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DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA APLICADA

Prof Zilma G. Nunes

INVESTIGAO DA ATIVIDADE METABLICA DE BACTRIAS


PROVAS BIOQUMICAS
MEIOS DE TRIAGEM
Os meios TSI (triple sugar iron), Kliger, CV (Costa e Vernin), SV (Surraco e V. Pereira), Rugai ou IAL (Instituto
Adolfo Lutz) entre outros, oferecem concomitantemente vrias informaes de natureza bioqumica, permitindo
estabelecer um diagnstico presuntivo imediato.
- MEIO DE TSI
O TSI ou trplice acar e ferro um meio slido para ser usado em tubos de ensaio 13 X100mm, envasado de tal
modo que apresenta uma base e uma inclinao. constitudo de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose
(1,0%), peptonas, aminocidos (incluindo sulfurados), tiossulfato de sdio e citrato frrico amoniacal (indicador da
produo de H2S), com pH neutro e um indicador de pH, o vermelho de fenol.
O meio semeado com agulha por picada na base e estrias na superfcie. Aps o crescimento da bactria podese observar os seguintes resultados:
- Ausncia de fermentao de qualquer dos acares, ficando o meio inalterado, ou at mesmo utiliza os
aminocidos com produo de aminas que alcalinizam o meio.
- Fermentao somente a glicose, de modo que os cidos formados mudam o pH do meio apenas na base,
que se torna amarela e a inclinao vermelha por utilizao dos aminocidos (por respirao), alcalinizando-a e
neutralizando a pequena quantidade de cidos, pois a concentrao de glicose baixa - assim o resultado
expresso como K/A (inclinao alcalina e base cida);
- Fermentao a lactose ou a sacarose com viragem do indicador de todo o meio para amarelo, tanto a base
como a inclinao permanecem cidas, pois os lcalis produzidos na inclinao so facilmente neutralizados pela
grande quantidade de cidos produzidos na base, tendo em vista que a concentrao desses acares dez
vezes maior que a da glicose - o resultado expresso como A/A (inclinao e base cidas).
Nos dois ltimos casos, existe a possibilidade de detectar gases resultantes da degradao do cido frmico em
hidrognio e anidrido carbnico, se a bactria possuir o sistema hidrognio frmico liase (os gases so indicados
ou visualizados indiretamente por levantar ou fragmentar o meio) o resultado representado como A/A com gs.
H tambm a possibilidade da bactria produzir H2S por utilizar anaerobiamente o tiossulfato, captando eltrons
atravs da tiossulfato redutase, resultando em gs sulfdrico e sulfito. O sulfeto de hidrognio na presena de sais
de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado negro insolvel - dessa forma o resultado dado
como A/A com gs e H2S.
Desse modo, pode-se observar num nico meio os processos fermentativos, respirao aerbia e anaerbia. A
utilizao dos acares e aminocidos na inclinao se d apenas por respirao aerbia, enquanto que na base
os processos so realizados por fermentao (incluindo tambm putrefao, quando da utilizao dos
aminocidos bsicos, sulfurados, triptofano, com produo de gs sulfdrico, mercaptanas, aminas, dentre outras).
J a utilizao do tiossulfato ocorre por respirao anaerbia, gerando tambm gs sulfdrico.
Este meio , geralmente, usado para diferenciar os gneros das Enterobacteriaceae e para distinguir esta famlia
de outros bastonetes Gram negativo de origem intestinal.
Tanto o meio agar TSI (triple sugar iron) como o agar Kligler Iron contm glicose em pequena concentrao
(0,1%), lactose em concentrao superior (1%), o indicador de pH, vermelho de fenol, para detectar a produo de
cidos resultantes da fermentao dos hidratos de carbono, tiossulfato de sdio, substrato para a produo de
H2S, e sulfato de ferro para a deteco desse produto final. A diferena entre estes dois meios diferenciais que o
TSI possui mais um acar, a sacarose, em concentrao igual da lactose (1%).
Ambos os meios so inoculados por picada, na base e por estria, na rampa. essencial que as culturas sejam
observadas aps 18 a 24 h de incubao para evitar que os hidratos de carbono sejam completamente utilizados
e que ocorra degradao das peptonas, formando produtos finais alcalinos. na rampa que se faz a leitura da
lactose e da sacarose, no fundo do cilindro a da glicose e no meio do cilindro a de H2S.

- Rampa alcalina (vermelha) e base cida (amarela):


S a glicose foi fermentada. Os microrganismos degradam, preferencialmente, a glicose em primeiro lugar, mas
como este substrato est presente em concentrao mnima, a quantidade de cido produzida limitada e
rapidamente oxidada na superfcie da rampa. Por outro lado, as peptonas do meio so tambm usadas na
produo de substncias alcalinas. No cilindro, a reao cida mantida devido tenso reduzida do oxignio e
ao crescimento mais lento dos microrganismos. O indicador, vermelho de fenol, muda para amarelo devido
persistncia da formao de cido no cilindro.
- Rampa cida (amarela) e base cida (amarelo):
Ocorreu a fermentao da lactose e/ou da sacarose, aps a utilizao total da glicose. Como as duas primeiras
substncias esto presentes em altas concentraes so substratos para a atividade fermentativa contnua com
manuteno da reao cida (cor amarela) em todo o meio (rampa e base).
Produo de gs:
Nota-se a ocorrncia de fraturas no meio de cultura. Quando ocorre em grande quantidade pode levantar o meio
do fundo do tubo.
Produo de H2S:
Ocorre enegrecimento, principalmente na zona intermdia do cilindro. Isto deve-se ao facto do microrganismo em
estudo ser capaz de produzir sulfureto de hidrognio (H2S), que se conjuga com um composto de ferro existente
no meio, dando origem a sulfureto de ferro que, sendo insolvel, precipita.
- Rampa alcalina (vermelha) e base alcalina (vermelho) e/ou inalterado (tijolo):
No ocorreu fermentao dos hidratos de carbono presentes no meio, nem produo de gs ou de H2S. As
peptonas do meio podem ser catabolizadas sob condies anaerbias e/ou aerbias, resultando num pH alcalino
devido produo de amnia. Se s ocorrer degradao aerbia das peptonas, a reao alcalina s
evidenciada na superfcie da rampa. Se houver degradao aerbia e anaerbia das peptonas, a reao alcalina
visvel em todo o meio.

