts. however. 1989; Figure 2).. utilis (Weusthuis et al.. It has been reported in more than 100 yeast species (Sims and Barnett..1994). 1966; Fiechter et al. 1983; Käppeli. However there are some plausible explanations like a lowered rate of sugar transport (i. 1978). it was proposed that the onset at alcoholic fermentation at even higher dilution rates might be due to a limited capacity of acetaldehyde dehydrogenase..' (Sims & Barnett.  Postma (1989) studied the correlation between the occurrence of the long­term Crabtree effect and the levels of key enzymes in glucose metabolism in glucose­limited chemostat cultures grown at various dilution rates (Postma et al. 1984; Van Urk. They have shown that. proposed that the increased respiration rate might reflect uncoupling by acetate. cerevisiae does not exhibit this effect. The long­term Crabtree effect has been explained from a limited respiratory capacity of respiratory sugar metabolism (Fiechter et al. but not anaerobically. 1989).nl/GeneralIntroduction.e.. The long­term Crabtree effect is defined as aerobic alcoholic fermentation under steady­state conditions at high specific growth rates (Fiechter et al. Weusthuis et al. 1986). Furthermore some yeasts have a reduced activity of pyruvate decarboxylase during growth on non­glucose sugars. 1981; Van Dijken & Scheffers. 1991). 1995). the Crabtree effect is described as the occurrence of alcoholic fermentation under aerobic conditions (Crabtree.. thus necessitating the redirection of the carbon flux via alcohol dehydrogenase (Postma. Weusthuis et al. 1992.home. although these yeast's can use one or more of the component hexoses anaerobically. This effect was explained in terms of an 'overflow' in metabolism. 1981; Postma et al.. able to grow rapidly on maltose under aerobic conditions by respiring this disaccharide. certain yeasts can utilize particular disaccharides aerobically. C. suggesting that t the Kluyver effect must be caused in a difference between the metabolism of this sugar and that of glucose.. This phenomenon is widespread under facultatively fermentative yeasts. The accumulation of acetate was explained by these authors from an insufficient amount of acetyl­CoA synthetase at high growth rates (Postma et al.htm 4/14 . Similarly. rates of glycolysis and glycogen http://marcelf. S. 1929; de Deken..1983; Käppeli and Sonnleitner. 1989).  When S. 1982; Barnett. 1989)..xs4all. added ethanol suppresses the utilisation of maltose by C.  The definition of the short­term Crabtree effect is the instantaneous aerobic alcoholic fermentation upon addition of excess sugar to sugar­limited and/or non­fermenting cultures (Rieger et al. (1994) proposed feedback inhibition of disaccharide utilisation by ethanol as a possible cause of the Kluyver effect. 1994). utilis is. 1983; Verduyn et al. Crabtree effect In general.. a transport limitation) or control of the synthesis of the sugar transporter (Barnett and Sims. Yeasts that exhibit the Kluyver effect for a particular sugar are able to ferment glucose. 1986). indeed. the long­term Crabtree effect and the short­term Crabtree effect can be distinguished (Van Urk.. 1983; Rieger et al. 1981; Petrik et al. 1989).. cerevisiae is cultivated in a glucose­limited chemostat the long­term Crabtree effect appears when the dilution rate (and consequently the specific growth rate) exceeds the so­called 'critical specific growth rate' (Figure 1). More specifically. including different kinetics of glucose uptake. Postma et al.  Van Urk (1989) studied the short­term Crabtree effect and compared some Crabtree­positive with Crabtree­negative yeasts. cerevisiae is exposed to excess sugar the glucose consumption rate increases until the respiratory capacity becomes limiting (Petrik et al. The exact mechanism underlying this phenomenon has not yet been resolved. 1994; Kaliterna et al. An uncoupling effect of respiration (reflected by an enhanced qO2; Figure 1) coincided with the accumulation of some acetic acid in the cultures.

cerevisiae has recently been tested by overproducing this enzyme. (Taken from Postma et al.. acetate production were not cerevisiae CBS 8066.e. 1998).home. Panel B: Steady­state concentrations of metabolites in glucose­limited chemostat cultures of S. require a free­energy input (ATP). Most strikingly. Furthermore. Figure 1. specific growth rate) in glucose­ limited cultures of S.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction formation and the levels of a number of key enzymes involved in pyruvate metabolism. This indicates that a 'bottle­neck' at the level of acetyl­CoA synthetase is not the sole cause for acetate excretion. http://marcelf. 1988). Example of the short­term Crabtree effect in Saccharomyces cerevisiae. despite a 3­6 fold overproduction of acetyl­CoA synthetase (de Jong­Gubbels et al. A small number of common intermediates in these catabolic pathways is required for biosynthesis of biological macromolecules. yeasts and other micro­organisms degrade sugars via catabolic pathways to produce ATP. despite the presence of some pyruvate decarboxylase.. which involve anabolic pathways. Panel A: Specific rate of oxygen uptake. Pronk and co­workers (1998) increased pyruvate decarboxylase levels in the Crabtree­ negative yeast Kluyveromyces lactis by more than ten­fold by introduction of multiple copies of the S.xs4all. All Crabtree­positive yeasts contained higher levels of this fermentative key enzyme than the Crabtree negative yeasts. Example of the long­term Crabtree effect in Saccharomyces cerevisiae.  Recently. cerevisiae PDC1 gene. carbon dioxide production and biomass yield as a function of the dilution rate (i. When respiring cultures of such engineered strains were exposed to glucose excess. Pyruvate metabolism After uptake. aerobic alcoholic fermentation was absent and the strain retained its Crabtree­negative phenotype.  The hypothesis that a limited activity of acetyl­CoA synthetase is the cause of acetate excretion by S. 1989) Figure 2. ethanol production rates showed a clear positive correlation with the level of pyruvate decarboxylase in Crabtree­positive yeasts. cerevisiae CBS 8066.htm 5/14 . apparently.. When an aerobic steady­state chemostat culture of this Pdc­overproducing strain was exposed to excess sugar. high levels of acetaldehyde dehydrogenase and acetyl­CoA synthetase were observed in the Crabtree­negative yeasts. Production of ethanol and acetate after a pulse of glucose (50 mM) to an aerobic glucose­limited chemostat culture (Van Urk et al. a high level of pyruvate decarboxylase is not the sole reason for ethanol formation under aerobic conditions. These biosynthetic reactions. This indicates that. These may 'pull' the carbon flux towards respiration.

