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TEMA 8 LOCALIZACIÓN DE ANTÍGENOS

1) TISSUE PRINTING

Aprovechando que hay membranas que absorben proteínas, usamos esta característica
para hacer una impresión de un tejido consistente.
A) Tallo de un vegetal hacemos un corte y ese corte lo puedo imprimir sobre el papel.
B) Hacemos una réplica sobre el papel, una vez realizada la impresión dejamos secar y las
proteínas se quedan en el papel, ese papel lo puedo tratar, primero saturamos con unas
proteína inespecífica incubamos con el primario luego con el secundario y puedo
localizar proteínas y saber en qué estadio del desarrollo se expresa esa proteína.

Se puede hacer con tejidos animales, podemos saber en qué zona anatómica está
expresándose la proteína, también en patógenos para seguir como avanza la
patogénesis.

fijar. A veces los Ab no reconocen a los Ag después de los tratamientos histológicos a los que sometemos las muestras después de esos cortes finos.mo) con la reacción Ab-Ag y después detectar la marca (reacción bioquímica) además de enzimas se pueden utilizar fluoróforos o metales. vamos a utilizar 3 tipos de técnicas. En los casos en los que se pueda se deberá evitar la fijación. el indirecto amplifica la señal. debemos marcar el Ab para poderlo detectar. Los sustratos son de 3 tipos: cromogénicos. Se localizan por la reacción con su Ab correspondiente. fluorescentes. . luminiscentes. la inmunológica y la bioquímica para localizar un determinado Ag en un corte histológico y vamos a ver dónde se expresa o dónde están localizados.Lo más habitual son las técnicas de inmunohistoquímica. cuando queremos aumentar la sensibilidad y hay muy poco ag . Se mezcla la histología (inclusión. las histológicas. debemos amplificar al máximo porque hay muy poca señal y por eso usamos los indirectos. Muchas veces los protocolos histoquímicos llevan un paso de fijación pero se debe saber que las fijaciones son muy invasivas para los Ags. Es crucial tener en cuenta como son las fijaciones y es mejor usar la congelación. Los marcajes enzimáticos: normalmente son indirectos (ab secundario marcado con una enzima) cuando es directo se marca con enzima el ab primario.

la peroxidasa de rábano es la enzima que más se utiliza. en presencia del sustrato adecuado. Debemos tener en cuenta el precipitado del producto de la reacción para elegir un tinte y que se haga un buen contraste. es muy importante al principio bloquear para aumentar la especificidad con proteínas específicas de forma que el Ab no se pegue de manera inespecífica y busque el Ag. en la que el complejo inmune formado se mide por una reacción colorimétrica catalizada por una enzima acoplada químicamente a uno de los reactivos. Tabla de diferentes sustratos cromogénicos. . Muchas veces nos dan KITs en los protocolos. Muchos tejidos los debemos teñir y debemos tener en cuenta si el producto de reacción lleva asociado un color.Revelan la presencia de Ag o Ac mediante una reacción Ag-Ac específica. lo que tienen son sustratos comerciales.

Cuando utilicemos los Ab 2 estos al tener 2 brazos por un lado m reconocen al primario q tengo contra el Ag y el otro al primario asociado a la peroxidasa. lo normal es hacer un marcaje indirecto a veces debemos hacer un tercer paso que es amplificar la señal. la avidina hace de puente entre esas moléculas biotinilados. Biotinizamos los ab secundarios y usamos Avidina que tiene el enzima. . Otros métodos: Biotina/avidina en rojo los Ab primarios en gris los secundarios que son usados para amplificar. Si le añadimos plata hacemos que los precipitados se vean muy bien (aumentan la sensibilidad de la detección) otro sistema es tener Ab contra el enzima que vamos a utilizar. Para visualizar mejor muchas veces se adicionan metales. utilizando ab secundarios y el sistema este puedo conseguir un montón de ab-enzima unido covalentemente a la avidina Sistema ABC: El complejo abc es aquel en el que la avidina forma una red entre el enzima biotinilado y los ab biotinilados. Si pueden ser Ab hechos en el mismo organismo que tenga el Ab primario.Un problema es la baja cantidad de Ag que tenemos y con ello problema de amplificación.

