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AnaJimnezBelenguer

PRCTICASDE
MICROBIOLOGAyBIOQUMICAENOLGICA

readeMicrobiologa
DepartamentodeBiotecnologa
________________________________
EscuelaTcnicaSuperiorIngenieraAgronmicaydelMedioNatural

UNIVERSIDADPOLITCNICADEVALENCIA

NORMASDESEGURIDADENELLABORATORIODEMICROBIOLOGA
HBITOSPERSONALESARESPETARENELLABORATORIO

Esobligatoriollevarbatadelaboratorio,quesemantendrabrochadaentodomomento.

Enellaboratorioestprohibidofumar,comerybeber.

Nodejarobjetospersonalesenlassuperficiesdetrabajo,manteniendolospasilloslibres.
Utilizarlastaquillas.

Llevarelpelorecogido.

Nollevaraccesorios,mangasanchasniprendassueltasquepuedanengancharse.

Lavarselasmanosantesdeentrarenellaboratorioytrasfinalizarlasesindeprcticas.
UTILIZACINDELMATERIALDELABORATORIO

Seguirentodomomentolasindicacionesdelprofesordeprcticas.

Encenderlosmecherosconprecaucinsinmoverlosdesulugar.Notrasladarnuncaun
mecheroencendidoyapagarloscuandonoseutilicen.

Evitar los guantes de ltex si se trabaja cerca del mechero. Las quemaduras son muy
peligrosas.

No tocar el instrumental recin flameado, ni depositarlo sobre las mesas o material


inflamable(papel,alcohol...).

Mantener alejados del alcohol los objetos flameados. Asegurarse que estn bien
apagadosantesdeintroducirlosenalcohol.

Notrabajaralavezconelmecheroencendidoyproductosqumicosvoltiles.

Notrabajarseparadodelpuestodetrabajo.

Evitartocarconlasmanosmojadaslosaparatosconectadosalaredelctrica.
ELMANEJODEMUESTRAS

En el laboratorio no se trabaja con microorganismos patgenos, pero en las muestras


analizadasesposiblelaexistenciademicroorganismospatgenos.
EXTREMARLASPRECAUCIONESENTODASLASMANIPULACIONES.

Nopipetearconlaboca.Usarlaspropipetasolaspipetasautomticascalibradas.

Despusdelosanlisis,loscultivosseretirarnparasudestruccinenautoclave.
INDICACIONESENCASODEACCIDENTES

Enelcasodevertidosoroturasaccidentales,notocarnadaeinformarinmediatamente
alprofesordeprcticas.

SISESIGUENCORRECTAMENTEESTASINSTRUCCIONES,ELTRABAJODELABORATORIO
SERSEGUROPARATODOS.

OBJETIVOS
Sepretendeconseguirquelosalumnosconozcan:

BuenasprcticasdetrabajoenellaboratoriodeMicrobiologa.

Utilizar correctamente las tcnicas empleadas en Microbiologa, para el cultivo y la


manipulacin de levaduras y microorganismos relacionados con el vino, en condiciones
deesterilidad.

Utilizar el microscopio ptico como herramienta para la visualizacin de las distintas


morfologasdelevadurasydistinguirlasbacteriaslcticasdeaquellasperjudicialesque
puedanalterarelvino.

Manejodetcnicassencillasparaelrecuentodelosdistintosmicroorganismosquenos
podemosencontrartantoenelmostocomoenelvino.

Aislar levaduras de inters enolgico a partir de un mosto o de uva, caracterizarlas e


identificarlasmediantemtodosclsicos.

Utilizarsistemasminiaturizadosparalaidentificacindebacteriaslcticas.

1. CULTIVO Y CONSERVACIN DE BACTERIAS Y LEVADURAS DE INTERS


ENOLGICO
Los microorganismos presentes en el proceso de vinificacin principalmente son levaduras y
bacterias lcticas. Tienen por lo tanto caractersticas fisiolgicas y necesidades nutricionales
distintas. En general los medios de cultivo utilizados para el aislamiento y cultivo de bacterias
lcticasenellaboratorionosonptimosparaelcultivodelevaduras,aligualquesuscondiciones
de incubacin. Cuando queramos que crezca una levadura y que no aparezcan bacterias, se le
adicionar al medio de cultivo antes de esterilizarlo, un inhibidor del crecimiento bacteriano,
habitualmenteCloranfenicol.
Losmedioshabitualesparaelcultivodelevadurasson:YPD,Agarmosto
Losmediosdecultivoparabacteriaslcticasenalgunoscasossonespecficosparacadagnero:
MRSparalactobacilos,M17paralactococosyMedioOenococcusparadichomicroorganismo.
Normasgeneralesparalapreparacindemediosdecultivo

Aadirloscomponentesdelmedioenlascantidadesindicadasaunrecipientelimpiocon
lacantidaddeaguadestiladaquesedeseepreparar,disolvindoloscompletamente.