  Pyruvate.htm 6/14 . pyruvate carboxylase; Pdh. acetyl­coenzyme A synthetase. The three major pathways of pyruvate metabolism are depicted in Figure 3. This redirection of metabolic fluxes to stimulate the formation of a commercially important compound (glycerol was used in the production of explosives) can be considered as 'metabolic http://marcelf.1998; Larsson et al.. 1919). a reaction catalysed by the enzyme pyruvate decarboxylase (Figure 3). pyruvate is first converted into acetaldehyde. Schematic representation of the key enzymic reactions of pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. the end­product of glycolysis. This pathway couples the conversion of glucose into pyruvate to the formation of only 2 ATP via substrate­level phosphorylation. flux distribution at the level of pyruvate is of crucial importance for byproduct formation by S. A major complicating factor in this area is that S. The acetaldehyde acts as an electron acceptor for NADH reoxidation. the mitochondria (respiration) and alcohol dehydrogenase (fermentation) also compete for the cytosolic NADH formed in glycolysis. alcohol dehydrogenase; Ald.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction In S. During fermentation. 1996). This interaction between respiration and fermentation at the redox level is the subject of the PhD project of ir.xs4all. the rate of glycerol formation increases (Neuberg. Pyc. cerevisiae (for a review see Pronk et al. the major pathway involved in the initial steps of glucose catabolism is the Embden­ Meyerhof­Parnas pathway (EMP­pathway or glycolysis). Besides competition for pyruvate. acetaldehyde dehydrogenase; Acs. This modified fermentation is known as Neuberg's second fermentation. pyruvate decarboxylase; Adh. Figure If acetaldehyde is trapped by the non­toxic hydrogen sulfite. 1998). The intermediate in this reaction is acetaldehyde. including an external NADH dehydrogenase and the glycerol­3­ phosphate shuttle (Luttik et al. Under anaerobic conditions. is an important intermediate in the metabolism of   carbohydrates by S. cerevisiae possesses different systems for mitochondrial oxidation of cytosolic NADH. An alternative route for the regeneration of NAD+ is the conversion of dihydroxyacetone phosphate to glycerol. during fermentative growth. Karin Overkamp (project started in 1998). It is important to note that byproduct formation is unlikely to be completely governed by carbon metabolism. The physiological function of this conversion is to maintain the redox balance by reoxidation of NADH formed in glycolysis which. As pyruvate is located at the branch­point between respiratory and fermentative carbon metabolism. cerevisiae.home. cerevisiae. pyruvate dissimilation involves its conversion to ethanol and carbon dioxide. is the only way to provide the yeast with ATP. pyruvate­dehydrogenase complex; Pdc. The reaction is catalysed by alcohol dehydrogenase (Figure 4).

 1975).nl/GeneralIntroduction.Under these conditions. 1989). which takes place in the mitochondria. cerevisiae shows a respiro­fermentative metabolism under aerobic conditions in the presence of excess sugar... A completely respiratory sugar metabolism requires that glycolysis be coupled to the tricarboxylic acid (TCA) cycle. Pdc.htm 7/14 . pyruvate can be completely oxidized to carbon dioxide and water via the TCA­cycle.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction engineering avant la lettre'. In a Pdh­negative mutant of S. Only under aerobic sugar­limited conditions at low specific growth rates S. Dissimilation of pyruvate via pyruvate decarboxylase is favoured at high pyruvate concentrations (Holzer. Consequently a relatively large part of glucose is fermented rather than respired under these conditions. The subcellular localisation of the enzymes of this PDH­bypass is not entirely known. Secondly. On a longer timescale this effect is enhanced because the http://marcelf. At high glucose concentrations or at high dilution rates the pyruvate concentration is high. pyruvate can be converted to acetyl­CoA by the concerted action of pyruvate decarboxylase. 1989; Jacobson & Bernofski. 1991). 1961; Rieger et al. At low pyruvate concentrations the main flux is directed via the PDH­complex (Boiteux & Hess. pyruvate decarboxylase; Adh. alcohol dyhdrogenase. Operation of this route results in a lower biomass yield due to the increased ATP requirement for the synthesis of acetyl­CoA (Pronk et al. In S.. Figure 4. This hypothesis was based on the different kinetic properties of the PDH complex and pyruvate decarboxylase. acetaldehyde dehydrogenase and acetyl­CoA synthetase (Figure 3; Holzer & Goede. 1994).. cerevisiae there are two pathways via which this can occur. Reoxidation of NADH via the alcoholic fermentation pathway in Saccharomyces cerevisiae. 1981). Being a Crabtree­positive yeast. 1983). A well­suited cultivation method to meet these requirements is the chemostat (Pirt.. 1961; Pronk et al. cerevisiae it was observed that this Pdh­bypass can completely meet the acetyl­CoA requirement. The PDH complex is located in the mitochondria. The first is a direct oxidative decarboxylation by the mitochondrial pyruvate­dehydrogenase complex after pyruvate is transported. 1974; Kispal et al. the fuel of the TCA­cycle. Respiratory dissimilation of pyruvate requires its conversion to acetyl­CoA. Holzer (1961) proposed that this may be the result of a competition for pyruvate between respiration and fermentation.. cerevisiae exhibits a fully respiratory metabolism. The pyruvate dehydrogenase complex has a tenfold higher affinity for pyruvate whilst its capacity for pyruvate is about tenfold lower compared to pyruvate decarboxylase (Figure 5). 1970; Holzer & Goede. into the mitochondria (Nalecz et al.xs4all. but experiments have shown that the Km of isolated mitochondria is similar to that of the PDH­complex (Van Urk et al.. enzyme activities have been shown to be present at least partially in the cytosol (Van Urk et al. However. This indirect route is often referred to as the pyruvate­dehydrogenase bypass. 1991).home. 1994). S. 1961; Kresze & Ronft. probably via a carrier. Cytosolic acetyl­CoA can be transported into the mitochondrion via the carnitine­acetyl transferase shuttle.

