You are on page 1of 105

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.

COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ẠO

TP

.Q
U

NGUYỄN THỊ QUẾ MAI

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

G

Đ

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
H

Ư

N

ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN
TR

ẦN

TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

BỘ Y TẾ

H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

.Q
U

Y

N

H

NGUYỄN THỊ QUẾ MAI

ẠO

TP

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG
G

Đ

ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN
H

Ư

N

TRONG CHẾ PHẨM CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO

00

B

TR

ẦN

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
10

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

HÀ NỘI 2015

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

CHUYÊN NGÀNH KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT
MÃ SỐ: 60720410

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

LỜI CẢM ƠN

ỊN

Đ

PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã trực tiếp hướng dẫn, động viên và

H

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô giáo


N

H

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

H

Tôi xin cảm ơn ban lãnh đạo viện thực phẩm chức năng và các đồng

TỈ
N

nghiệp phòng hóa lý trung tâm kiểm nghiệm viện thực phẩm chức năng đã tạo

Ơ

N

mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm thực nghiệm

N

H

tại cơ sở.

.Q
U

Y

Tôi xin chân thành cảm ơn ban giám hiệu, phòng đào tạo sau đại học,

TP

các thầy cô đã tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình học tập tại trường và thực

ẠO

hiện luận văn này.

G

Đ

Cuối cùng tôi gửi lời thân thương nhất đến gia đình, bạn bè, tập thể lớp

Ư

N

CH18 đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn

TR

ẦN

H

thành luận văn.

Học viên

Nguyễn Thị Quế Mai

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

2015

Hà Nội, ngày 28 tháng 8 năm

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

MỤC LỤC

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

ỊN
Đ
H

N

TỈ
N

H

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………...
Chương 1. TỔNG QUAN…………………………………………..
1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo……………………………...
1.1.1. Đặc điểm của đông trùng hạ thảo……………………………
1.1.2. Phân loại đông trùng hạ thảo………………………………...
1.1.3. Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo………………
1.1.4. Tác dụng của đông trùng hạ thảo…………………………….
1.1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo…………………..
1.2. Tổng quan về adenosin,
cordycepin……………………………
1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học…………………
1.2.2. Dược động học cordycepin và adenosin…………………….
1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosin…………………………
1.3. Phương pháp xác định cordycepin và adenosin……………….
1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng………………………………
1.3.2. Phương pháp đo màu………………………………………..
1.3.3. Phương pháp điện di mao quản……………………………..
1.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR…………...
1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng…………………………………….
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao……………………….
1.4.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng……………………………
1.4.2. Một số thông số đặc trưng…………………………………...
1.4.3. Ứng dụng…………………………………………………….
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….
2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………….
2.2. Hóa chất, dung môi…………………………………………….
2.3. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu……………………………….
2.4. Phương pháp nghiên cứu………………………………………
2.4.1. Nghiên cứu các cách chiết adenosin và cordycepin trong
mẫu
2.4.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp……………………
2.4.3. Đánh giá phương pháp phân tích……………………………
2.4.4. Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo……

H

Trang

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

1
3
3
3
3
4
5
7
7

7
9
10
11
11
12
13
13
13
16
16
18
19
20
20
21
21
22
21
23
24
26

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

ỊN
Đ

H

26
27
27
27
27
28
30
31
33
33
35
35
37
38
39
39
40
41
41
41
42
47
48
51
53
54
54
56
58
64

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H

2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu…………………………………..
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………….
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký…………………………
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn…………………………………...
3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện……………………..
3.1.3. Khảo sát lựa chọn pha động…………………………………
3.1.4. Khảo sát thể tích tiêm mẫu………………………………….
3.1.5. Khảo sát nhiệt độ cột………………………………………..
3.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu…………………….
3.2.1. Khảo sát dung môi chiết...…………………………………..
3.2.2. Khảo sát số lần chiết……..………………………………….
3.2.3. Khảo sát phương pháp chiết…………………………………
3.2.4. Khảo sát nhiệt độ chiết………………………………………
3.2.5. Khảo sát thời gian chiết……………………………………..
3.3. Quy trình phân tích……………………………………………
3.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử…………………
3.3.2. Điều kiện sắc ký……………………………………………..
3.3.3. Đánh giá kết quả……………………………………………..
3.4. Đánh giá phương pháp…………………………………………
3.4.1. Độ thích hợp của hệ thống…………………………………..
3.4.2. Độ đặc hiệu…………………………………………………..
3.4.3. Xây dựng đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính….......
3.4.4. Khảo sát độ chính xác………………………………………..
3.4.5. Khảo sát độ đúng…………………………………………….
3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)…..
3.5. Áp dụng phương pháp phân tích trên một số TPCN chứa
ĐTHT
3.5.1. Định tính……………………………………………………..
3.5.2. Định lượng…………………………………………………...
Chương 4. BÀN LUẬN…………………………………………….
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………...
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

H

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


N

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

Hiệp hội các nhà Hóa
phân tích
Điện di mao quản
Dung dịch

H

CE
DD
DMSO
ĐTHT
EtOH
HL
HPLC

Tiếng Việt

ỊN

Tiếng Anh hoặc tên khoa học
Acetonitril
Association of Official
Analytical Chemists
Capillary electrophoresis

H

Từ viết tắt
ACN
AOAC

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Đ

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM


N

Dimethyl sulfoxide

Đông trùng hạ thảo

H

Ethanol

ẠO

Ư

N

G

Đ

Relative standard deviation
Standard deviation

ẦN

H

Thin layer chromatography

TỈ
N

N

Ơ

H
N

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

Ultraviolet
Visible

Khối phổ
Dãy diod quang
Phần triệu
Hệ số tương quan
Độ lệch chuẩn tương đối
Độ lệch chuẩn
Trung bình
Thực phẩm chức năng
Sắc ký lớp mỏng
Tài liệu tham khảo
Tử ngoại
Khả kiến

Y

TP

MeOH
MS
PDA
ppm
r
RSD
SD
TB
TPCN
TLC
TLTK
UV
VIS

.Q
U

High Performance Liquid
Chromatography
Methanol
Mass spectrometry
Photo diode array
Parts per million

Hàm lượng
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

DANH MỤC CÁC BẢNG

9

Bảng 1.2. Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin

13

Đ
H


N

Bảng 2.3. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng rắn…………………………………

ỊN

Bảng 1.1. Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8]…………………

TỈ
N

H

Bảng 2.4. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng………………………………..

N

Bảng 2.5. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm……..

H

Ơ

Bảng 3.6. Khảo sát thành phần pha động…………………………………...

Y

N

Bảng 3.7. Khảo sát chương trình gradient nồng độ…………………………

20
20
21
28
29
35

Bảng 3.9. Kết quả độ thích hợp của hệ thống ……………………………...

42

.Q
U

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát số lần chiết (n = 3)……………………………..

TP

H

Trang

Đ

ẠO

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ adenosin,

G

cordycepin và diện tích pic………………………………………………….

47
49

Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu L1……..

49

Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác trung gian ……...………………………..

50

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu R1……………………………...

52

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu R1…………...

52

Bảng 3.16. Kết quả S/N của các mẫu thêm chuẩn………………………….

53

Ó
A

10

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu thử L1………………………….

-L
Í-

H

Bảng 3.17. Kết quả thời gian lưu pic adenosin và cordycepin các mẫu thử
55

Bảng 3.18. Kết quả định lượng các mẫu thử………………………………..

57

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

và chuẩn hỗn hợp……………………………………………………………

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

5

Hình 1.2. Công thức cấu tạo cordycepin [14]…………………………..

8

Hình 1.3. Công thức cấu tạo adenosin [8]……………………………....
Hình 1.4. Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28]...

10

Đ

ỊN

H

Hình 1.1. Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28]……..

H

Trang

TỈ
N

H


N

8

N

Hình 1.5. Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron

H

Ơ

của cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15]……..............

Y

N

Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao…………...

.Q
U

Hình 3.7. Phổ hấp thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b)………

12
18
28

TP

Hình 3.8. Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm 5 µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40

ẠO

µl (d)…………………………………………………………………….

31

G

Đ

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) và mẫu thử (c) ở điều kiện

Ư

N

nhiệt độ cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) và mẫu thử (d) ở điều kiện
32

Hình 3.10. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu R1 (n = 3)…..

34

Hình 3.11. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu L1 (n = 3)…..

34

00

B

TR

ẦN

H

nhiệt độ cột 25oC………………………………………………………...

36

Hình 3.13. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu L1 (n = 3)

36

Hình 3.14. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu R1 (n = 3)……

37

-L
Í-

H

Ó
A

10

Hình 3.12. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu R1 (n = 3)

37

Hình 3.16. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu R1 (n = 3)…..

38

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Hình 3.15. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu L1 (n = 3)……
Hình 3.17. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu L1 (n = 3)…....

39

Hình 3.18. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp……………….

44

Hình 3.19. So phổ adenosin của mẫu R1 (A) và mẫu L1 (C), so phổ
cordycepin của mẫu R1 (B) và mẫu L1 (D)…………………………….

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

46

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Hình 3.20. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng mỗi chất từ
1- 40 µg/ml (pic adenosine tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2

H

47

ỊN

phút)…………..........................................................................................
tích pic (mAU.s) của adenosin (a) và cordycepin b)……………………....

H

Đ

Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu placebo 1 thêm chuẩn (0,25 µg/ml mỗi chất)

54

Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b)……………………………….

55

TỈ
N

H


N

48

Ơ

N

Hình 3.24: So phổ adenosin (a) và cordycepin (b) của mẫu thử R2 và
56

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

mẫu chuẩn tương ứng…………………………………………………..

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

ĐẶT VẤN ĐỀ
Đông trùng hạ thảo là tên gọi một dạng cộng sinh giữa loài nấm có tên

ỊN

H

khoa học là Cordyceps sinensis với ấu trùng của một loại côn trùng thuộc chi

Đ

Hepialus, thường gặp nhất là sâu non của loài Hepialus armoricanus.


N

H

Là một loại nấm dược liệu quý hiếm từ lâu đã được cả thế giới biết đến,

H

đông trùng hạ thảo cùng tam thất, linh chi, nhân sâm tạo thành bộ tứ thần dược.

TỈ
N

Sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xưa đã coi đông trùng hạ thảo là vị

Ơ

N

thuốc dùng để bồi bổ sức khỏe cho người và hỗ trợ điều trị hàng loạt bệnh như

N

H

bệnh tim, thận, huyết áp, tiểu đường, nhiễm khuẩn, nhiễm virus, ung thư. Mặt

.Q
U

Y

khác các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định đông trùng hạ thảo

TP

hầu như không có tác dụng phụ đối với cơ thể người. Các nghiên cứu Tây y

ẠO

trên thế giới đều khẳng định đông trùng hạ thảo không chỉ nâng cao hiệu quả

G

Đ

hệ miễn dịch còn giải độc thận, tăng cường chức năng gan, khả năng tình dục

Ư

N

[2]. Đông trùng hạ thảo có hơn 350 loài khác nhau tuy nhiên hai loài chính

TR

Cordyceps militaris [2].

ẦN

H

người ta đi sâu nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis và

00

B

Việc sử dụng ngày càng nhiều chế phẩm chứa thành phần đông trùng hạ

10

thảo đòi hỏi cần có các phương pháp đánh giá chất lượng chúng. Dược điển

Ó
A

Trung Quốc 2010 mới chỉ đưa ra chuyên luận đánh giá dược liệu đông trùng hạ

-L
Í-

H

thảo Cordyceps và viên Bailing capsule với thành phần đánh giá định lượng là
adenosin [30]. Tuy nhiên loài Cordyceps militaris lại có thành phần cordycepin

ÁN

khá cao chưa được đánh giá. Hiện nay tại Việt Nam chưa có phương pháp chuẩn

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

hóa để đánh giá chất lượng dược liệu đông trùng hạ thảo cũng như chế phẩm
chứa thành phần đông trùng hạ thảo, việc xây dựng phương pháp đánh giá hai
thành phần này trong dược liệu và chế phẩm là vô cùng cần thiết.
Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng
phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

phẩm chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”
với các mục tiêu sau:

ỊN

Đ

trong chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo (dạng lỏng, dạng rắn) bằng phương

H

- Xây dựng phương pháp định tính, định lượng adenosin và cordycepin


N

H

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

H

- Ứng dụng phương pháp để phân tích một số chế phẩm chứa đông trùng

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

hạ thảo đang lưu hành trên thị trường.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đông trùng hạ thảo:

H

Đ

Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) là một loại đông dược quý có bản chất là

ỊN

H

1.1.1. Đặc điểm của đông trùng hạ thảo


N

dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensis thuộc nhóm nấm

H

Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bướm trong chi Thitarodes

TỈ
N

trước đây phân loại trong chi Hepialus.

H

Ơ

N

Tên gọi “đông trùng hạ thảo” (tiếng Trung dongchungxiacao) xuất phát từ

N

quan sát thực tế khi thấy vào mùa hè nấm Ophiocordyceps sinensis mọc chồi

.Q
U

Y

từ đầu con sâu nhô lên khỏi mặt đất. Vào mùa đông thì nhìn cặp cá thể này

TP

giống con sâu (côn trùng), đến mùa hè thì chúng giống như một loài thực vật.

ẠO

Dược liệu đông trùng hạ thảo thu hái gồm phần sâu non dài 2,5 – 3 cm, đường

G

Đ

kính 3 – 5 mm màu vàng nâu hay xám nâu. Sâu có 8 đôi chân, 4 đôi chân ở

Ư

N

giữa thân sâu là trông rõ nhất. Thân nấm hình trụ mọc ra từ đầu con sâu, thân

ẦN

H

nấm thường dài 3 – 6 cm. Khi nấm đạt đến độ trưởng thành nhất, nó tiêu thụ

TR

đến 99% chất dinh dưỡng từ thân sâu biến sâu thành xác khô. Nấm quả thể

00

B

thành thục sẽ phát tán các bào tử ra xung quanh. Cơ chế nhiễm nấm C. sinensis

10

vào sâu hiện nay chưa biết rõ. Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm do ăn

Ó
A

phải bào tử nấm hoặc qua hơi thở của sâu. Nấm phát triển bằng chất dinh dưỡng

-L
Í-

H

của sâu, khi sử dụng hết chất dinh dưỡng của sâu làm sâu chết khô. Đến mùa
hè nấm phát triển thành cây mọc ra từ đầu sâu vươn ra khỏi mặt đất. Thời gian

ÁN

để nấm phát triển thành dạng quả thể trong cơ thể sâu kéo dài từ các tháng mùa

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

đông đến cuối xuân đầu hè. Tại Trung Quốc, đông trùng hạ thảo thường gặp ở
vùng rừng ẩm ướt thuộc các tỉnh Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Khang, Tây Tạng
và nhiều nhất ở Tứ Xuyên và Tây Khang [2], [4].

1.1.2. Phân loại đông trùng hạ thảo
Chi nấm Cordyceps có hơn 350 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã
tìm thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài được nghiên cứu nhiều nhất và

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

đưa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và Cordyceps militaris
(L. ex Fr) Link [2], [29], [30].

Đ

Đông trùng hạ thảo chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học như: các

ỊN

H

1.1.3. Thành phần hóa học trong đông trùng hạ thảo


N

H

ribonucleotid, mannitol, sterol, các acid hữu cơ, các loại đường mono- , di-,

H

oligosaccharid và polysaccharid, các protein, polyamin, vitamin (E, K, B1, B2,

TỈ
N

B12…) và rất nhiều khoáng chất (K, Na, Ca, Mg, Cu, Mn, Zn, Se, Si…) trong

H

Ơ

N

đó nhóm hoạt chất có tác dụng quan trọng là HEAA (hydroxyl ethyl adenosin

Y

Các nucleotid:

.Q
U

a.

N

analogs).

TP

Các nucleotid là một trong những thành phần có hoạt tính trong đông trùng

ẠO

hạ thảo, trong đó adenosin, cordycepin được sử dụng là hoạt chất để đánh giá

G

Đ

chất lượng của đông trùng hạ thảo. Ngoài ra trong đông trùng hạ thảo còn nhiều

Ư

N

loại nucleotid khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosin (cấu trúc này được đưa

ẦN

H

vào các hợp chất có hoạt tính antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV

TR

như didanosin, hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt

Các polysaccharid

10

b.

00

B

chất này không thể tìm thấy ở trong các dược liệu khác trong tự nhiên.

Ó
A

Đây cũng là thành phần chính góp phần vào các tác dụng sinh học của

-L
Í-

H

đông trùng hạ thảo. Bản đồ saccharid của dược liệu này có vai trò trong đánh
giá chất lượng. Một số monosaccharid có trong đông trùng hạ thảo như

TO

ÁN

rhamnose, ribose, arabinose, glucose, mannitol, fructose…
c.

Các phytosterol trong đông trùng hạ thảo (cholesterol, campesterol, β

ÀN
Đ
N
IỄ
D

Các sterol

sitosterol) đóng vai trò quan trọng trong điều trị ung thư vú, tuyến tiền liệt và
ung thư trực tràng.
d.

Các nhóm hoạt chất khác

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Đông trùng hạ thảo có chứa các acid amin thiết yếu như acid glutamic,
acid aspartic, arginin… và các hợp chất kiểu polyamin như cadaverin,

ỊN
Đ

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

này có hoạt tính chống viêm, chống nhiễm khuẩn, kháng virus [25], [37].