Interpretao dos possveis resultados do meio TSI:


PICE
Vermelho
Vermelho
Amarelo
Amarelo
Amarelo

BASE
Vermelho
Vermelho
Vermelho
Amarelo
Amarelo

H2S
Neg
Neg
Neg
Neg
Pos

GS
Neg
Neg
Neg
V
V

Pos.: positivo; Neg.: negativo; V.: varivel.

Interpretao mais provvel


Sem crescimento: bactria exigente
Crescimento na superfcie: no fermentador ou Gram +
Crescimento na superfcie: Gram + ou no semeadura da base
Enterobactrias ou Aeromonas Lac neg
Salmonella, Proteus, Morganella, Providncia e Citrobacter

- MEIO IAL / RUGAI


Atualmente conhecido como IAL (Meio Instituto Adolfo Lutz) foi inicialmente proposto por Rugai & Arajo, em
1986, com a inteno de eliminar as falhas existentes nos meios similares at ento usados.
Em 1972, Pessoa & Silva, desenvolveram um meio que possibilitou a pesquisa da motilidade e da descarboxilao
da lisina, concomitantemente com as reaes obtidas no meio clssico de Rugai & Arajo.
Este meio utilizado para identificar as principais espcies de Enterobactrias, Vbrios e Aeromonas, permitindo
em um s tubo a leitura, das seguintes reaes: motilidade da bactria indicado pela turvao da lisina na base,
lisina descarboxilase, fermentao da glicose em profundidade e da sacarose na superfcie do meio, produo de
gs sulfdrico (H2S), gs em glicose, utilizao do aminocido L-triptofano (desaminao), hidrlise da uria e no
tampo do tubo, um desenvolvimento de colorao avermelhada que indica a formao de indol.
O meio IAL constitudo por duas fases, superior e inferior, separadas por uma camada intermediria, chamada
vascar, de cerca de 2 mm (0,2 mL).
Nota - Vascar - Vaselina lquida ......... 90 mL
Cera de carnaba ...... 10 g
Inoculao: com o auxlio de uma agulha bacteriolgica, coletar a amostra da colnia a ser pesquisada e inocular
atravs de picada at o fundo do tubo, realizando estrias na superfcie do meio. Incubar em estufa a 37C por 24
horas.

Leitura do meio de IAL


Fase Superior
pice:
azul: sacarose negativa LTD negativo
amarelo: sacarose positiva LTD negativo
verde garrafa: sacarose negativa LTD positivo
castanho: sacarose positiva LTD positivo
Base:
amarelo: glicose positiva
azul: uria positiva
preto: H2S positivo
amarelo com bolhas : glicose e gs positivos
Fase Inferior:
violeta : lisina descarboxilase positiva
amarelo : lisina descarboxilase negativa
com turvao : motilidade positiva (mvel)
sem turvao : motilidade negativa se observa nitidamente o
crescimento

Teste de indol na rolha:


Aps a incubao pingar assepticamente, 2 3 gotas do reativo de
Kovacs na rolha do algodo hidrfilo.
Indol positivo: algodo fica rosa ou vermelho
Indol negativo: algodo permanece sem cor ou com colorao amarelo.

- PROVA DE FERMENTAO DE ACARES


Objetivo:
Determinar a capacidade de um microrganismo de utilizar um determinado acar, com produo de cido.
Base Bioqumica
Carboidratos: a) polissacardeos: amido e glicognio
b) dissacardeos: maltose, sacarose, lactose
c) monossacardeos: glicose, frutose
Duas vias metablicas: Oxidao ou Fermentao - sacardeo

enzima

cidos

Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base de Indicador
de Andrade. Pode-se utilizar o mesmo inculo para at 04 tubos ou mais
b) Incubar a 37C por 18-24h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Amarelo
Rosa

INTERPRETAO
Presena de cido
Ausncia de cido

- PROVA DE PRODUO DE GS A PARTIR DE ACARES


Objetivo:
Determinar a capacidade de um microrganismo fermentar a glicose incorporada a um meio base,
com a produo de gs ou sem a produo de gs.
Base Bioqumica
Na fermentao, substratos como hidratos de carbono e lcoois sofrem uma desassimilao
anaerbia, podendo ocorrer produo de compostos orgnicos cidos (cido frmico) que podem
ser degradados (formiases) gerando gases, como hidrognio e o CO2.
glicose

fermentao

cido frmico formiase

H2 + CO2

Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base de Indicador de Andrade, contendo tubo de
Durhan invertido.
b) Incubar a 37C por 18-24h.
Resultado e Interpretao
A produo de gs pode ser evidenciada em caldos pela formao de bolha no interior do tubo de Durham ou pela
presena de rachaduras, no caso dos meios slidos.
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO

INTERPRETAO

Amarelo sem bolhas


Amarelo com bolhas
Rosa

Presena de cido s/ gs
Presena de cido c/ gs
Ausncia de fementao

- PROVA DE VERMELHO DE METILA (VM)


Objetivo:
Determinar a habilidade de um microrganismo de produzir alta concentrao de cidos orgnicos relativamente
estveis a partir da fermentao da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampo existente no meio de
cultura sem, no entanto, metaboliz-los.
Base Bioqumica
Fermentao cida mista.
Glicose

fermentao

cido ltico
cido actico
cido frmico
cido etlico

H2CO2

Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio de Clark e Lubs
b) Incubar a 37C por 24h.
c) No momento da leitura, retirar 2,5mL do meio e acrecentar 0,5mL do indicador (vermelho de
metila em soluo alcolica a 60%)
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Vermelho
Amarelo

INTERPRETAO
Fermentao cida mista
Ph 6,0

- PROVA DE VOGES PROSKAUER (VP)


Objetivo:
Determinar a habilidade de um microrganismo de produzir acetona (acetilmetil carbinol), 2,3- butanediol ou diacetil
a partir da fermentao da glicose.
Base Bioqumica
Fermentao do tipo butilenogliclica, na qual a glicose fermentada a acetona.
A adio do reagente de Barritts (soluo 40% KOH e soluo de -naftol em etanol absoluto) permite detectar a
presena de acetilmetilcarbinol (acetona) que percursor da sntese de 2,3 butanediol, pois ocorre a formao de
um complexo rosa/vermelho que d essa cor ao meio de cultura. O desenvolvimento de uma cor rosa/vermelha na
cultura, 15 minutos aps a adio do reagente de Barritts representa uma prova positiva. A ausncia dessa cor
uma prova negativa. Este tipo de fermentao da glicose caracterstico do E.aerogenes.