 E2.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction expression of respiratory enzymes is repressed by glucose while the expression of pyruvate decarboxylase is several fold induced by glucose. cerevisiae. 1996) Structural Enzyme gene Peptide size (kDa) Cofactor Reaction E1 45 TPP Decarboxylation of pyruvate   PDA1 E1 PDB1 35   E2 LAT1 56 Lipoamide E3 LPD1 54 FAD X PDX1 50 Lipoamide Binding of E3 to E2 core http://marcelf. 1974; Yeaman.1. 1974).home. The E1 subunit catalyses the TPP­dependent decarboxylation of pyruvate. in the case of the PDH complex. The composition of the PDH complex is summarised in table 3. thiamine pyrophosphate. Table 3. In mammalian cells the activity of the PDH­complex is regulated by phosphorylation of three serine residues in the E1 subunit resulting in inactivation of the PDH­complex. The E1 and E2 subunits are complex specific.6.1 (Kresze & Ronft. In the mammalian PDH­complex.5 (Kresze & Ronft. E1 (substrate specific dehydrogenase; EC 1. 1994 and Pronk. peptide size and catalysed reaction of the subunits of the pyruvate dehydrogenase complex.3. This large multi­enzyme complex has an apparent molecular weight of 8·106. protein X. Each of the three complexes consists of three major components. 1997). Abbreviations; TPP. FAD flavin adenine dinucleotide. This oxaloacetate is synthesised from pyruvate via the anaplerotic (replenishing) carboxylation of pyruvate by pyruvate carboxylase (Figure 3). A fourth is probably involved in the assembly of the complex (McCartney et al.. E1.htm Transfer of acetyl group to CoA Reoxidation of lipoamide (E2) 8/14 .4. cerevisiae only one site containing a serine residue is found which can be phosphorylated in vitro (Uhlinger et al. Structural genes.2. 1987). When all five proteins (E1. phosphorylation and dephosphorylation are catalysed by a PDH­specific kinase and phosphatase.  The two major dissimilatory enzymes (PDH and PDC) which directly compete for pyruvate play an important role in the distribution of the glycolytic flux over fermentation and respiration and therefore they will be discussed separately below. However.. an active complex is formed (Kresze & Ronft.12) and E3 (dihydrolipoamide dehydrogenase; EC 1. 1982). 1989). The Km decreased to 200 µM when the pH was decreased to 6.. Several intermediates of the TCA­cycle are used for biosynthetic purposes. whilst the E3 subunit is common in all three complexes (Reed. branched­chain 2­ oxoacid dehydrogenase and pyruvate dehydrogenase.4. E3 and X) of the PDH complex are assembled. 1981). Kinetic studies with purified PDH complex from S. Pyruvate­ dehydrogenase complex The yeast pyruvate­dehydrogenase complex (PDH­complex) is an enzyme system that catalyses a lipoic­acid­mediated oxidative decarboxylation of a­oxo­acids (Reed.1) which.. 1995). 1986; James et al.3). To keep the cycle from terminating oxaloacetate is transported into the mitochondria for replenishing purposes. 1981). which all act in sequence (Reed and Yeaman. respectively. 1981; Keha et al. no PDH­specific kinase or phosphatase have been isolated from S. consists of two subunits (E1 and E1). cerevisiae have revealed a Km value for pyruvate of 625 µM at a pH of 8. It is a member of a family of related dehydrogenase complexes. consisting of 2­oxoglutarate dehydrogenase. E2 dihydrolipoamide acyltransferase (EC 2. In S.xs4all. (Partly taken from Wenzel.