H

spermidin, spermin…, các cyclodipeptid như cordycedipeptid A. Các hợp chất

Adenosin

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

Cordycepin

Cytidin

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

Guanosin

Uridin

Thymidin

Hình 1.1. Cấu tạo một số nucleotid trong đông trùng hạ thảo [28].
1.1.4. Tác dụng của đông trùng hạ thảo
Đông trùng hạ thảo là một vị thuốc được ghi vào tài liệu thuốc đông y từ
giữa thế kỷ 18 trong bộ “bản thảo cương mục thập di” (1765). Theo tài liệu cổ,
đông trùng hạ thảo có vị ngọt, tính ôn, quy vào 2 kinh phế và thận, tác dụng ích

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, dùng chữa hư lao sinh ho, ho ra máu,
liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh.

Đ

Các nghiên cứu cho thấy dịch chiết cao đông trùng hạ thảo có tác dụng tăng

ỊN

H

a. Tác dụng tăng cường sức khỏe


N

H

cường hoạt động các enzym superoxid dismutase, glutathion peroxidase và

H

catalase (các enzym tham gia loại bỏ gốc tự do trong cơ thể), giảm quá trình

TỈ
N

peroxide lipid do đó có tác dụng chống lại các nhân tố có hại như căng thẳng,

Ơ

N

tuổi tác.

N

H

b. Tác dụng miễn dịch

.Q
U

Y

Các nghiên cứu thực nghiệm đã chứng minh đông trùng hạ thảo có khả năng

TP

tăng cường hoạt động miễn dịch tế bào cũng như miễn dịch dịch thể. Cụ thể là

ẠO

tác dụng nâng cao hoạt tính của đại thực bào và tế bào miễn dịch tự nhiên

G

Đ

(natural killer cell), điều tiết phản ứng của tế bào lympho B, tăng cường một

H

ẦN

IgG, IgM trong huyết thanh.

Ư

N

cách có chọn lọc hoạt tính của tế bào T ức chế, làm tăng nồng độ các kháng thể

TR

c. Tác dụng chống oxy hóa

00

B

Dịch chiết cao đông trùng hạ thảo cho tác dụng chống oxy hóa tương tự như

10

quá trình peroxide chất béo, men xanthin oxidase.

Ó
A

d. Tác dụng chống ung thư

-L
Í-

H

Thành phần polysaccharides trong nấm đông trùng hạ thảo (cordyglucan (1 3)β – glucan) cũng như vài loài nấm khác được cho là có tác dụng ức chế khối u

ÁN

do hai cơ chế: (1) trực tiếp gây độc cho tế bào ung thư; (2) gián tiếp ức chế

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

thông qua hệ miễn dịch tự miễn của cơ thể [9].
e. Tác dụng chống viêm
Đông trùng hạ thảo tác dụng ức chế việc sản sinh các tác nhân gây viêm như
gốc tự do NO, các cytokine TNF α và IL 12, ức chế sự mất hạt nhỏ và phát triển
của bạch cầu.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

f. Tác dụng bảo vệ thận, phổi, gan
Đông trùng hạ thảo có công dụng nhanh trong việc phục hồi và làm giảm các

ỊN

Đ

các vấn đề của đường hô hấp: ho, đờm, suyễn, viêm/ hen phế quản, lao

H

triệu chứng viêm thận mãn, suy thận, liệt dương, di tinh, mệt mỏi, đau lưng,


N

H

phổi…Tác dụng bảo vệ gan thông qua việc làm tăng hoạt tính của các men

H

AST, ALT, γ GTP, ALP, LDH [7], [23], [25], [37].

TỈ
N

1.1.5. Một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo

Ơ

N

Hiện nay không thể thống kê được có bao nhiêu chế phẩm chứa đông trùng hạ

N

H

thảo được bán trên thị trường. Đông trùng hạ thảo được đưa vào trong chế phẩm

.Q
U

Y

một thành phần hoặc kết hợp với một số dược liệu bổ, quý hiếm khác như nhân

TP

sâm, tam thất, tổ yến. Các dạng bào chế thường gặp là dạng rắn (viên nang,

ẠO

viên hoàn, gói bột) và dạng lỏng (nước uống, cao lỏng). Có thể kể tên một vài

G

Đ

chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo như sau:

Ư

N

- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken,

ẦN

H

bột Cordyceps extract…

TR

- Dạng lỏng: cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ

00

B

thảo, nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps, nước

10

cốt gà Đông trùng hạ thảo…

Ó
A

1.2. Tổng quan về adenosin, cordycepin

-L
Í-

H

1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học
Cordycepin và adenosin đều được cấu tạo bởi nhân purin liên kết với đường

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

ribose (ribofuranose) bằng liên kết β –N9 – glucosid [14], [33].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Ơ

N

Hình 1.2. Công thức cấu tạo cordycepin [14].

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

1.2.1.1. Cordycepin

N

H

Tên khoa học: 9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin

.Q
U

Y

Công thức phân tử: C10H13N5O3

TP

Trọng lượng phân tử: 251,24

ẠO

Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết.

Đ

Điểm chảy: 228 – 231oC

Ư

N

G

Độ tan: tan trong DMSO, methanol, ethanol

ẦN

H

Bước sóng hấp thụ cực đại 259,0 nm [14].

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

1.2.1.2. Adenosin

Hình 1.3. Công thức cấu tạo adenosin [8].

Tên khoa học: 9 - β-D-ribofuranosyl adenin
Công thức phân tử: C10H13N5O4
Trọng lượng phân tử: 267,24
Adenosin dạng bột tinh thể màu trắng.
Nhiệt độ nóng chảy: 234 – 235oC.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Độ tan:

ỊN
Đ
H

N
H

H

Ơ

N

TỈ
N

Độ tan (mg/ml)
5
6
13
20
13
9
8

Dung môi
Nước
Methanol
Ethanol
1 – propanol
2 – propanol
1- butanol
Ethylen glycol
Phổ hấp thụ UV:

H

Bảng 1.1. Độ tan của adenosin trong một số dung môi [8].

Y

N

Trong dung dịch nước, HCl 0,1N, NaOH 0,1N adenosin có phổ hấp thụ UV

TP

1.2.2. Dược động học cordycepin và adenosin

.Q
U

tương tự nhau, bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm với ε = 15185 [8].

Đ

ẠO

Cordycepin là chất cấu tạo tương tự adenosin nên có con đường chuyển

N

G

hóa tương tự. Khi nghiên cứu dùng adenosin cho động vật có vú, ở bên ngoài

H

Ư

tế bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase

ẦN

trong huyết tương tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vào

TR

trong tế bào, adenosin được phosphoryl hóa bởi adenosin kinase tạo thành ATP.

00

B

Nếu tế bào không cần dùng adenosin, nó sẽ tiếp tục được loại nhóm amin bởi

10

adenosin deaminase trong tế bào. Dạng hypoxanthinosin không hoạt tính được

H

Ó
A

tiếp tục biến đổi tạo acid uric thải trừ qua thận. Tương tự như vậy, cordycepin

-L
Í-

cũng nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase tạo

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

hypoxanthinosin [28].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

.Q
U

Y

Hình 1.4. Con đường chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú [28].

TP

1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosin

ẠO

a. Tác dụng của cordycepin

Đ

* Ức chế sinh tổng hợp purin, ADN/ARN và tín hiệu mTOR

N

G

Khi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và

H

Ư

tri phosphate ức chế các enzyme như ribose phosphate pyrophosphokinase và

TR

ẦN

5 – phosphoribosyl – 1 – pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin.

B

Do cấu trúc gần giống adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN,

10

00

enzyme kết hợp cordycepin, gây rối loạn tổng hợp ARN. Các nghiên cứu cũng

Ó
A

chỉ ra cordycepin có thể hoạt hóa AMP activated kinase, do đó ức chế di truyền,

H

sinh trưởng phát triển tế bào [17].

ÁN

-L
Í-

* Tác dụng chống sự di căn
Sự di căn thông thường là sự tách tế bào ung thư khỏi vị trí ban đầu, xâm

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

lấn vào các khối ngoại bào khác. Cordycepin có tác dụng ức chế các enzyme
metalloproteinase (bản chất là endopeptidase phụ thuộc kẽm và calci, vai trò
chính trong phân hủy tổ chức ngoại bào) [10].
* Tác dụng chống viêm
Phản ứng viêm là phản ứng có liên quan đến quá trình ung thư. Các tế
bào ung thư sinh nhiều cytokine, chemokine và các receptor của chúng, các

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

chất này gây ra phản ứng viêm. Cordycepin được cho rằng làm giảm các tác
nhân gây viêm như NO, PGE2, TNF α và IL 1β [33].

Đ

Li Ma và cộng sự nghiên cứu tác dụng cordycepin trên chuột gây tiểu

ỊN

H

* Tác dụng giảm đường huyết:


N

H

đường bởi alloxan. Kết quả cho thấy cordycepin không làm tăng nồng độ

H

insulin trong máu nhưng làm giảm hàm lượng glucose máu thông qua tác dụng

TỈ
N

làm tăng nồng độ glycogen tại gan. Đồng thời cordycepin có tác dụng bảo vệ

Ơ

N

thận và giảm chấn thương lách do tiểu đường [22].

N

H

b. Tác dụng của adenosin

.Q
U

Y

* Tác dụng chống viêm

TP

Adenosin được chứng minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ

ẠO

thể của adenosin A2A. Nồng độ adenosin ngoại bào ở tế bào bình thường khoảng

G

Đ

300 nM. Tuy nhiên khi tế bào bị tổn thương nồng độ này nhanh chóng nâng lên

Ư

N

600 – 1200 nM.

ẦN

H

* Tác dụng trên tim

TR

Adenosin trực tiếp kiểm soát các chức năng mô tim, tác dụng giãn mạch

00

B

vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim, ức chế nút xoang và dẫn truyền

10

nút nhĩ thất. Adenosin được dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim.

Ó
A

* Tác dụng trên phổi, thần kinh trung ương

-L
Í-

H

Adenosin có khả năng điều chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến
bệnh viêm đường hô hấp như bạch cầu, tế bào lympho… Ngoài ra adenosin có

ÁN

tác dụng tốt đối với một số bệnh rối loạn thần kinh như thiếu máu cục bộ, thoái

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

hóa thần kinh…[11], [27].
1.3. Phương pháp xác định cordycepin và adenosin
1.3.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
MA King Wah và các cộng sự đã tiến hành xác định cordycepin và 7
nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient. Dịch chiết nước của 11 sản phẩm chứa đông

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

trùng hạ thảo được phân tích trên bản mỏng silicagel GF254 được xử lý bằng
hỗn hợp Na2HPO4 0,05M : carboxymethyl cellulose (4 : 1) sau đó đặt vào tủ

ỊN

Đ

ethylacetat : isopropanol : nước (8 : 2 : 6 : 0,6 theo thể tích) với 2 giọt amoniac

H

sấy 8 phút ở 60oC để hoạt hóa. Dung môi triển khai là hỗn hợp cloroform:


N

H

cho mỗi 10 ml hỗn hợp. Quãng đường triển khai dung môi 18 cm, chạy lượt hai

H

9 cm trong hỗn hợp dung môi cloroform : ethylacetat : isopropanol : nước :

TỈ
N

dimethylfomamid (10 : 2 : 8 : 0,5 : 2 theo thể tích), phát hiện chất phân tích tại

Ơ

N

bước sóng 254 nm. Phương pháp cho độ thu hồi cordycepin 98,09%, độ thu hồi

N

H

của adenosin là 97,88% [21].

.Q
U

Y

1.3.2. Phương pháp đo màu

TP

Nicholas M. Kredich và Armand J. Guarino đã nghiên cứu chỉ ra phương

ẠO

pháp đo màu định lượng cordycepin sử dụng thuốc thử anthron để tạo hợp chất

G

Đ

có màu đỏ cherry. 5,0 ml thuốc thử anthron (0,2 g anthron trong 100 ml H2SO4

Ư

N

90%) phản ứng với 1,0 ml dung dịch thử có lượng cordycepin từ 1 – 135 μg/ml,

ẦN

H

trộn đều và đặt trong nước đá. Mẫu trắng tiến hành tương tự thay 1,0 ml nước

TR

cho 1,0 ml dung dịch thử. Sau đó các ống nghiệm được đặt trên cách thủy 100 oC

00

B

trong 10 phút, làm nguội, đo màu bằng thiết bị đo màu sử dụng kính lọc số 52,

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

hỗn hợp màu tạo thành bền sau vài giờ phản ứng [15].

Hình 1.5. Phổ hấp thụ hỗn hợp màu được tạo thành với thuốc thử anthron của
cordycepin, adenosin, glucose và deoxyadenosin [15].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

1.3.3. Phương pháp điện di mao quản
Yerra Koteswara Rao và cộng sự đã định tính và định lượng cordycepin

ỊN

Đ

dung dịch đệm borat 0,02 M với 28,6% methanol, pH = 9,5, điện thế 20 kV,

H

trong Cordyceps militaris bằng phương pháp điện di mao quản với điều kiện:


N

H

nhiệt độ 25oC, bước sóng 254 nm. Đường chuẩn xây dựng từ 20 – 100 μg/ml,

H

độ thu hồi từ 82% đến 107% [24].

TỈ
N

1.3.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR

Ơ

N

Seul Gi Lee và cộng sự đã định lượng cordycepin trong Cordyceps

N

H

militaris bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, sử dụng chất chuẩn

.Q
U

Y

nội muối natri của acid 3 – (trimethylsilyl) – propionic – 2,2,3,3 – d4. Các tác

TP

giả so sánh phương pháp định lượng này với phương pháp sắc ký lỏng hiệu

ẠO

năng cao, kết quả cho thấy không có sự khác biệt kết quả định lượng cordycepin

N

Ư

1.3.5. Phương pháp sắc ký lỏng

G

Đ

giữa 2 phương pháp này [18].

ẦN

H

Bảng 1.2. Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosin, cordycepin.
Tốc độ dòng Detector TLTK
1,0 ml/phút UV 260 [31]
nm
1,0 ml/phút UV 260 [1]
nm

1,0 ml/phút

UV
nm

0,2 ml/phút

ESI-MS
[34]
+
[M + H]
tại
m/z

260 [32]

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

Cột
Pha động
C18 (250 x Đệm phosphat pH 6,5 :
4,6 mm)
methanol (17 :3)
C18 (250 x Methanol (A) và Nước (B)
4,6 mm)
0 – 2 phút: 100 – 85% B; 2
– 5 phút: 85 – 70% B; 5 –
10 phút: 70 – 55% B; 10 –
12 phút: 55 – 85% B; 12 –
15 phút: 85 – 100% B
Eclipse
A: dung dịch NaH2PO4
XDB-C18 0,02M và Na2HPO4 0,02 M
(250 x 4,6 B: methanol
mm, 5 µm) 0 – 5 phút: 0% A
5 – 15 phút: 0 – 5% A
15 – 40 phút: 5 – 40% A
40 – 50 phút: 40% A
Shimadzu
A: dung dịch amoni acetat
VP-ODS
0,04M pH 5,2
B: methanol

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

[12]


N

H

Đ

ỊN

[16]

[26]

[32]

[35]

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

150 x 2,0 0 – 6 phút: 85% A
127, 136,
mm
6 – 12 phút: 85 – 80% A
268, 252
12 – 17 phút: 80% A
và 302
17 – 20 phút: 95% A
ProtoSIL
Methanol : H2O (20 : 80)
1,0 ml/phút UV 254
250 x 4,6
nm
mm, 5 µm
Waters
Methanol : H2O (8 : 92)
1,0 ml/phút UV 254
Sheild RP
nm
18 (150 x
4,6 mm, 5
µm)
Eclipse
A: nước có 0,1% acid 0,8 ml/phút UV 260
XDB-C18 acetic
nm
(150 x 4,6 B: acetonitril có 0,1% acid
mm, 5 µm) acetic
0 – 2,5 phút: 2% B
2,5 – 12,5 phút: 2 – 12% B
2,5 – 14 phút: 12 – 96% B.
C18 (150 x Methanol : H2O (30 : 70)
0,5 ml/phút UV 260
4,6 mm, 5
nm
µm)
Zorbax
A: H2O
1,0 ml/phút UV 260
300SB–
B: Methanol
nm
C18 250 x 0 – 3 phút: 2% B
4,6 mm, 5 3 – 10 phút: 2 – 10% B
µm
10 – 22 phút: 10 – 22% B
22 – 30 phút: 22% B
30 – 40 phút: 22 - 100% B
40 – 41 phút: 100 – 2% B
41 – 50 phút: 2% B
Theo dược điển Trung Quốc 2010, dược liệu đông trùng

H

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

hạ thảo được

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

đánh giá hàm lượng adenosin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Dược liệu được chiết tách bằng đun hồi lưu 30 phút trong dung môi methanol
90%. Chuyên luận yêu cầu hàm lượng adenosin không ít hơn 0,01% đối với
dược liệu khô kiệt [31].
Jian – Ping Yuan và cộng sự đã tiến hành định lượng 7 nucleosid và 7
nucleobase trong một số loài nấm bằng phương pháp sắc ký lỏng detector PAD.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Phương pháp sử dụng pha động gradient với hai thành phần A (methanol) và B
(đệm phosphat: natri dihydro phosphat 0,02M và dinatri hydro phosphat

ỊN

Đ

định lượng của cordycepin và adenosin là 0,01 μg/ml và 0,03 μg/ml. Độ thu hồi

H

0,02M). Đường chuẩn xây dựng 5 – 300 μg/ml. Giới hạn phát hiện và giới hạn


N

H

của phương pháp đối với cordycepin là 98,3%, với adenosin là 100,6% [36].

