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Determinacin cualitativa de ADN genmico total en muestras

de tejido animal.
Jose D Ibez*, Mauren C Lobo*, Mary I Mndez*, Camila A Pacheco*, Maria A Prez*
*Universidad de Sucre, Facultad de Ciencias de la Salud, Programa de Medicina.

Resumen
La prctica de laboratorio inici con la ilustracin conceptual de la estructura y
composicin del ADN y de su importancia en la transmisin de la informacin hereditaria.
As mismo se habl sobre las tcnicas ms comunes para la extraccin de ADN y los
materiales utilizados en estas. Tambin se indag en la utilizacin de metodologas para la
visualizacin de los cidos nucleicos como la electroforesis y de algunos reactivos
necesarios para llevar a cabo esta prctica. Estos conocimientos fueron claves para extraer
ADN de una muestra de tejido heptico, que posteriormente fue cultivada en gel de agarosa
para realizar la electroforesis que hizo posible la visualizacin de cidos nucleicos.

Introduccin

La extraccin de DNA es uno de los


procedimientos ms importantes en la
biologa molecular pues permite un
anlisis ms detallado y preciso de la
formacin de DNA, el cul es nico para
cada persona. La relevancia de este
proceso cientfico radica en que tiene
muchas aplicaciones para resolver
incgnitas que se presentan en el diario
vivir, un ejemplo claro de lo anterior es
que para resolver muchos crmenes; la
identificacin de gentica de DNA ha sido
clave para determinar si una persona
estuvo implicada en un crimen, ya que a
menudo el criminal deja alguna forma de
evidencia de DNA.

No solo en la parte de la criminalstica es


indispensable el proceso de extraccin de
DNA, pues en la rama de la medicina esto
es casi que imprescindible para casos
como la determinacin de relaciones
familiares, ya que hoy por hoy es posible
decir sin un padre o madre son los
verdaderos padres del hijo y tambin se
puede decir si dos personas son
hermanos. As mismo se pueden predecir
enfermedades
que
son
heredadas
genticamente. Por las anteriores razones
se hace necesario que los estudiantes de
medicina adquieran destrezas a la hora de
manipular los elementos que son
comnmente utilizados para llevar a cabo
la extraccin de DNA.

Materiales y mtodos

Durante la realizacin de la prctica de


laboratorio de determinacin cualitativa
de ADN genmico total, se utiliz como
muestra una pequea porcin de hgado
de pollo. Tambin se us cloruro de sodio,
agua destilada, shampoo, etanol absoluto
fro, gaza, agarosa, un beaker de 100 ml,
un bistur con cuchilla, una micropipeta,
una probeta de 20 ml, buffer TBE, gelstar, refrigerador, tubos de centrifugar,
microcentrfuga, varilla de vidrio para
doblar, mortero y una caja de Petri.
Esta prctica de laboratorio const de dos
fases una de extraccin de ADN y la otra
en la cual se realiz una electroforesis
para visualizar el ADN antes extrado.
Antes de proceder a realizar la extraccin
fue necesario realizar los clculos para
preparar 60 ml de una solucin de cloruro
de sodio de concentracin 2M. Luego de
conocer las cantidades necesarias de agua
destilada y cloruro de sodio; 60 ml y 7.1
gr respectivamente, se realiz la medicin
de cada uno y se prepar la solucin en
un beaker de 100 ml. A continuacin se
procedi a cortar con un bistur con
cuchilla una pequea porcin de hgado
de pollo que luego fue puesta en una caja
de Petri. Despus se cort en partes muy
pequeas con un bistur y se macer con
un mortero la porcin de hgado de pollo,
esto para separar las clulas presentes en
la muestra. Seguidamente se depositaron
los cortes de hgado de pollo en un
mortero y se adicionaron 20 ml de agua

