Challenge Testing: Principios y Prctica

Introduccin
Una prueba de desafo (tambin conocida como prueba de efectividad del preservativo, PET, o prueba
de efectividad antimicrobiana) es un procedimiento para determinar si una formulacin cosmtica,
farmacutica o de otro tipo de producto esta preservada de forma adecuada para prevenir la
contaminacin de los productos en bruto y durante su uso.
Aunque las propiedades qumicas, fsicas y microbiolgicas de un preservante son muy importantes, no
proveen informacin suficiente para predecir si la formulacin est preservada adecuadamente. Hay
muchos factores que pueden influir en la actividad de un preservante: concentracin, pH, temperatura,
tipo, naturaleza y condicin de los microorganismos, presencia o ausencia de materia orgnica o de otras
sustancias interferentes, y las posibles interacciones del preservante con el contenedor y cierre. Estos
aspectos deben ser considerados al elegir un agente antimicrobiano como preservante, como parte
integral del desarrollo de una formulacin. Los microorganismos pueden estar en las interfaces slidolquido o lquido-lquido o diseminados por toda la formulacin. Las caractersticas de la formulacin son
por tanto importantes.
Factor
Concentracin
pH
Temperatura
Constituyentes de la
formulacin
Contenedores y cierres
Microorganismos
Materia Orgnica

Efecto en la actividad preservante

Aumenta la actividad (segn exponente de concentracin)
Depende el preservante: aumenta con el pH (quads) o disminuye con el pH (cidos
orgnicos)
Actividad aumenta con la temperatura
Puede aumentar o disminuir la actividad (sinergismo con EDTA u otros preservantes,
parabenos disminuyen actividad con TA no inicos, respectivamente)
Posibles interacciones/adsorcin
Determina tipo, naturaleza y condicin
Puede reducir la actividad

En esencia, una prueba desafo est diseada para asegurar si un producto est preservado
adecuadamente durante la vida til estipulada.
Principios de diseo de una prueba desafo
Como resultado de las buenas prcticas de manufactura (atencin a la calidad de materias primas y
seleccin apropiada de envases y cierres), una formulacin cosmtica o farmacutica no estril debera
tener una baja cantidad de microorganismos contaminantes; la evaluacin de esta contaminacin
natural por s sola no da tanta informacin como el PET. Este acercamiento natural mide la
capacidad de los organismos a desarrollarse durante el almacenamiento; otro procedimiento sera
remover estos contaminantes por filtracin o esterilizacin por calor antes de realizar el PET pero esto
generara cambios qumicos y fsicos importantes en un producto y no se recomienda.
El nivel de preservacin adecuado de un producto cosmtico debe mantenerse durante la vida til de
ese producto, incluyendo el uso por el consumidor. Durante el uso, el producto podra contaminarse con
varios tipos de microbios y para asegurar que est preservado adecuadamente, se realizan las pruebas
desafo en muestras del lote al principio, durante y despus de la vida til de ese producto. Un PET

adecuado involucra la adicin deliberada de bacterias u hongos al producto de prueba para asegurar que
ocurre la inactivacin microbiana. Por tanto, se deben considerar y evaluar los siguientes aspectos:
Aspectos del PET
Tipo de producto y
almacenamiento
Tipo de preservativo
Eleccin del organismo de
prueba
Inoculacin del organismo de
prueba

Procedimientos de muestreo

Criterios de aceptacin

Resumen
Formulaciones complejas de cosmticos (principalmente) afectan la actividad del
preservante. El almacenamiento puede afectar estabilidad (temperatura y humedad
podran evaluarse)
Alcoholes, quads, cidos, formaldedo y clorhexidina. Tener en cuenta propiedades
qumicas, fsicas y antimicrobianas antes de formular.
USP y BP recomiendan: Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa, Aspergillus niger
y Candida albicans. Podran incluirse otros exponentes. No se espera actividad esporicida a
las concentraciones evaluadas.
Puede ser desafo nico, desafo mixto (inocular con varios microorganismos a la vez) o
desafo mltiple (muy exigente). Agregar materia orgnica podra hacerse pero la prueba
ya es exigente per s y su influencia no se observara.
Tomar las muestras y realizar diluciones seriadas para realizar conteo de colonias despus
de la incubacin por el tiempo estipulado en la temperatura adecuada.
Se debe neutralizar el preservante para la incubacin: esto se puede hacer mediante
dilucin, neutralizacin qumica y/o filtracin por membrana. Para la dilucin es necesario
tener en cuenta el exponente de concentracin.
Dependiendo si se utiliza la USP o la BP. La BP tiene criterios ms estrictos y se divide en 2
niveles, A y B, que son ms exigentes para productos no estriles. La USP no es tan
estricta. Otros detalles de las pruebas tienen cierto grado de uniformidad.

Tipo de producto y almacenamiento: Hay muchos tipos de cosmticos y medicamentos. Los

cosmticos incluyen muchos productos y pueden alterar la flora microbiana de la piel; muchos
de estos productos son formulaciones complejas en donde la actividad del preservante puede
ser reducida o potenciada por otros ingredientes. El almacenamiento puede ser a temperatura
ambiente o en condiciones aceleradas con diferentes temperaturas y humedades, as mismo,
medir el contenido de preservativo durante el almacenamiento dara informacin sobre su
estabilidad.