Glicose

fermentao

acetona (+ -naftol + KOH 40% cor)

Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio de Clark e Lubs.
b) Incubar a 37C, por 02 a 05 dias.
c) No momento da leitura, acrescentar 0,6 mL (por mL de meio) de -naftol a 5%
d) Adicionar 0,2 mL (por mL de meio) de soluo de KOH em soluo alcolica a 40% e agitar
vigorosamente por aproximadamente 3 minutos. Depois de decorrido pelo menos 5 minutos,
verificar a colorao do caldo.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Vermelho
Amarelo

INTERPRETAO
pH 4,5
pH 6,0

- UTILIZAO DE FONTE DE NITROGNIO: descarboxilao da lisina e da ornitina; dehidrogenao da


arginina.
Objetivo:
Determinar a capacidade de um microrganismo de utilizar um determinado aminocido, atravs da
descarboxilao.
Base Bioqumica
A descarboxilao de aminocidos, como a lisina, resulta na produo de uma amina e de dixido de carbono. As
bactrias que produzem a enzima descarboxilase da lisina podem descarboxilar a lisina e usar as aminas como
percursoras para a sntese de outras molculas. Adicionalmente, quando certas bactrias fazem fermentao so
produzidos produtos cidos que tornam o meio cido e portanto hostil. Assim, muitas descarboxilases so
activadas por um pH baixo, pois ao remover os grupos cidos dos aminocidos produzem aminas que aumentam
o pH do meio que fica mais adequado.
A descarboxilao da lisina pode ser detectada semeando a bactria em um caldo (base de Moeller) contendo
esse aminocido, glicose e um indicador de pH (prpura de bromocresol).
As bactrias descarboxilam aminocidos mais ativamente em meio ligeiramente cido e em anaerobiose. Assim,
antes da incubao deve ser colocado leo mineral no caldo para impedir o oxignio de atingir as bactrias e inibir
a reaco. Os cidos produzidos pelas bactrias a partir da fermentao da glicose vo inicialmente baixar o pH
do meio e causar a mudana de cor do indicador de pH de prpura para amarelo. O pH cido ativa ento a enzima
que causa descarboxilao da lisina a aminas e a subsequente neutralizao do meio, que muda de amarelo para
prpura outra vez.
Protenas

a) Peptdeos
b) Aminocidos

Aminocidos

descarboxilase

amnia + CO2

Metodologia
a) Inocular a bactria no meio para descarboxilao de aminocidos com auxlio de
agulha de inoculao.
b) Acrescentar cerca de 0,5mL de leo mineral ao meio de cultura assepticamente. Caso
o meio j esteja com o leo mineral no momento da inoculao, cuidar para que a agulha
no emita aerossis contaminados ao ser flambada.
c) Incubar a 37 C por 24-48h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO

COR DO MEIO

Positivo

Roxo

Negativo

Amarelo

Controle (sem aminocido)

Amarelo

INTERPRETAO
Presena de amnia ou o microrganismo
no utiliza a glicose
Fermentao do acar sem utilizao do
aminocido. Ausncia de amnia
Fermentao do acar

- PROVA DE PRODUO DA UREASE


Objetivo:
Determinar a capacidade do microrganismo em degradar a uria, com formao de amnia.
Base Bioqumica
A urease uma enzima hidroltica que ataca a ligao entre o azoto e o carbono em compostos como a ureia,
formando o produto final alcalino, amnia, alm de CO2 e H2O.
uma prova importante para diferenciar espcies de Proteus de outras bactrias entricas lactose negativas.
A presena de urease detectada quando o microrganismo cresce num meio com ureia (meio de ureia de
Christensen) que contm tambm o indicador de pH vermelho de fenol. Quando a ureia desdobrada pela
urease, a amnia acumula-se no meio tornando-o alcalino.
Este aumento de pH faz com que o indicador de pH presente no meio (vermelho de fenol) passe de amarelo a
rosa, indicando uma reao positiva para a presena de urease. A ausncia da colorao rosa indica uma reao
negativa.
No entanto, basta que ocorra o aparecimento de uma zona do meio rosa para se considerar
a reao positiva; apenas os microrganismos que produzem precocemente urease tm
capacidade para modificar a cor de todo o meio para rosa forte.
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base.
b) Incubar a 37C por 24h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Rosa
Amarelo

INTERPRETAO
Presena de amnia
Ausncia de amnia

- PROVA DO INDOL
Objetivo:
Determinar a habilidade do microrganismo em produzir indol a partir do triptofano.
Base Bioqumica
Triptofano
triptofanase

indol + piruvato + amnia

Reativo de Kovacs

Indol + p-dimetilaminobenzaldeido
composto quinoidal vermelho
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de agulha de inoculao no meio SIM com o cuidado de no
chegar ao fundo do tubo (2/3 do meio)
b) Incubar a 37C, com papel de filtro embebido em Reativo de Kovac`s (pdimetilaminobenzaldeido) junto tampa do tubo ou acrescentar algumas gotas do reativo ao
meio aps o perodo de incubao.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Vermelho
Incolor

INTERPRETAO
Composto quinoidal
Ausncia do composto

A presena deste composto ocorre ao longo da linha de inoculao e indica que houve produo de sulfureto de
hidrognio (reaco positiva). A ausncia do precipitado negro evidencia uma reaco negativa.