destilada; luego con ayuda de una varilla


de vidrio para doblar se revolvi la
mezcla para homogenizarla. Despus se
dej precipitar el tejido macerado durante
5 minutos. Pasado este tiempo se coloc
una gasa doble de 10 x 10 cm sobre un
beaker limpio para filtrar la mezcla y
luego se eliminaron las partculas slidas
retenidas en la gaza. Posteriormente se
midieron 10 ml de la mezcla con la ayuda
de una probeta. Seguidamente se
transvasaron estos 10 ml a un beaker y se
agregaron 10 ml de la solucin de
cloruro de sodio de concentracin 2M
anteriormente preparada. Prontamente se
agreg 1 ml de shampoo; esto para
disgregar la membrana de las clulas
presentes, y se revolvi la mezcla para
homogeneizarla. Pasado 10 minutos se
separ la mezcla en cuatro tubos
eppendorf con la ayuda de una
micropipeta y estos fueron llevados a la
microcentrifugadora
donde
se
centrifugaron a 12000 r.p.m durante 5
minutos.
Enseguida al terminar de
centrifugar se tom el sobrenadante de
cada uno de los tubos eppendorf con el
uso de una micropipeta, y se transfiri a
un tubo de ensayo limpio. Luego se
aadi etanol absoluto previamente
enfriado a -20 C, en el tubo de ensayo
con una micropipeta hasta que se
formaron dos capas. En este punto fue
posible visualizar los cidos nucleicos
precipitados en forma de hilitos blancos
que se ubicaban entre el alcohol y el agua.
Despus se introdujo una varilla de vidrio
para doblar se tomaron los cidos
nucleicos antes observados
y se

transfirieron a un tubo eppendorf que


luego fue centrifugado a 14000 r.p.m
durante 5 minutos y se elimin la capa
sobrenadante. Luego se dej secar la
muestra a temperatura ambiente y se le
agrego 1 ml de agua destilada. Con esto
se da por terminada la primera fase de la
prctica y se procede a dar inicio a la
electroforesis.
Continuando con la prctica despus de
que se prepar la cmara de electroforesis
con el gel star, la agarosa y el buffer TBE,
se hicieron los pozos con la ayuda de un
peine,
se
dej
solidificar
aproximadamente media hora, se retir el
peine del plato con el gel; se coloc el gel
en el tanque de electroforesis, el cual
contena buffer TBE y se procur que este
cubriera por lo menos un milmetro por
encima del gel. Luego se procedi a
preparar una mezcla de 2 microlitros de

buffer Green de carga ms 8 microlitros


de la muestra de ADN extrado sobre el
papel parafinado. Seguidamente se
sembraron las muestras de ADN en cada
pozo del gel de agarosa, as mismo se
agreg en la misma cantidad
un
marcador de peso molecular y se
conectaron los electrodos de la cmara de
electroforesis a la fuente de poder
teniendo en cuenta los colores indicados,
a continuacin se encendi la fuente de
poder y se dej correr la muestra a un
voltaje de 80 V durante 45 minutos, Para
terminar con este proceso se apag la
fuente de poder y se traslad el gel al
fotodocumentador para visualizar los
resultados obtenidos y poder registrar
estos datos en fotografas. Con la
fotografa se realizar una tabla donde se
registrarn las distancias de migracin del
ADN que se sembr en los pozos de
cultivo.

Resultados

Imagen de la electroforesis realizada

1: Marcador de Peso
Molecular*
2: Muestra Dengue1-4**
3: Grupo 1

5: Grupo 2
6: Grupo 3
7: Grupo 4
8: Grupo 5

4: Muestra Dengue***

* 1 Kb Plus DNA Ladder


(http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10787018)
**Aislados de los cuatro serotipos del virus Dengue
***Dengue virus en Mosquito

MW (bp)

Rf ( cm )

Log10 MW

100

6,86

200

6,33

2,30103

300

5,79

2,47712125

400

5,42

2,60205999

500

5,04

2,69897

Tabla #1. Marcadores de peso molecular.

Resultados Electroforesis
3
2.5

f(x) = - 0.38x + 4.64

2
1.5
1
0.5
0
5

5.2

5.4

5.6

5.8

6.2

6.4

6.6

6.8

Grafica #1.Lnea de tendencia del peso molecular Rf Vs Log10 Mw.


MW (bp)
Rf ( cm )
Log10 MW
91,64842375

7,09

1,962125

230,2899577

6,03

2,362275

340,5257828

5,58

2,53215

494,8516242

5,15

2,694475

Tabla #2. Peso molecular de las barras problemas.