H

Jian – Wei Xie và cộng sự đã tiến hành định lượng các nucleosid chính trong

TỈ
N

Cordyceps sinensis (thymin, adenine, adenosin, cordycepin) bằng phương pháp

Ơ

N

sắc ký lỏng khối phổ LC/ESI – MS. Phương pháp sử dụng pha động A (amoni

N

H

acetat 0,04M pH 5,2) và B (methanol). Đường chuẩn cordycepin xây dựng từ

.Q
U

Y

0,5 – 107,5 μg/ml, adenosin 0,6 – 114,0 μg/ml . Độ thu hồi của cordycepin 99,3

TP

– 104,0%, độ thu hồi adenosin 98,0 – 101,5% [34].

ẠO

Lei Huang và đồng nghiệp đã nghiên cứu, tối ưu hóa điều kiện phân tích

G

Đ

adenosin và cordycepin trong dược liệu ĐTHT loài C. sinensis và C. militaris.

Ư

N

Phương pháp cho kết quả pha động tối ưu methanol và nước tỷ lệ 92 : 8, bước

ẦN

H

sóng phát hiện 254 nm. Đường chuẩn của cordycepin được xây dựng từ 2,85

TR

đến 130 μg/ml, của adenosin từ 2,50 – 120 μg/ml, giới hạn phát hiện cordycepin

00

B

là 0,25 μg/ml, của adenosin là 0,30 μg/ml [12].

10

Jiang – Feng Song cùng đồng nghiệp đã nghiên cứu tối ưu cách chiết xuất

Ó
A

cordycepin từ loài Cordyceps militaris bằng phần mềm tối ưu hóa, phân tích

-L
Í-

H

bằng phương pháp sắc ký lỏng. Pha động sử dụng A (nước có 0,1% acid acetic)
và B (acetonitril có 0,1% acid acetic) theo tỷ lệ gradient. Kết quả tối ưu hóa

ÁN

chiết xuất cho điều kiện chiết: dung môi chiết ethanol 20,21%, thời gian chiết

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

101,88 phút, tỷ lệ dung môi chiết/dược liệu: 33,13 ml/g [26].
Li Yu và đồng nghiệp đã nghiên cứu định lượng đồng thời 11 nucleosid
trong dược liệu ĐTHT được thu hái tại Trung Quốc. Pha động sử dụng dung
môi methanol và nước theo chương trình gradient. Mẫu dược liệu được chiết
tách bằng dung môi methanol 70% theo phương pháp siêu âm 15 phút ở nhiệt

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

độ phòng. Giới hạn phát hiện của phương pháp đối với adenosin và cordycepin
là 0,057 và 0,099 µg/ml [35].

ỊN

H

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đ

1.4.1. Nguyên lý chung của sắc ký lỏng


N

H

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn

H

và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn). Mẫu phân tích được chuyển lên

TỈ
N

cột tách dưới dạng dung dịch. Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ, phân

Ơ

N

bố, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ.

N

H

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích được tiêm qua buồng

.Q
U

Y

tiêm và được đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích

TP

được tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho

ẠO

các tín hiệu được ghi trên sắc đồ.

G

Đ

a. Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Ư

N

Pha tĩnh hay dùng nhất trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh mà

ẦN

H

trong đó các nhóm silanol trên bề mặt hạt silicagel (chất mang) đã được liên

TR

kết với các nhóm hóa học khác nhau tạo nên các hợp chất siloxan có độ phân

Ó
A

10

00

B

cực khác nhau tùy theo nhóm liên kết:

- Si-O-Si -R

-L
Í-

H

Khi R là các nhóm ít phân cực như octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl
Khi R là nhóm khá phân cực như alkylamin hay alkylnitril, pha động là

TO

ÁN

và pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC).

D

IỄ

N

Đ

ÀN

dung môi ít phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC). Hiện nay, kỹ thuật
RP-HPLC được sử dụng rộng rãi vì tách tốt được nhiều hợp chất khác nhau,
thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh tế. Cột thông dụng là cột
ODS (RP18), C8 với cỡ hạt 5 hay 10m. Để cải thiện khả năng tách, tiết kiệm
dung môi và thời gian, gần đây người ta đã đưa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

ứng dụng rộng rãi. Trong UPLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7
– 2,2 m) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5-10cm).

H

Đ

Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân

ỊN

H

b. Pha động trong sắc ký lỏng


N

tích trong quá trình sắc ký nhất định. Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải

TỈ
N

H

riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt. Pha động có hai loại phân cực và ít
phân cực thường dùng cho sắc ký pha đảo và sắc ký pha thuận. Tuy nhiên pha

H

Ơ

N

động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta

N

thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp

.Q
U

Y

đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổi thành phần pha động theo thời

TP

gian gọi là rửa giải gradient nồng độ.

Đ

ẠO

c. Detector trong sắc ký

N

G

Có nhiều loại detector khác nhau, tùy thuộc bản chất lý hóa của chất phân

H

Ư

tích mà lựa chọn detector cho phù hợp:

ẦN

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả

B

TR

năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại hoặc khả kiến.

10

00

- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh

Ó
A

quang. Đối với các chất không phát huỳnh quang cần phải dẫn xuất hóa chất

-L
Í-

H

phân tích để tạo sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang.

ÁN

- Detector khúc xạ: thường dùng định lượng hợp chất đường.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

- Detector độ dẫn: phù hợp các chất có hoạt tính điện hóa.
Ngoài ra còn tán xạ ánh sáng bay hơi (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa, phổ khối
(MS)... trong đó detector chuỗi diode (PDA) cho phép thay đổi bước sóng theo
chương trình đã đặt trong một quá trình sắc ký.
d. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

- Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu.

ỊN

Đ

- Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy tính)

H

- Phần tách: gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ.

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

[3].

Ư

N

G

Hình 1.6. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.

H

1.4.2. Một số thông số đặc trưng

TR

ẦN

Hiệu lực của cột sắc ký được biểu thị thông qua số đĩa lý thuyết trên cột

N =16(

10

00

B

(N). Số đĩa lý thuyết được tính theo công thức: 𝑡𝑅
2
) 𝑊

= 5,54( 𝑡𝑅 𝑊

1/2

)2

W: Độ rộng pic
W1/2: độ rộng pic ở ½ chiều cao pic.

Để đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký người ta

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

Trong đó: tR: thời gian lưu chất phân tích

D

IỄ

N

Đ

ÀN

thường sử dụng độ phân giải R giữa 2 píc cạnh nhau. Độ phân giải giữa 2 píc
(píc số 1 và số 2) được tính theo công thức sau:
R=

2(𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1 ) 𝑊
1 + 𝑊2

=

1,177(𝑡𝑅2 − 𝑡𝑅1 ) 𝑊
1 + 𝑊1
2

,1

2

,2

Trong đó: tR: Thời gian lưu

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

W: Độ rộng đáy píc.
W1/2: Độ rộng đáy pic ở ½ chiều cao pic.

ỊN

H

Khi: R = 0,75 hai píc không tách tốt, còn xen phủ nhau nhiều.


N

H

Đ

R = 1,0 hai píc tách khá tốt, còn xen phủ nhau 4%.

H

R = 1,5 hai píc tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%.

N 𝑊

1/20

Ơ

2𝑎

H

AF =

TỈ
N

Hệ số bất đối AF (assymetry factor)

Y

N

Trong đó:

.Q
U

W1/20 là độ rộng pic ở chiều cao 1/20.

TP

a là khoảng cách từ đường cao hạ từ đỉnh pic tới đường cong phía trước

Đ

ẠO

của pic ở 1/20 chiều cao pic [3].

N

G

1.4.3. Ứng dụng

H

Ư

a. Định tính

ẦN

Sự giống nhau về thời gian lưu của chất phân tích trên sắc ký đồ dung

TR

dịch chuẩn và dung dịch thử là cơ sở của phép thử định tính. Với detector PDA

00

B

hệ số Match khi chồng 2 phổ của chuẩn và thử cũng là cơ sở để định tính chất

10

phân tích.

H

Ó
A

b. Định lượng

-L
Í-

Việc so sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch

ÁN

chuẩn và dung dịch thử (diện tích hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện

TO

sắc ký xác định là cơ sở của phép định lượng.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

Các phương pháp định lượng có thể áp dụng:
- Phương pháp dùng chuẩn ngoại.
- Phương pháp dùng chuẩn nội.
- Phương pháp thêm chuẩn.
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích [3].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu

ỊN

H

Đ

code: A9251, lot: SLBG2403V); cordycepin (Cordycepin from Cordyceps

H

- Chất chuẩn: Adenosin (Adenosin 100%, chất chuẩn Sigma Aldrich prodruct


N

militaris 99,0% chất chuẩn Sigma Aldrich, product code: C3394, lot:

H

043M4030V).

TỈ
N

- Chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo:

Ơ

N

Mẫu dạng rắn:

N

H

Bảng 2.3. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng rắn.
Số lô

Hạn dùng

Mẫu R1
Mẫu R2

Pure cordyceps
Cordypower
capsule
Pure cordyceps
Aloha capsule
Aweto capsule

152501
150315

01/01/2017
01/03/2017

TP

ẠO

Đ

G

N

Ư
H

20140401

29/04/2017

TR

Mẫu R4

200315CSS Tháng 3/2018

ẦN

Mẫu R3

Bột ĐTHT sấy 010515
khô
Hong-cho gold

10

00

B

Mẫu R5

Tháng 1/2017

Ó
A

Mẫu R6

Tháng 5/2018

Công
ty
sản
xuất/công ty phân
phối
Công ty Medinam
Công ty Mushtech
Việt Nam
Aloha
Mecicinals
Inc.
Shenzhen Allnature
biotechnology
Co.Ltd
Công ty dược thảo
Thiên Phúc
Công ty dược phẩm
Đông Á

Y

Tên mẫu

.Q
U

STT

-L
Í-

H

Mẫu dạng lỏng:

Bảng 2.4. Chế phẩm chứa ĐTHT dạng lỏng.
Tên mẫu

Số lô

Mẫu L1

Rượu ĐTHT

204367

Mẫu L2
Mẫu L3

Nước yến ĐTHT
Cordypower
Cordyceps
militaris
extract
drink

Hạn dùng

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

STT

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Tháng
12/2017
2604140156 26/04/2016
20150410
10/04/2018

Công
ty
sản
xuất/công ty
phân phối
Công ty Văn Duy
Phương
Công ty Tribeco
Công ty Mushtech
Việt Nam

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

Tháng
1/2018

Wei
(Malaysia)

Tháng
3/2018

Korea silkworm CS7615
cordyceps

Tháng
3/2017

Công ty Sunchag
Xingfulai
Health
Products Co. Ltd
Công ty TNHH kinh
Doanh thực phẩm
An Minh

Shan


N

TỈ
N

H

Mẫu L6

H

Đ

Mẫu L5

Trùng thảo nhân
sâm
Cordyceps
pao sam extract
Cordyceps extract 010315TC

H

Mẫu L4

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

ỊN

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Ơ

N

- Mẫu placebo dạng rắn (placebo 1): bao gồm các thành phần sau trộn đồng

N

H

lượng

.Q
U

Y

Bột dược liệu nhân sâm

TP

Bột dược liệu tam thất

ẠO

Bột tổ yến.

G

Đ

- Mẫu placebo dạng lỏng (placebo 2): bao gồm các thành phần sau trộn đồng

Ư

N

lượng:

ẦN

H

Dịch chiết xuất nhân sâm (hàm lượng ginsenosid tổng 5% kl/tt)

TR

Dịch chiết xuất tam thất (hàm lượng notoginsenosid R1 5% kl/tt)

00

B

Nước yến ngân nhĩ (0,007g/L)

10

2.2. Hóa chất, dung môi

Ó
A

Bảng 2.5. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

TT
Tên hóa chất
Nguồn gốc
1
Ethanol
Trung Quốc
2
Methanol
Merck, Đức
3
Methanol
Trung Quốc
4
Acetonitril
Merck, Đức
5
Nước cất 2 lần
Việt Nam
2.3. Phương tiện, thiết bị nghiên cứu

Tiêu chuẩn
Tinh khiết phân tích
Dùng cho HPLC
Tinh khiết phân tích
Dùng cho HPLC
Dùng cho HPLC

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L5000 (Nhật) với detector PDA,
phần mềm điều khiển EZChromlite.
- Cân phân tích Sartorius (Đức).
- Cân kỹ thuật Shimadzu (Nhật).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

- Bể lắc siêu âm Helma S60H (Đức).
- Nồi cách thủy Memmert WNB14 (Đức).

ỊN

H

- Máy ly tâm Hettich EBA 20 (Đức).

Đ

- Bộ lọc hút chân không.


N

H

- Dụng cụ: các loại pipet, bình định mức, màng lọc mẫu (syringe filter), sinh

H

hàn hồi lưu…

TỈ
N

2.4. Phương pháp nghiên cứu

Ơ

N

Nguyên lý phân tích: Mẫu được chiết theo phương pháp thích hợp, dịch

N

H

chiết được định mức, lọc qua màng lọc 0,45 μm, tiêm vào hệ thống HPLC, ghi

.Q
U

Y

lại sắc ký đồ.

TP

Các số liệu đề tài thu thập từ kết quả thực nghiệm ứng dụng phương pháp

ẠO

HPLC.

G

Đ

2.4.1. Nghiên cứu chiết adenosin và cordycepin trong mẫu

Ư

N

Quy trình xử lý mẫu:

ẦN

H

- Đồng nhất mẫu.

TR

- Cân chính xác lượng mẫu thích hợp vào ống ly tâm (đối với mẫu dạng rắn)

00

B

hoặc bình định mức (đối với mẫu dạng lỏng), thêm dung môi chiết.

10

- Chiết mẫu theo cách thích hợp.

Ó
A

- Đối với mẫu dạng rắn: ly tâm dịch chiết, thu lấy phần dung dịch. Chiết lặp

-L
Í-

H

mẫu với dung môi trên. Gộp dịch chiết mẫu, thêm dung môi chiết vừa đủ đến

ÁN

vạch, lắc đều.
Đối với mẫu dạng lỏng: thêm dung môi chiết vừa đủ đến vạch, lắc đều,

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

- Lọc mẫu qua màng lọc 0,45 μm.
- Tiêm vào hệ thống sắc ký.
a. Khảo sát các phương pháp chiết:
Khảo sát hai phương pháp chiết: chiết bằng siêu âm và đun hồi lưu cách thủy.
b. Khảo sát điều kiện chiết:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

- Dung môi chiết: khảo sát các dung môi chiết là hỗn hợp nước – ethanol, nước
– methanol với các tỷ lệ khác nhau để lựa chọn được dung môi chiết phù hợp

ỊN

Đ

loại dung môi tỷ lệ khác nhau, mỗi loại tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.

H

nhất. Trên cùng một nền mẫu tiến hành chiết theo quy trình chiết trên với các


N

H

-Thời gian chiết: khảo sát thời gian chiết 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút,

H

120 phút.

TỈ
N

- Khảo sát số lần chiết: cùng một nền mẫu chiết lặp lại 1, 2, 3 lần, so sánh kết

Ơ

N

quả giữa các mẫu.

N

H

- Khảo sát nhiệt độ chiết: cùng một nền mẫu, chiết theo một phương pháp siêu

.Q
U

Y

âm, khảo sát nhiệt độ thường, 40oC, 50oC, 75oC, 100oC. Mỗi mức nhiệt độ làm

TP

3 lần, lấy kết quả trung bình để đánh giá.

ẠO

2.4.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký thích hợp:

G

Đ

Tiến hành trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L5000 detector

Ư

N

PDA để khảo sát điều kiện sắc ký mẫu chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin:

TR

- Khảo sát tỷ lệ pha động.

ẦN

H

- Khảo sát thành phần pha động: nước và methanol, nước và acetonitril

00

B

- Quan sát phổ đồ, lựa chọn bước sóng phát hiện.

10

- Khảo sát lựa chọn thể tích tiêm mẫu.

Ó
A

- Khảo sát nhiệt độ cột.

-L
Í-

H

Các số liệu được tính toán và xử lý thống kê.
Thông số đánh giá: thời gian lưu, độ cân đối của pic sắc ký, hệ số phân giải của

ÁN

2 pic adenosin và cordycepin.
toàn, hệ số phân giải Rs > 2.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

Yêu cầu: pic sắc ký gọn, cân đối, 2 pic adenosin và cordycepin tách nhau hoàn

2.4.3. Đánh giá phương pháp phân tích

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Chiết mẫu nghiên cứu theo cách chiết đã lựa chọn, chạy sắc ký các dung dịch
thu được theo điều kiện đã khảo sát, thẩm định phương pháp dựa trên các chỉ

ỊN

H

tiêu: tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn phát hiện,

Đ

giới hạn định lượng.


N

H

* Tính thích hợp của hệ thống: Đánh giá độ ổn định của hệ thống về thời gian

H

lưu và diện tích pic khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp đã chuẩn bị

TỈ
N

ở trên, ghi lại các giá trị thời gian lưu, diện tích pic.

Ơ

N

Yêu cấu: độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích ≤ 2,0%,

N

H

hệ số phân giải Rs >2.

.Q
U

Y

* Độ đặc hiệu: Tiêm lần lượt mẫu placebo, mẫu thử, mẫu chuẩn hỗn hợp, chuẩn

TP

đơn vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Trên sắc ký đồ mẫu placebo phải

ẠO

không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của hai chất

G

Đ

chuẩn.

Ư

N

* Tính tuyến tính: Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả mối tương

ẦN

H

quan tuyến tính trong khoảng xác định (là khoảng nồng độ đảm bảo sự phụ

TR

thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được Y và nồng độ chất phân tích X).