Tipo de preservante: Pueden ser alcoholes, amonios cuaternarios, cidos benzico/

dehidroactico/ srbico, parabenos, triclosan, formaldehido y clorhexidina. Se deben conocer
sus propiedades qumicas, fsicas y antimicrobianas para realizar una formulacin adecuada de
los productos cosmticos y tambin para realizar los PETs.

Eleccin del Organismo de prueba: Es claramente imposible desafiar un producto con todos los
microorganismos habidos y por haber. Por tanto, cuando se conduce una prueba desafo, se
utilizan organismos representativos de aquellos que podran contaminar el producto. Para
medicamentos, la BP y la USP recomiendan: Staphylococcus aureus (coco gram +), Pseudomona
aeurginosa (bacilo gram -), Aspergillus niger (moho) y Candida albicans (levadura). Se permiten
otros microorganismos si se considera necesario.
Sin embargo, la CTFA y CTPA especifican microorganismos adicionales, incluyendo un formador
de esporas, Bacillus subtilis. Los preservantes suelen utilizarse a concentraciones inferiores que
en antispticos y desinfectantes, por lo que a dichas condiciones, es muy poco probable que

tengan actividad esporicida incluso despus de tiempos de contacto prolongados. Por tanto, la
inclusin de un formador de esporas slo indica si el preservativo puede prevenir la germinacin
de esporas. Aislados de casa pueden utilizarse, en especial en un re-desafo. Si el producto falla
en prevenir el crecimiento o reducir la viabilidad del organismo, se debe reevaluar el sistema
preservante y la interferencia de la formulacin.

Inoculacin del organismo de prueba: Los desafos se pueden realizar de muchas formas:
1. Desafo nico: Un organismo de prueba se aade al producto tal que se obtengan 106
ufc/mL o g para bateras o 105 ufc/mL para hongos. Se debe aadir un volumen muy
pequeo de suspensin microbiana, no ms del 1% del volumen total del producto, para
prevenir la dilucin
2. Desafo mixto (inoculacin multiespecie): Para simular mejor una situacin prctica, se
puede aadir un cultivo mixto al producto. Se usa para cosmticos, no tanto para
medicamentos.
3. Desafo mltiple: Esta exigente prueba involucra la inoculacin repetida a un cosmtico
a intervalos definidos por un determinado nmero de ciclos o hasta que el producto falle.
4. Con cosmticos que se diluyen durante su uso, por ejemplo, champs en botella, la
inclusin de materia orgnica podra simularse, no obstante, el inculo per s provee ya
suficiente demanda en el sistema preservante como para que la materia orgnica se
considere superflua.

Procedimientos de muestreo: Como estipulan las farmacopeas u otros protocolos oficiales, las
muestras son removidas y diluidas serialmente para enumerar los supervivientes viables a
periodos de tiempo definidos. El conteo de colonias se realiza despus de la incubacin en agar
por periodos de tiempo apropiados a temperaturas especficas. Para procedimientos de
enumeracin, se puede calcular la reduccin logartmica (logCo logCt, siendo C ufc/mL).
Es esencial neutralizar los preservativos para realizar un conteo exacto; esto se puede lograr
mediante dilucin, neutralizacin qumica o filtracin por membrana. Se deben conocer los
efectos de la dilucin y la concentracin en la actividad preservante, para lo cual se define el
exponente de concentracin (valor n): un n grande implica una prdida de actividad rpida por
dilucin, un n pequeo ocurre en preservantes que mantienen gran parte de su actividad incluso
despus de diluirse, por lo que es mejor utilizar un agente neutralizante.

Criterios de aceptacin: Dependen si se emplea la BP o la USP. La primera tiene dos criterios: A

(eficacia recomendada) y B (slo si hay razones para no alcanzar A), siendo A bastante estricta
para productos no estriles, ms que para los estriles. La USP es menos demandante pero
aparte de esto hay cierto grado de uniformidad entre ambas farmacopeas.