- TESTE DE PRODUO DE CIDO SULFDRICO


Objetivo:
Determinar a habilidade do microrganismo em produzir acido sulfdrico, por degradao
sulfurados (cistena).

de aminocidos

Base Bioqumica
Muitas protenas so ricas em aminocidos sulfurados, como a cistena. Quando estas protenas esto presentes
no meio de cultura podem ser degradadas pelas enzimas microbianas a aminocidos que so utilizados como

nutrientes. A cistena, na presena da enzima cistena dessulfurase, perde o seu tomo de enxofre, que por sua
vez reduzido pela adio de hidrognio da gua para formar H2S. O H2S ento produzido pela hidrogenao
(reduo) do enxofre orgnico presente no aminocido cistena.
O meio de cultura agar SIM contm peptonas (a cistena um dos componentes) e tiossulfato de sdio como
substratos sulfurados, e sulfato ferroso amoniacal (Fe (NH4)2 SO4) que actua como indicador da presena de H2S.
Como o H2S incolor e, por conseguinte, no visvel. O sulfato ferroso amoniacal serve como indicador, pois o
ferro combina-se com o H2S formando sulfureto de ferro que um precipitado negro insolvel.
Por outro lado, o H2S pode ser produzido pela reduo de compostos sulfurados inorgnicos, como os tiossulfatos
(S2O32-), os sulfatos (SO42-) e os sulfitos (SO32-). Quando o meio contm tiossulfato de sdio alguns
microrganismos tm capacidade para o reduzir a sulfitos usando a enzima tiossulfato redutase, com libertao de
H2S. Os tomos de enxofre, ento, atuam como receptores de hidrognio durante a oxidao dos compostos
inorgnicos.
Cistena
ons frricos

cistena sulfidrilase

acido pirvico + cido sulfdrico + amnia + gs de cido sulfdrico

sulfeto

Metodologia
a) Inocular a cultura com auxlio de agulha de inoculao no meio SIM, com o cuidado
de no alcanar o fundo do meio de cultura (2/3 do meio).
b) Incubar a 37 C.
c) Observar se h crescimento bacteriano e a formao de precipitado negro.
Resultado e Interpretao
A formao de precipitado negro indica a presena de H2S no meio. Na ausncia de
H2S o meio permanece inalterado.
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Negro
Incolor

INTERPRETAO
Presena de H2S
Ausncia de H2S

- PROVA DE MOTILIDADE
Objetivo
Verificar se o microrganismo dotado de flagelos (mvel) ou no (imvel)
Base Bioqumica
A motilidade observada atravs do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semi-slido, o que
permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo caso a bactria possua flagelos. Se a
motilidade positiva o aspecto do meio ficar turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento s ser
observado na zona da picada. Fica mais fcil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma folha de papel
pautado, comparando o tubo inoculado com um tubo no inoculado.
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de ala de inoculao em meio base.
b) Incubar a 37C por 24h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

ASPECTO DO MEIO
Turvo
Inalterado

INTERPRETAO
Presena de flagelos
Ausncia de flagelos

- PROVA DA OXIDAO E FERMENTAO DA GLICOSE ( O\F)


Objetivo:
Determinar o tipo de metabolismo do microrganismo, se e oxidativo, fermentativo ou facultativo.
Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de agulha de inoculao em dois tubos contendo meio com verde de
bromocresol.
b) Cobrir um dos tubos com 1 mL de leo mineral estril.
c) Incubar a 36 C.

Resultado e Interpretao
RESULTADO
Oxidativo
Fermentativo

COR DO MEIO
Amarelo ou verde no tubo sem leo
Amarelo nos dois tubos

INTERPRETAO
Aerbio
Facultativo

- PROVA DO CITRATO
Objetivo:
Determinar a habilidade do microrganismo de utilizar o citrato como nica fonte de carbono (meio de citrato de
Simmons).
Base Bioqumica
Na ausncia de glicose ou lactose fermentveis, alguns microrganismos so capazes de usar o citrato como nica
fonte de carbono para produzir energia. Esta capacidade depende da presena de citrato permease que facilita o
transporte do citrato para o microrganismo. Uma vez dentro da clula o citrato degradado pela enzima citratase,
produzindo cido oxalactico e acetato. Estes produtos so depois convertidos enzimaticamente em cido pirvico
e CO2.
O meio de citrato de Simmons contm citrato de sdio como nica fonte de carbono, NH4+ como fonte de azoto e
o indicador de pH, azul de bromotimol. Esta prova feita com meio em rampa e sem base, uma vez que o O2
necessrio para a utilizao do citrato. Quando o microrganismo remove o citrato do meio e o oxida, ocorre
libertao de CO2. Durante esta reao o meio torna-se alcalino, pois o CO2 gerado combina-se com sdio
(fornecido pelo citrato de sdio) e gua para formar carbonato de sdio, que um produto alcalino. A presena de
carbonato de sdio faz aumentar o pH e virar o indicador de pH do meio de verde para azul forte.
Citrato +NH4 piruvato CO2 + Na + H2O Na2CO3 (pH alcalino)
Metodologia
a) Inocular a bactria, com auxlio de agulha de inoculao, em estrias na superfcie do agar
inclinado.
b) Incubar a 37C/24h.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Azul
Verde

INTERPRETAO
Utilizao do citrato
No houve utilizao do citrato

- PROVA DO MALONATO
Objetivo:
Verificar se a bactria utiliza malonato de sdio como nica fonte de carbono e sulfato de amnio como nica
fonte de nitrognio.
Base Bioqumica
O malonato liga-se competitivamente desidrogenase succnica, impedindo sua ao cataltica sobre o cido
succnico, com interrupo do ciclo de Krebs. Esta reao tira da bactria sua principal fonte de energia e impede
a formao de outros intermedirios necessrios ao metabolismo. A utilizao do sulfato de amnio produz
hidrxido de sdio, o qual alcaliniza o meio tornando-o azul. A mudana de cor verde para o azul propiciado pelo
aumento do pH, visualizado atravs da viragem do indicador azul de bromotimol do verde para o azul.
Metodologia
a) Inocular a bactria, com auxlio de ala de inoculao no caldo malonato.
b) Incubar a 37C/24h
c) Observar se houve crescimento bacteriano e a colorao do meio.
Resultado e Interpretao
A viragem da cor verde para o azul indica prova positiva para a utilizao do malonato. A
manuteno da cor
verde indica prova negativa para a utilizao do malonato.
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Azul
Verde

