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Prctica 5

Preservacin de Cepas
y Mtodos de Cultivos.
Objetivo
Que el alumno se familiarice con las tcnicas de transferencia de
cultivos, el instrumental microbiolgico y las formas comunes de
preservacin de cepas.

Introduccin
Los microorganismos como todo sistema biolgico tiene un ciclo de vida limitado por lo que cuando las condiciones
ambientales se muestran adversas mueren o en algunos casos generan estructuras de resistencia para pasar a un estado
latente (ej. esporas). Cuando no es posible mantener los cultivos microbianos en las condiciones optimas para su
crecimiento es momento de considerar las tcnicas para la preservacin de estos. La conservacin de cepas se divide
comunmente en 3 tipos, a corto plazo, cuando el periodo a preservar es de dias o semanas, a mediano plazo, de semanas
a meses, y , a largo plazo, de meses y aos.
Dentro del material comn para manipular a los microorganismos se encuentran las agujas y asas inoculadoras que son
usadas para transferir microorganismos aspticamente de un medio de cultivo a otro. Ambos (agujas y asas) pueden
consistir de un mango, tallo y ensamble, los cuales sostienen un alambre que puede ser de nquel-cromo o platino. Si el
alambre esta derecho (o recto) es una aguja inoculante; y si esta en forma de doblada es un asa inoculante. Antes de
cualquier uso el extremo del alambre debe esterilizado pasando lentamente a travs de la punta de la flama de un mechero
Bunsen. Se esteriliza correctamente el alambre cuando este cambia a color rojo por efecto del calor. Despus de cada uso
de la aguja o asa inoculante debe ser completamente esterilizado en la flama, los microorganismos son transferidos desde
un medio de cultivo a otro por sub-cultivo, usando procedimientos especficos y tcnicas aspticas.
Despus de que ha habido crecimiento del microorganismo que se desea preservar en agar en tubo inclinado, la superficie
interna del tubo es cubierta aspticamente con el aceite estril. La superficie del aceite mineral puede ser de 0.5 a 1.0 cm.
de espesor sobre el agar. El tubo cubierto de aceite puede ser almacenado a temperatura ambiente.Varios gneros puede
ser almacenados por de esta manera (por ejemplo: Bacillus, Proteus, Pseudomonas, y Streptococcus) aunque hay otros que
no (por ejemplo: Azotobacter y Leuconostoc).

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Prctica 5
Preservacin de Cepas
y Mtodos de Cultivos

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Mtodo
1. Tcnica asptica para siembra

A. Usando un plumn o (marcador de cera), marque los tubos o placas que van a ser inoculados con fecha, nombre
del alumno y el nombre del microorganismo.
B. Mezcle suavemente el tubo del cultivo primario para suspender homogneamente en todo el tubo a las bacterias.
El tubo puede estar tapado para usar el vortex y suspender a los microorganismos.

En otros casos hay gneros que no necesitan aceite mineral para lograr periodos largos de mantenimiento. Como E. coli y otros
miembros de la familia de Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa pueden ser satisfactoriamente almacenados por aos a temperatura ambiente. Aunque el mejor de los modos para preservar muchos cultivos puros de microorganismos por periodos largos es por
liofilizacin (secado en fri). Este mtodo elimina la necesidad de transferir peridicamente y reduce la posibilidad de que ocurran
mutaciones en los cultivos puros. En la liofilizacin, las bacterias son suspendidas en una solucin estril de algn medio protector como:
leche, suero, o lactosa al 3%. Pequeas cantidades de la suspensin espesa son transferidas a viales y rpidamente enfriadas en una mezcla
de hielo-seco/ alcohol. La suspensin enfriada es secada al vaci mientras aun se enfra en el vial sellado. Este sello diseca (o deshidrata)
al cultivo y a menudo puede ser almacenado por aos.

C. Colocar el tubo de cultivo puro (tubo con cultivo stock) y el tubo a donde va a ser inoculado (tubo con medio
nuevo) en la palma de la mano y afianzar con el dedo pulgar. Los tubos son separados en forma de V en la mano;
esto puede ser sostenido en un ngulo que al abrirlos no estn en posicin vertical y expuestos directamente a
corrientes contaminantes de aire del laboratorio.
D. Usando la otra mano pase por la flama del mechero la punta del asa inoculadora hasta que el asa cambie a color
rojo.
E. Usando la misma mano que est sosteniendo el asa remueva las tapas de los tubos, sostenindolas entre sus
dedos y suavemente flamee la boca (o cuello) de los tubos. Nunca caliente los tubos hasta que sea doloroso
sostenerlos.
F. Enfri el asa en el agar del tubo que va a ser inoculado y squela. Con el asa estril transfiera una gota del tubo
con el cultivo puro al interior del tubo nuevo. En este punto uno puede transferir la muestra de cultivo puro a un
portaobjetos (6a), a la superficie de agar de un tubo inclinado (6b) o una caja petri (6c).

Materiales y Equipos

G. Flamee nuevamente la boca de los tubos.


H. Tape los tubos
I. Flamee otra vez la punta del asa inoculante.

Asa inoculadora
Aguja inoculadora
Mechero Bunsen
Cultivos de 24 horas de caldo nutritivo
y tubo inclinado con agar nutritivo de E. Coli.
Tubos inclinados con agar Nutritivo
Tubos hondo con agar Nutritivo
Marcador o crayn de cera
Incubadora

y a menudo puede ser almacenado por aos.

Figura 2.- Tcnica asptica para resiembra de bacterias.

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Cuestionario

2. Usando la tcnica aseptica realice:

1. Cul es el propsito del flameo en la tcnica asptica?


A. Con el asa, transfiera a E. coli del cultivo en caldo Nutritivo a un tubo inclinado con agar Nutritivo y un tubo con caldo
Nutritivo.

2. Cul es el propsito del subcultivo?


3. En el subcultivo Cundo se usa el asa inoculadora?
4. Cmo es posible la contaminacin de un subcultivo?

B. Con la aguja inoculadora transfiera E. coli a un tubo hondo con agar Nutritivo. Esto se hace sumergiendo la aguja con
el inoculo dentro del tubo sin tocar las paredes de este. Penetrando el medio a 2/3 partes del fondo y la aguja es retirada
del tubo (figura 3 a, b y c).
C. Usando el asa hacer una transferencia de tubo a tubo inclinado. Esto se hace rayando suavemente la superficie del

Referencias
1.Harley, J., Prescott, L. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology. McGrawHill . 5th Edition. EUA.

tubo inclinado en forma de serpiente parecido a una S (figura 3d).

2.Madigan, M.T., Martinko, J.M. y Parker, J. Brock, Biologa de los microorganismos. 10 edicin. Prentice Hall. USA.
D. Colocar los tubos en una gradilla e incubarlos a 35 C por 24 a 48 horas. Despus de este tiempo examinar todos

3.Prescott, H. K. Microbiologa. 4. Edicin. McGraw Hill.

los tubos para ver la presencia de crecimiento bacteriano. El crecimiento es indicado por la turbidez en el cultivo del

Schiegel, G. Microbiologa General. Editorial Omega. Espaa.

caldo; en el cultivo de tubo inclinado por la apariencia de un color de naranja a rojo; y solo se aprecia una lnea de
inoculacin en el tubo hondo.

3. Reporte

Tipo de cultivo

Crecimiento

Contaminacin

Agar hondo de Nutritivo


Tubo inclinado con agar
Nutritivo
Caldo de Nutritivo

Figura 3.- Tcnica de transferencia