Procedimiento del valor-D

En estudios de dao trmico e inactivacin de esporas y clulas vegetativas, suele medirse la eficacia
de un proceso de calentamiento mediante el valor-D o tiempo de reduccin decimal (DRT), el cual es el
tiempo en minutos para reducir el nmero inicial de viables en una unidad logartmica, es decir, un 90%
o que quede en un 10% de la original. Un procedimiento alternativo para desafiar productos
farmacuticos y cosmticos involucra la determinacin de los valores-D por extrapolacin de la curva de
reduccin para obtener tiempos de contacto que permitan dar un punto final. El tiempo de deteccin
para calcular los valores D es comparativamente corto. La extrapolacin exponencial no es necesaria y
una prueba adicional para posible crecimiento despus de un largo tiempo podra ser importante.
Metodologas rpidas
Un mtodo rpido para evaluar la idoneidad de los agentes neutralizantes ya ha sido descrito. Una
cantidad considerable de informacin acerca de mtodos rpidos para detectar la viabilidad microbiana
ya se encuentra disponible. Por ejemplo, los mtodos de impedancia han demostrado buena correlacin
entre el tiempo de deteccin de impedancia con el conteo total de colonias para suspensiones
bacterianas y fngicas tratadas y no tratadas con preservativos; an as, la posible interferencia de los
constituyentes de la formulacin en la determinacin de los tiempos de deteccin debe ser evaluada.
An se requiere ms desarrollo para que la impedancia u otros mtodos rpidos puedan reemplazar los
procedimientos de conteo tradicionales.
Limitaciones de los PETs: Son laboriosos, demorados y caros. No obstante, son necesarios
Test de Ames
Es necesario identificar nuevos riesgos para la salud del hombre mediante el examen de todas las
sustancias que se incorporen al medio ambiente, aqu es importante valorar la posible actividad
cancergena de dichas sustancias: para esto estn las pruebas de mutagenicidad. Existen mltiples
fuentes de mutgenos potenciales pero una muy preocupante es el agua de consumo pblico, ya que los
concentrados orgnicos derivados pueden tener actividad genotxica. Aqu destacan los derivados
clorados, ya que el cloro es el desinfectante qumico ms utilizado para potabilizar aguas y ste puede
reaccionar con precursores presentes en el agua para producir cncergenos: por ejemplo, el MX o 3cloro-4-dimetil-5-hidroxi-2(5H) furanona y su ismero E-2-cloro-3-(diclorometil)-4-cido oxobutenoico.
En fin, hay preocupacin de si el consumo crnico de estas sustancias en la concentracin que podran
encontrarse en agua de consumo supone un riesgo real para la salud, y estudios epidemiolgicos
relacionan el consumo de agua desinfectada con cloro y la aparicin de cncer. Existen muchos ensayos
para valorar la actividad mutagnica de derivados clorados, entre los que se encuentran los test rpidos
in vivo e in vitro. Una alternativa econmica es el test de Ames que se desarroll en 1975 que utiliza
Salmonella e hgado de mamfero. El estudio del artculo evala la existencia de actividad mutagnica en
concentrados derivado de agua de consumo pblico en Madrid capital con el test de Ames.
Materiales y Mtodos

Material Biolgico: Utiliza cepas de Salmonella histidina dependientes, que derivan de

Salmonella typhimurium LT2 y que poseen una mutacin en el opern histidina por lo que el
medio debe proveerlo para que puedan crecer. Las cepas fueron TA 1535, TA 1538, TA 100 y TA
98. Resumir las especificaciones en una tabla. En los ensayos con activacin enzimtica, se
utiliz la fraccin microsomal de hgado de rata S9 mix y como inductor enzimtico, Aroclor
Cepa

Mutacin en opern

Mutaciones uvrB y rfa

PKM 101 (factor R)

TA 1535
TA 100
TA 1538
TA 98

His G46
His G46
His D3052
His D3052

Si
Si
Si
Si

No
Si
No
Si

Mutacin
His G46
His D3052
uvrB
rfa
PKM 101

Descripcin
Sustitucin de pares de bases en el operon histidina
Delecin de un par de bases en el operon histidina (frameshift)
Deficiencia en el mecanismo de escisin/reparacin
Mayor permeabilidad a macromolculas
Resistencia a ampicilina y aumenta probabilidad de duplicacin con error del ADN

Muestras de agua y tratamiento: Se procesaron 3 muestras, aumentando concentracin de la 1

a la 3. El pH del agua deba estar neutro y la extraccin de los compuestos fue con tres
disolventes, el residuo se re-disolvi con DMSO.

Metodologa del Test de Ames:

1.
2.

3.

Revisar que no haya mutacin en las cepas utilizadas (con respecto a las especificaciones de la
tabla).
Se realizaron dos ensayos de mutagenicidad y un control de toxicidad. Tambin se realizaron
controles positivos con mutgenos conocidos. En los ensayos sin S9 se emple para TA 1535 y TA
100 azida sdica, para TA 1538 y TA 98 se emple 2-nitrofluoreno. En los ensayos con S9 se
emple para todos 2-aminofluoreno.
El ensayo de mutagenicidad se realiz por incorporacin en placa, con ambas variantes (S9+ y S9-).
Se mezcl la cepa bacteriana con la sustancia problema (aadiendo 0,9 mL de S9 mix segn sea el
caso) y se verti la mezcla en una placa de agar glucosado.

Cuantificacin del efecto mutagnico: Se calcula el ndice de mutacin como el cociente entre el
nmero de colonias revertantes inducidas y el nmero de colonias revertantes espontneas (las
del control negativo). Se utiliz la regla de las 2 veces, de tal forma que si I > 2 se considera
mutagnico, 1,5 < I < 2 se considera levemente mutagnico e I < 1,5 se considera no mutagnico.
Si no hay crecimiento, I = 0, la sustancia se considera txica. Se aplica un ANOVA para comparar
las diferencias entre los dos grupos de muestras.

Resultados: Soy perezosa as que hay tabla.