INTERPRETAO
Utilizao do malonato
No houve utilizao do malonato

- PROVA DO NITRATO
Objetivo: Verificar a capacidade de um microrganismo de reduzir o nitrato a nitrito.
Base Bioqumica
A reduo dos nitratos por alguns microrganismos aerbios ou anaerbios facultativos ocorre na ausncia de
oxignio. Nestes microrganismos a respirao anaerbia um processo oxidativo pelo que as clulas usam
substncias inorgnicas como os nitratos (NO3-) ou os sulfatos (SO42-) para fornecer oxignio que so
subsequentemente utilizados como aceitadores finais de eltrons durante a formao de energia. Nesse processo,
os nitratos so reduzidos a nitritos (NO2-).
Por outro lado, alguns desses microrganismos possuem capacidade enzimtica para atuarem sobre os nitritos
reduzindo-os a amnia (NH3+) ou a azoto molecular (N2). A capacidade de alguns microrganismos reduzirem os
nitratos pode ser usada na sua identificao.
Metodologia
a) Semear o microrganismo em um caldo nutritivo suplementado com 0,5% de nitrato de potssio (KNO 3) como
fonte de nitratos (caldo nitrato), com auxlio de ala bacterilogica.
b) Incubar a 37C/24h.
c) Proceder leitura dos resultados adicionando 0,5mL da soluo A (c. sulfanlico) e, a seguir, 0,5mL da
soluo B (-naftilamina). Os nitritos presentes no meio vo reagir com esses reagentes produzindo uma
mudana de cor imediata para vermelho.
Nota: se a cultura no mudar de cor existem duas possibilidades: o microrganismo possui enzimas que reduziram
os nitratos a nitritos e estes a amnia ou a azoto molecular ou os nitratos no foram reduzidos pelo
microrganismo.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DESENVOLVIDA
Vermelho a vinho
Inalterado*

INTERPRETAO
Reduz nitrato a nitrito
No reduz nitrato a nitrito

* - Para determinar se os nitratos foram ou no reduzidos a nitritos, adiciona-se uma pequena quantidade de zinco
em p cultura incolor que j contm os reagentes. Uma vez que o zinco reduz os nitratos a nitritos, o
aparecimento de uma cor vermelha aps a sua adio revela que os nitratos no foram reduzidos a nitritos pelo
microrganismo (reao negativa). Por outro lado, se a adio de zinco no produzir uma mudana de cor indica
que os nitratos j tinham sido reduzidos a nitritos e este a amnia ou a azoto (reao positiva).

- PROVA DE INIBIO PELO KCN


Objetivo:
Verificar se o microrganismo capaz de crescer em presena de 0,5% de KCN.
Base Bioqumica
O KCN inibe a cadeia respiratria por ligao aos citocromos, o que, por sua vez, inibe o crescimento microbiano.
No entanto, algumas bactrias so tolerantes ao KCN e por isso conseguem crescer em sua presena.
Metodologia
a) Inocular a cultura, com auxlio de uma agulha bacteriolgica, um tubo de gua peptonada com KCN.
b) Incubar a 37C/24h.
c) Observar se houve crescimento bacteriano.
Nota: O meio distribudo em tubos 13x 100mm 1mL por tubo.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

ASPECTO DO MEIO
Turvo
Inalterado

INTERPRETAO
Tolerante ao KCN
No tolerante ao KCN

- PROVA DA CITOCROMO-OXIDASE
Objetivo:
Determinar se um microrganismo possui a enzima citocromo oxidase.
Base Bioqumica
Este sistema enzimtico est relacionado com o citocromo c da cadeia respiratria de alguns microrganismos, que
oxidam o reagente dihidrocloreto de tetrametil-p-fenilenodiamina originando colorao prpura. Este reagente,
de cor rosa plido, age como um substrato artificial, fornecendo eltrons e, consequentemente, ficando oxidado e
tornando-se um composto escuro (prpura) na presena de oxidase e de oxignio livre.
Metodologia
a) Colocar uma ou duas gotas do reagente incolor dihidrocloreto tetrametil p-fenilenodiamina, recmpreparado e protegido da luz, em uma tira de papel de filtro.
b) Espalhar uma colnia do microrganismo (cultura de 18-24h) sobre a rea do papel de filtro contendo o
reagente, utilizando uma ala de platina, um basto de vidro ou palito de madeira.
c) Observar por at 60seg.

E. coli

e. C e.e. COLI

Pseudomonas
Vibrio

Resultado e Interpretao
A prova considerada positiva quando na mistura do reagente com a massa bacteriana desenvolve-se a cor
prpura em at 1 minuto e considerada negativa quando a colorao da massa bacteriana permanece com
colorao inalterada. A alterao da cor da cultura aps o perodo de tempo estipulado consequncia da
oxidao do reagente em contato com o ar.
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DESENVOLVIDA
Prpura
Inalterado

INTERPRETAO
Citocromo oxidase +
Citocromo oxidase -

As enterobactrias so oxidase negativas e podem ser diferenciadas de outras famlias de bastonetes Gram
negativos. Como a famlia Pseudomonadaceae e a famlia Vibrionaceae. A prova pode ser feita tambm em
culturas em meios slidos, adicionando-se o reagente oxalato de p-aminodimetilanilina. A reao inicia-se com o
desenvolvimento de cor rsea, marrom e finalmente uma colorao negra na superfcie das colnias, indicativa da
produo de citocromo-oxidase (teste positivo). O teste negativo se no ocorrer alterao da cor ou houver o
desenvolvimento de uma cor rsea plida.