b).5 (PDC1)     62. 1997). Pyruvate decarboxylase was first detected in yeast in 1911 by Neuberg and Karczag who described the decarboxylation of pyruvate to acetaldehyde by fermenting yeast. spontaneous revertants of the pdc1pdc5 double mutant have been found in which a recombination had occurred resulting in a fusion of the PDC6 open reading frame and the PDC1 promotor. 1991a. 1989) and PDC4 (Seehaus. Expression of these genes is enhanced during growth on glucose. With this double mutant the existence of a third PDC gene (PDC6) was shown and it was isolated by low­stringency hybridisation of a genomic library with a PDC1 probe (Hohmann. Beside the structural genes PDC1 (Schmitt et al. cerevisiae. 1993). 1990)..9     Hanseniaspora uvarum 61. 1983).0   Nicotiana tabacum (tobacco) 67.htm 9/14 1983). It is not known either under which conditions it is expressed.. PDC5 (Seeboth et al.1. Deletion mutants expressing neither PDC1 nor PDC5 lacked pyruvate decarboxylase activity (Seeboth et al.4   Oriza sativa (rice) 65. PDC2 regulates the expression of the structural PDC genes.0 (PDC5)   Kluyveromyces marxianus 61. The PDC6 sequence had a high similarity to those of PDC1 and PDC5.3   Aspergillus parasiticus 64 Bacteria Zymomonas mobilis 60. The glucose induction of the PDC1 mRNA level was significantly stronger (fivefold) than that of the PDC5 mRNA level (Smith et al. Deletion of the PDC2 gene resulted in a ten fold reduction of the PDC activity (Hohmann. in particular the conversion of branched chain oxo­acids to its corresponding aldehydes in the Ehrlich pathway. several PDC­genes have been described.. PDC2 is involved in the regulation of thiamine pyrophosphate (TPP) synthesis (Hohmann & Meacock.1 http://marcelf. 1991a).. encoding the active PDC isoenzymes.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction Pyruvate decarboxylase (EC 4. In S. Although it is not sure whether or not Pdc is involved in this route. Pdc is also known for the cleavage of other a­oxo­acids..xs4all. This yielded a functional Pdc enzyme (Hohmann 1991a). However.1) Pyruvate decarboxylase (Pdc) catalyses the irreversible cleavage of pyruvate to acetaldehyde and carbon dioxide. These genes are PDC2 (Schmitt & Zimmerman.. Furthermore. 1990; Hohmann. also regulatory genes have been described. 1998).1 Kluyveromyces lactis ­ Fungi Neurospora crassa 62. fungi. bacteria and plants (partly taken from Pohl.9 Plants Zea mays (maize) 65. The PDC enzyme and/or the genes encoding for PDC have been isolated from different organisms (Table 4). 1986) which are probably involved in the control of expression of the structural genes PDC1 and PDC5. Pyruvate decarboxylases of various yeast's. Organism Species Subunit (kDa) Yeast Saccharomyces cerevisiae 61. The role of PDC6 is unclear.1   Lycopersicon esculentum (tomato) 62 (a) 64 (b)   Pisum sativum (pea) 64. Deletion of the PDC1 gene resulted in a fivefold increase of the transcription of the PDC5 gene suggesting that the PDC genes are be subject to autoregulation (Schaaf et al. Expression could not be demonstrated (Hohmann. 1982). 1991b). 1990) and PDC6 (Hohmann. 1989; Hohmann & Cederberg. 1991b). PDC3 (Wright et al.1. Table 4.

 the cytosolic pyruvate concentration is high.Y. carried out by Anne­Marie Zeeman (Leiden University; PhD thesis in preparation) focuses on the genetics and physiology of pyruvate metabolism in the Crabtree­negative yeast Kluyveromyces lactis.2.home.xs4all. Distribution of metabolic fluxes at the pyruvate branchpoint is a subject which receives special attention. pyruvate (Boiteux & cerevisiae. At the alkaline pH 8.D. Furthermore. 1998) addresses the physiological role of acetyl­CoA synthetase. In the dimers the two subunits are tightly bound. P.. Finally. carbon and redox metabolism of industrial yeasts is investigated by a combination of genetic. H. The four subunits are identical and have a molecular mass of approximately 60 kDa each (Kuo et al. This pH­dependent reversible dissociation of the tetramer state to the dimer state of Pdc is also found in pea seeds (Gounaris et al.JAAR. 1997) focuses on the molecular genetics and regulation of acetyl­CoA synthetase in this yeast. van Dam (University of Amsterdam) involved the active participation of a number of academic research groups. subsidised by the Dutch Ministry of Economic Affairs via the Dutch Association of Biotechnological Research Schools (ABON). Hooykaas at Leiden University) and outside the research school (with the group of Dr. Simultaneous with the work described in this thesis. These properties of PDC together with the observation that both structural genes encoding PDC (PDC1 and PDC5) are induced during growth on glucose (Hohmann. thus favouring formation of the PDC tetramer. addressing various aspects of glycolytic flux in industrially important yeasts and filamentous fungi. Kötter and Prof. These problems have been addressed by quantitative physiological studies on wild­type and genetically engineered yeast strains. 1971; Mücke et al. P. However a transient exposure to glucose will lead to an immediate reduction of the intracellular phosphate concentration (Van Urk.htm 10/14 .J. High concentrations of pyruvate could bring down the pH. The molecular­genetic part of the work is part of collaborations inside the Research School BSDL (Biotechnological Sciences Delft­Leiden; with the group of Dr. a second BSDL PhD project dealing with pyruvate metabolism was part of the ABON program. cerevisiae as a cell factory for the production of high­added­value products. particularly heterologous proteins (Osseweijer & Van http://marcelf.. coordinated by Prof. 1994) deals with the molecular genetics. This project. the feasibility of minimising the formation of ethanol and acetate in biomass­directed applications of this yeast by modifying pyruvate­decarboxylase is experimentally investigated.. The thesis of Marco van den Berg (Delft University of Technology.. Since there is a pH of about 6. The catalytic activity of the PDC tetramer is at its optimum at pH 6. 