Cepa

Sin S9

Con S9

TA 1535

Ligero incremento en nmero de

revertantes conforme aumenta
concentracin, alcanzando LM.

ndices de mutacin
netamente inferiores

TA 100
TA 1538
TA 98

Ninguna es mutagnica pero hay

aumento del ndice con la
concentracin
Ninguna es mutagnica pero hay
aumento del ndice con la
concentracin
Ninguna es mutagnica

Correlacin
No hay diferencia
estadsticamente significativa
en el nmero de revertantes
con o sin S9.

ndices de mutacin
netamente inferiores

No hay diferencia
significativa

ndices de mutacin
netamente inferiores

No hay diferencia
significativa

ndices de mutacin
netamente inferiores

No hay diferencia
significativa

Discusin: En el estudio no se encontr actividad mutagnica de los concentrados orgnicos clorados,

aunque en la cepa TA 1535 s se alcanzaron valores de ligera mutagenicidad, casi mutagenicidad positiva,
y en la TA 100 se encontraron resultados muy parecidos. Ambas cepas son mutantes por sustitucin de
pares de bases en el opern histidina, por lo cual son buenas para detectar mutaciones que produzcan
sustitucin, a diferencia de las TA 1538 y TA 98 que detectan mutaciones que ocasionan desplazamiento
en el marco de lectura; por tanto, es posible que las mutaciones que se llevaran a cabo por los
organoclorados seran por sustitucin de pares de bases. Posiblemente, la regla de las dos veces se
queda corta y es demasiado restrictiva (en especial con la TA 100 porque es una cepa de mutacin
espontnea alta de ah que propongan el criterio de un exceso de 100 revertantes).
Razones para falso negativo: toxicidad sustancia, estructura compuesto, inadecuado sistema de
transporte, imposibilidad del teste Ames para detectar aberraciones cromosmicas, dificultad de aislar
voltiles. La presencia de S9 en general disminuye la mutagnesis derivada de aguas cloradas
(metabolizacin de compuestos activos a derivados no mutagnicos)
Pruebas de Pirgenos
Los productos farmacuticos para uso parenteral deben estar libres de pirgenos generados por
bacterias gram + y -, virus y hongos. Hay evidencia de que las endotoxinas inducen la liberacin de
pirgenos endgenos que tienen actividad pirognica e inflamatoria como IL-1a, IL-1B, TNF-a e IL-6.
Tipos de pirgenos: Segn el microorganismo que los generan. Los ms estudiados son las endotoxinas
LPS (lipopolisacrido), aunque tambin hay lipopptidos, pptidoglicano y cidos teicicos.

LPS: Producidos por las gram son de particular cuidado; son molculas de gran peso molecular
asociadas a la membrana externa de estas bacterias, consisten en una fraccin lipidica (lpido A,
genera la pirogenicidad) unida a un ncleo de polisacrido que a su vez se une al antgeno O cada
endotoxina tiene composicin variable que afecta su funcin y actividad biolgica, las cuales
incluyen induccin de fiebre y protenas de fase aguda, dolor de cabeza y shock hipotensivo.

Hay diferentes pruebas de pirgenos:

Prueba de pirgenos en conejos (RPT por sus siglas en ingls): Muy usada, tiene como
inconvenientes su baja sensibilidad, ausencia de cuantificacin, que no se puede aplicar a
algunos productos y que involucra animales. Se considera positivo si el producto produce un
aumento de 0,5C en la temperatura del conejo despus de ser inyectado en su oreja. Se ve
interferido por la presencia de hidrxido de aluminio y algunas protenas.

Prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL): Deriva de la observacin que la sangre
(hemolinfa) de estos crustceos se coagula en presencia de endotoxinas. Da falsos positivos y
negativos y adems no detecta pirgenos de gram +, virus y fungi. No se puede aplicar para
varios productos farmacuticos de naturaleza compleja, como los biolgicos. Reacciona con
beta-glucanos tambin. Se ve interferido por la presencia de hidrxido de aluminio y algunas
protenas.
o

Procedimiento: Hay dos tipos: Gel-clot (coagulacin en gel) y ensayo cromognico. No

hay diferencias significativas en los resultados de ambos

Ensayo de Gel-clot: Se aade a la caja de petri iguales volmenes de lisado y solucin de

prueba, se incuba a 37C por 1 h, se hacen diluciones seriadas y se puede determinar el
punto final aadiendo azul de metileno de tal forma que si hay mezcla el resultado es
negativo o si hay distribucin en la superficie el resultado es positivo. La concentracin
de endotoxinas se calcula al multiplicar el recprico de la dilucin mxima que dio
resultado positivo (EU/mL).
Ensayo Cromognico: Hay kits especiales para esto. Se realizan en microplacas a 37C. Se
aade 50 mcL de las muestras o estndar en los pozuelos y luego 50 mcL de la solucin
de LAL. Se incuba a 37C por 10 minutos y se aaden 100 mcL de solucin sustrato y se
detiene la reaccin despus de 6 minutos con 100 mcL de cido actico 25%. Se lee la
absorbancia a 405 nm y se realiza una curva de calibracin.

Uso de lneas celulares, monocitos de sangre perifrica y sangre entera: Se basa en el hecho de
que la fiebre es mediada por la produccin de pirgenos endgenos producidos por los
monocitos en respuesta de la presencia de pirgenos exgenos. Estos pirgenos endgenos
incluyen a la IL-1a, IL-1B, TNF-a e IL-6.
o

Lneas celulares: Se pueden utilizar lneas celulares relacionadas a macrfagos como

indicadores de pirgenos pero los sistemas propuestos estn sujetos a un alto grado de
variabilidad (cultivos de clulas primarias) o de sensibilidad insuficiente (lneas celulares).
Adems, se espera que los cultivos de lneas de monocitos difieran en su sensibilidad al
LPS, resultado en una seleccin incontrolada de clulas de distinta sensibilidad en
funcin del tiempo y en mano de diferentes investigadores. En uno de los artculos, para
evadir estas desventajas, se clonaron y seleccionaron lneas celulares de monocitos
humanos que combinan alta sensibilidad y estabilidad fenotpica duradera para as
asegurar alta reproducibilidad. Se usaron 2 clones de Mono Mac 6 (MM6) y un clon de
THP-1 que muestran alta sensibilidad a LPS al ser probados segn la produccin de TNF
con ELISA.