Al observar la tabla #1 los datos de la


primera columna corresponden al peso
molecular (MW) de las barras del
marcador de peso molecular, que en este
caso se tomaron las barras que se
encontraban en el rango de 100 500
pares bases (bp), debido a que estas eran
las ms visibles en la imagen de la
electroforesis y dentro de este rango
tambin se encontraban las barras
problemas a analizar. La segunda
columna corresponde al desplazamiento
en centmetros que presento el ADN (Rf)
desde el pozo de cultivo durante la
electroforesis. La tercera y ltima
columna corresponde al Log10 de (MW)
el cual es importante al momento de
graficar los datos. Al analizar esta tabla
fue posible deducir que el desplazamiento
que present el ADN (Rf), es
inversamente proporcional al (MW); por
ejemplo cuando (MW) es 100 bp, (Rf) es
igual a 6,86 cm y cuando (MW) es 300

Log10 Mw la cual indica el


comportamiento de los datos presentes
en la tabla #1. Esta lnea est representada
por la ecuacin
y = -0,3775x + 4, 6386 que expresa el
comportamiento del Log10 de (MW) con
respecto a Rf, y ayuda a calcular el peso
molecular de los fragmentos de ADN
problema.
La tabla #2 corresponde al peso molecular
de las barras problemas, a las distancias
que estas recorrieron desde el pozo de
cultivo y al Log10 del peso molecular de
estas mismas. Al analizar esta tabla se
pudo observar que el peso molecular de
las barras problemas y el desplazamiento
de estas mantienen la misma relacin
inversa que las barras estudiadas en la
tabla #1; por ejemplo cuando (MW) es
igual a 91,64842375 bp, (Rf) es igual a
7,09 cm y cuando (MW) es igual a
340,5257828 bp, (Rf) es igual a 5,58 cm.

Discusin

bp (Rf) es igual a 5,79 cm; conforme a


esto cuando (MW) va aumentando (Rf) va
disminuyendo.
La grfica # 1 corresponde a la lnea de
tendencia del peso molecular Rf Vs

ADN o cido desoxirribonucleico, es una


molcula que se encuentra en el ncleo de
las clulas y lleva la informacin gentica
utilizada por las mismas para la creacin
de protenas. Esta contiene las
instrucciones genticas usadas en el

desarrollo y funcionamiento de todos los


organismos vivos conocidos. La funcin
principal de las molculas de ADN es el
almacenamiento a largo plazo de la
informacin gentica. Su estructura se
basa en una doble cadena que forma una
escalera enrollada en forma de caracol, la
informacin se almacena como un cdigo
formado por cuatro bases qumicas:
adenina (A), guanina (G), citosina (C) y
timina (T). Cada peldao de la escalera es
un par de bases, (A unida con T) o (C con
G).1
Los organismos eucariotas presentan dos
barreras separadas que protegen el ADN.
La primera es la membrana celular, una
doble capa formada por molculas de
lpidos unidas. Dentro de la clula existe
una segunda barrera llamada ncleo, cuya
composicin es similar a la de la
membrana.
La extraccin de ADN constituye la
primera etapa de la mayora de los
estudios de biologa molecular y de todas
las tcnicas de recombinacin de ADN.
Este es un proceso vital con muchas
aplicaciones
cientficas.
En
la
investigacin y la medicina, sus usos
incluyen secuenciacin del ADN, la
deteccin de los virus y las bacterias, y la
investigacin
de
enfermedades
y
trastornos con base gentica. En el campo
de la ciencia forense, es utilizado para la
identificacin de los muertos y los vivos,
1 GENETIC EDUCATION FOR ILLINOIS.
Qu es el ADN? (en lnea).
<http://easylearngenetics.net/what-isgenetics/what-is-dna/que-es-el-adn/> (citado el 24
de abril de 2014).