1989).. Context and scope of this thesis The work described in this thesis is aimed at elucidating the physiological functions of pyruvate decarboxylase in S. Between these two pH values an equilibrium exists between the concentration of the tetramer and the dimers. The research described in this thesis was part of a national project entitled "Metabolic Fluxes in Yeasts and Fungi". 1978. 1992). This project. During the research described in this thesis.4 the tetramer is fully dissociated into the inactive dimers (König et al. 1986). regulation and physiological function of the pyruvate­dehydrogenase complex in S. indicate that pyruvate will be metabolised preferentially via pyruvate decarboxylase during exposure to excess glucose. cerevisiae. 1992). 1989). The enzyme functions only with the cofactor TPP along with the metal ion Mg2+ (Hübner et al.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction The catalytically active PDC enzyme is a tetramer composed of two dimers. Within BSDL. the Delft yeast group were involved in a European Commission research project entitled: "From gene to product in yeast: a quantitative approach".  At high glycolytic fluxes. physiological and process­engineering techniques.1988). Yeast PDC is activated by its substrate. Steensma and Prof. the thesis of Patricia de Jong­Gubbels (Delft University. 1991; Chapter 2). the tetramer is active in vivo. 1970; Hübner et al.. 1978; Van Urk et al. Germany). chapter IV). K. pyruvate carboxylase and malic enzyme in S. which can be taken as an indicator for the intracellular concentration (Postma et al. During conditions of glucose excess significant concentrations of pyruvate are observed extracellularly. 1996). Inorganic phosphate is a competitive inhibitor of the enzyme (Hübner et al.J. K.. as is evident from three recently published PhD theses. The objective of this project was to provide a quantitative description of S..8 in the cytosol. cerevisiae. The thesis of Thibaut Wenzel (Leiden University. Entian in Frankfurt.

 and Sims A. (1996) The "petite­negative" yeast Kluyveromyces lactis has a single gene expressing pyruvate decarboxylase activity. J. cerevisiae PDH­complex is inactivated upon exposure of respiring cells to excess glucose. attempts were made to restore the glycolytic flux of the Pdc­ mutant to wild­type levels by addition of an external electron acceptor. To investigate whether the occurrence of aerobic fermentation may be a consequence of a competition for pyruvate between respiration and fermentation. M. prototrophic wild­type strain. this chapter addresses an apparent discrepancy in the growth characteristics of Pdc­ strains when grown on complex and media. (1983) The role of redox balances in the anaerobic fermentation of xylose by yeast's. Outline of this thesis Chapter 2 of this thesis describes a physiological characterisation of a Saccharomyces cerevisiae strain in which all three structural genes encoding pyruvate decarboxylase isoenzymes (PDC1. Rosa A. (1992). Boiteux. cerevisiae to excess glucose was much lower than that of wild­type cultures.. (1982) The requirement of oxygen for the active transport of sugars into yeast's.A.htm 11/14 . In: Berry. the effects of overproduction of pyruvate decarboxylase on the flux distribution at the pyruvate branchpoint was studied in steady­state chemostat cultures. the hypothesis that pyruvate decarboxylase is essential for the provision of cytosolic acetyl­CoA is investigated in more detail. 100:371­378. it has been proposed that pyruvate decarboxylase is a key enzyme in the production of fusel alcohols from branched­chain 2­oxo acids.M. Patrito L. D.P. Gen. J. Bianchi M.. J. Maccioni H. Allen and Uwin. Bradbury. Allosteric properties of yeast pyruvate decarboxylase.xs4all. cerevisiae to glucose pulses. Destruelle M. (1996) Yeast genome sequenced completely.G. (1987) The technology of aerobic yeast growth. in Chapter 7.. 19: 27­36. Fems Microbiol. respiring cultures of Pdc­ S. Chapter 4 focuses on the response of steady­state.... offered a platform for discussion of the work with colleagues from outside the Netherlands. Russel.. J. London:200­230. byproduct formation is studied in a strain with a reduced (non­zero) level of pyruvate decarboxylase. FEBS Lett. Tizzani L. Barnett. 18:287­292. Growth of the Pdc­ mutant in batch and chemostat cultures on defined minimal media was compared with growth of the isogenic.F. The choice of the pyruvate node as one of the focal points of research in this project. J. G. this chapter addresses the question whether the S. Bruinenberg et al. Eur. 293­296. the hypothesis was tested that the reduced glycolytic flux in the mutant strain was due to a reduced capacity for reoxidation of glycolytic (cytosolic) NADH.R.. B. Microbiol.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction Dijken. Lancet 347:1175. J. Barnett.. Frontali L. PDC5 and PDC6) were disrupted.. I. (eds). Microbiol.. 9.L. Mol. Panzetta G. A. Furthermore. Wolstenholme A. The 59­kDa polypeptide constituent of 8­10­nm cytoplasmic filaments in Neurospora crassa is a pyruvate decarboxylase. Lett. (1970)..  The experiments described in Chapter 2 led to the conclusion that absence of pyruvate decarboxylase causes a requirement for C2­compounds. In Chapter 3. Gene 130:253­258. Wesolowski­Louvel M. 1998). Some controls on oligosaccharides utilization by yeast's: the physiological basis of the Kluyver effect..E. Biotechnol.P. which involved 10 research groups from 8 European countries. These experiments are discussed in Chapter 6 The C2­requirement that results from complete elimination of pyruvate decarboxylase from the cells (Chapters 2 and 3) implies that this is not a viable option for reduction of byproduct formation in industrial strains.D.A. Therefore. To this end. Microbiol. In Chapter 5.  The experiments discussed in Chapter 4 demonstrated that the glycolytic flux observed after exposure of respiring cultures of Pdc­ S. and Hess. Furthermore. http://marcelf. (1993).. 128:2303­2312. Yeast Biotechnology. Barford. In addition to its role in pyruvate metabolism. and Stewart. The role of pyruvate decarboxylase in this so­called 'Ehrlich pathway' is investigated in Chapter 8 References Alvarez. Temporini E.