Procedimiento: Se sembraron las clulas en microplacas con 200 mcl de medio

apropiado. Se probaron las diluciones de LPS despus de 44 h (10 mcl). Despus de 5 h,
el sobrenadante fue recogido, centrifugado para quitar clulas contaminantes, y
almacenado a -20C hasta determinacin de TNF. Se prob el contenido de TNF con
ELISA.
Resultados: Los clones de MM6 tuvieron una respuesta fuerte de TNF inducida a 1
mcg/mL por todos los tipos de LPS y compuestos derivados, excepto por el lpido A libre
de cidos grasos; los otros agentes indujeron respuestas ms dbiles, o ninguna, a la
misma concentracin. Respuesta: LPS liso > LPS rugoso > difosforil lpido A > LPS
detoxificado > monofosforil lpido A. En general, MM6 y THP-1 tuvieron respuestas
similares, excepto por el difosforil lpido A que no mostr respuesta a las ltimas.
En soluciones de IgG y albmina, hay buena correlacin con LAL pero en las
preparaciones con IgG la actividad inducida de TNF fue demasiado baja, lo cual
supone una inhibicin por parte de IgG de la produccin de TNF.
En soluciones para dilisis, se observ que las THP-1 pudieron distinguir entre
muestras positivas y negativas para endotoxinas determinadas por LAL. En
general, tanto MM6 y THP-1 son buenas discriminando estas preparaciones y se
obtuvo buena correlacin. Tambin se observ buena correlacin con la RPT en
pruebas de vacunas.
En general, el mtodo propuesto iguala al RPT en sensibilidad y parece ser ms
especfico que el LAL, aunque es necesario hacer validacin. A comparacin del
LPS, pirgenos de gram positivos son inductores menos potentes de TNF en los
clones probados

Deteccin de Pirgenos mediante sangre entera

Es necesario hacer pruebas de pirgenos para asegurar la seguridad del usuario cuando los productos
sobrepasan las barreras naturales del cuerpo humano. La primera prueba, la prueba de pirgenos con
conejos (RPT) se introdujo en la BP que refleja, hasta cierto punto, la pirogenicidad de los contaminantes
bacterianos que se encuentran en productos biolgicos. En 1885, el descubrimiento de que la hemolinfa
del cangrejo herradura (Limulus polyphemus) coagula en contacto con LPS, permiti el desarrollo de la
prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL), tambin llamada prueba de endotoxinas bacterianas
(BET) en la USP, que reemplaza en varios casos a la RPT que es proclive al error y muy costosa; no
obstante, LAL no refleja la fiebre humana y no hay correlacin entre LAL y la expresin de citoquinas. En
los 40s, se descubri que el cuerpo humano libera sustancias pirgenas endgenas en respuesta de
sustancias endgenas a manera de mecanismo de defensa. A finales de los 80s se desarroll la primera
IL-1B y con ella inici el desarrollo de pruebas de pirgenos alternativas utilizando monocitos y sangre
entera. Entendiendo este mecanismo se podran probar sistemas que reflejen este mecanismo,
incluyendo a los pirgenos que no son endotoxinas (NEP) y los receptores de LPS y NEP.

RPT: En resumen, se inyecta la muestra en los conejos y se registra el cambio en la temperatura

corporal de los conejos. La sensibilidad de los conejos depende de la cepa utilizada y de las
condiciones experimentales (edad, gnero, condiciones del bioterio). La cepa ms sensible
desarrolla aumento significativo de la temperatura a 500 pg de LPS de referencia por Kg, esto se
traduce a 50 pg/mL mientras que el umbral de fiebre para el humano suele ser de 30 pg/mL. Es

una prueba cualitativa y slo da un resultado cuantal (pasa o no). Adems, no es apropiado para
varios productos como radiofarmacuticos, quimioteraputicos, analgsicos, antipirticos,
citoquinas, dopamina e inmunosupresores, as como antipirticos y esteroides y medicamentos
que producen reacciones inmunolgicas. Se dice que detecta endotoxinas y NEPs.

LAL o BET: Hay muchas formas de medir la reaccin inducida por LPS (coagulacin,
turbidimtrica, medida cromognica cintica o de punto final). Permite medidas semicuantitativas o cuantitativas de endotoxinas con un lmite de deteccin de 3 pg/mL o 0,03
EU/mL, incluso en variantes ms sensibles hasta 0,005 EU/mL. No obstante, la prueba slo
puede realizarse a muestras lquidas, dificultando su aplicacin a slidos como los dispositivos
mdicos (esto se subsana mediante enjuagado del producto). Tambin tiene problemas con
fluidos para dilisis, liposomas, nanopartculas y terapias celulares. Adems, frmacos que
interfieran con el sistema de coagulacin (inhibicin en el caso de los quelantes e inhibidores de
proteasa; o fortalecimiento en el caso de alto contenido protico y proteasas), no pueden ser
probados. Tambin se sabe que hay varios interferentes que requieren como mnimo dilucin;
LAL es inducido tambin por 1,3-B-d-glucanos y polisacridos como fibras de celulosa, dando
falsos positivos. Finalmente, no detecta componentes inmunoestimulantes de bacterias gram +
y en general no detecta NEPs.