- ATIVIDADE DA -GALACTOSIDASE (PROVA DA ONPG)


Objetivo
Verificar se microrganismos que se comportam como lactose-negativos produzem a enzima -galactosidase,
sendo deficientes apenas da permease.
Base Bioqumica
As enzimas essenciais ao metabolismo deste hidrato de carbono so a -galactosidase que hidrolisa a lactose, a
galactose e glicose e uma permease que transporta a lactose atravs da membrana celular, tornando-a disponvel
para -galactosidase intracelular. Algumas bactrias so deficientes na produo da permease e por isso
comportam-se com se fossem lactose negativas. Os verdadeiros no fermentadores da lactose no possuem a galactosidase.
Nesta prova, em vez de pesquisar simplesmente a fermentao da lactose, pesquisa-se a produo de galactosidase. Com este propsito, utiliza-se o substrato artificial ONPG (o-nitrofenil--D-galactopiranosdeo) no
lugar da lactose. Um nmero suficiente de molculas de beta-galactosidase pode difundir para fora das clulas
catalisando a hidrlise do ONPG, que d origem a galactose e o-nitrofenol, O ONPG incolor, mas o o-nitrofenol
originado na hidrlise, amarelo em soluo alcalina. O teste do ONGP muito mais sensvel que a prova de
fermentao da lactose convencional.
Metodologia
a)Num tubo de ensaio contendo gua destilada e um disco de ONPG, inocula-se a bactria,
aps esta ter sido semeada num meio com lactose;
b) Incubar a 37C.
c) Aps 20 minutos a 1 hora de incubao, verifica-se se ocorreu mudana de cor de incolor
para amarelo, caso contrrio a incubao deve continuar por at 24 horas.
Resultado e Interpretao
Se o tubo ficar amarelo a prova positiva para a atividade da -galactosidase. Se o tubo
ficar incolor a prova negativa para a atividade da -galactosidase.
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Amarelo
Incolor

INTERPRETAO
Presena de -galactosidase
Ausncia de -galactosidase

- PROVA DA FENILALANINA DESAMINASE


Objetivo
Verificar se as bactrias produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina.
Base Bioqumica
Quando a fenilalanina presente no meio desaminada, d origem ao cido fenilpirvico, que reage com o cloreto
frrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde.
No entanto, algumas bactrias podem usar os cidos orgnicos em reaes de biosntese, alm de eliminarem as
aminas formadas.
Metodologia
a) Inocular a bactria, com auxlio de ala de inoculao no caldo malonato.
b) Incubar a 37C/24h
c) Acrescentar algumas gotas da soluo de cloreto frrico a10%.
d) Observar se h surgimento de cor.
Resultado e Interpretao
Se o reagente e a superfcie do meio de cultura permanecerem inalterados o resultao da
prova negativo e se tomarem a colorao verde ou verde azulada o resultado positivo.
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Verde
Incolor

INTERPRETAO
Presena de cido fenilpirvico
Ausncia de cido fenilpirvico

- PROVA DA CATALASE
Objetivo:
Determinar se o microrganismo possui a enzima catalase
Base Bioqumica
A catalase uma enzima que decompe o perxido de hidrognio (H2O2) em gua e oxignio.
H2O2

catalase

2H2O + O2

Metodologia
a) Inocular a bactria com auxlio de agulha de inoculao em agar inclinado ou
em placa;
b) Incubar a 37C/24h;
c) Verter 0,1 mL (ou algumas gotas) de gua oxigenada sobre o crescimento
bacteriano e observar.
Nota: Este teste pode ser feito tambm colocando uma colnia em uma lmina e
adicionando-se uma gota de gua oxigenada.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

ASPECTO DO MEIO
Formao de bolhas
Ausncia de bem bolhas

INTERPRETAO
Catalase +
Ausncia de catalase

- PROVA DA COAGULASE
Objetivo
Verificar a capacidade de microrganismos coagularem o plasma meso em presena de anticoagulante.
Base Bioqumica
As coagulases so enzimas com capacidade para coagular o plasma sanguneo atravs de um mecanismo similar
ao da coagulao normal.
A atividade da coagulase utilizada para distinguir a espcie Staphylococcus
aureus das demais espcies do gnero. Pode ser feita de duas maneiras: em
lmina e em tubo. Na coagulase ligada ou conjugada, pesquisa-se a presena
da enzima que se encontra ligada parede celular bacteriana (no est presente
em filtrados de cultivos. Quando as clulas bacterianas so suspensas em plasma
(fibrinognio), formam-se cordes de fibrina entre elas, o que causa agrupamento
sob a forma de grumos visveis.
A coagulase livre uma substncia similar trombina (presente em filtrados de
cultivos). secretada extracelularmente e reage com uma substncia presente
no plasma denominado Fator de Reao com a Coagulase CRF, para formar um
complexo que, por sua vez, reage com fibrinognio que convertido em fibrina,
originando os cogulos.
Metodologia
- Prova da coagulase em tubo (coagulase livre):
a) Colocar 0,5mL de plasma (obtido de sangue de carneiro, cavalo ou coelho) em um tubo de ensaio pequeno (13
x 100mm);
b) Com auxlio de uma agulha bacteriolgica, suspender uma colnia da cultura em estudo em caldo BHI e colocar
em estufa 37C at que turve. Se necessrio, acertar a turbidez at o tubo 0,5 da escala de MacFarland;
c) Em um tubo de ensaio estril, colocar 0,5mL de plasma reconstitudo e 0,5 ml do caldo BHI com crescimento
bacteriano recm preparado;
d) Incubar em estufa 37C at que turve.
e) Verificar a formao de cogulos aps 2h, 4h, 6h e 24h de incubao pela inclinao do tubo em um ngulo de
quase 90. A formao de cogulo a qualquer momento encerra a prova, que considerada positiva. A ausncia
de coagulao aps 24 horas de incubao indicativa de uma prova negativa.