Ajustar el pH del medio. Hay que tener en cuenta que en los medios no tamponados,
despus de esterilizar en el autoclave desciende el pH unas 0,10,2 unidades, a veces
incluso0,4unidades.

Sielmediovaaserslidoosemislidoseleaadeagar.Enelcasodequeelmediose
vayaarepartirentubosesnecesarioenprimerlugarllevarloaebullicinparaqueelagar
sefundayserepartahomogneamente;despusdistribuirenlostubosyesterilizar.Siel
mediosevaarepartirenplacas,seesterilizaenunmatrazyunavezestrilsereparteen
lasplacaspreviamenteesterilizadas.

Con algunas excepciones, los medios se esterilizan en autoclave a 121 C durante 15


minutos.

Muchos de los medios de cultivo estn comercializados; stos tienen sus componentes
previamentemezcladosynecesitanslodelaadicindeaguayesterilizacin.

Paralaconservacindelascepasduranteperiodosdetiempodehasta2semanasyparasuuso
inmediato,laslevadurassepuedenmantenerenplacasPetriconmedioYPDa4C.
Paraperiodosdetiempomslargossepuedenmantenerobiencomocultivoenfrescoentubos
de agar inclinado con YPD a 4C. Tanto las levaduras como las bacterias lcticas de inters se
pueden conservar durante periodos de ms de un ao. Para ello hacer una suspensin de un
cultivode2448horasencriovialescon1,5mldecaldoconglicerolal20%yconservara20Co
a80C.

PreparacindealgunosMediosdeCultivo
YPD(Difco)paralevaduras
Extractodelevadura.....................................10g
Peptona........................................................20g
Glucosa.........................................................20g
Aguadestilada..........................................1000ml
MRS(Merk)parabacteriaslcticas
Peptona............................................................10g
Extractodecarne...............................................8g
Extractodelevadura..........................................4g
D(+)glucosa.....................................................20g
Acetatosdico...................................................5g
Citratotriamnico..............................................2g
Sulfatomagnsico..............................................0,2g
Sulfatomanganoso............................................0,05g
Polisorbato80....................................................1mL
Agar..................................................................17g
Aguadestilada...................................................1L
pHfinal(aprox.)6,3

Medioparalafermentacindecompuestoscarbonados.Mediobasal:
Extractodelevadura.......................................2,5g
Peptona..........................................................7,5g
Azuldebromotimol........................................0,04g
Aguadestilada..........................................1000ml

RepartirentubosconcampanaDurhamcantidadesmedidasde4mlyesterilizar
enautoclave.
Aadir a cada tubo en condiciones estriles 2 ml del azcar que se quiera
ensayaresterilizandoporfiltracinyalasconcentracionessiguientes:

Glucosa................6%

Melecitosa...........6%

Sacarosa...............6%

Melibiosa.............6%

Maltosa................6%

Trealosa..............10%

Galactosa.............6%

Rafinosa.............10%

Lactosa.................6%

Almidn..............10%

Celobiosa.............6%

YEASTGLUCOSEAGARparaAcetobacter
Glucosa.......................................................100g
Extractodelevadura.....................................10g
CaCO3............................................................20g
Agar..............................................................18g
Aguadestilada..........................................1000ml

OenococcusoeniMedium
Triptona........................................................10g
Extractodelevadura.......................................5g
Glucosa.........................................................10g
Fructosa..........................................................5g
SO4Mg.7H2O...................................................0,2g
MnSO4H2O.......................................................0,05g
Diamoniocitrato............................................3,5g
LCisteinahidroclorada....................................0,5g
Zumodetomatefiltrado.............................100ml
Tween80........................................................1ml
Aguadestilada............................................900ml
Agar...............................................................18g
pH4,8

Agarmosto
Mostodescongeladoyfiltradocongasaestril(medirelvolumenenml)
Cloranfenicol

0.5g/l

Agar

18g/l

Hervirduranteunosminutos,atemperara45CyrepartirenplacasPetri.
Conservarunavezsolidificadasa4C.