Ensayos basados en clulas humanas o Prueba de Activacin de Monocitos (MAT): Incluye

pruebas utilizando clulas mononucleares de sangre perifrica (las primeras), sangre humana
entera, sangre criopreservada, lneas de monocitos (MM6) y lnea celular de monocitos
humanos de leucemia aguda (THP-1). Hay buena correlacin entre la prueba con sangre entera y
RPT. La ECVAM ya ha validado 5 variantes de MAT, con un lmite de deteccin menor que RPT,
adems de ser ms exactas y eficientes en costo y tiempo. Son capaces de detectar pirgenos de
gram +. Se utilizan desde 2010 para detectar pirgenos en inyectables, segn sea el caso,
aunque si alguien quiere utilizarlos, debe validar el mtodo. El MAT con sangre entera, o prueba
de pirgenos in vitro, tiene la ventaja de que no se requiere medio celular y no hay artefactos
por preparacin; las clulas se mantienen en su medio natural. Adems, como se utiliza una
suspensin celular, la sangre puede estar en contacto con cualquier material, incluso
dispositivos mdicos o filtros con muestras de aire. La prueba no se ve perturbada por
componentes que s afectan LAL o RPT como el hidrxido de aluminio en vacunas, parenterales
lipidicos, frmacos inmunomoduladores o txicos, agua, soluciones de dilisis y componentes
naturales con estructuras parecidas a glucanos.

Estmulos que no son por endotoxinas: NEPs incluyen protenas asociadas a endotoxinas,
peptidoglicano, muramilpptidos, porinas, DNA bacteriano, cidos lipoteicicos y otros
componentes de la pared celular, superantgenos, exotoxinas, lipoarabinomananos de
micobacterias, componentes fngicos (mananos, glucanos, manoprotenas), componentes de
parsitos (fosfoinositol), virus y contaminacin no microbiana.

Base Molecular de las reacciones pirognicas: En los mamferos, los receptores especializados
de reconocimiento de patrones (PRRs) se encuentran en monocitos y macrfagos, los cuales

reconocen los patrones microbianos asociados a patgenos (PAMPs) que incluyen componentes
de la pared celular como los LPS, cidos lipoteicicos (LTA) y pptidoglicano, as como
lipopptidos, flagelina, componentes virales y fngicos y DNA bacteriano. Se han identificado 6
familias de PRRs que inician vas de sealizacin pro-inflamatoria, siendo los ms estudiados los
receptores tipo Toll (TLRs). Esto tiene como consecuencia una variedad de respuestas que
disparan la produccin de citoquinas pro-inflamatorias. TLR2 es responsable del reconocimiento
de PAMPs de gram + como las lipoprotenas bacterianas, lipomananos y LTAs; TLR3 reconoce
RNA bicatenario de virus, TLR4 se activa por LPS, TLR5 responde a flagelina y TLR2 a CpG
desmetilado de DNA; TLR7 y TLR8 reconoce molculas antivirales pequeas y RNA de cadena
sencilla. Tambin forman redes complejas que reconocen otros compuestos. Los receptores tipo
NOD (dominio de oligomerizacin de nucletidos) son una familia de receptores de
reconocimiento intracelular que reconocen otras cosas como NOD2 y el dipptido muramil que
se encuentra en casi todas las bacterias. Los receptores de Lectina tipo C son receptores
fagocticos que se unen residuos de carbohidratos de varios patgenos; estn presentes en
muchos macrfagos y clulas dendrticas.

Evidencia de deteccin de NEPs por MAT de sangre entera

o

o
o

Suero de Albmina Humana: Un lote contaminado con NEPs fue descubierto con MAT a pesar de
que daba negativo para LAL y RPT. Reacciones fbriles por suero de albmina fueron reportados
a pesar de que RPT daba negativo, este lote s daba positivo con MAT.
Solucin para infusin: Un lote causaba fiebre en hospitales a pesar de dar negativo con LAL y
RPT; un estudio ciego comprob la induccin de pirgenos endgenos con MAT, lo que supone
contaminacin con NEPs que no se detectan por LAL, adems uno de ellos no es pirognico para
conejos aunque s para humanos.
Solucin para dilisis: La misma historia de arriba.
Biopelculas: Aparecieron en tubos para dilisis, lo cual es bastante peligroso ya que los fluidos
que pasen por ah pueden llevar componentes de biopelculas a la sangre y al sistema humano.
LAL no es suficiente para detectarlas.
Deteccin de pirgenos en parenterales inmunomoduladores, txicos y de gran volumen: En un
estudio se demostr que era posible detectar concentraciones muy bajas de LPS y LTA (0,1 pg/mL
o 0,001 EU/Ml)

Ejercicios de validacin y comparacin entre RPT y LAL/BET: El estudio de validacin comprob

que todos los puntos finales, IL-1B/IL-6/TNF-a/nepterina, estn correlacionados con LPS de tal
forma que permite su deteccin. Adems se observ que las lneas celulares y clulas primarias
son apropiadas para la evaluacin. Todos los mtodos evaluados sirven para prueba de
pirogenicidad aunque tienen cada uno sus ventajas y desventajas:
o
o

Los basados en sangre humana fresca son muy robustos, transferibles y prcticos. Son buenos
anlisis de rutina. Es ms cercana a los humanos
Las lneas celulares tienen como ventaja la disponibilidad de clulas y la posibilidad de
manipulacin gentica para optimizacin.