00

B

Xây dựng đường chuẩn 6 điểm X1 đến X6 của dung dịch chứa chất chuẩn

10

adenosin, cordycepin ở trong khoảng nồng độ phù hợp. Tiến hành sắc ký theo

Ó
A

điều kiện đã lựa chọn. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính giữa nồng độ

-L
Í-

H

từng chất và diện tích pic chất đó.
Yêu cầu: hệ số tương quan r ≥ 0,995.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

* Khảo sát độ chính xác:
Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ

nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều
kiện xác định.
- Độ lặp lại của phương pháp: Độ lặp lại diễn tả độ chính xác của một
quy trình phân tích trong cùng điều kiện thí nghiệm trong khoảng thời gian
ngắn. Tiến hành: chuẩn bị 6 mẫu thử theo quy trình chuẩn bị mẫu thử đã xây

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

dựng, tiêm vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ. Xác định độ lệch tương đối
RSD% của hàm lượng mỗi hoạt chất.

ỊN

Đ

phương pháp nhưng tiến hành vào ngày khác nhau. Yêu cầu: RSD đối với mỗi

H

- Độ chính xác trung gian: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại của


N

H

hoạt chất không lớn hơn 5,3% [6] đối với 18 mẫu tiến hành vào 3 ngày khác

H

nhau.

TỈ
N

* Khảo sát độ đúng: Độ đúng phản ánh sự phù hợp giữa kết quả thực nghiệm

Ơ

N

thu được với giá trị thực của kết quả.

N

H

Tiến hành: cân chính xác lượng mẫu thử thích hợp vào ống ly tâm (đối với mẫu

.Q
U

Y

rắn) và bình định mức (đối với mẫu lỏng), thêm lượng chuẩn hỗn hợp thích hợp

TP

sao cho tổng hàm lượng mỗi chất trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính,

ẠO

thêm dung môi, chiết mẫu theo quy trình chuẩn bị mẫu thử đã xây dựng. Tiến

G

Đ

hành ở 3 mức nồng độ, mỗi nồng độ làm 3 lần. Tiêm dung dịch thử thêm chuẩn

Ư

N

vào hệ thống sắc ký, xác định hàm lượng mỗi hoạt chất. Độ đúng xác định bằng

ẦN

H

hệ số thu hồi lượng chuẩn tìm được so với lượng chuẩn thêm vào.

B
00

chất ≥ 0,01% [6].

TR

Yêu cầu: độ thu hồi nằm trong khoảng 90 – 107% đối với mẫu hàm lượng hoạt

10

* Giới hạn phát hiện (LOD):

Ó
A

Giới hạn phát hiện là hàm lượng thấp nhất của chất phân tích có thể phát hiện

-L
Í-

H

về mặt định tính.

Cách xác định: chuẩn bị các dung dịch placebo 1, placebo 2, thêm các dung

ÁN

dịch chuẩn pha loãng vào các mẫu placebo được các dung dịch có hàm lượng

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

khoảng 0,5, 0,25, 0,2, 0,1 µg/ml mỗi chất, tiến hành sắc ký, xác định tỷ lệ tín
hiệu chia cho nhiễu nền (S/N). S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là
nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền, bề rộng mỗi bên tối
thiều gấp 10 lần chiều rộng của pic tại ½ chiều cao. LOD xác định tại nồng độ
có tỷ lệ S/N bằng 3 [5].
* Giới hạn định lượng (LOQ): được tính bằng 3,3 lần giới hạn phát hiện [5].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

2.4.4. Áp dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo
- Thu thập một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo dạng lỏng và rắn.

ỊN

H

- Tiến hành phân tích thành phần adenosin và cordycepin trong chế phẩm theo

Đ

quy trình đã xây dựng.


N

H

2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu

H

* Một số đặc trưng thống kê: Các đặc trưng thống kê được tính dựa vào các

TỈ
N

hàm số trong Microsoft Excel.

Ơ

N

Giá trị trung bình (X): Hàm AVERAGE.

%

Y

N
X

.Q
U

100 𝑥 𝑆𝐷

TP

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD):

H

Độ lệch chuẩn (SD): Hàm STDEV.

ẠO

* Tương quan hồi quy tuyến tính:

Đ

Phương trình hồi quy tuyến tính thể hiện quan hệ giữa diện tích pic sắc ký và

N

G

nồng độ chất phân tích:

ẦN

Hệ số góc a: Hàm SLOPE.

H

Ư

Y = aC +b

TR

Hệ số chắn b: Hàm INTERCEPT.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

Hệ số tương quan r: Hàm CORREL.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Đ

- Dung dịch chuẩn gốc adenosin: Cân chính xác khoảng 50,0 mg chuẩn

ỊN

H

3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn


N

H

adenosin vào bình định mức dung tích 50,0 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu

H

âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc kỹ (dung dịch 1) bảo quản

TỈ
N

ở 2- 8oC dùng trong 1 tháng.

Ơ

N

- Dung dịch chuẩn adenosin: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc

N

H

adenosin pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 50,0 ml thu được dung

.Q
U

Y

dịch chuẩn adenosin nồng độ 20 µg/ml tiến hành khảo sát tại nồng độ 20 µg/ml.

TP

- Dung dịch chuẩn gốc cordycepin: Cân chính xác khoảng 50,0 mg chất

ẠO

chuẩn cordycepin vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm khoảng 30 ml

G

Đ

MeOH, lắc siêu âm trong 5 phút, thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc kỹ (dung

Ư

N

dịch 2), bảo quản ở 2 -8oC dùng trong 1 tháng .

ẦN

H

- Dung dịch chuẩn cordycepin: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc

TR

cordycepin pha loãng bằng MeOH trong bình định mức 50 ml thu được dung

00

B

dịch chuẩn cordycepin nồng độ 20 µg/ml tiến hành khảo sát tại nồng độ 20

10

µg/ml.

Ó
A

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch gốc

-L
Í-

H

cordycepin và 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc adenosin cho vào bình định mức
50,0 ml, thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH được dung dịch chuẩn hỗn hợp có

ÁN

hàm lượng mỗi chất khoảng 20 µg/ml.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

3.1.2. Khảo sát lựa chọn bước sóng phát hiện:
Qua tham khảo các tài liệu với điều kiện của phòng thí nghiệm và thực
nghiệm, chúng tôi tiến hành phân tích lần lượt dung dịch chuẩn adenosin và
cordycepin nồng độ khoảng 20 µg/ml trên hệ thống HPLC, detector PDA với
các điều kiện như sau:
- Cột sắc ký: cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

- Detector PDA bước sóng 190 – 400 nm.
- Pha động: MeOH : H2O (1:1 tt/tt).

ỊN

H

- Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút.

H

Đ

- Nhiệt độ cột: 25⁰C.


N

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

H

Tiến hành quét phổ của pic adenosin và cordycepin trên sắc ký đồ dung

TỈ
N

dịch chuẩn adenosin và dung dịch chuẩn cordycepin cho kết quả như hình 3.8.

N

(b)

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

(a)

H

Ơ

N

Từ phổ đồ thu được, chúng tôi quyết định lựa chọn bước sóng đo là 260 nm.

00

B

Hình 3.7. Phổ hấp thụ tử ngoại của adenosin (a) và cordycepin (b).

10

3.1.3. Khảo sát lựa chọn pha động

Ó
A

- Pha động là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tách sắc ký, nó có thể

-L
Í-

H

ảnh hưởng tới độ chọn lọc, thời gian lưu giữ, hiệu lực của cột tách, độ phân
giải, độ rộng của pic sắc ký…

ÁN

- Tiến hành với các thành phần pha động khác nhau gồm: Kênh A là H2O, kênh

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

B là dung môi ACN hay MeOH, cố định các điều kiện phân tích khác. Quá
trình khảo sát cho kết quả như sau:
Bảng 3.6. Khảo sát thành phần pha động.
Thành phần pha động (92: 8)
Kênh A
Kênh B
H2O
ACN
H2O
MeOH

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Thời gian lưu (phút)
Adenosin
Cordycepin
5,6
7,0
16,7
22,6

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Nhận xét: Mặc dù chương trình chạy sử dụng H2O và ACN cho pic đẹp,
gọn nhưng thời gian lưu ngắn < 7 phút, do vậy có thể bị ảnh hưởng bởi các hoạt

ỊN

Đ

sử dụng ACN là 2,5 nhỏ hơn so với pha động sử dụng MeOH và H 2O, đồng

H

chất trong thành phần khác của mẫu thử. Mặt khác hệ số phân giải của pha động


N

H

thời sử dụng dung môi ACN tốn kém hơn. Vì vậy, chúng tôi sử dụng thành

H

phần pha động gồm methanol và nước, tiến hành khảo sát chương trình gradient

TỈ
N

tỷ lệ thành phần pha động.

B

TP

ẠO

Đ

H

G
N
Ư

0
15
30
45
85
100

100
85
70
55
15
0

10

00

H

ẦN

0
2
5
10
12
15

Thời gian lưu (phút):
- Adenosin: 9,31
- Cordycepin: 9,91

0
2
98
3
2
98
10
10
90
22
22
78
28
100
0
31
2
98
40
2
98
Thời gian lưu (phút):
- Adenosin: 20,67
- Cordycepin: 22,73

Nhận xét: Với chương trình gradient 1 và 2, pic của 2 chất gọn nhưng

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

Thời gian lưu (phút):
- Adenosin: 21,52
- Cordycepin: 21,83

Chương trình
gradient 3
Thời
MeOH H2O
gian
(%)
(%)
(phút)

.Q
U

Chương trình
gradient 2
Thời
MeOH H2O
gian
(%)
(%)
(phút)

TR

Chương trình
gradient 1
Thời
MeOH Dung
gian
(%)
dịch
(phút)
đệm
(%)
0
0
100
5
0
100
15
5
95
40
40
60
50
40
60

Y

N

Bảng 3.7. Khảo sát chương trình gradient nồng độ.

Ơ

N

- Tiến hành chạy 3 chương trình gradient, kết quả thu được như sau:

D

IỄ

N

Đ

ÀN

chưa tách nhau hoàn toàn. Còn đối với chương trình gradient 3 thì pic adenosin
và cordycepin rất gọn, cân đối, thời gian lưu ổn định, lặp lại với thời gian lưu
hợp lý. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chương trình gradient 3 để tách và
định lượng chất phân tích.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

3.1.4. Khảo sát thể tích tiêm mẫu
Tiến hành khảo sát trên dung dịch chuẩn hỗn hợp với điều kiện sắc ký như sau,

ỊN

H

thể tích tiêm mẫu thay đổi các giá trị: 5 µl, 10 µl, 20 µl, 40 µl.

Đ

- Cột sắc ký: cột InertSustain C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).


N

H

- Detector PDA bước sóng 260nm.

MeOH (%)

0

2

3

2

10

10

22

22

28

100

31

2

40

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

98
98
90
78
0
98
98

TR

- Nhiệt độ cột: 25⁰C.

ẦN

H

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.

H2O (%)

Ư

N

2

TỈ
N

Thời gian (phút)

G

H

- Pha động:

00

B

Kết quả cho thấy với thể tích tiêm mẫu 5 hoặc 10 µl, pic adenosin và

10

cordycepin đều gọn, cân đối, tách tốt, trong khi đó thể tích tiêm mẫu 20 µl và

Ó
A

40 µl pic hai chất đều bị chẻ đôi. Do đó chúng tôi lựa chọn thể tích tiêm mẫu

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

10 µl đảm bảo pic sắc ký cân đối, đảm bảo độ chính xác buồng tiêm mẫu.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

(b)

(a)

10

(c)

(d)

H

-L
Í-

µl (d).

Ó
A

Hình 3.8. Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp tiêm mẫu 5 µl (a), 10 µl (b), 20 µl (c), 40
3.1.5. Khảo sát nhiệt độ cột

TO

ÁN

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột đến khả năng tách pic sắc ký.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

Điều kiện sắc ký tiến hành như mục 3.1.4, thể tích tiêm mẫu 10 µl, nhiệt độ cột
khảo sát: 25oC (tương ứng nhiệt độ phòng) và 40oC.
Đối tượng khảo sát:
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin hàm lượng 20 µg/ml.
- Dung dịch thử: cân chính xác khoảng 0,50 g bột mẫu R1 vào ống ly tâm, thêm
khoảng 15 ml MeOH, siêu âm 30 phút, ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 5

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

phút, lọc dịch chiết qua giấy lọc thô, dịch lọc trong tập trung vào bình định mức
25 ml. Rửa giấy lọc bằng 7 – 8 ml MeOH, tập trung dịch rửa vào bình định mức

ỊN

H

trên. Thêm MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Kết

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

quả thu được như sau:

G

(b)

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

(a)

(c)

(d)

Hình 3.9. Sắc ký đồ mẫu chuẩn hỗn hợp (a) và mẫu thử (c) ở điều kiện nhiệt độ
cột 40oC, mẫu chuẩn hỗn hợp (b) và mẫu thử (d) ở điều kiện nhiệt độ cột 25oC.
Nhận xét: trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp, nhiệt độ cột ở 40 oC, cả hai
chất đều rửa giải nhanh hơn (16,5 và 18,5 phút) so với nhiệt độ cột 25 oC (20,0

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

và 22,1 phút), hệ số phân giải Rs đều lớn hơn 5. Tuy nhiên sắc ký đồ dung dịch
thử cho thấy adenosin chưa được tách ra khỏi nền mẫu khi sử dụng pha động

ỊN

Đ

nền mẫu. Do đó chúng tôi lựa chọn nhiệt độ cột kiểm soát ở 25 oC để đảm bảo

H

với nhiệt độ cột 40oC, trong khi đó nhiệt độ cột 25oC, pic tách rõ ràng ra khỏi


N

H

tách được hai chất ra khỏi nền mẫu.

H

3.2. Khảo sát và lựa chọn quy trình xử lý mẫu

TỈ
N

- Yếu tố khảo sát: dung môi chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, số lần chiết,

Ơ

N

phương pháp chiết.

N

H

- Đối tượng khảo sát:

.Q
U

Y

Mẫu dạng rắn: mẫu bột Pure Cordyceps do công ty Medinam cung cấp (mẫu

TP

R1).

ẠO

Mẫu dạng lỏng: mẫu rượu đông trùng hạ thảo do công ty Văn Duy Phương

G

Đ

cung cấp (mẫu L1).

Ư

N

- Thông số đánh giá: hàm lượng adenosin và cordycepin trong mẫu chiết được.

ẦN

H

3.2.1. Khảo sát dung môi chiết

TR

Do adenosin và cordycepin tan trong H2O, MeOH và EtOH, chúng tôi

00

B

dùng các dung môi này làm dung môi chiết, khảo sát thành phần dung môi, tỷ

10

lệ dung môi chiết. Thông số đánh giá: hàm lượng adenosin và cordycepin trong

Ó
A

mẫu. Các điều kiện chiết cố định: phương pháp chiết siêu âm, thời gian chiết:

-L
Í-

H

30 phút, nhiệt độ chiết: không kiểm soát, số lần chiết: 1 lần. Mỗi điều kiện khảo
sát lặp lại 3 lần, lấy kết qủa trung bình.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Kết quả phân tích được chỉ ra trong hình sau

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

EtOH:H2O=1:9

3.98

EtOH:H2O=1:1

4.11

H

8.13

Đ

EtOH:H2O=9:1

57.29

ỊN

2.34

62.78

17.65

MeOH:H2O=1:9

61.74

16.63

60.86

TỈ
N

H

MeOH:H2O=1:1


N

EtOH

H

1.18
2.6

MeOH:H2O=9:1

10.93

29.91

Ơ

MeOH

N

6.56
6.68

0

10

20

30

40

60

70

cordycepin

TP

adenosin

50

60.65

.Q
U

Hàm lượng (mg/100g)

N

H2O

H

21.47

Y

Dung môi chiết

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đ

ẠO

Hình 3.10. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu R1 (n = 3).

G

1.56

Ư

1.32

20.43

2.08

20.46

00

MeOH: H2O=1:9

Ó
A

MeOH:H2O = 1:1
MeOH 100%

H

20.91

B

H2O

0

2.68

19.7

3.68

23.05

5

10

15

20

25

Hàm lượng (mg/100g)
Adenosin

Cordycepin

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

21.74

TR

1.44

ẦN

3.33

EtOH

10

Dung môi chiết

H

EtOH:H2O=1:1

20.26

N

EtOH:H2O=1:9

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát dung môi chiết đối với mẫu L1 (n = 3).
Nhận xét: Kết quả cho thấy đối với mẫu R1 dạng rắn, khi sử dụng dung
môi chiết là H2O hoặc MeOH : H2O = 1 : 9 hoặc MeOH : H2O = 1 : 1, lượng
adenosin và cordycepin chiết được đều cao hơn hẳn khi sử dụng các dung môi
còn lại nhưng H2O có khả năng chiết cả hai chất cần phân tích cao nhất. Vì vậy,

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

chúng tôi quyết định sử dụng dung môi chiết là H2O đối với mẫu dạng rắn vì
không độc hại, không gây ô nhiễm môi trường, không dễ cháy nổ và tiết kiệm

Đ

Đối với mẫu L1, khi sử dụng dung môi MeOH và EtOH, hàm lượng

ỊN

H

hơn các loại dung môi khác.