as como el anlisis de la escena de


crimen.2
Para extraer los cidos nucleicos del
material biolgico es preciso provocar
una lisis celular, inactivar las nucleasas
celulares y separar los cidos nucleicos de
los restos de clulas. La extraccin de
ADN tiene de tres a cuatro pasos
operacin, que consisten bsicamente en:
1. Romper las clulas abiertas,
comnmente conocido como disrupcin
de la clula o lisis celular, para exponer el
ADN. El procedimiento de lisis idneo
suele consistir en un equilibrio de tcnicas
y ha de ser suficientemente fuerte para
romper el material inicial complejo (un
tejido, por ejemplo), pero suficientemente
suave para preservar el cido nucleico. En
este caso, se utiliz la tcnica de
trituracin, aunque tambin existen otros
mtodos
que resultan
igualmente
efectivos para este proceso, como es la
sonificacin por ejemplo, la cual
convierte seales elctricas en vibraciones
fsicas que tienen un efecto muy poderoso
en los tejidos y las sustancias en general,
haciendo que sus molculas se separen y
sus clulas se rompan. 2. Extraer los
lpidos de la membrana mediante la
adicin de un detergente. Esto se logra
gracias a que todas las membranas
biolgicas presentan la misma estructura
general, integrada por molculas de
lpidos y de protenas, unidas por
interacciones no covalentes.
2 HOYLE, Gideon. eHow en Espaol. Salud,
pasos para la extraccin de ADN. (en lnea)
<http://www.ehowenespanol.com/pasosextraccion-adn-como_143739/> (citado el 25
de abril de 2014)

Fig. 2. Solubilizacin de lpidos3


Fig. 1. Representacin simplificada de
las membranas celulares3.
Tal como muestra se muestra, las
molculas lipdicas estn ordenadas en
una doble capa continua, en la que las
molculas protenicas estn disueltas.
Las molculas lipdicas estn formadas
por extremos hidrfilos, denominados
cabezas, y extremos hidrfobos,
denominados colas. En este mtodo, el
detergente provoca la lisis de la
membrana. Dado que los detergentes (que
son anfipticos) tienen una composicin
similar a la de los lpidos, el componente
del detergente captura los lpidos que
integran la membrana celular y nuclear.
As como se muestra a continuacin:

3 Las ilustraciones son rescatadas de Genetic

Science Learning Center, Universidad de


Utah.
<http://gslc.genetics.utah.edu>
4

JCR, European commission. Anlisis de la


Presencia de Organismos
Genticamente Modificados en Muestras de
Alimentos. (en lnea) < http://gmocrl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals
/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf> (citado
el 26 de abril de 2014).

Ms adelante se muestra cmo se libera el


ADN genmico cuando el detergente
captura los lpidos y las protenas al entrar
en contacto la membrana celular. Con una
concentracin salina (NaCl) determinada,
el detergente forma un complejo insoluble
con los cidos nucleicos. El detergente
posee un componente quelante, que se
une al magnesio, entre otros metales. El
magnesio es un cofactor de la
desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio
al agente quelante, la actividad de la
desoxirribonucleasa presente disminuye.
Es importante sealar que, como los
cidos nucleicos se degradan fcilmente
en esta fase de la purificacin, debe
reducirse al mnimo el tiempo
transcurrido entre la homogeneizacin de
la muestra y la adicin del detergente.
Una vez que se han roto las membranas
de la clula y de los orgnulos (como los
que se encuentran alrededor de las
mitocondrias y los cloroplastos), se
purifica el ADN.
35 BRENNAN, John. eHow en Espaol.

Educacin y ciencia, por qu algunas


personas obtienen ms ADN que otras en un
laboratorio de extraccin? (en lnea).
<http://www.youtube.com/watch?
v=obKWQneMM1Q> (citado el 26 de abril
de 2014).

Fig. 3. Rotura de la membrana celular y


extraccin del ADN genmico3.
3. Extraccin de protenas mediante la
adicin de una proteasa (opcional pero
casi siempre se hace). Aunque a veces se
hace de manera simultnea con la adicin
del detergente, as como se describi en el
paso anterior. 4. Precipitar el ADN con un
alcohol,
normalmente
etanol
o
isopropanol helado. El etanol limpia el
ADN de otras biomolculas por un
proceso llamado "precipitacin". En este
proceso, el etanol (que se usa
preferiblemente fro ya que las altas
temperaturas
generan
cambios
estructurales y pueden hacer que la
molcula de ADN se rompa y se separe)
hace que el ADN se deshidrate, es decir,
pierda contacto con las molculas de agua
que lo rodean, y lo asla de la solucin
acuosa para dejarlo libre de impurezas.
Adems, con la ayuda de sales de sodio,
por ejemplo NaCl (que neutraliza las
cargas de las protenas y cidos nucleicos
para que se puedan separar y se vuelvan
insolubles) se facilita este aislamiento de
ADN y su separacin por centrifugacin4
Existen diversas razones por las que en un
proceso de extraccin de ADN resulta
3