Criterio/Prueba

Principio

Procedimiento

Ventajas

Desventajas

Aplicaciones

Prueba de Pirgenos en Conejos

(RPT)
Inyectar soluciones con
pirgenos en conejos les produce
fiebre (aumento de temperatura
corporal)
Se inyecta un volumen (10
mL/Kg) en la oreja de 3 conejos.
Se registra el cambio de
temperatura corporal y se
considera positivo si hay
incremento mayor a 0,5 C

Detecta gran variedad de

pirgenos (NEPs y LPS). Permite
evaluar productos que no se
pueden evaluar con LAL
(quelantes, proteasas, biolgicos)
Es una prueba in vivo. Cuestiones
ticas. Baja reproductibilidad y
alta influencia de factores
experimentales. No detecta
todos los pirgenos.
Relativamente mala sensibilidad
(0,5 EU/mL). Es nicamente
cualitativa. No se puede aplicar a
radiofrmacos,
inmunomoduladores,
quimioteraputicos y
antipirticos
Es el estndar de prueba de
pirgenos. En medicamentos que
no se puedan valorar por LAL (no
se pueden neutralizar
interferencias) o en los que se
indique en la monografa

Prueba de lisado de amebocitos

de Limulus (LAL)
Endotoxina activa cofactor C que
a su vez activa una protena procoagulante que gelifica la
solucin de prueba.
Se coloca en microplacas el lisado
de amebocitos; se aade la
sustancia de prueba y se deja
incubar a 37C por 1 h. Si se
produce coagulacin, la prueba
es positiva (hay otros mtodos de
deteccin del punto final)

Pruebas de Activacin de
Monocitos (MAT)
Pirgenos exgenos activan clulas
inmunes (monocitos) que producen
pirgenos endgenos que pueden
ser detectados con ELISA
Se coloca en microplacas un inculo
de clulas (o la sangre), se deja
incubando y se aade la sustancia
de prueba. Se incuba por 5 h y se
mide la produccin de pirgenos
endgenos como TNF con ELISA.

Es una prueba cuantitativa de

LPS. Tiene mayor sensibilidad y
reproductibilidad que RPT (0,03
EU/mL). Es una prueba in vitro

Puede ser una prueba cuantitativa

para LPS y NEPs. Puede llegar a ser
muy sensible. Detecta sustancias
que no son pirgenos para conejos
pero s para humanos. Mayor
reproductibilidad que RPT. Es una
prueba in vitro. No se ve
perturbada por sustancias como
hidrxido de aluminio

No detecta NEPs. Falsos positivos

con 1,3-B-d-glucanos y derivados
de celulosa. Se ve interferido por
varios excipientes (quelantes,
hidrxido de alumnio, proteasas)
que afectan coagulacin.
Tambin tiene problemas con
fluidos para dilisis, liposomas,
nanopartculas y terapias
celulares

No est validada. En los cultivos

celulares, la sensibilidad y
reproducibilidad depende de la
lnea elegida y las variaciones
genticas inciden en sta. Algunas
lneas celulares no son muy
sensibles a NEPs.

Para detectar endotoxinas en

productos parenterales (en
especial cuando se asegure que
el nico pirgeno contaminante
es endotoxina)

Ensayo de pirgenos alternativo.

Para productos que no se puedan
valorar con RPT o LAL. Puede ser
aplicado en cualquier caso siempre
que se valide la prueba.

Guas para la Industria: Pruebas de Pirgenos y Endotoxinas Q&A

1. Cmo establezco un plan de muestreo para la prueba del producto en proceso y liberacin del
terminado? Las firmas deben incluir un plan de muestreo como parte de la documentacin de
aplicacin. En el plan se debe considerar la posibilidad de contaminacin de materias primas,
materiales en proceso y producto terminado. Especficamente, se debe tomar en consideracin
aspectos del diseo de produccin, incluyendo la consistencia del proceso de manufactura, impacto
de los tiempos de demora en el proceso, pasos de remocin de endotoxinas y especificaciones del
producto terminado. El plan de muestreo debe ser dinmico, las firmas deben comenzar con
cobertura mxima y ajustar sus planes de muestreo segn ganan confianza en la prevencin de
endotoxinas en el proceso. Tambin deben actualizar los archivos legales en caso de ajuste del plan.