Se utiliza mucho microscopia confocal que permite eliminar el ruido de la fluorescencia no enfocada. Se puede hacer la técnica de sándwich y se consigue ampliar la señal cuando hacemos los test indirectos. Los fluoróforos que más se utilizan: los Alexa fluor y FITC lo importante es que los espectros no sean solapantes.Uso de fluoróforos marcando los ab. . Si es directa IF y si es indirecta IFI y marcamos un ab2. fotobleaching se deben tener ciertas precauciones. se usa en inmunofluorescencia .

Debemos tener otro marcador que reconozca el otro tipo de célula y marcar con otro fluoróforo distinto. en técnicas de localización nos piden que tengamos los controles con sueros preinmunes porque nos puede dar ruido de fondo. Para tintar usamos dapi que me sirve para orientarme en el tejido y saber donde esta localizado mi proteína. . Tengo un fluoróforo asociado a un ab contra una carboxilasa que es específica de un tipo celular.Nos permite distinguir las células beta y alfa pancreáticas. Debemos solapar esas imágenes y ver si realmente se ha marcado en el sitio de interés . este control negativo me debe servir para ver como es la fluorescencia base. tengo que tener un marcador específico de cada una de las células. Estos marcajes multiples permiten hacer cosas como vienen ahí. Es muy importante tener los controles negativos y los positivos y ver una diferencia clara.

Citometro de flujo: las poblaciones celulares se pueden distinguir porque expresan diferentes marcadores. Podremos recoger y separar las células según la marca que llevan. pruebas de autoinmunidad. Con una población celular podemos añadir ab marcador con distintos fluoroforos y cada uno de ellos me reconocen un marcador celular. FACs separación de las células asociadas. estos tienen unos imanes que lo que hace es que según la fluorescencia de esta celula se va a desviar.Análisis reciente de la parte inmunológica.. desvia las células según la fluorescencia que llevan asociada. Las células quedaran marcadas cada una con un fluoroforo según lo que estén expresando. . Nos permite el citometro pasar las células de una en una para que las células se alineen de una en una y nos permite determinar los fluoroforos y nos dara un resultado de las poblaciones celulares para saber que tipos tengo. Podemos tener anticuerpos antiCD3.

La distancia si importa. Se utiliza tradicionalmente oro coloidal. Un nanoab debemos reducir al máximo el tamaño. se dividen en transmisión y barrido.Conjugación con metales que se utilizan para microoscopia electrónica. son sales de oro que al reducirla forma unos coloides. en el barrido es en la superficie. el hierro es denso al paso de electrones y acumula un atomo de hierro en su interior y nos permite verlo al microscopio. hay diferentes tipos de microoscopios electrónicos. en mo electrónica a veces lo que se utilizan son fragmentos de ab. según el que sea deben ser cortes ultrafinos. Se deben conjugar los ab en una proteína que almacena hierro que se llama ferritina. . queremos saber exactamente donde en una celula en un determinado orgánulo se determina un ag.

Podemos seguir el procesado de un determinado ag con una forma no procesada que lleva un tamaño de oro diferente en el mismo corte .Como unir el oro a los ab se hace de manera covalente.

Solución: recuperación de la antigenicidad y hay dos tipos de técnicas: enzimática: las proteasas que rompen las uniones covalentes y dejan los determinantes ag otra vez expuestos Técnicas químicas: calentar y usar unos tampones adecuados haciendo que se recupere esta actividad antigénica .Puentes de metileno y tb entrecruzamientos de aldehídos entre las proteinas y esto impiden q los ab puedan actuar con los ag. se llama enmascaramiento.