mayor cantidad de ADN que en otro, en el


caso de la extraccin que se realiz en
esta prctica de laboratorio, no se obtuvo
la cantidad de ADN suficiente para el
proceso de electroforesis. Entre las
razones que explican esta circunstancia se
encuentran las siguientes: la cantidad de
ADN que se asla depende de la cantidad
de material con que se empieza a trabajar,
entre ms grande es la muestra, mayor es
la cantidad de ADN que se extrae. La
concentracin tambin es un factor
determinante, ya que, si se adiciona
demasiada agua cuando se mezcla la
muestra resulta una solucin muy diluida
y no se extraer mucho ADN. De igual
modo, el tiempo tambin es importante ya
que se debe invertir el tiempo suficiente
en cada paso, por ejemplo, algunas de las
membranas celulares quedaran sin
romperse si no se da el tiempo suficiente
para que el detergente acte, en tal caso,
no se puede extraer todo el ADN.5
Existen mtodos que sirven para separar e
identificar fragmentos de ADN. El ms
conocido es la electroforesis en gel, que
consiste en la separacin de especies
qumicas (cidos nucleicos y protenas) a
lo largo de un campo elctrico en funcin
de su tamao y de su carga elctrica. Los
cidos nucleicos tienen por naturaleza
carga negativa. Si se colocan fragmentos
del ADN extrado de una muestra
biolgica (en este caso el hgado), sobre
un soporte poroso (como gel de agarosa)
y se aplica un campo elctrico, se
producir una migracin diferencial de

los fragmentos a travs de los poros de la


matriz.
Cuando una mezcla de molculas
ionizadas y con carga neta son colocadas
en un campo elctrico, estas experimentan
una fuerza de atraccin hacia el polo que
posee carga opuesta, dejando transcurrir
cierto tiempo las molculas cargadas
positivamente se desplazarn hacia el
ctodo (el polo negativo) y aquellas
cargadas positivamente se desplazarn
hacia el nodo (el polo positivo). El
movimiento de la molculas est
gobernado tambin por dos fuerzas
adicionales; inicialmente la friccin con
el solvente dificultar este movimiento
originando una fuerza que se opone, por
otro lado las molculas tienen que
moverse en forma aleatoria o movimiento
browniano debido a que poseen energa
cintica propia denominado difusin. La
energa cintica de las molculas aumenta
con la temperatura, por ello a mayor
temperatura mayor difusin.
La suma de todas estas fuerzas
provoca que las molculas no migren de
una manera homognea, de tal manera
que, si las molculas son colocadas en un
cierto lugar de solucin, los iones
comenzaran a moverse formando un
frente cuya anchura aumentara con el
tiempo.
Para reducir la anchura de este frente
podemos reducir el movimiento de las
molculas empleando un medio que
oponga ms resistencia a dicho
movimiento. Una forma comn de hacer
esto es formar un gel. El gel consiste de
un polmero soluble de muy alto peso

molecular que atrapa molculas de agua y


forma un tamiz
que dificulta el
movimiento
de
los
solutos,
consecuentemente,
la
migracin
electrofortica de las molculas ser ms
lenta, pero el ensanchamiento del frente
se ver reducido tambin.
Por esta razn se hace necesaria la
utilizacin de un Buffer, tampn o
sustancia amortiguadora. Las muestras
de ADN que deben cargarse en el gel de
agarosa se mezclan en primer lugar con
un tampn de carga que por lo general
contiene agua, sacarosa y un colorante
(por ejemplo, cianol de xileno, azul de
bromofenol, verde de bromocresol, etc.).
El tampn de carga se emplea con tres
fines: aumentar la densidad de las
muestras para que las gotas de ADN
caigan uniformemente en el pocillo;
aadir color a la muestra, simplificando
de este modo el proceso de carga
incorporar un colorante a la muestra que,
en un campo elctrico, se desplace hacia
el nodo a una velocidad previsible. Cabe
destacar que, La movilidad electrofortica
del ADN se ve afectada por la
composicin y la fuerza inica del
tampn de electroforesis. En ausencia de
iones, la conductancia elctrica es mnima
y el ADN migra lentamente o ni siquiera
se desplaza. En un tampn de elevada
fuerza inica la conductancia elctrica es
muy elevada y se genera una importante
cantidad de calor. En el peor de los casos,
el gel se funde y el ADN se desnaturaliza.
Se dispone de varios tipos de tampones
para la electroforesis de ADN nativo
bicatenario. Para el caso de esta prctica,
se utiliz un tampn tris-borato (TBE).