2. OBSERVACINDEMICROORGANISMOS
Existenvariastcnicasdetincinparalavisualizacin,diferenciacinyseparacindelos
gruposbacterianossegncaractersticasmorfolgicasyestructurascelulares.
TINCINDEGRAM
LatincindeGram,lamsempleadaenbacteriologa,esunatincindiferencial.Poreste
mtodo se pueden separar las bacterias en dos grandes grupos: Grampositivas y Gram
negativas.
El distinto comportamiento en la tincin es debido a diferencias en la estructura y
composicinqumicadelaparedcelular.
Material
Portaobjetos
Asadesiembra
Cristalizador
Pinzasparaportaobjetos
Mechero
Microscopio
Productos
Violetadegenciana
ReactivodeLugol
Alcoholde96
Fuchsinabsicadiluida
Microorganismoaestudiar
Procedimiento
1.Extensin
2.Desecacinalaire
3.Fijacinalcalor
4.TeirconVioletadeGenciana1minuto.
5.Sinlavar,reemplazarelcoloranteporelreactivodeLugol,arrastrandoprimero
ydejndoloactuar1minuto.
6.Lavarconagua
7.Decolorarconalcoholhastaquesalgaexentodecolorantes.Generalmente
unos30segundosessuficiente.
8.Lavarconagua
9.Teirconfuchsinabsicadiluidadurante3minutos.
10.Lavar,secaryobservaralmicroscopioconobjetivodeinmersin(100x).

Los microorganismos Gram positivos aparecen de color violeta, mientras que los Gram
negativosseobservandecolorrojoorosa.

3.OBSERVACINMORFOLGICADELEVADURASALMICROSCOPIO
Observacindelevadurasenfresco:
1.Sobreunportaobjetosdepositarunagotadeazuldemetileno.Tomarconelasauna
pequeamuestradelalevadurayhacerunasuspensin.
2.Colocarencimaelcubreobjetosprocurandoquenoseformenburbujasdeaire.
3.Observarconelobjetivosecode40Xo60X.
Tincinvitaldelevaduras
1.
Procederigualqueenelcasoanteriorutilizandoelazuldemetilenotamponado
paratincinvital
2.
La levaduras que estn activas metablicamente y por tanto viables se tien de
colorazul,mientrasqueaquellasqueestnmuertasnosetien.
Azuldemetilenotamponadoparatincinvitaldelevaduras:
Azuldemetileno0,1g(refMerck:1.15943.0025)
Potasiodihidrgenofosfato13,5g(refMerck:1.04873.0250)
DiSodiohidrgenofosfatododecahidrato0,12g(refMerck:1.06579.0500)
Enrasarconaguadesionizadaenunmatrazde500ml
Observacinconelobjetivodeinmersin:
1.Realizarunaextensindelalevadurasobreunportaobjetosalqueselehaaadido
previamenteunagotadeagua.
2.Dejarsecaralaireoconcalorsuave
3.Fijarlapreparacinalallamacon34cortedellama
4.Dejarenfriaryteirconazuldemetilenodurante35minutos.
5.Lavarparaarrastrarelrestodecolorante,secarymiraralmicroscopioconaceitede
inmersin(100X).

Morfologadelevaduras:

ayb:Gemacinmultilateral:Saccharomyces
c:Gemacinbipolar:Hanseniaspora
d:Fisinbinaria:Schizosaccharomyces
e:Yemassobrecortostallos:Sterigmatomyces
f:Artroconidios:Trichosporon
g:Balistoconidios:Sporobolomyces

4.RECUENTODEMICROORGANISMOS

4.1.RECUENTOTOTALDEMICROORGANISMOSALMICROSCOPIO.CAMARADETHOMA

Materiales
CmaradeThomaconcubreobjetos
PipetasPasteur
Microscopio

Procedimiento
Estemtodoseutilizaparacontarmicroorganismosenmedioslquidos.

1. Colocar el cubreobjetos sobre la cmara y presionar sobre loa bordes para que
aparezcan los anillos de Newton. Esto se consigue si la cmara y el objetivo estn
perfectamentelimpios
2. Descargar una gota con la pipeta sobre la cmara para llenar el espacio del
cubreobjetos.
3. Llevar al microscopio y observar con objetivos secos de 20X o 40X. Cada cuadrado
tieneunreade1/400mm2,,ylaalturadelasuperficiedelacmarayelcubreobjetoses
de0,1mm;porlotanto,elvolumendellquidosobrecadacuadradoesde1/4000mm3.
Por tanto, 1mm3 contiene 4000 veces el nmero de microorganismos contados. Para
expresarelresultadoenclulaspormlmultiplicamospor1000.
4. EnlafrmuladelapginasiguienteDeselinversodeladeladilucinutilizada,nesel
nmerototaldemicroorganismoscontadosyFelnmerototaldecuadraditoscontados.
Sedebencontardosdiagonales,esdecirF=40.