. Bacteriol 173: 7963­7969. (1993) Characterisation of PDC2.. Cold Spring Harbor Symp. G. Eur.188: 615­621.E.. ECB. Chem... Weidhase R. W. (1997) Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. 3. In: Yeast Sugar Metabolism 187­211 ed. S.O.. Gancedo C. de Jong­Gubbels. Dujon B. Jacq C.T.P. Bussey H. Steensma H.D.H.. Burden D. Curr. Hohmann. 350:277­291. Science 278:680­686. Barrell BG. Hohmann. (1940) Onderzoekingen aan het gistgeslacht Brettanomyces. 26. Pergamon press. (1988) The functional role of thiol groups of pyruvate decarboxylase from brewer's yeast. (1991b) Characterization of PDC6. PhD Thesis. Science 1274(5287):546.L. Fiechter A. 246:1302­1307.R. Galibert F. S.D. (1992) Correlation of cofactor binding and the quarternary structure of pyruvate decarboxylase as revealed by 31P NMR spectroscopy. In: yeast technology; Spencer J. Biochim.A. Adv. a gene necessary for high level expression of pyruvate decarboxylase structural genes in Saccharomyces cerevisiae. (1897) Ber.. Biochem. 22: 123­183.. Acta 47:9­18. Johnston M.K.. Holzer. (1990) Yeast's ­ diverse substrates and products. (1974) Mitochondrial acetaldehyde dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae. (1957) Zwei Wege von Pyruvat zu Acetyl­coenzym A in Hefe. Hoheisel JD. Hübner. Biochem. Quant. Mewes HW. Biomed. (1981) Regulation of glucose metabolism in growing yeast cells. Van den Berg M.. G. a third structural gene for pyruvate decarboxylase in Saccharomyces cerevisiae. Berlin.L. (1998) Metabolic fluxes at the interface of glycolysis and TCA cycle in Saccharomyces cerevisiae. S. 175­ 191. Luttik M. (1985) Production of bakers' yeast. Tettelin H. Biochem 92:175­81 Hübner. Comprehensive Biotechnology Vol.F. http://marcelf.A. J. J. 305­312. Biol. and Goedde. Hohmann. (1993) The isolation and nucleotide sequence of the pyruvate decarboxylase gene from Kluyveromyces marxianus. König S.. 20: 373­378..J... Murakami Y. König S. FEMS Microbiol. (1997) Pyruvate decarboxylase. Van Dijken J.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction Buchner E. H.T. Hohmann.xs4all.K. In: Moo­Young. and Subden R.W. Holzer. Eur. H. 277­288.htm 12/14 . de Jong­Gubbels P.­D. Genet. J. Gen. Philippsen P. PhD. Hübner. Pronk J. (1996) 1996: A vintage year for yeast and Yeast.M. Biochim.C. Lett. Biophys. Biochim. (1978) The mechanism of substrate activation of pyruvate decarboxylase: a first approach. Schellenberger R. K. 30. (1966) The Crabtree­effect: A regulatory system in yeast. a weakly expressed pyruvate decarboxylase gene from yeast. F. Genet. D. J. Turkenkopf I. Feldmann H. Biol..J.L.. Schnackerz. Hohmann. C.. and Cederberg. Hohmann S.. Heijnen J. Fuhrmann F. Ges. Iyer V. Hrsg. Antonie van Leeuwenhoek 67: 261­279. Biophys. P. Z.M. Regulation of carbohydrate metabolism by enzyme competition. 23:536­545. Gen Microbiol.  Custers M. Louis EJ. H. Delft University of Technology. 44:149­156. Delft. Käppeli O.H. Genet. (1995) Physiological and technological aspects of large­scale heterologous­protein production with yeast's. Mol. (ed). Rouwenhorst R... is activated when fused spontaneously under the control of the PDC1 promotor. (1991a) PDC6. 314:101­103.. Van Dijken J. and Chiger M. 241: 657­666. 563­7 Gounaris A. Delft. Jacobson M. M. Goffeau A..J. Davis RW. 329. Phys. Schellenberger R. Chem.. 24: 274­277. Protein dissociation into subunits under conditions in which TDP is released.L.Y. Curr.T. ( 1998 ) Overproduction of acetyl­coenzyme A synthetase isoenzymes in respiring Saccharomyces cerevisiae cells does not reduce acetate production after exposure to glucose excess. and Eveleigh. and Bernofski.P. Acta 1385: 201­219.A. Micr. Brown P. Buckwald S.M. G. H (1961).. (1998) Thiamin metabolism and thiamin diphosphate­dependent enzymes in the yeast Saccharomyces cerevisiae: genetic regulation.; Springer­verlag. 117­124.. Hensing M. Chen S. Pronk J. and Gancedo J.  de Deken R.. Holloway P.E. (1990) Autoregulation may control the expression of yeast pyruvate decarboxylase structural genes PDC1 and PDC5. Goffeau A.G..H. S. DeRisi. Biochem. and Meacock. 165:15­29. (1971) Pyruvate decarboxylase. Oxford: 429­461 Crabtree. Delft University of Technology. Spencer D.. Oliver SG (1996) Life with 6000 genes.. Zimmermann en K. J. (1929) Observation on the carbohydrate metabolism of tumors. I. J. Acta. Entian.. Yeast 12:1603­1606. Young A. FEBS Lett. Thesis. (1994) A new look at carbohydrate metabolism in yeast. J. S.