N

H

adenosin và cordycepin đều cao hơn hẳn khi sử dụng các dung môi còn lại,

H

nhưng dung môi MeOH cho hàm lượng cả hai chất cần phân tích đều cao nhất,

TỈ
N

mặt khác khi sử dụng dung môi EtOH nền mẫu khá xấu do hòa tan nhiều tạp

H

.Q
U

Y

3.2.2. Khảo sát số lần chiết

N

mẫu dạng lỏng để đảm bảo hiệu suất chiết cao nhất.

Ơ

N

chất. Vì vậy, chúng tôi quyết định sử dụng dung môi chiết là MeOH đối với

TP

Việc khảo sát số lần chiết được tiến hành trên mẫu dạng rắn. Tiến hành chiết

ẠO

lặp lại 3 lần để khảo sát khả năng chiết, cố định những thông số còn lại (dung

G

Đ

môi chiết: H2O, phương pháp: siêu âm, thời gian chiết: 30 phút, nhiệt độ chiết:

Ư

N

40⁰C). Tại mỗi lần chiết chúng tôi làm lặp 3 lần song song, lấy kết quả trung

ẦN

H

bình. Kết quả thu được trình bày ở bảng sau:

Số lần chiết

Ó
A

10

00

HL Adenosin
HL cordycepin
(mg/100 g) (TB ± sd)
(mg/100 g) (TB ± sd)
22,01 ± 0,05
60,05 ± 0,12
22,13 ± 0,08
60,32 ± 0,15
22,20 ± 0,06
60,36 ± 0,10
xét: Hàm lượng của adenosin và cordycepin thu được trong mẫu

-L
Í-

H

1
2
3
Nhận

B

TR

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát số lần chiết (n=3).

ÁN

thay đổi không đáng kể khi tăng số lần chiết. Vì vậy, chúng tôi quyết định tiến

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

hành chiết một lần vẫn đảm bảo hiệu suất và tiết kiệm thời gian.
3.2.3. Khảo sát phương pháp chiết
Chúng tôi tiến hành khảo sát hai phương pháp chiết: siêu âm và đun hồi lưu
cách thủy, cố định các thông số chiết khác: thời gian chiết 30 phút, số lần chiết:
01 lần, dung môi chiết: H2O đối với mẫu R1, MeOH đối với mẫu L1. Mỗi

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

phương pháp chiết tiến hành lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình. Kết quả được
thể hiện trong hình sau:

ỊN

Hàm lượng (mg/100 g)

61.12

58.20

60

H

70

Đ

50
30

23.04

18.01

H

20


N

H

40

TỈ
N

10
0
Adenosin

N

Cordycepin

H

Đun hồi lưu

Ơ

Phương pháp chiết

.Q
U

Y

N

Siêu âm

22.35

ẠO

20.36

Đ

20

G

15

N

10

3.15

Ư

2.89

H

5
0
Cordycepin

ẦN

Hàm lượng (mg/100g)

25

TP

Hình 3.12. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu R1 (n = 3).

Adenosin

Đun hồi lưu

Siêu âm

10

00

B

TR

Phương pháp chiết

Ó
A

Hình 3.13. Kết quả khảo sát phương pháp chiết đối với mẫu L1 (n = 3).

H

Nhận xét: Đối với cả hai dạng mẫu rắn và lỏng, lượng adenosin và cordycepin

-L
Í-

chiết được bằng phương pháp siêu âm đều cao hơn so với phương pháp hồi lưu

ÁN

vì siêu âm có tác dụng tăng mạnh khả năng khuếch tán nhờ tác dụng của sóng

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

siêu âm: làm tăng diện tích tiếp xúc giữa hai pha bằng cách phân tán chúng
thành những hạt nhỏ, tăng cường sự xáo trộn của hỗn hợp, có tác dụng làm
nóng tại chỗ. Do đó, chúng tôi lựa chọn phương pháp siêu âm để chiết chất cần
phân tích ra khỏi nền mẫu.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

3.2.4. Khảo sát nhiệt độ chiết
Tiến hành khảo sát chiết mẫu với các thông số chiết cố định: phương pháp chiết

ỊN

Đ

đối với mẫu L1, số lần chiết: 01 lần. Thông số khảo sát: nhiệt độ chiết (nhiệt

H

siêu âm, thời gian chiết 30 phút, dung môi chiết: H 2O đối với mẫu R1, MeOH


N

H

độ phòng, 40oC, 50oC, 75oC, 100oC). Mỗi khảo sát tiến hành lặp lại 3 lần, lấy

TỈ
N

19.3

100

Ơ

N

58.37

20.35

60.77

N

75

H

Nhiệt độ chiết (oC)

H

kết quả trung bình. Kết quả được thể hiện ở hình sau:

Y

24.47

20

30

Đ

10

40

57.73
50

60

70

G

0

ẠO

21.1

25

59.86

TP

25.04

40

59.26

.Q
U

50

Ư

N

Hàm lượng (mg/100g)
cordycepin

ẦN

H

adenosin

00

B

TR

Hình 3.14. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu R1 (n = 3).
1.89

21.57

Ó
A

H

75

2.58

40

2.60

ÁN
TO

22.79
22.69
22.65
2.35

25

20.35
0

5

10

15

20

25

Hàm lượng (mg/100g)

IỄ

N

Đ

ÀN

2.67

50

-L
Í-

Nhiệt độ chiết (oC)

10

100

D

adenosin

cordycepin

Hình 3.15. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết đối với mẫu L1 (n = 3).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Nhận xét: Đối với mẫu dạng rắn R1, hàm lượng cordycepin không chênh
lệch nhiều giữa các mức nhiệt độ chiết, hàm lượng adenosin tăng khi tăng nhiệt

ỊN

Đ

adenosin thu được giảm dần, thấp nhất ở nhiệt độ 100oC (19,30 mg/100 g). Do

H

độ chiết đến 40oC (25,04 mg/100 g) sau đó khi tăng nhiệt độ chiết hàm lượng


N

H

đó chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 40ºC để chiết adenosin và cordycepin đối với

H

nền mẫu rắn.

TỈ
N

Đối với mẫu dạng lỏng L1, khi nhiệt độ tăng từ 25 oC lên 75oC lượng

Ơ

N

adenosin và cordycepin chiết được đều tăng lên, khi chiết ở 100 oC lượng hai

N

H

chất chiết được giảm một lượng nhỏ so với hàm lượng khi chiết ở 75oC. Do vậy

.Q
U

Y

chúng tôi lựa chọn nhiệt độ chiết mẫu lỏng ở 75oC.

TP

3.2.5. Khảo sát thời gian chiết

ẠO

Tiến hành chiết mẫu theo quy trình dự kiến, cố định các thông số: phương

G

Đ

pháp chiết siêu âm, nhiệt độ chiết 40oC đối với mẫu rắn R1 và 75oC đối với

Ư

N

mẫu lỏng L1, dung môi chiết: H2O đối với mẫu rắn R1 và MeOH đối với mẫu

ẦN

H

lỏng L1, số lần chiết: 01 lần. Thông số khảo sát: thời gian chiết (15 phút, 30

TR

phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút). Mỗi khảo sát tiến hành lặp lại 3 lần, lấy kết

10

00

B

quả trung bình. Kết quả được thể hiện ở hình sau:

90

62.35

22.32

30

TO

62.72

22.45

60

61.46

22.56

15

61.04

21.17
0

10

20

30

40

50

60

70

Hàm lượng (mg/100g)

N

Đ

ÀN

62.15

22.58

ÁN
Thời gian chiết (phút)
-L
ÍH
Ó
A

120

Adenosin

D

IỄ

Cordycepin

Hình 3.16. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu R1 (n = 3).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

22.25
3.06
21.99

90

ỊN

H

2.97
22.3

60

H

Đ

2.99


N

22.46

30

3.05

H

22.02

15

2.69
0

5

10

15

TỈ
N

Thời gian chiết (phút)

120

20

25

N

Adenosin

Y

Cordycepin

H

Ơ

N

Hàm lượng (mg/100g)

.Q
U

Hình 3.17. Kết quả khảo sát thời gian chiết đối với mẫu L1 (n = 3).

TP

Nhận xét: Đối với cả 2 mẫu rắn và lỏng, khi tăng thời gian chiết từ 15

Đ

ẠO

phút đến 120 phút, hàm lượng cordycepin trong mẫu chiết được không có sự

G

chênh lệch đáng kể, hàm lượng adenosin tăng khi tăng thời gian chiết từ 15

H

Ư

N

phút đến 30 phút (2,69 mg/100g đến 3,05 mg/100g đối với mẫu L1; 21,17

ẦN

mg/100g đến 22,56 mg/100g đối với mẫu R1), sau đó khi tăng thời gian chiết

TR

đến 120 phút thì hàm lượng chất này thay đổi không đáng kể. Do vậy chúng tôi

00

B

lựa chọn thời gian 30 phút để chiết adenosin và cordycepin ra khỏi nền mẫu vì

H

phân tích.

Ó
A

10

nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp ảnh hưởng tới kết quả

-L
Í-

3.3. Quy trình phân tích

ÁN

Qua khảo sát quy trình phân tích và điều kiện sắc ký, chúng tôi đưa ra

TO

quy trình định lượng đồng thời adenosin và cordycepin trong chế phẩm chứa

D

IỄ

N

Đ

ÀN

đông trùng hạ thảo dạng lỏng và rắn như sau:
3.3.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Dung dịch chuẩn: Cân và pha adenosin và cordycepin trong methanol để

được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/ml mỗi
chất, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Dung dịch thử:

Mẫu thử dạng rắn: Cân chính xác lượng mẫu dạng rắn thích hợp (tương

ỊN

Đ

siêu âm ở 40oC trong 30 phút, lọc qua giấy lọc thô, dịch lọc chuyển vào bình

H

ứng với 0,30 – 0,50 g ĐTHT) vào ống ly tâm, thêm khoảng 15 ml H2O, lắc đều,


N

H

định mức 25 ml, dùng H2O rửa phần cắn trên giấy lọc, dịch rửa tập trung vào

TỈ
N

H

bình định mức 25 ml trên, thêm H2O vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua màng
lọc 0,45 µm.

H

Ơ

N

Mẫu thử dạng lỏng: Cân chính xác lượng mẫu lỏng thích hợp (tương ứng

Y

N

vứi 0,30 – 0,50 g ĐTHT) vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml MeOH,

.Q
U

lắc đều, siêu âm ở 75oC trong 30 phút, để dung dịch về nhiệt độ phòng, thêm

TP

MeOH vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.

ẠO

3.3.2. Điều kiện sắc ký

G

Đ

- Cột sắc ký: cột sắc ký pha đảo C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).

Ư

N

- Detector PAD bước sóng 260nm.

ẦN

H

- Pha động:

MeOH (%)
2
2
10
22
100
2
2

H2O (%)
98
98
90
78
0
98
98

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

Thời gian (phút)
0
3
10
22
28
31
40

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút.
- Nhiệt độ cột: 25⁰C.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.
- Thứ tự rửa giải: adenosin

cordycepin.

Tiến hành tiêm dung dịch thử và dung dịch chuẩn hỗn hợp vào hệ thống sắc ký,
ghi lại sắc ký đồ.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

3.3.3. Đánh giá kết quả
- Định tính: Định tính thành phần adenosin và cordycepin trong mẫu thử dựa

ỊN

Đ

dung dịch mẫu thử với thời gian lưu và phổ tương ứng của các pic này trong

H

vào so sánh thời gian lưu và phổ UV của các pic xuất hiện trong sắc ký đồ của


N

H

sắc ký đồ của dung dịch mẫu chuẩn.

H

- Định lượng:

TỈ
N

Hàm lượng adenosin (cordycepin) trong mẫu thử (mg/g) được xác định dựa vào

Ơ
N

H

(𝐴𝑇 −𝑏) 𝑥 25 𝑥 0,001

Y 𝑎

𝑥 𝑚𝑡

.Q
U

X=

N

đường chuẩn theo công thức sau:

TP

Trong đó:

ẠO

- AT: diện tích pic của adenosin (cordycepin) trong sắc ký đồ của dung dịch

G
N

- mt: khối lượng mẫu thử (g).

Đ

mẫu thử (mAU.s).

H

Ư

- a, b: hệ số của phương trình đường chuẩn adenosin (cordycepin)

TR

ẦN

y = ax +b biểu diễn sự phụ thuốc tuyến tính giữa diện tích pic và hàm

B

lượng chất chuẩn.

10

00

3.4. Đánh giá phương pháp

Ó
A

3.4.1. Độ thích hợp của hệ thống

H

Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin và cordycepin có nồng độ chính

-L
Í-

xác khoảng 20 µg/ml mỗi chất theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn (mục 3.3.2),

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

ghi lại sắc ký đồ. Kết quả được trình bày ở bảng sau:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

ỊN


N

H

Đ

Diện
Hệ
số Độ phân Số đĩa lý
tích pic bất đối giải
thuyết
(mAU.s) xứng
2740860
0,98
54230
2775004
1,00
53497
2751945
1,01
53881
2757071
1,03
53909
2769706
1,01
53752
2799351
1,01
52932
2765656
20570,25
0,744
2200453
1,02
6,13
71230
2220244
1,02
6,11
70516
2204457
1,00
6,16
71764
2207623
1,03
6,12
70994
2208372
1,03
6,11
70784
2231010
0,99
6,10
70384
2212027
11418,32
0,516

H

TỈ
N

N

Ơ

H

N

Y

.Q
U

TP

ẠO

Đ

G

N

Ư

TR

ẦN

H

Cordycepin

Adenosin

Thời
gian lưu
(phút)
C3.1
20,080
C3.2
20,087
C3.3
20,087
C3.4
20,100
C3.5
20,107
C3.6
20,093
Trung bình
20,09
SD
0,010
RSD (%)
0,049
C3.1
22,153
C3.2
22,167
C3.3
22,173
C3.4
22,180
C3.5
22,187
C3.6
22,180
Trung bình
22,17
SD
0,012
RSD (%)
0,054
Nhận xét:

H

Bảng 3.9. Kết quả độ thích hợp của hệ thống.

00

B

Kết quả cho thấy độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của thời gian lưu, diện tích

10

pic đều nhỏ hơn 1%, pic cân đối với hệ số bất đối xứng xấp xỉ 1, số đĩa lý thuyết

H

Ó
A

> 5000 đối với cả 2 chất, độ phân giải giữa hai pic adenosin và cordycepin > 6,

-L
Í-

đạt yêu cầu cho phép phân tích định lượng với cả hai chất adenosin và

ÁN

cordycepin.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

3.4.2. Độ đặc hiệu
Độ đặc hiệu được đánh giá qua phân tích các mẫu thử, mẫu placebo và mẫu
chuẩn:
- Dung dịch mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn adenosin và cordycepin trong
MeOH có nồng độ chính xác khoảng 20 µg/ml mỗi chất.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

- Dung dịch mẫu placebo 1:
Cân chính xác khoảng 0,50 g bột hỗn hợp các dược liệu đã trộn theo tỷ

ỊN

Đ

yến) vào ống ly tâm, thêm khoảng 15 ml H2O, lắc đều, tiến hành chiết và

H

lệ đồng lượng (bột dược liệu nhân sâm, bột dược liệu tam thất, bột tổ


N

H

phân tích theo quy trình đã lựa chọn đối với mẫu dạng rắn (mục 3.3.1).

H

- Dung dịch mẫu placebo 2:

TỈ
N

Cân chính xác khoảng 1,00 g hỗn hợp các dịch chiết dược liệu đã trộn

Ơ

N

theo tỷ lệ đồng lượng (dịch chiết xuất nhân sâm, dịch chiết xuất tam thất,

N

H

nước yến) vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml MeOH, lắc đều,

.Q
U

Y

tiến hành chiết và phân tích theo quy trình đã lựa chọn đối với mẫu thử

TP

dạng lỏng (mục 3.3.1).

ẠO

- Dung dịch mẫu R1: đồng nhất mẫu, cân chính xác khoảng 0,30 – 0,50 g

G

Đ

chế phẩm vào ống ly tâm, tiến hành chiết và phân tích theo quy trình đã

Ư

N

lựa chọn đối với mẫu thử dạng rắn (mục 3.3.1).

ẦN

H

- Dung dịch mẫu L1: cân chính xác khoảng 1,00 g chế phẩm vào bình định

TR

mức 25 ml, tiến hành chiết và phân tích theo quy trình đã lựa chọn đối

00

B

với mẫu thử dạng lỏng (mục 3.3.1).

10

Tiến hành: tiêm dung dịch mẫu placebo 1, mẫu placebo 2, dung dịch thử các

Ó
A

mẫu R1 và L1, mẫu chuẩn hỗn hợp vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn (mục 3.3.2). Kết quả thu được như hình sau:

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H

a. Sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo 1

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

b. Sắc ký đồ dung dịch mẫu placebo 2

d. Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn cordycepin

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

c. Sắc ký đồ dung dịch mẫu chuẩn adenosin

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

e. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

f. Sắc ký đồ dung dịch mẫu R1

-L
Í-

g. Sắc ký đồ dung dịch mẫu L1

ÁN

Hình 3.18. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu phương pháp.
đồ dung dịch chuẩn và các dung dịch thử, tiến hành so phổ. Kết quả thu được
như hình sau:

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

Lấy phổ của adenosin và cordycepin tại thời gian lưu tương ứng trong sắc ký

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

(B)

(C)

(D)

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

(A)

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Hình 3.19. So phổ adenosin của mẫu R1 (A) và mẫu L1 (C), so phổ
cordycepin của mẫu R1 (B) và mẫu L1 (D).