La tincin del gel con bromuro de etidio,


que es una sustancia fluorescente que se
intercala en la molcula de ADN y la
exposicin con luz ultravioleta, permite
observar el resultado de esta migracin;
(Es importante tener en cuenta que, el
bromuro de etidio es una sustancia
fuertemente mutagnica y es irritante a
los ojos, piel, mucosas y el tracto
respiratorio).
El tamao de los fragmentos de ADN se
puede estimar comparndolos con el
patrn de bandas que se obstine de
marcadores
comerciales
de
peso
molecular conocido. La electroforesis de
ADN es til para comparar patrones de
bandas de diferentes muestras biolgicas.
As por ejemplo se puede usar para
comparar muestras de individuos sanos
frente a individuos enfermos, para la
identificacin de cidos nucleicos de
agentes infecciosos o para la obtencin de
un fragmento determinado de ADN que,
una vez localizado en el gel puede ser
extrado para anlisis posteriores.
Las
enormes
aplicaciones
de
electroforesis son ms evidentes en la
industria de la salud o mdica, incluyendo
los antibiticos y el anlisis de la vacuna.
El anlisis de las protenas y ADN son
tambin importantes aplicaciones de la
electroforesis. Aparte de permitir a los
investigadores localizar y ver las
diferencias en el cdigo gentico de las
especies en la tierra, el anlisis de ADN
electrofortico tambin proporciona una

herramienta fiable en investigaciones


forenses6.

Conclusin

Despus de haber realizado la prctica se


pudo constatar que la extraccin de DNA
y su posterior anlisis a travs de la
electroforesis son procesos de gran
utilidad en la Biologa molecular debido a
que estos son necesarios para establecer
cules son los motivos por los cuales
ocurren mltiples variaciones en el paso
de la informacin hereditaria pues casi
todos los procesos que se realizan para el
anlisis de la misma inician con una
extraccin de DNA.
Gracias a los procedimientos realizados
se logr evidenciar el impacto y la
funcionalidad de los reactivos utilizados
para llevar a cabo cada uno de los pasos
del proceso de extraccin.

66 QUINTERO SOTO, Nicols. Slideshare.


Electroforesis. (en lnea).
<http://www.slideshare.net/nikho9030/electro
foresis-6726763> (citado el 1 de marzo de
2014).

BIBLIOGRAFIA

1. GENETIC EDUCATION FOR ILLINOIS. Qu es el ADN? (en lnea).


<http://easylearngenetics.net/what-is-genetics/what-is-dna/que-es-el-adn/>
(citado el 24 de abril de 2014).
2. HOYLE, Gideon. eHow en Espaol. Salud, pasos para la extraccin de
ADN. (en lnea) <http://www.ehowenespanol.com/pasos-extraccion-adncomo_143739/> (citado el 25 de abril de 2014).
3. Genetic Science Learning Center, Universidad de Utah. (en linea)
<http://gslc.genetics.utah.edu> (citado el 26 de abril de 2014)
4. JCR, European commission. Anlisis de la Presencia de Organismos
Genticamente Modificados en Muestras de Alimentos. (en lnea) <
http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual
%20ES/Sesi%C3%B3n4.pdf> (citado el 26 de abril de 2014).
5.

BRENNAN, John. eHow en Espaol. Educacin y ciencia, por qu


algunas personas obtienen ms ADN que otras en un laboratorio de
extraccin?
(en
lnea).
<http://www.youtube.com/watch?
v=obKWQneMM1Q> (citado el 26 de abril de 2014).

6. QUINTERO SOTO, Nicols. Slideshare. Electroforesis. (en lnea).


<http://www.slideshare.net/nikho9030/electroforesis-6726763> (citado el 1
de marzo de 2014).