 Seeboth P. R.H. Dominguez C.. and Azzi A..P. Acta 1085. S.. E. Wohlfarth T. Bäumlein H.. H. cerevisiae growing on sugars. 299­325. Yeast 12. Nucl Acid Res 14:8963­8977. J.. Properties..T. FEBS Lett. (1911) Uber zuckerfreie Hefegarungen. Kaliterna J.A. Jordan F. Steensma H. Neuberg C. Environ. Biochem.. Kuo.. and Karzag L.. and Van Dijken J. Yeast 11: 317­325. 119. 573­579.. 237: 373­382. J. 28:183­209. Critical Reviews in Biotechnology.M. J. (1998) manuscript in preparation.E. Kellermann E. 261.M. Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. New York. Properties and some kinetic and regulatory properties.xs4all. John Wiley and Sons Inc.(1986) Resolutions of brewers' yeast decarboxylase into two isoenzymes.J.. Osseweijer P. Luttik M. (1991) Isolation and characterization of carnitine acetyl transferase from Saccharomyces cerevisiae. Fiedler U. Naleçz.home. and Van Dijken J. Zeeman A.1998 Mücke U. App.. (1986) Regulation of carbon metabolism in Saccharomyces cerevisiae and related yeast's. (1979) Energetic irrelevanceof aerobiosis for S. McCartney R. Cell. Sanderson S. Pronk J.. (1994). Petrik M... C. Yeast 2:221­228. Biochim.. Microbial Physiol.. Sandor A. Gen. and Sonnleitner.. 36:6819­6826.A. Hollenberg. Wenzel T.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction James.. Pronk J. On the origin of mitochondria: a reexamination of the molecular structure and kinetic properties of pyruvate dehydrogenase complex from brewer's yeast.. (1996). 1.J. Neuberg. (1919). 129: 43­49. Pronk J.A. Kispal G. Koch. Purification and functional characterization of the pyruvate (monocarboxylate) carrier from baker's yeast mitochondria (Saccharomyces cerevisiae). (1981) Pyruvate dehydrogenase complex from baker's yeast. Lagunas R. editors (1998) Yeast as a cell factory..G. A. Postma E.H. Luttik et al.. http://marcelf. Biochem.I.. Moll.G. K.. O. IV. Microbiol..M.G.. Scheffers W. M.P.T.. Acta 1079. Verduyn C. 139­146. van Dijken J.G.P. Naleçz. (1995) Transient responses of Candida utilis to oxygen limitation: Regulation of the Kluyver effect for maltose. Biochem.Y. 36 68­81. Lindsay J. 217­222. Alkonyi I. Adv.. (1992) 'Synchrotron radiation solution X­ray scattering study of the pH dependence of the quaternary structure of yeast pyruvate decarboxylase" Biochemistry 31:8726­8731. D. Svergun D. C. (1997) Refolding and reconstitution studies on the transacetylase­ protein X (E2/X) subcomplex of the mammalian pyruvate dehydrogenase complex: Evidence for specific binding of the dihydrogenase component to sites on reassembled E2.Y. (1991).Biol. Dikdan G.T.J.Y. 55: 468­477. and Reinfurth.J. (1983) An expanded concept for the glucose effect in the yeast Saccharomyces uvarum: Involvement of short­ and long­term regulation. 601­610.. 3316­3319. B.. Kresze G. M. Biochem.. 4. Frontali Van Dijken J. (1996) Pyruvate decarboxylase from Pisum sativum. van Dijken J... Kresze. Klaassen C..B.. Keha E. Pirt. J. 92.A. J Bacteriol 152:19­25  Lagunas.. R. Eur. Pronk J. M.P. Weusthuis R. (1975) Principles of microbe and cell cultivation. Steensma H.G. Bianchi... G.. EC Framework IV symposium abstract book.M.B. Kuyper M. nucleotide and amino acid sequences. Microbiol. Busturia A.. König S.T. König S. Scheffers W. (1986) Misconceptions about the energy metabolism of Saccharomyces cerevisiae.P. Ronft. Käppeli. 1607­1633. H. Chem. Eur. R. Z.A. 140. Cook. 27. Käppeli O.P. Biophys. and Ronft.J. Natürliche und erzwungene Glycerinbildung bei der alkoholischen Gärung Biochem. Lagunas.. Fiechter A. Microbiol. 234­266. Rücknagel K. Biochem. Biochem. Castrillo J.. Carboxylase.htm 13/14 . Energetic aspects of glucose metabolism in a pyruvate­dehydrogenase­negative mutant of Saccharomyces cerevisiae. 373:111­114. Van Dijken J.. (1986) Analysis of the primary structure and promotor function of a pyruvate structure and promotor function of a pyruvate decarboxylase gene (PDC1) from Saccharomyces cerevisiae. Saez MJ (1982) Mechanisms of appearance of the Pasteur effect in Saccharomyces cerevisiae: inactivation of sugar transport systems. 87­95..C.. (1989) Enzymatic analysis of the Crabtree effect in glucose­limited chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. Cseko J. 145:289­292. Lindsay J.P. Hübner G.. ein neues Enzym der Hefe.P. (1986) Regulation of sugar metabolism in Saccharomyces­type yeast: experimental and conceptual considerations. FEBS Lett.. (1982). West S.J.. Schellenberger A. Käppeli O. Biophys. (1995) The pyruvate dehydrogenase complex of Saccharomyces cerevisiae is regulated by phosphorylation. Zeitschr. Steensma H.