Nhận xét:
Trên sắc ký đồ của dung dịch placebo tương ứng không xuất hiện pic nào tại
thời gian lưu tương ứng của các pic adenosin và cordycepin.
Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử có các pic tương ứng với các pic của các
chất nghiên cứu trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn với phổ tương ứng, so phổ

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

các chất này cho hệ số Match lớn hơn 0,99. Do đó có thể kết luận phương pháp
có độ đặc hiệu cao.

Đ

Chúng tôi tiến hành khảo sát tính tuyến tính giữa diện tích pic sắc ký và nồng

ỊN

H

3.4.3. Xây dựng đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính


N

H

độ các chất phân tích:

TỈ
N

H

- Dung dịch chuẩn gốc: chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc trong MeOH
adenosin 1000 µg/ml, cordycepin 1000 µg/ml.

Ơ

N

- Dung dịch chuẩn làm việc: từ các dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha

N

H

loãng với MeOH để có các dung dịch chứa chất chuẩn adenosin và

.Q
U

Y

cordycepin ở trong khoảng nồng độ 1 µg/ml – 40 µg/ml.

TP

Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn (mục 3.3.2), ghi lại sắc ký

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

đồ. Kết quả được trình bày trong hình 3.21 và bảng 3.10:

H

Hình 3.20. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp hàm lượng mỗi chất từ 1- 40

-L
Í-

µg/ml (pic adenosin tR = 20,1 phút, pic cordycepin tR = 22,2 phút)

ÁN

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ adenosin,

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

cordycepin và diện tích pic.
Nồng độ (µg/ml)
1
2
4
10
20

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

Diện tích (mAU.s)
Adenosin
145234
292199
651285
1410235
2863410

Cordycepin
115209
230243
446631
1119984
2324907

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

6203678
y = 153969x - 48266
0,999

5050020
y = 126124x - 70764
0,999

ỊN

H

40
Phương trình hồi quy
Hệ số tương quan (r)

Đ
H
TỈ
N

H

y = 153969x - 48266
R² = 0.998

6000000


N

8000000

4000000

Ơ

N

2000000

5

10

15

20

25

30

40

45

.Q
U

Nồng độ (µg/ml)

35

N

0

H

0

Y

Diện tích pic (mAU.s)

Đường chuẩn adenosin

ẠO

TP

(a)

Đ
G

6000000

y = 126124x - 70764
R² = 0.9982

N

5000000

Ư

4000000

H

3000000

ẦN

2000000

TR

1000000
0
5

10

15

20

25

30

35

40

45

Nồng độ (µg/ml)

10

00

0

B

Diện tích pic (mAU.s)

Đường chuẩn cordycepin

Ó
A

(b)

-L
Í-

H

Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ (µg/ml) và diện tích pic

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

(mAU.s) của adenosin (a) và cordycepin (b).
Nhận xét: Kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy trong khoảng nồng độ từ 1

đến 40 µg/ml có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic (hệ số tương
quan r > 0,995).
3.4.4. Khảo sát độ chính xác
3.4.4.1. Độ lặp lại của phương pháp

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Độ lặp lại của phương pháp được tính trên kết quả phân tích các mẫu độc lập
trong cùng một điều kiện phân tích. Tiến hành định lượng 6 lần độc lập trên mẫu thử

ỊN

Đ

kết quả hàm lượng adenosin và cordycepin trong mẫu thử, độ lệch chuẩn tương đối,

H

R1, mẫu thử L1 theo quy trình chiết mẫu và phân tích đã lựa chọn (mục 3.3). Tính

Ơ

N

Cordycepin
Diện tích
Hàm lượng
pic (mAU.s)
(mg/100g)

H

Adenosin
Diện tích
Hàm
pic (mAU.s)
lượng
(mg/100g)
407705
23,34
420146
22,31
402896
21,41
422596
22,33
402156
22,91
400012
23,51
22,64

N

Lượng
cân (g)

Y

Lần

TỈ
N

H

Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu R1.


N

H

kết quả thu được như sau:

Adenosin
Diện tích
Hàm
pic (mAU.s)
lượng
(mg/g)
140122
0,028
157893
0,029
169278
0,029
163256
0,030
178345
0,031
165417
0,030
0,030

00

Lượng
cân (g)

0,9416
1,0353
1,0999
1,0460
1,0724
1,0353

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

1
2
3
4
5
6
TB
RSD
(%)

H

Ó
A

10

Lần

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

1
0,3125
1059456
61,70
2
0,3292
1060365
62,20
3
0,3191
1005896
61,89
4
0,3285
998561
59,13
5
0,2925
1015687
64,07
6
0,2892
975241
62,45
61,74
TB
RSD
3,14
3,17
(%)
Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp với mẫu L1.

3,93

Cordycepin
Diện tích
Hàm lượng
pic (mAU.s)
(mg/g)
1042890
1140293
1223490
1189357
1250378
1092376

0,223
0,222
0,224
0,229
0,235
0,212
0,224
3,34

Nhận xét: Theo AOAC, tại mức nồng độ ≥ 0,01%, độ lặp lại của phương
pháp (RSD %) phải đạt < 5,3%. Kết quả phân tích cho thấy độ lặp lại của

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

phương pháp đối với cả adenosin và cordycepin trên 2 nền mẫu đều đạt yêu
cầu. Như vậy, phương pháp có độ lặp lại đạt yêu cầu của AOAC [6].

Đ

Tiến hành định lượng 6 lần lặp lại song song đối với mẫu thử R1 và L1 theo

ỊN

H

3.4.4.2. Độ chính xác trung gian


N

H

quy trình chiết và phân tích đã lựa chọn ở mục 3.3 nhưng tiến hành vào 3 ngày

H

khác nhau.

TỈ
N

Kết quả được thể hiện ở bảng sau:

N

Adenosin

H

Ơ

N

Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác trung gian.

Cordycepin

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

Trung bình
22,64 mg/100g
61,74 mg/100g
(n=6)
Ngày 1
3,14
3,17
RSD (%)
Trung bình
22,23 mg/100g
61,12 mg/100g
(n=6)
Ngày 2
2,89
3,56
RSD (%)
Mẫu R1
Trung bình
22,79 mg/100g
62,10 mg/100g
(n=6)
Ngày 3
3,43
2,34
RSD (%)
22,65 mg/100g
61,71 mg/100g
Trung bình (n=18)
3,12
2,79
RSD (%)
Trung bình
0,030 mg/g
0,224 mg/g
(n=6)
Ngày 1
3,93
3,34
RSD (%)
Trung bình
0,029 mg/g
0,217 mg/g
(n=6)
Ngày 2
4,73
3,67
RSD (%)
Mẫu L1
Trung bình
0,030 mg/g
0,220 mg/g
(n=6)
Ngày 3
4,86
3,46
RSD (%)
0,030 mg/g
0,220 mg/g
Trung bình (n=18)
4,71
3,56
RSD (%)
Nhận xét: Ở cả 2 mẫu thẩm định chỉ tiêu độ chính xác trung gian, kết quả cho
thấy phương pháp khảo sát có độ chính xác đạt yêu cầu của AOAC cho khoảng
nồng độ ≥ 0,01% (độ lặp lại RSD < 5,3%).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

3.4.5. Khảo sát độ đúng
Độ đúng được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, xác định giá trị

ỊN

H

phần trăm tìm lại chuẩn. Thực hiện ở ba mức nồng độ khác nhau, mỗi mức

Đ

nồng độ tiến hành 3 lần, tương ứng 9 mẫu thử riêng biệt.


N

H

Chuẩn bị dung dịch chuẩn thêm vào mẫu thử: hút chính xác 5,0 ml dung

H

dịch chuẩn gốc adenosin và 5,0 ml dung dịch chuẩn gốc cordycepin vào bình

TỈ
N

định mức 50 ml, thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH, lắc đều được dung dịch

Ơ

N

chuẩn hỗn hợp có hàm lượng mỗi chất khoảng 50 µg/ml.

N

H

Chuẩn bị dung dịch thử R1 thêm chuẩn khảo sát độ đúng: cân chính xác

.Q
U

Y

khoảng 0,50 g bột mẫu thử vào ống ly tâm, thêm chính xác 1,0 ml hoặc 2,0 ml

TP

hoặc 4,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trên, thêm khoảng 15 ml H2O, tiến hành

ẠO

chiết mẫu như mục 3.3.1 đối với mẫu thử dạng rắn được các dung dịch thử thêm

G

Đ

chuẩn ở 3 mức nồng độ.

Ư

N

Chuẩn bị dung dịch thử L1 thêm chuẩn khảo sát độ đúng: cân chính xác

ẦN

H

khoảng 1,00 g mẫu thử vào bình định mức 25 ml, thêm chính xác 1,0 ml hoặc

TR

2,0 ml hoặc 4,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trên, thêm khoảng 15 ml MeOH,

00

B

tiến hành chiết mẫu như mục 3.3.1 đối với mẫu thử dạng lỏng được các dung

10

dịch thử thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ.

Ó
A

Tiến hành tiêm sắc ký các dung dịch thử thêm chuẩn, xác định hàm lượng

-L
Í-

H

adenosin và cordycepin trong các dung dịch dựa vào đường chuẩn xây dựng
trong cùng ngày phân tích.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.14.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

ỊN
Đ


N

H

TỈ
N

N

Ơ

H

G

Đ

ẠO

TB
RSD
(%)

N

Mức 3

Y

Mức 2

.Q
U

Mức 1

TP

Lượng
thêm
(µg)
45,8
45,8
45,8
91,6
91,6
91,6
183,2
183,2
183,2

Cordycepin
Lượng
Lượng
Độ thu
thêm (µg)
tìm lại
hồi (%)
(µg)
49,5
50,7
102,4
49,5
49,8
100,6
49,5
49,0
99,1
99,0
94,8
95,7
99,0
95,9
96,9
99,0
97,8
98,8
198,0
189,1
95,5
198,0
188,5
95,2
198,0
196,6
99,3
98,2
2,55

H

Adenosin
Lượng
Độ thu
tìm lại
hồi (%)
(µg)
44,4
96,9
47,5
103,7
45,5
99,4
91,2
99,5
94,8
103,5
94,6
103,2
178,5
97,5
179,8
98,1
190,7
104,1
100,7
3,66

H

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu R1.

Ư

N

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng mẫu thử L1.

-L
Í-

ÁN

Mức 2

H

Ó
A

TO

Mức 3

ÀN

TB
RSD (%)

TR

B

Lượng
thêm
(µg)
49,5
49,5
49,5
99,0
99,0
99,0
198,0
198,0
198,0

Cordycepin
Lượng
tìm lại
(µg)
52,6
52,4
51,1
103,9
100,0
104,0
207,9
192,8
207,9

Độ thu
hồi (%)
106,3
106,0
103,3
104,9
101,0
105,1
105,0
97,4
105,0
103,8
2,77

D

IỄ

N

Đ

00

10

Mức 1

Lượng
thêm
(µg)
45,8
45,8
45,8
91,6
91,6
91,6
183,2
183,2
183,2

ẦN

H

Adenosin
Lượng
Độ thu hồi
tìm lại
(%)
(µg)
46,0
100,4
46,7
101,9
44,7
97,6
90,7
99,1
92,8
101,4
90,2
98,5
179,3
97,9
165,0
90,1
179,3
97,9
98,3
3,52

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Nhận xét:
Với quy trình đã lựa chọn, định lượng các chất đã nghiên cứu trên cả 2 nền

ỊN

H

mẫu thử có độ thu hồi đều nằm trong khoảng đáp ứng yêu cầu về thẩm định

Đ

phương pháp đối với phân tích mẫu của AOAC:


N

H

Mẫu R1: độ thu hồi của adenosin và cordycepin là 96,9 – 104,1% và 95,2

H

– 102,4% (nằm trong khoảng 90 – 107% với hàm lượng mẫu ≥ 0,01%)

TỈ
N

Mẫu L1: độ thu hồi của adenosin và cordycepin là 90,1 – 101,9% và 97,4–

Ơ

N

106,3% (nằm trong khoảng 90 – 107% với hàm lượng mẫu ≥ 0,01%).

N

H

3.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

.Q
U

Y

Tiến hành:

TP

Chuẩn bị mẫu placebo 1, mẫu placebo 2 như mục 3.4.2.

ẠO

Chuẩn bị mẫu placebo 1, mẫu placebo 2 thêm chuẩn hỗn hợp adenosin và

G

Đ

cordycepin được dung dịch có hàm lượng mỗi chất 0,5 µg/ml, 0,25 µg/ml, 0,2

Ư

N

µg/ml, 0,1 µg/ml.

ẦN

H

Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại 3 lần các dung dịch trên theo điều kiện sắc ký như

TR

mục 3.3.2.

00

B

Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu nền (S/N) bằng cách xác định chiều cao

10

pic mỗi chất chia cho độ nhiễu xung quanh pic tính về hai phía pic. Nhiễu nền

H

-L
Í-

như sau:

Ó
A

xác định trong khoảng 20 lần độ rộng pic ở ½ chiều cao pic. Kết quả trung bình
Bảng 3.16. Kết quả S/N của các mẫu thêm chuẩn.
S/N adenosin
15
11
8
3

S/N cordycepin
14
10
7
3

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

Nồng độ
0,5 µg/ml
0,25 µg/ml
0,2 µg/ml
0,1 µg/ml

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

.Q
U

Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu placebo 1 thêm chuẩn (0,25 µg/ml mỗi chất).

TP

Nhận xét: trên cả 2 nền mẫu placebo, phương pháp có giới hạn phát hiện

ẠO

của cả 2 hoạt chất là 0,1 µg/ml. Giới hạn định lượng xác định bằng 3,3 lần giới

G

Đ

hạn phát hiện có giá trị là 0,33 µg/ml. Giới hạn khá thấp chứng tỏ phương pháp

Ư

N

có độ nhạy cao.

ẦN

H

Kết quả thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu

TR

cao, khoảng tuyến tính rộng, độ lặp lại và độ đúng của phương pháp đáp ứng

00

B

yêu cầu của AOAC [6]. Phương pháp có giới hạn phát hiện thấp 0,1 µg/ml với

10

mỗi chất do vậy có thể định tính đối với các mẫu có hàm lượng thấp. Kết quả

Ó
A

thẩm định đáp ứng các yêu cầu của AOAC do vậy có thể áp dụng đối với phân

-L
Í-

H

tích mẫu thực.

Các mẫu TPCN chứa ĐTHT được chuẩn bị mẫu như mục 3.3.1, mỗi mẫu

TO

ÁN

3.5. Áp dụng phương pháp phân tích trên một số TPCN chứa ĐTHT

D

IỄ

N

Đ

ÀN

chuẩn bị 3 thử riêng biệt. Tiến hành sắc ký theo điều kiện sắc ký như mục 3.3.2,
ghi lại sắc ký đồ. Kết quả định tính và định lượng được minh họa trong hình
3.24, 3.25 (đầy đủ trong phụ lục C) và bảng 3.17, 3.18.
3.5.1. Định tính
Sắc ký đồ dung dịch thử các mẫu thử có pic tại thời gian lưu tương ứng với
thời gian lưu của pic adenosin và cordycepin trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Kết quả so phổ của pic tại thời gian lưu của adenosin và cordycepin với phổ
chuẩn adenosin và cordycepin của các mẫu thử đều cho hệ số Match > 0,99

ỊN

H

(phổ hai chất tương đối giống nhau). Do vậy có thể kết luận các mẫu thử khảo

Đ

sát thể hiện phép thử định tính của adenosin và cordycepin.


N

H

Bảng 3.17. Kết quả thời gian lưu pic adenosin và cordycepin các mẫu thử

TỈ
N
N

Hệ số Match

H

Ơ

Adenosin
0,9981
0,9903
0,9912
0,9933
0,9935
0,9934
0,9987
0,9908
0,9905
0,9906

Cordycepin
0,9994
0,9921
0,9984
0,9915
0,9996
0,9941
0,9978
0,9989
0,9969
0,9938

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

Mẫu Thời gian lưu pic dung Thời gian lưu pic dung
thử dịch mẫu chuẩn (phút)
dịch mẫu thử (phút)
Adenosin Cordycepin Adenosin Cordycepin
R2
20,0
22,1
20,0
22,1
R3
20,3
22,4
20,3
22,4
R4
20,5
22,9
20,5
22,9
R5
20,0
22,0
20,0
22,0
R6
19,9
21,8
19,9
21,8
L2
20,0
22,0
20,0
22,0
L3
19,9
21,9
19,9
21,9
L4
20,6
22,4
20,6
22,4
L5
21,1
23,1
21,1
23,1
L6
21,1
23,2
21,1
23,2

H

và chuẩn hỗn hợp.

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

a)

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

(b)

Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu R2 (a), L2 (b).

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

(b)

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

(a)

ẠO

Hinh 3.24. So phổ adenosin (a) và cordycepin (b) của mẫu thử R2 và mẫu

G

Đ

chuẩn tương ứng.

Ư

N

3.5.2. Định lượng

ẦN

H

Dựa vào khối lượng mẫu thử, nồng độ chất phân tích trong sắc ký đồ của dung

TR

dịch mẫu thử và đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích tính hàm

B

lượng (mg/g) adenosin và cordycepin trong mẫu thử.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

Kết quả được thể hiện ở bảng 3.18.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Bảng 3.18. Kết quả hàm lượng adenosin và cordycepin trong các mẫu thử.