DIAGONAL1
F

DIAGONAL2
F

4.2 RECUENTODEMICROORGANISMOSVIABLESENMOSTO

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Material
Pipetasestrilesde1ml.
PlacasPetri
Tubosdeensayocon9mldeaguaestril.
BaoMara
Mechero
Productos
Mediodecultivosegnelgrupodemicroorganismosenmatrazatemperadoa4550Co
enplacasyapreparado.
BacteriasLcticas:AgarMRS
AgarOenococcus
Mohosylevaduras:AgarYPD+Cloranfenicol

Procedimiento
1.Pipetearaspticamente1mldemuestrayrealizardilucionesdecimalesseriadasenlos
tubosdeaguadestiladaestril.
2. Siembra en profundidad: Inocular 1 ml de cada dilucin en placas Petri vacas por
duplicado. Verter unos 15 ml de medio fundido, mezclar con suave agitacin y dejar
solidificareinvertir.
2. Siembra en superficie: Inocular 0,1 ml de cada dilucin en placas conteniendo el
medio de cultivo por duplicado. Extender con el asa de Drigalski. Invertir las placas
cuandoestnsecas.
3.Incubaratemperaturaytiempoadecuados.
4.Considerarlasplacasenlasqueelnmerodecoloniasestcomprendidoentre30y
300.Hallarlamedia,ladesviacintpicayelerrortpico.
5. Para el recuento en profundidad multiplicar el nmero medio de colonias por el
inversodeladilucin.
6. Para el recuento ensuperficie multiplicarelnmero decolonias por el inversode la
dilucinypor0,1.

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5.AISLAMIENTODELEVADURASAPARTIRDEUNMOSTOy/oUVA
Paraobteneraisladosdelevaduraspertenecientesalamicrobiotaautctonadenuestras
vides,podemosutilizarmostoobtenidoapartirdelasuvas,unavezmaduras,oaislarlas
levadurasqueseencuentrenadheridasalapruina.
Materiales
Mostosinsulfitarysinconservantes
AgarYPDconCloranfenicol
AgarmostoconCloranfenicol
Tubosdeaguadestiladaestril
Hisoposestriles
CaldoYPD
Procedimiento
Latomademuestrassedeberealizarenunenvaseestrilymantenerloenrefrigeracin
a4Chastasuanlisis.
Serealizandilucionesdecimalesseriadasdelasmuestrasconaguadestiladaestril.
Sembrarmediantelatcnicadesuperficie0.1mldelasdilucionesseleccionadasenlos
distintosmedioseincubardurante3dasa28C.
Si queremos aislar las levaduras que se encuentren adheridas a la pruina de la uva
madura,procederarecogerdeformaasptica,conhisopoestrilhumedecidoencaldo
YPD, todas las partculas presentes en el grano de uva. Sembrar en placa por
agotamiento,enlosmediosanteriormenteseleccionados.
Hacertincinconazuldemetilenodelasdiferentescoloniasencontradasparaobservar
lamorfologadelaslevaduras.
Procederasupurificacinmediantetripleestraenlosmediosutilizadosparacultivode
levaduras.

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6. IDENTIFICACIN DE LEVADURAS POR EL SISTEMA API ID 32C. ENSAYO DE


FERMENTABILIDADDECOMPUESTOSCARBONADOS
La identificacin de las levaduras por mtodos clsicos se basa en la observacin de
caracteresmorfolgicoyenladeterminacindecaracteresfisiolgicos,deasimilaciny
fermentacindeazucares.
Enestaprcticavamosarealizarunaobservacinmorfolgicadelevaduraseidentificar
laslevadurasporelsistemaminiaturizadoAPIID32C.Tambinrealizaremosunensayo
defermentabilidaddedistintosazcares.Elobjetivodeestaspruebasrpidasespermitir
caracterizarlalevaduraqueestamosutilizandodurantenuestroprocesoindustrial.
Materiales
Cultivosdelevaduras
SistemaAPIID32C
Micropipetasautomticas
Tubosdeaguadestiladaestril
Medioparalafermentacindecompuestoscarbonadosenlevaduras
Procedimiento
IdentificacindelevadurasconelsistemaAPIID32C:
1.Tomar1ovariascoloniasidnticasdelevadurayrealizarunasuspensineneltubo
deaguaestrildeturbidezigualalpatrn2deMcFarland.
2. Abrir una ampolla de API C Medium y transferir 250 l de la suspensin anterior.
Homogenizarbienconlapipeta.
3. Inocular los pocillos de la galera con 135 l con la suspensin realizada en API C
Mdium.
4.Cerrarlatapaeincubara28Cdurante23dias.
5.Compararconelcontrol(pocillo0)yanotarlascpulasqueaparecenmsturbiasque
elcontrol.
6.LeerlosresultadosconlatabladelecturaoenelbancodedatosdelsistemaAPILAB.