 Leiden University. Romanos M. Nature 210:533­553.F. Two­fermenter system.. 32:199­224. (1994) Disaccharide fermentation by yeast's.H.Gen. F. FEMS microb Lett 117:207­210.D. Delft. (1987) Pyruvate Dehydrogenase. Sims A. (1966) Stimulation of fermentation in yeast's by acetoin and oxygen. Biophys. (1998) Yeast physiology and biotechnology. (1994) A pyruvate decarboxylase gene from Aspergillus parasiticus. Microbiol.A. (1986) Redox balances in the metabolism of sugars by yeast's. Reed L.Fiechter A. Van Dijken J. The Enzymes 18:77­95.P. 31:579­586. Van Urk. Walker.. Green J. (1989) Identification. (1986) Phosphorylation­dephosphorylation of the pyruvate dehydrogenase complex.B.J. (1989) Localisation and kinetics of pyruvate metabolising enzymes in Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 and Candida utilis CBS 621.. (1989) A deletion of the PDC1 gene for pyruvate decarboxylase of yeast causes a different phenotype than previously isolated point mutations. Scheffers W.P.. Clare J. 106:277­288. Scheffers W. (1992) Foreign gene expression in yeast: a review. Van Dijken J. cellobiose and D­ galactose by certain anaerobically fermenting yeast's (Kluyver effect).A. Sanchis V. Wright A.P...Y. Lett.. Wenzel T. 240:45­48. Käppeli O.. AVI publishing company. (1994) Function and regulation of the pyruvate dehydrogenase complex from the yeast Saccharomyces cerevisiae. 77: 295­298. USA:593­633. Genet. Breedveld G. Seeboth P. Ciriacy. Bacteriol 172: 678­685. 15(3):171­175   http://marcelf. Rev. J. Yeast 8: 423­488.. Reed. 126. FEBS Lett.. (1984) Continuous measurement of ethanol production by aerobic yeast suspensions with an enzyme electrode.A. (1990) Pdc10 Mutants of Saccharomyces cerevisiae give evidence for an additional structural PDC gene: cloning of PDC5.. (1986) PhD Thesis. Curr Genet 15: 75­81. Acta 992:78­86.P. Scorer C.. Gen. PhD thesis Delft University of Technology. van Kleeff B.M. a gene homologous to PDC1. Van Dijken J. Biochim.. R.. Technische Hochschule. van Dijken J. Darmstadt.A. Genet. Gozalbo D. (1983).. J.A. Hartley B. and Barnett J. Uhlinger.. Mak P. T. Hollenberg C. . 19:181­185.. (1978) The requirement of oxygen for the utilization of maltose. J. Weatport. (1974) Multienzyme complexes.K.  Reed. The role of limited respiration in the incomplete oxidation of glucose by Saccharomyces cerevisiae. Scheffers W. FEMS Microbiol.A. 7. (1984) Inhibition of fermentation and growth in batch culures of the yeast Brettanomyces intermedius upon a shift from aerobic to anaerobic conditions (Custers effect). Schaaff I..J. and Yeaman S. 653­661. Zomerdijk TPL. Sweere A. PhD thesis. M. and Zimmerman.S. Watson A.J..home. and Barnett J.P.J. Archer D.J. Biotechnol. Microbiol. Schmitt H. Curr.J. 192:247­252. and Scheffers W. (1983) The synthesis of pyruvate decarboxylase is regulated by large variations in the messenger RNA level. Hohmann S. Delft.F. Verduyn... Microbiol.R. Res..J. John Wiley & Sons Chichester.P.16/12/2015 PhD Thesis MTF General Introduction Reed L.. M.. Acc.. PhD thesis.P.A. Schipper D. (1991) Levels of activity of enzymes involved in anaerobic utilization of sugars by six yeast species: observations towards understanding the Kluyver effect. (1982) Genetic analysis of the pyruvate decarboxylase reaction in yeast glycolysis. (1989) Transient responses of yeast's to glucose excess. Seehaus.J.. Kossen N.A. G. Roberts I.. Delft University of Technology.A.A. (ed.A. Mol. 40­46. Sims A. L. Chem. Rieger M. FEMS Microbiol. C. In: Reed G. Jeenes D.htm 14/14 . Bohnsack K. Vinas I.J. cloning and characterisation of a new gene required for full pyruvate decarboxylase activity in Saccharomyces cerevisiae.xs4all... Germany..P.A.. D.. (1982) Production of bakers' yeast.  Scheffers W.A.. Wijsman M.P.J.A. Biotechnol. Janse L. H. G.) Industrial Microbiology.G.K. Zimmerman F. Van Urk H.W. Appl. J. Weusthuis. Antonie van Leeuwenhoek 50:183­192. Schmitt H.B. (1988a) Experimental simulation of oxygen profiles and their influence on bakers' yeast production: II.. Luyben K. Png H­L. Yang C. Bacteriol 151: 1146­1152.D.R. Gen.C.