ỊN
Đ

TỈ
N

H


N

H

R2

Hàm lượng (mg/g)(TB ± SD) (n = 3)
Adenosin
Cordycepin
Viên nang cứng vỏ màu 0,224 ± 0,004
1,624 ± 0,003
vàng nhạt, bột bên trong
màu vàng nâu
m = 0,5313 g
Viên nang cứng vỏ 0,282 ± 0,003
0,904 ± 0,006
trong, bột bên trong màu
vàng nhạt
m = 0,5031 g
Viên nang cứng màu 1,023 ± 0,011
0,205 ± 0,008
vàng nhạt, bột bên trong
màu nâu
m = 0,4986 g
Bột màu vàng cam
0,063 ± 0,002 3,134 ± 0,01 mg/g
mg/g
Viên hoàn cứng màu 1,584 ± 0,018 0,051 ± 0,0006
nâu đen
mg/g
mg/g
Chế phẩm dạng dịch 0,0108 ± 0,0002 0,0066 ± 0,0002
lỏng màu vàng nâu, lẫn mg/g
mg/g
mảnh nhỏ màu trắng
Chế phẩm dạng dịch 0,0087 ± 0,0006 0,027 ± 0,0006
lỏng màu nâu
mg/g
mg/g
Chế phẩm dạng cao 0,261 ± 0,004 0,102 ± 0,004
lỏng màu nâu đen
mg/g
mg/g
Chế phẩm dạng dịch 0,122 ± 0,004 1,519 ± 0,007
lỏng màu nâu đen
mg/g
mg/g
Chế phẩm dạng dịch 0,0094 ± 0,0008 0,0229 ± 0,0007
lỏng màu vàng
mg/g
mg/g

H

Mô tả

Tên
mẫu

N

H

Ơ

N

R3

TP

.Q
U

Y

R4

Đ

ẠO

R5

Ư

N

G

R6

TR

ẦN

H

L2

00

B

L3

10

L4

H

Ó
A

L5

-L
Í-

L6

ÁN

Nhận xét:

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

Các mẫu TPCN được định tính định lượng adenosin và cordycepin đều thể hiện
phép thử định tính của hai hoạt chất này. Tuy nhiên hàm lượng adenosin và
cordycepin trên các mẫu thử khảo sát rất khác nhau, tùy thuộc hàm lượng
ĐTHT, chất lượng ĐTHT, loài ĐTHT nhà sản xuất đưa vào sản phẩm. Do vậy
khó đánh giá sản phẩm đang lưu hành có đạt tiêu chuẩn chất lượng không.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Chương 4. BÀN LUẬN
1. Về lựa chọn phương pháp phân tích

ỊN

Đ

định lượng được ứng dụng phổ biến hiện nay cho nhiều hoạt chất. Phương pháp

H

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp có thể định tính,


N

H

này có tính đặc hiệu, độ đúng và độ chính xác cao được sử dụng nhiều tại các

H

phòng thí nghiệm.

TỈ
N

Phương pháp sắc ký lớp mỏng của tác giả MA King Wah và các cộng sự,

Ơ

N

phương pháp đo màu của Nicholas M. Kredich và Armand J. Guarino, phương

N

H

pháp điện di mao quản… của các nghiên cứu tham khảo đều chỉ tiến hành trên

.Q
U

Y

nền mẫu dược liệu ĐTHT chưa thực hiện trên nền chế phẩm có thêm các thành

TP

phần khác (ngoài ĐTHT). Phương pháp định lượng bằng sắc ký lớp mỏng tiến

ẠO

hành đơn giản, không cần quá quan tâm đến ảnh hưởng của nền mẫu nhưng quá

G

Đ

trình tiến hành chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như sự chính xác của thể tích

Ư

N

chấm sắc ký, cách chấm (tròn hay vạch), thiết bị và chương trình xử số liệu, …

ẦN

H

sẽ ảnh hưởng tới kết quả. Khi sử dụng phương pháp quang phổ phân tích mẫu

TR

thực phẩm chức năng có nhiều thành phần khác có đặc tính tương tự cordycepin

00

B

và adenosin thì nền mẫu sẽ ảnh hưởng lớn đến tính chọn lọc cũng như khả năng

10

phân tích chính xác hai hoạt chất nghiên cứu do vậy phương pháp so màu sẽ

Ó
A

không đảm bảo chính xác do ảnh hưởng bởi các thành phần khác trong mẫu

-L
Í-

H

phân tích. Phương pháp điện di mao quản có khả năng tách tốt, kinh tế và thân
thiện với môi trường do chỉ cần dung dịch đệm điện ly (dung dịch nước), nhưng

ÁN

thiết bị này không phổ biến trong các phòng thí nghiệm nên sẽ hạn chế khi triển

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

khai trong thực tế. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao được lựa chọn sử
dụng trong nghiên cứu này nhằm đưa ra phương pháp phân tích chính xác,
thường quy cho các phòng thí nghiệm để đánh giá hàm lượng hai hoạt chất
adenosin và cordycepin trong thực phẩm chức năng chứa ĐTHT.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

2. Về quy trình xử lý mẫu
Các loại dung môi chiết mẫu được sử dụng khảo sát dựa trên độ tan của

ỊN

Đ

dạng rắn, việc chiết hoạt chất bằng nước cho kết quả hàm lượng hai chất phân

H

hai hoạt chất trong các dung môi thông thường. Kết quả cho thấy đối với mẫu


N

H

tích cao nhất. Dung môi nước có ưu điểm phân tán, làm rã các hạt nhỏ mẫu

H

giúp cho việc chiết hoạt chất hiệu quả nhất, đồng thời là loại dung môi rẻ tiền,

TỈ
N

không độc hại. Đối với mẫu dạng lỏng, dung môi chiết cho hàm lượng hai hoạt

Ơ

N

chất nhiều nhất là dung môi MeOH. Các mẫu TPCN dạng lỏng phần lớn thành

N

H

phần nước là chủ yếu, do vậy đã phân tán tốt các tiểu phân hoạt chất trong dung

.Q
U

Y

dịch, khi sử dụng dung môi MeOH có thể hòa tan tốt hơn hai hoạt chất định

TP

lượng. Mặt khác mẫu lỏng có một lượng khá lớn thành phần đường, protein

ẠO

(trong mẫu nước yến), việc sử dụng MeOH làm dung môi chiết mẫu có ưu điểm

G

Đ

gây kết tủa các thành phần này giúp cho việc lọc mẫu dễ hơn.

Ư

N

Hai phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi là phương

ẦN

H

pháp siêu âm và đun hồi lưu cách thủy. Kết quả khảo sát trên nền mẫu rắn và

TR

mẫu lỏng đều cho thấy phương pháp chiết siêu âm cho kết quả hàm lượng

00

B

adenosin và cordycepin cao hơn so với phương pháp hồi lưu. Điều này có thể

10

giải thích là do phương pháp siêu âm có tác dụng tăng mạnh tính thấm thấu và

Ó
A

khuếch tán nhờ những tác dụng của sóng siêu âm: làm tăng diện tích tiếp xúc

-L
Í-

H

giữa hai pha bằng cách phân tán chúng thành những hạt nhỏ, tăng cường sự xáo
trộn của hỗn hợp.

ÁN

Nhiệt độ chiết mẫu khảo sát trên nền mẫu dạng rắn cho thấy với mẫu dạng

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

rắn nhiệt độ chiết mẫu tốt nhất ở 40oC. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên
cứu của tác giả Jiamin Li và cộng sự khi nghiên cứu nhiệt độ chiết ảnh hưởng
đến hàm lượng hoạt chất adenosin và cordycepin trong mẫu dược liệu C.
militaris. Các tác giả cho rằng, adenosin chiết trong mẫu dược liệu ở nhiệt độ
từ 20 – 40oC là tốt nhất do adenosin trong môi trường nước kém bền với nhiệt
độ, cordycepin không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ chiết [19].

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Đối với mẫu dạng lỏng, kết quả nghiên cứu này cho thấy nhiệt độ chiết tốt
nhất ở 75oC, chứng tỏ trong môi trường methanol, adenosin ít chịu ảnh hưởng

ỊN

Đ

liệu C. sinensis theo chuyên luận dược điển Trung Quốc 2010 (đun hồi lưu trên

H

bởi nhiệt độ. Kết quả này phù hợp với phương pháp chiết adenosin trong dược


N

H

cách thủy trong 30 phút) [31].

H

Kết quả của nghiên cứu cho thấy thời gian chiết mẫu cũng ảnh hưởng đến

TỈ
N

hàm lượng hoạt chất chiết ra. Cụ thể khi tăng thời gian chiết từ 15 phút đến 30

Ơ

N

phút, hàm lượng cả hai chất đều tăng, khi tăng thời gian chiết từ 30 – 120 phút,

N

H

hàm lượng hoạt chất thay đổi không đáng kể. Do vậy việc lựa chọn thời gian

.Q
U

Y

chiết 30 phút có tác dụng tiết kiệm thời gian đồng thời có thể tránh sự giảm

TP

hàm lượng adenosin nếu bị tác động bởi nhiệt khi chiết thời gian dài (siêu âm

ẠO

thời gian dài dung dịch nước trong máy nóng lên gây tăng nhiệt độ chiết).

G

Đ

Kết quả khảo sát số lần chiết mẫu trên nền mẫu dạng rắn cho thấy hàm lượng

Ư

N

hai chất adenosin và cordycepin khi chiết 1 lần, chiết 2 và 3 lần không khác

ẦN

H

nhau đáng kể, điều này có nghĩa là việc chiết 1 lần đã lấy được hết hoạt chất ra

TR

khỏi nền mẫu. Hơn thế nữa việc chiết 1 lần có ưu điểm tiết kiệm thời gian, dung

00

B

môi chiết.

10

Về phương pháp chiết hoạt chất, nghiên cứu của tác giả Jian – Ping Yuan

Ó
A

và cộng sự cho thấy dược liệu C. militaris được chiết bằng dung môi nước theo

-L
Í-

H

phương pháp siêu âm cho hàm lượng 12 nucleosid cao nhất [36]. Trong khi đó
Lei Huang và cộng sự chiết adenosin và cordycepin trong mẫu quả thể và sinh

ÁN

khối các loài Cordyceps bằng phương pháp siêu âm công suất 75W với hỗn

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

hợp dung môi methanol và nước tỷ lệ 1:1 (tt/tt). Như vậy với nền mẫu dạng rắn
nước là dung môi chiết tốt hai hoạt chất adenosin và cordycepin. Đối với nền
mẫu dạng lỏng hiện nay chưa có nghiên cứu nào về phương pháp tách chiết hai
hoạt chất này.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

3. Về điều kiện sắc ký
Sắc ký lỏng pha đảo hiện nay được sử dụng rộng rãi vì tách và phân tích

ỊN

Đ

không phân cực. Đồng thời thành phần chính của pha động là nước nên rất kinh

H

được nhiều hợp chất có độ phân cực đa dạng, từ phân cực, ít phân cực đến


N

H

tế. Nghiên cứu này sử dụng pha tĩnh không phân cực bản chất silicagel được

H

xilan hóa bởi nhóm octadecyl (C18) là loại pha tĩnh có hiệu quả tách tốt, được

TỈ
N

sử dụng phổ biến nhất hiện nay.

Ơ

N

Nhiệt độ cột ảnh hưởng đến khả năng phân tích thông qua ảnh hưởng đến

N

H

sự rửa giải của hoạt chất. Khi tăng nhiệt độ cột sẽ khiến cho pha động giảm độ

.Q
U

Y

nhớt, do vậy chất phân tích được rửa giải nhanh hơn. Tuy nhiên trong nền mẫu

TP

phức tạp việc rửa giải nhanh có thể dẫn đến khả năng tách kém cho cột. Trong

ẠO

nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát nhiệt độ cột 40 oC và nhiệt độ phòng 25oC,

G

Đ

kết quả cho thấy khi nhiệt độ cột ở 40oC cả hai chất phân tích rửa giải nhanh

Ư

N

hơn nhưng trong nền mẫu thử lại chưa tách được hoạt chất adenosin ra khỏi nền

ẦN

H

mẫu.

TR

Pha động có vai trò quan trọng để rửa giải chất phân tích trong sắc ký lỏng.

00

B

Tiến hành so sánh khả năng rửa giải adenosin và cordycepin bằng hai dung môi

10

thường được sử dụng trong sắc ký lỏng pha đảo là methanol và acetonitril. Kết

Ó
A

quả cho thấy dung môi acetonitril rửa giải 2 chất này nhanh hơn, pic gọn, cân

-L
Í-

H

đối. Tuy nhiên, với nền mẫu TPCN còn có nhiều thành phần khác nên rửa giải
sớm sẽ dẫn đến việc chưa tách hoàn toàn pic hoạt chất ra khỏi nền mẫu phức

ÁN

tạp. Mặt khác, methanol là dung môi rẻ tiền hơn, do vậy việc sử dụng methanol

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

sẽ kinh tế hơn mà vẫn đảm bảo khả năng rửa giải hoạt chất trong nền mẫu phức
tạp. Việc khảo sát 3 chương trình gradient cho thấy chương trình gradient chúng
tôi lựa chọn đảm bảo độ phân giải giữa 2 chất (>6), pic sắc ký gọn, cân đối,
thời gian phân tích 40 phút đảm bảo các thành phần khác của được rửa giải
hoàn toàn.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Phổ hấp thụ tử ngoại của hai hoạt chất thu được cho thấy hai chất có cực
đại hấp thụ ở bước sóng 260 nm, do vậy chúng tôi lựa chọn bước sóng phát

ỊN

Đ

nhạy của phương pháp. Bước sóng này giống bước sóng phát hiện trong phần

H

hiện là 260 nm để tăng đáp ứng phân tích của chất phân tích, do vậy tăng độ


N

H

định lượng adenosin trong chuyên luận của dược điển Trung Quốc 2010 trong

H

khi đó một số tác giả lựa chọn bước sóng 254 nm [12], [16].

TỈ
N

4. Về việc thẩm định phương pháp phân tích

Ơ

N

Phương pháp phân tích trong nghiên cứu này được thẩm định các chỉ tiêu

N

H

độ chọn lọc, khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng. Kết quả cho thấy đối

.Q
U

Y

với cả 2 nền mẫu TPCN đánh giá, phương pháp cho độ chọn lọc cao, hệ số

TP

chồng phổ của cả adenosin và cordycepin đều lớn hơn 0,99. Khoảng tuyến tính

ẠO

được xây dựng với hàm lượng mỗi chất từ 1 – 40 µg/ml, kết quả cho thấy có sự

G

Đ

tương quan chặt chẽ giữa hàm lượng hoạt chất và đáp ứng pic sắc ký (diện tích

Ư

N

pic sắc ký). Độ lặp lại trên 2 nền mẫu TPCN được tiến hành trong ngày và khác

ẦN

H

ngày cho kết quả đáp ứng yêu cầu của AOAC [6]. Độ đúng của phương pháp

TR

được đánh giá thông qua độ thu hồi theo phương pháp thêm chuẩn. Kết quả cho

10

của AOAC [6].

00

B

thấy đối với cả 2 mẫu TPCN nghiên cứu, phương pháp cho độ đúng đạt yêu cầu

Ó
A

Phương pháp định tính, định lượng adenosin và cordycepin trong các

-L
Í-

H

nghiên cứu trong và ngoài nước chủ yếu dùng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao với detector UV – VIS. Tác giả Jian Wei Xie và cộng sự đã xây dựng

ÁN

phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC/ESI-MS) định lượng 4 nucleosid trong

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

C. sinensis trong đó có thành phần adenosin và cordycepin [34]. Phương pháp
này đánh giá giới hạn phát hiện của adenosin và cordycepin đều có giá là 0,1
µg/ml, giới hạn định lượng của adenosin và cordycepin lần lượt là 0,6 và 0,5
µg/ml. Như vậy phương pháp sắc ký lỏng trong nghiên cứu này có độ nhạy
tương đương phương pháp sắc ký lỏng khối phổ của tác giả Jian Wei Xie.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

5. Về việc ứng dụng phương pháp để định tính, định lượng một số TPCN chứa
ĐTHT

ỊN

Đ

hết đều không ghi rõ hàm lượng ĐTHT trong mẫu là bao nhiêu gây khó khăn

H

Trên thị trường Hà Nội, lượng mẫu TPCN chứa ĐTHT vô cùng lớn, hầu


N

H

cho nhà quản lý khi đánh giá chất lượng sản phẩm. Mặt khác hiện nay ĐTHT

H

được bán dưới dạng dược liệu sấy khô khá nhiều, chủ yếu là loài C.militaris

TỈ
N

được nuôi trồng (cordycepin là nucleosid có hàm lượng cao nhất trong loài

Ơ

N

này). Do vậy việc đánh giá hàm lượng cả hai hoạt chất adenosin và cordycepin

N

H

là cần thiết. Kết quả phân tích cho thấy mẫu dược liệu C. sinensis cũng như các

.Q
U

Y

mẫu TPCN có thành phần ĐTHT loài này (ví dụ như mẫu viên hoàn cứng Hong

TP

– cho gold) có hàm lượng adenosin cao hơn cordycepin nhiều trong khi đó mẫu

ẠO

dược liệu C. militaris cũng như TPCN có thành phần ĐTHT loài này (ví dụ

G

Đ

mẫu ĐTHT Aloha) có hàm lượng cordycepin cao hơn adenosin. Dược điển

Ư

N

Trung Quốc 2010 có chuyên luận Cordyceps sinensis trong đó quy định hàm

ẦN

H

lượng adenosin không ít hơn 0,01% (tính theo dược liệu khô kiệt) và chuyên

TR

luận sản phẩm Bailing capsule (Fermented cordyceps powder Cs – C – Q80)

00

B

quy định hàm lượng adenosin không ít hơn 0,16 mg/viên đối với viên 200 mg

10

và 0,40 mg/viên đối với viên 500 mg [31]. Ở Việt Nam hiện nay theo thông tư

Ó
A

số 43/2014/TT-BYT ban hành ngày 24 tháng 11 năm 2014 của Bộ Y tế quy

-L
Í-

H

định về quản lý thực phẩm chức năng yêu cầu kiểm nghiệm chất có hoạt tính
sinh học có nguồn gốc từ dược liệu và các cơ sở đăng ký phải công bố giới hạn

ÁN

cho hàm lượng các hoạt chất này. Do vậy rất khó khăn trong việc đánh giá chất
thể là một kênh thông tin giúp nhà sản xuất tiêu chuẩn hóa để nâng cao chất
lượng sản phẩm của đơn vị mình.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

lượng sản phẩm nếu sản phẩm chưa được đăng ký lại. Kết quả bước đầu này có

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận

Đ

1. Đã xây dựng được phương pháp định tính, định lượng đồng thời adenosin và

ỊN

H

Qua nghiên cứu thực nghiệm chúng tôi thu được các kết quả sau:


N

H

cordycepin trong chế phẩm dạng lỏng và dạng rắn chứa đông trùng hạ thảo

H

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

TỈ
N

* Quy trình cụ thể là:

Ơ

N

Xử lý mẫu:

N

H

Đối với mẫu dạng rắn, mẫu được chiết với nước bằng phương pháp siêu âm

ẠO

Điều kiện sắc ký:

TP

pháp siêu âm trong 30 phút ở nhiệt độ 75oC.