- Prova da coagulase em lmina (coagulase ligada):


a) Traar dois crculos com lpis de cera em uma lmina de vidro;
b) Colocar duas gotas de gua destilada ou soluo fisiolgica estril dentro de cada crculo;
c) Com auxlio de uma agulha bacteriolgica agregar uma colnia em estudo em cada crculo, homogeneizando
delicadamente;
d) Colocar uma gota de plasma para a prova de coagulase em um dos crculos;
e) Homogeneizar com auxlio da agulha bacteriolgica;
f) Inclinar a lmina delicadamente, para frente e para trs e observar se h a formao de grumos no crculo
onde foi adicionado o plasma, caracterizando uma reao positiva. A homogeneidade do lquido na lmina, sem a
formao de grumos, caracteriza a prova como negativa.
Nota: A ocorrncia de aglutinao no crculo onde foi colocado apenas o soro fisiolgico indica que a cepa em
estudo auto-aglutinante, o que invalida a prova.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Bolhas
Sem bolhas

INTERPRETAO
Catalase +
Ausncia de catalase

- PROVA DA DNAse:
Objetivo
usado para detectar a degradao do cido Desoxirribonucleico (DNA), contido no meio de cultura, por
bactrias que possuem uma enzima extracelular, a desoxirribonuclease,
Base Bioqumica
A enzima DNAse, que quebra o DNA em subunidades compostas de
nucleotdeos, produzida por muitas espcies de microrganismos.
Assim, esta prova muito til para diferenciaro gnero Serratia do
gnero Enterobacter; a espcie Staphylococcus aureus das espcies de
estafilococos coagulase
negativos
e Moraxella
catarrhalis de
espcies
de Neisseria. O DNA acrescentado ao meio de cultura e se no hidrolisado
precipitado por uma soluo de HCl a 0,1N, que torna o meio opaco. Quando o
DNA hidrolisado forma-se um halo translcido em torno da cultura.
Metodologia
a) Fazer uma estria ou uma macrocolnia na superfcie do agar DNAse co o
auxlio de uma ala bacteriolgica.
b) Incubar a 37C por 18 a 24h.
c) Derramar cerca de 1mL de HCl a 0,1N na superfcie do meio de cultura, fechar
e deixar descansar por cerca de 5min.
Resultado e Interpretao
A presena de zona clara em volta da colnia indica reao positiva. Caso no haja atividade dessa enzima o HCl
reagir com o cido nuclico intacto, formando um precipitado (meio opaco), o que indica a reao negativa.
RESULTADO
Positivo
Negativo

ASPECTO DO MEIO
Formao de halo translcido
Ausncia de halo translcido

INTERPRETAO
Presena de DNAse
Ausncia de DNAse

- PROVA DA HIDRLISE DO AMIDO


Objetivo:
Verificar se os microrganismos em estudo possuem a habilidade para hidrolisar o amido.
Base Bioqumica
O amido um polissacardeo de elevado peso molecular. Para ser transportado para o interior da clula e ser
utilizado, necessrio, primeiro, que ele seja quebrado em unidades menores (dextrinas, glicose e maltose), o que
depende da produo e secreo de vrias amilases.

Metodologia
a) Inocular a cultura em agar amido;
b) Incubar a 37C/24h;
c) Cobrir com uma soluo de iodo (3 a 4 mL por placa) e observar.
Resultado e Interpretao
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Halo translcido
Ausncia de halo

INTERPRETAO
Presena de amilase
Ausncia de amilase

O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro. Assim, o surgimento de uma zona clara em
torno do crescimento bacteriano aps a adio de iodo a um meio que contenha amido indica que a -amilase foi
produzida pela bactria. Se no ocorrer a formao de uma zona clara ao redor do crescimento bacteriano, o
amido no foi hidrolisado, indicando que a cultura em teste no produtora da -amilase.

Amilase negativa

Amilase positiva

- PROVA DA HIDRLISE DA GELATINA


Objetivo
Determinar a capacidade do microrganismo excretar uma enzima hidroltica extracelular capaz de degradar a
gelatina (gelatinase).
Base Bioqumica
A gelatina uma protena produzida pela hidrlise do colgeno, que abaixo dos 25C mantm as suas
propriedades de gel e slida, enquanto acima dos 25C lquida.
Determinados microrganismos tm capacidade de produzir gelatinase, que atua hidrolisando a gelatina em
aminocidos. Se a degradao ocorre no se consegue restaurar as caractersticas de gel da gelatina, mesmo a
baixas temperaturas (fica lquido).
A hidrlise da gelatina uma caracterstica importante na diferenciao dos microrganismos e pode tambm ser
usada para determinar a sua patogenicidade.
Metodologia
a) Inocular por picada um meio de cultura em tubo, suplementado com 12%
de gelatina;
b) Incubar a 37C durante 24 a 48 h;
c) Colocar a cultura a 4C durante 30 minutos ou num banho de gelo durante
3 a 5 minutos.
Resultado e Interpretao
Se a gelatina foi hidrolisada pela gelatinase, o meio mantm-se lquido aps
refrigerao (reao positiva). Se o microrganismo no possui gelatinase, o
meio resolidifica durante o perodo em que est no frigorfico (reao
negativa).
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Halo translcido
Ausncia de halo

INTERPRETAO
Presena de gelatinase
Ausncia de gelatinase

- PROVA DA HIDRLISE DA CASENA


Objetivo
Determinar a capacidade do microrganismo produzir e excretar uma enzima hidroltica capaz de degradar a
casena.
Base Bioqumica
A casena a mais importante protena do leite, sendo uma macromolcula, composta por aminocidos ligados
entre si por ligaes peptdicas, incapaz de penetrar na membrana celular dos microrganismos. Para que a
casena seja utilizada pelos microrganismos, tem de ser degradada em peptonas, polipeptdeos, dipeptdeos e
finalmente em aminocidos. Este processo quando os microrganismos produzem enzimas proteolticas
(proteases) que catalisam a hidrlise da casena em aminocidos, os quais so depois assimilados e
catabolizados pelas clulas.
Nesta prova utiliza-se o agar Milk (agar leite) para demonstrar a atividade hidroltica das proteases. O meio
composto por agar nutritivo suplementado com leite que contm a protena casena. Esta protena do leite uma
suspenso coloidal que d ao meio a sua cor e opacidade. Aps incubao deste meio, os microrganismos que
secretam proteases exibem uma zona de protelise, que aparece como uma rea translcida rodeando o
crescimento bacteriano.
Metodologia
a) Inocular por estrias na superfcie de uma placa de Petri contendo o agar leite;
b) Incubar a 35C durante 48h;
c) Observar se h a ocorrncia de uma zona clara em torno da cultura .
Resultado e Interpretao
A perda da opacidade do meio resultante de uma reao hidroltica com formao de aminocidos solveis e
no coloidais e representa uma reao positiva. Na ausncia de proteases, o meio que envolve o crescimento do
microrganismo mantm-se opaco (reao negativa).
RESULTADO
Positivo
Negativo