Ensayodefermentabilidaddecompuestoscarbonados:
1.DeuncultivodelevaduracrecidaenYPDagar,realizarunasuspensinenYPDbroth.
2.Inocular0,5mldelasuspensinanteriorenlostubosdemediodefermentacinde
compuestoscarbonadosconcampanaDurham.
3.Incubara28Cyrealizarlecturasalas24h,48hy72h.
4. Lectura de los resultados. Si hay crecimiento y gas en la campana Durham la
fermentacinespositiva.

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7.IDENTIFICACINDEBACTERIASLACTICASCONELSISTEMAAPI50CH
Este sistema estandarizado esa compuesto por 50 ensayos bioqumicos destinados al
estudio del metabolismo de los hidratos de carbono por los microorganismos. Esta
diseadoparaidentificacindeLactobacillusymicroorganismosprximos.
AntesdeutilizarelsistemaAPI50CHsedebeverificarlapurezadelcultivo.Comprobar
su pertenencia a bacterias lcticas: Bacilos Gram positivos, Catalasa positivos, no
esporulados,anaerobiosestrictosofacultativosycultivablessobreMRS.
1. Prepararunacmaradeincubacin(fondoytapa)yllenarlosalvolosdelfondo
conaguaparacrearunaatmsferahmedaycolocarlastirasenelfondodela
cmaradeincubacin.
2. Realizarunasuspensindensaenuntubodeaguadestiladaestril.
3. Abrir una ampolla de API Suspensin Medium (5ml) o utilizar un tubo de agua
destilada estril y realizar una suspensin de turbidez igual al patrn 2 de
McFarland transfiriendo un cierto nmero de gotas de la suspensin anterior.
Anotarelnmerodegotas(n)
4. AbrirunaampolladeAPI50CHLMediumeinocularcondosveceselnmerode
gotasutilizadasparaprepararlasuspensinanterior(2n).Homogeneizar.
5. Repartir el API 50 CHL Medium as inoculado solo en los tubos, y recubrir con
vaselina.
6. Incubara30Coa37Cdurante48horas.
7. Lecturaderesultados:Encadatuboseinvestigalaacidificacinproducidaquese
traduceenuncambiodeaAMARILLO.Elensayodelaesculina(n25)seobserva
decolornegro.
8. Anotarlosresultadosenlahojaderesultadosyconsultarelbancodedatos

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9. ENSAYOPREVIODECONSERVACINDELVINO:FILTRACIN

Enestaprcticavamosaestudiarlosmicroorganismosviablesquepuedenquedarenel
vino envasado. Se puede realizar por observacin microscpica del vino o por un
recuentodeviablesenplaca,peroenestoscasoselvolumenestudiadoesmuypequeo.
Paraestudiarvolmenesmsgrandesseutilizalatcnicadelafiltracin.
Latcnicadelafiltracinpormembranasebasaenhacerpasarlamuestraatravsdeun
filtro en cuya superficie quedan retenidos todos los microorganismos. Se utilizan
membranas que tienen un tamao de poro de 0,45 micras, ya que la mayora de los
microorganismostienenuntamaosuperior.Unavezfiltradalamuestraseincubasobre
unmediodecultivoadecuadoalatemperaturaytiemponecesario.

Materiales

Sistemadefiltracin
Fuentedevaco
Membranasdefiltracinde0,45micras
Pinzasdeaceroconbordesbiselados
PacasPetriconmediodecultivoadecuado

Procedimiento

1. Flamearlasuperficiedelportafiltros
2. Colocar una membrana sobre el soporte con la ayuda de unas pinzas biseladas
previamenteflameadasconalcohol
3. Situarunembudosobreelsoportepresionandohastaqueestfijo.
4. Verterlamuestradevinoenelembudoyaplicarelvacohastaqueellquidose
hayafiltrado.
5. Romper el vaco y extraer el embudo. Con las pinzas flameadas se extrae la
membranadelsoporte.
6. Colocar la membrana en una placa Petri cobre el medio de cultivo, con la
cuadriculahaciaarriba,procuradoquenoquedenburbujasentrelamembranay
elmedio.
7. Incubarenposicininvertidaatemperaturaytiempoadecuado
8. Realizarlalecturacontandolascoloniascaractersticasencadamedio.Referirel
nmerodeUFCrespectoalvolumendevinoinicialfiltrado.

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Muestra problema

Filtracin
Levaduras

Bacterias

LosresultadosseexpresanennmerodeUFCporvolumendevinofiltrado

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