.Q
U

Y

trong 30 phút ở 40oC. Mẫu dạng lỏng chiết với dung môi methanol bằng phương

G

Đ

Cột sắc ký pha đảo C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), nhiệt độ cột 25 oC, pha động

Ư

N

gồm hai thành phần methanol (A) và nước (B) theo chương trình gradient: 0 –

ẦN

H

3 phút: 2% A; 3 – 10 phút: 2 – 10% A; 10 – 22 phút: 10 – 22% A; 22 – 28 phút:

TR

22 – 100% A; 28 – 31 phút: 100 – 2% A; 31 – 40 phút: 2% A. Tốc độ dòng 1,0

00

B

ml/phút, thể tích tiêm mẫu: 10 µl, detector PDA bước sóng 260 nm.

10

Định tính adenosin và cordycepin dựa vào thông số thời gian lưu và hệ số Match

H

-L
Í-

chuẩn.

Ó
A

chồng phổ dung dịch mẫu thử tại thời gian lưu tương ứng với dung dịch mẫu
Định lượng: tính kết quả dựa vào đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân

ÁN

tích với r > 0,995.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

* Đã thẩm định phương pháp phân tích adenosin và cordycepin trên nền mẫu
dạng rắn và nền mẫu dạng lỏng chứa đông trùng hạ thảo. Kết quả thu được cho
thấy các tiêu chí thẩm định: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính 1 – 40 µg/ml cho
thấy mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ hoạt chất và diện tich pic, độ lặp
lại của phương pháp đối với cả hai hoạt chất RSD từ 3,14% đến 3,93% đạt yêu
cầu AOAC [5] (< 5,3%), độ đúng từ 96,2% đến 106,3% nằm trong khoảng giới

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

hạn 90 – 107% đối với hàm lượng mẫu ≥ 0,01% theo AOAC. Giới hạn phát
hiện, giới hạn định lượng của phương pháp đối với adenosin và cordycepin

Đ

2. Đã áp dụng phương pháp phân tích đối với một số sản phẩm TPCN chứa

ỊN

H

tương đối thấp (0,1 µg/ml) chứng tỏ phương pháp có độ nhạy cao.


N

H

ĐTHT (5 mẫu dạng rắn, 5 mẫu dạng lỏng). Sắc ký đồ cho 2 pic của 2 chất tách

H

nhau và không bị ảnh hưởng bởi nền mẫu (hệ số Match > 0,99) và đáp ứng phân

TỈ
N

tích (diện tích pic) nằm trong khoảng tuyến tính 1 – 40 µg/ml đối với mỗi hoạt

Ơ

N

chất. Quy trình xử lý mẫu áp dụng đối với các chế phẩm chứa ĐTHT cho thấy

N

H

phương pháp có thể áp dụng đối với đa số nền mẫu ví dụ các mẫu thành phần

.Q
U

Y

dược liệu có chứa nhóm hoạt chất flavonoid, saponin kém tan trong nước cũng

TP

như thành phần protein, đường trong mẫu dạng lỏng sẽ kết tủa bởi dung môi

ẠO

methanol do đó dịch chiết mẫu sẽ ít tạp hơn. Kết quả phân tích các sản phẩm

G

Đ

này cho thấy do có nguồn gốc khác nhau (xuất xứ Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt

Ư

N

Nam), thành phần ĐTHT các loài khác nhau nên hàm lượng hoạt chất thu được

ẦN

H

khác nhau (adenosin mẫu dạng rắn từ 0,063 mg/g đến 1,584 mg/g và mẫu dạng

TR

lỏng từ 0,009 mg/g đến 0,261 mg/g; cordycepin mẫu dạng rắn từ 0,051 mg/g

00

B

đến 3,134 mg/g và mẫu dạng lỏng từ 0,007 mg/g đến 1,519 mg/g, do vậy rất

10

khó khăn cho việc đánh giá chất lượng sản phẩm khi chưa có quy định rõ ràng

-L
Í-

H

Kiến nghị

Ó
A

cho mặt hàng TPCN này.
- Ứng dụng phương pháp phân tích adenosin và cordycepin đã xây dựng

ÁN

để kiểm tra chất lượng các đối tượng mẫu thực phẩm chức năng chứa đông

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

trùng hạ thảo có thành phần tương tự nền mẫu đã khảo sát.
- Phát triển, đánh giá phương pháp này để phân tích adenosin và
cordycepin trong mẫu thực phẩm chức năng chứa đông trùng hạ thảo có chứa
nhiều thành phần dược liệu khác như sắn dây (Puerariae radix), cam thảo
(Liquorice root), táo (Jujube)…

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

TÀI LIỆU THAM KHẢO

H

Đ

HPLC, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Đại học Dược Hà Nội.

ỊN

có chứa đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

H

Tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Vân Anh (2014), Xác định adenosin trong thực phẩm chức năng


N

2. Đái Duy Ban, Lưu Tham Mưu (2009), Đông trùng hạ thảo, nhà xuất bản Y

TỈ
N

H

học, Hà Nội.

N

3. Bộ Y tế (2007), Hóa phân tích tập 2 – Phân tích dụng cụ, NXB Y học, Hà

H

Ơ

Nội.

Y

N

4. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà

.Q
U

Nội.

TP

5. Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định

Đ

ẠO

phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật, NXB Khoa học và

N

G

kỹ thuật, Hà Nội

H

Ư

Tiếng Anh

ẦN

6. AOAC International (2012), AOAC official methods of analysis, Appendix

TR

K: Guidelines for dietary supplements and botanicals, Part I: AOAC

00

B

Guidelines for single laboratory validation of chemical methods for

10

dietary supplements and botanicals.

H

Ó
A

7. E.J. Buenz, B.A. Bauer, T.W. Osmundson, T.J. Motley (2005), “The

-L
Í-

traditional Chinese medicine Cordyceps sinensis and its effects on the

ÁN

apoptotic homeostatic”, Journal of Ethnopharmacology, 96, pp. 19 – 29.

Excipients Volume 25, Academic Press, USA.

9. Peter C.K. Cheung (2008), Mushrooms as functional foods, A John Wiley &
Sons Inc, USA.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

8. Harry G. Brittain (1998), Analytical profiles of Drug Substances and

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

10. Baoyan Fan and Haibo Zhu (2012), “Cordycepin: pharmacological
properties and their relevant mechanisms”, TANG Humanitas medicine, 2,


N

and Coronary Circulation”, Hypertension, 18, pp. 565 – 574.

H

Đ

11. Masatsugu Hori and Masafumi Kitakaze (1991), “Adenosine, the Heart,

ỊN

H

pp. 141 – 147. Td cordycepin

H

12. Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou

TỈ
N

(2009), “Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the

Ơ

N

products of Cordyceps spp”, Journal of Microbiology Research, 3 (12),

Y

N

H

pp. 957 – 961.

.Q
U

13. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical

TP

procedures: Text and Methodology Q2 (R1).

ẠO

14. P. Karthe, N. Gautham, Anil Kumar and S.B. Katti (1997), “β – D – 3’ –

G

Đ

Deoxyadenosine (Cordycepin), Acta Cryst., C53, pp, 1694 – 1696.

Ư

N

15. Nicholas M. Kredich and Armand J. Guarino (1960), “An improved method

ẦN

H

of isolation and determination of cordycepin”, Biochim. Biophy. Acta, 41,

TR

pp. 361 – 363.

00

B

16. Hemanth Kumar and M. Spandana (2013), “Simultaneous Extraction,

10

determination and anaylysis of Adenosine, Cordycepin and other

Ó
A

derivatives of Cordyceps sinensis of Nepal by new validated HPLC

-L
Í-

H

method”, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 2 (4), pp. 43 –
45.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

17. Hong Jue Lee et al (2012), “The nucleoside antagonist cordycepin causes
DNA double strand breaks in breast cancer cells”, Invest New Drugs, 20,
pp. 1917 – 1925.
18. Seul Gi Lee, Sun – Hee Hyun, Gi – Ho Sung and Hyung – Kyoon Choi
(2014), “Simple and rapid determination of Cordycepin in Cordyceps
militaris Fruiting Bodies by Quantitative Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy”, Analytical Letters, 47, pp. 1031 – 1042.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

19. Jiamin Li, Minyi Guan and Yi Li (2015), “Effects of cooking on the
contents of adenosine and cordycepin in Cordyceps militaris”, Procedia

Đ

20. Yuanhong Liao et al (2015), “Cordycepin induces cell cycle arrest and

ỊN

H

Engineering, 102, pp. 485 – 491.


N

H

apoptosis by inducing DNA damage and up – regulation of p53 in

H

Leukemia cells”, Cell Cycle, 14, pp. 761 – 771.

TỈ
N

21. King – Wah Ma, Foo – Tim Chau, Jian – Yong Wu (2004), “Analysis of

Ơ

N

the Nucleoside Content of Cordyceps sinensis Using the Stepwise

N

H

Gradient Elution Technique of Thin – Layer Chromatography”, Chinese

.Q
U

Y

Journal of Chemistry, 22, pp. 85 – 91.

TP

22. Li Ma, Song Zhang and Mei Du (2015), “Cordycein from Cordyceps

ẠO

militaris prevents hyperglycemia in alloxan – induced diabetic mice”,

G

Đ

Nutrition research, 35, pp. 431 – 439.

Ư

N

23. K.J. Patel, R.S. Ingalhalli (2013), “Cordyceps militaris (L.:Fr.) Link – An

ẦN

H

Important Medicinal Mushroom”, Journal of Pharmacognosy and

TR

Phytochemistry, Vol. 2, Issue 1, pp. 315 – 319.

00

B

24. Yerra Koteswara Rao, Chia – Hsien Chou, Yew – Min Tzeng (2006), “A

10

simple and rapid method for identification and determination of

Ó
A

cordycepin in Cordyceps militaris by capillary electrophoresis”, Analytica

-L
Í-

H

Chimica Acta, 566, pp. 253 – 258.
25. M.G. Shashidhar, P. Giridhar, K. Udaya Sankar, B. Mahohar (2013),

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

“Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement
– A review”, Journal of Functional foods, Vol. 5, Issue 3, pp. 1013 – 1030.

26. Jiang – Feng Song, Chun - Quan Liu, Da – Jing Li and Bang – Quan Jin
(2007), “ Optimization of cordycepin extraction from cultured Cordyceps
militaris by HPLC – DAD coupled with uniform design”, J. Chem.
Technol. Biotechnol, 82, pp. 1122 – 1126.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

27. Lucia Spicuzza, Giuseppe Di Maria, Riccardo Polosa (2006), “Adenosine
in the airways: Implications and applications”, European Journal of

Đ

28. Yung – Jen Tsai, Lie – Chwen Lin and Tung – Hu Tsai (2010),

ỊN

H

Pharmacology, 533, pp. 77 – 88.


N

H

“Pharmacokinetics of Adenosine and Cordycepin, a Bioactive Constituent

H

of Cordyceps sinensis in Rat”, J. Agric. Food Chem., 58, pp. 4638 – 4643.

TỈ
N

29. Oyvind Stensrud, Nigel L. Hywel – Jones and Trond Schumacher (2005),

Ơ

N

“Toward a phylogenetic classification of Cordyceps: ITS nrDNA

N

H

sequence data confirm divergent lineages and paraphyly”, Mycol. Res.,

.Q
U

Y

109(1), pp. 41 – 56.

TP

30. Gi – Ho Sung et al (2007), “Phylogenetic classification of Cordyceps and

ẠO

the clavicipitaceous fungi”, Study in Mycology, 57, pp. 5 – 59.

G

Đ

31. The Pharmacopoeia of the people’s republic of China (2010), pp. 129.

Ư

N

32. Hardeep S. Tuli, S.S. Sandlu, Dharambir Kashap and Anil K. Sharma

ẦN

H

(2014), “Optimization of extraction conditions and antimicrobial potential

TR

of a bioactive metabolite, cordycepin from Cordyceps militaris 3936”,

00

B

World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical sciences, Vol. 3, Issue

10

4, pp. 1525 – 1535.

Ó
A

33. Hardeep S. Tuli, Anil K. Sharma, Sardul S. Sandhu, Dharambir Kashyap

-L
Í-

H

(2013), “Cordycepin: A bioactive metabolite with therapeutic potential”,
Life Sciences, 93, pp. 863 – 869.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

34. Jian – Wei Xie, Lan – Fang Huang, Wei Hu, Yun – Biao He and Kin Ping
Wong (2010), Molecules, 15, pp. 305 – 314.

35. Li Yu et al (2006), “Quality evaluation of Cordyceps through simultaneous
determination of eleven nucleosides and bases by RP – HPLC”, J. Sep.
Sci., 29, pp. 953 – 958.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

36. Jian – Ping Yuan, Shu – Yan Zhao, Jiang – Hai Wang, Hui – Cong Kuang
and Xin Liu (2008), “Distribution of Nucleosides and Nucleobases in

Đ

37. Xuanwei Zhou, Zhenghua Gong, Ying Su, Juan Lin and Kexuan Tang

ỊN

H

Edible Fungi”, J. Agric. Food Chem, 56, pp. 809 – 815.


N

H

(2009), “Cordyceps fungi: natural products, pharmacological functions

H

and developmental products”, Journal of Pharmacy and Pharmacology,

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

61, pp. 279 – 291.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A: MỘT SỐ HÌNH ẢNH VỀ ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO VÀ
THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA ĐTHT

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

Hình A.1. Hình ảnh của một số loài ĐTHT: a: C. gracilis; b: C. ishikariensis;
c: C. liangshanensis; d: C. martialis; e: C. militaris; f: C. nutans; g: C.
pruinosa; h: C. sinensis; i: C. sphecocephala; j: C. tricentri

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Hình A.2. Hình ảnh một số sản phẩm TPCN chứa ĐTHT.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

ỊN
Đ

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Phụ lục B1: Tiêu chí đánh giá độ lặp lại
Bảng C1.1. Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo
AOAC)
TT Hàm lượng %
Tỷ lệ chất
Đơn vị
RSD (%)
1
100
1
100
1,3
-1
2
10
10
10
1,8
-2
3
1
10
1
2,7
-3
4
0,1
10
0,1
3,7
-4
5
0,01
10
100
5,3
-5
6
0,001
10
10
7,3
-6
7
0,0001
10
1
11
-7
8
0,00001
10
100
15
-8
9
0,000001
10
10
21
-9
10 0,0000001
10
1
30

H

PHỤ LỤC B: TIÊU CHÍ ĐÁNH GIÁ

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

Phụ lục B2: Tiêu chí đánh giá độ thu hồi
Bảng C2.1. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
TT Hàm lượng
Tỷ lệ chất
Đơn vị
Độ thu hồi (%)
%
1
100
1
100%
98 – 102
-1
2
≥10
10
10%
98 – 102
-2
3
≥1
10
1%
97 – 103
-3
4
≥0,1
10
0,1%
95 – 105
-4
5
0,01
10
100ppm
90 – 107
-5
6
0,001
10
10ppm
80 - 110
-6
7
0,0001
10
1ppm
80 - 110
-7
8
0,00001
10
100ppb
80 - 110
-8
9
0,000001
10
10ppb
60 - 115
-9
10
0,0000001
10
1ppb
40 - 120

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

PHỤ LUC D. MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Mẫu R3

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Mẫu R4

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Mẫu R5

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Mẫu R6

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Mẫu L3

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Mẫu L4

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Mẫu L5

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Mẫu L6

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

PHỤ LỤC D. HÌNH ẢNH CHỒNG PHỔ PIC ADENOSIN,
CORDYCEPIN MỘT SỐ MẪU THỬ

Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu R5.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L3.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu R6.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L5.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L6.

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

Chồng phổ adenosin (trái), cordycepin (phải) mẫu L4.

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

PHỤ LỤC E: CHỨNG CHỈ PHÂN TÍCH CHUẨN

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Chuẩn adenosin

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

D

IỄ

N

Đ

ÀN

TO

ÁN

-L
Í-

H

Ó
A

10

00

B

TR

ẦN

H

Ư

N

G

Đ

ẠO

TP

.Q
U

Y

N

H

Ơ

N

TỈ
N

H


N

H

Đ

ỊN

H

Chuẩn cordycepin

Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COM