ASPECTO DO MEIO
Halo translcido em trono do
crescimento bacteriano
Ausncia de halo

INTERPRETAO
Atividade hidroltica da casena
Ausncia de atividade hiroltica

- PROVA DA HIDRLISE DO HIPURATO:


Objetivo:
Verificar a capacidade de microrganismos de hidrolisar o hipurato de sdio em seus componentes: glicina e cido
benzico.
Base Bioqumica
Os Streptococcus agalactiae (grupo B) so capazes de sintetizar a enzima hipuricase, que
hidrolisa o hipurato em glicina e cido benzoico.
Metodologia
a) Preparar solues de hipurato de sdio a 1% em gua destilada estril;
b) Distribuir 0,4mL em tubos 13x100mm com tampa de rosca e congelar a te o momento do
uso;
c) Emulsificar uma alada do crescimento da cultura em agar BHI sangue de carneiro;
d) Incubar em banho Maria por 2 horas a 37C.
e) Adicionar 0,2mL da soluo de nihidrina a 3,5% em uma mistura a 1:1 de acetona e
butanol e reincubar em banho Maria por 10min.
f) Verificar se h o desenvolvimento de uma colorao violeta escura.
Nota: a soluo de nihidrina deve ser conservada no escuro e temperatura ambiente.
Resultados e interpretao
O surgimento da colorao violeta escura indica reao positiva enquanto a permanncia da soluo como incolor
indica a reao negativa.
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Violeta escuro
Inalterado

INTERPRETAO
Presena de hipuricase
Ausncia de hipuricase

- PROVA DA BILE E ESCULINA


Objetivo
Verifica a capacidade de certas espcies de estreptococos de hidrolisar a esculina em presena de sais biliares.
Base Bioqumica
A esculina quimicamente um derivado da cumarina (6--glicosdeo-7-hidroxicumarina), que
pertence classe dos glicosdeos. A capacidade de hidrolisar a esculina, originando
escutelina, em presena de1 a 4% bile uma caracterstica de todos os estreptococos do
grupo D e do gnero enterococo. Nesta prova a escutelina reage com ons frricos presentes
no meio resultando em um precipitado escuro.
Metodologia
a) Inocular a cultura por estrias na superfcie e por picada no agar bile esculina com auxlio de
agulha bacteriolgica;
b) Incubar a 37C durante 1 a 4dias;
c) Observar diariamente se h a enegrecimento do meio. Se o meio permanecer inalterado ao
final de 4 dias finalizar a prova e consider-la como negativa.
A reao positiva quando observado um enegrecimento difuso na superfcie do gar ou,
em certos casos, um halo marrom ou negro ao redor das colnias.
RESULTADO
Positivo
Negativo

COR DO MEIO
Marrom a negro
Inalterado

INTERPRETAO
Presena de gelatinase
Ausncia de gelatinase

Provas Bioqumicas em Sistemas Miniaturizados


Para se proceder realizao de provas laboratoriais baseadas em diferenas nas actividades bioqumicas dos
microrganismos podem ser usados sistemas miniaturizados de multitestes (kits comerciais de provas
bioqumicas) que permitem identificar a espcie. So usadas microtcnicas que incorporam um conjunto de meios
numa nica unidade. Dois destes sistemas disponveis comercialmente so:

1- Sistema API (Analytical Profile Index) 20 E


O sistema API 20 E uma verso miniaturizada das provas bioqumicas convencionais usado para identificao
das Enterobacteriae e outros bacilos Gram negativo. um sistema de mictotubos pronto a usar que permite
realizar 22 provas e culturas puras isoladas apropriadamente num meio de cultura.
Consiste numa tira de plstico composta por 20 microtubos individuais, cada um dos quais contendo um meio
desidratado. Os meios ficam hidratados quando da inoculao da suspenso do microrganismo a ser ensaiado,
sendo depois a tira de plstico incubada num tabuleiro tambm de plstico com cobertura para evitar a
evaporao. Aps incubao (18-24h a 35-37 C), a identificao do microrganismo feita pelo mtodo tradicional
de verificar a mudana de cor nos microtubos, aps o sistema indicador ter sido alterado pelos metabolitos ou
pelos reagentes.
A identificao da bactria desconhecida consiste na determinao de um cdigo de 7 dgitos (profile index
number) e na consulta do API 20 E Profile Index Booklet ou de um sistema de computador designado API 20 E
PRS (profile recognition system).

2- Sistema de multitestes Enterotube II


Consiste num tubo contendo 12 compartimentos com meios de cultura slidos e uma agulha de inoculao. Esta
agulha toca numa colnia isolada e depois de uma s vez os microrganismos so arrastados atravs dos 12
compartimentos, de modo que todos os meios fiquem inoculados. Desta maneira so realizadas 15 provas
bioqumicas com uma s sementeira. Aps incubao, a mudana de cor de cada compartimento interpretada
de acordo com as instrues do fabricante para identificar o microrganismo.
A partir dos resultados e consultando um manual obtm-se um cdigo de 5 dgitos que permite identificar a
bactria. Este mtodo tornou-se mais eficiente permitindo a identificao das Enterobacteriaceae por meio de um
sistema de computador designado ENCISE (Enterobacteriaceae numerical coding and identification system for
enterotube).

3- Bactray