Para productos biolgicos, los cambios en-proceso a los planes de muestreo son reportados
anualmente. Para dispositivos, un aviso a 30 das podra ser apropiado.
2. Cundo se debe hacer re-evaluacin? Cuando hay resultados conflictivos en una corrida las firmas
deben consultar la USP captulo <85>, Prueba lmite de Gel-Clot (Interpretacin), como gua en la
repeticin de la prueba. Como se especfica en este captulo, si la falla ocurri a una dilucin menor
que la dilucin mxima vlida (MVD), la prueba debe repetirse utilizando una dilucin mayor que no
exceda la MVD. Un registro de esta falla debe ser incluido en los resultados de laboratorio. Si la
prueba se realiza en la MVD y se observa un resultado fuera de especificaciones (OOS) que no puede
ser atribuido a un error experimental, el lote se rechaza. Todos los procedimientos, incluyendo las
reevaluaciones que cumplan con estos lmites, deben especificarse en los procedimientos estndar
escritos aprobados por la unidad de control de calidad.
3. Es importante el almacenamiento y manipulacin? Si. La habilidad de detectar endotoxinas puede
verse afectada por ambas. Las firmas deben establecer procedimientos de almacenamiento y
manipulacin (que incluye el mezclado de productos) de las muestras para el anlisis de endotoxinas
bacterianas utilizando datos que demuestren la estabilidad del contenido de endotoxinas. Los
protocolos deben considerar la fuente de endotoxinas utilizadas en el estudio, teniendo en cuenta
que las endotoxinas purificadas pueden reaccionar diferente a la fuente nativa.
4. Se pueden juntar las muestras de producto terminado para el anlisis de endotoxinas en una
muestra compuesta antes del anlisis? Si. En la mayora de los casos, las unidades de producto
terminado puede juntarse en una muestra compleja y ser probado para endotoxinas. La muestra
compleja puede ser representada por la unidad entera o por alcuotas parciales de volumen igual de
los contenedores del producto terminado de un lote. La agrupacin puede aceptarse para
parenterales de pequeo volumen siempre que se ajuste la MVD a un valor proporcional y menor
debido a la probabilidad de diluir una unidad con niveles de endotoxinas peligrosos. Esta MVD
ajustada se obtiene al dividir el MVD de una muestra individual por el nmero total de muestras a ser
juntadas. La FDA recomienda no juntar ms de tres unidades teniendo en cuenta que se deben
probar contenedores representativos del producto antes, durante y despus del proceso. Si la
reduccin de la MVD resulta en la imposibilidad de superar las interferencias relacionadas con el
producto por dilucin insuficiente, las muestras deben ser probadas individualmente.
Los dispositivos mdicos tambin pueden juntarse en una muestra compuesta, utilizando tcnicas de
enjuagado/elucin y muestreo como las descritas por la ISO. La FDA recomienda que las muestras
agrupadas consistan en alcuotas removidas aspticamente de cada contenedor, ya que los
contenedores quedan disponibles para una posible reevaluacin. Algunos productos no deberan ser
agrupados. Dos ejemplos son los productos que tienen una MVD baja y las suspensiones ya que no se
garantiza la homogeneidad de la alcuota (posibles interferencias). La FDA tampoco recomienda
agrupar muestras de diferentes etapas del proceso de produccin porque no se puede asegurar la
homogeneidad de los materiales.

5. Se pueden utilizar ensayos alternativos a los de la USP? Si, siempre que los procedimientos
alternativos provean ventajas en trminos de exactitud, sensibilidad, precisin, selectividad o
adaptabilidad a automatizacin o reduccin computarizada de datos, entre otras. Estos
procedimientos alternativos deben ser validados segn se describe en USP <1225>, Validacin de
Procedimientos, y debe demostrarse resultados equivalentes o mejores. Cuando hay diferencias, la
decisin final se realiza segn el mtodo de gel-clot a excepcin de que en la monografa del producto
se indique lo contrario. 2 ejemplos de ensayos alternativos: Ensayo del factor C recombinante de
cangrejo herradura y Prueba de pirgenos por activacin de monocitos.
6. Cul es el mejor proceso para pasar de un mtodo alternativo de prueba de endotoxinas
bacterianas (BET) a otro? La transicin entre pruebas que miden la misma entidad se puede realizar
al comparar las dos pruebas para verificar la equivalencia del nuevo mtodo. La comparacin de los
lmites de deteccin e inhibicin/sinergia es fundamental. La evaluacin de la sensibilidad del nuevo
mtodo se puede evaluar en muestras a las que se les adicion endotoxina (spiked samples). Adems
de las spiked samples, una batera de muestras de un producto con resultado positivo puede ser una
buena forma de comparar resultados. Para medicamentos, medicamentos animales y productos
biolgicos, la transicin a un nuevo mtodo debe ser presentada en un suplemento de aprobacin y
un protocolo de comparabilidad.
7. Qu pas con la tabla lmite de endotoxinas en el Apndice E de la gua de 1987? Est
desactualizada debido al incremento en el nmero de dosificacin (regmenes) y fuerza de dosis
desde la publicacin de dicha gua. La forma apropiada de establecer el lmite de endotoxinas es usar
los mtodos de clculo provistos por la USP o AAMI. Se deben comprobar los lmites de la monografa
para las dosis a ser evaluadas. Si hay muchos componentes en el producto terminado, el lmite de
endotoxinas general para productos parenterales no debe exceder el lmite umbral especificado en
USP <85>, sin importar el lmite de endotoxinas de un componente individual. Los productos
administrados va intratecal, oftlmicos o dispositivos mdicos pueden tener lmites que no se basan
en los parenterales, as que deben ser confirmados por la firma.
8. Cmo los conceptos de Calidad desde el Diseo pueden soportar los lmites de endotoxinas? La
estrategia para evaluar endotoxinas debe basarse en el entendimiento del proceso y producto en
combinacin con el manejo del riesgo para asegurar una calidad consistente del producto final. La
prueba en-proceso apropiada debe utilizarse para evaluar las reas de produccin que tienen riesgo
de formacin o inclusin de endotoxinas. Muchas firmas ya tienen programas de monitoreo de
ingredientes y componentes entrante, incluyendo el agua, para detectar endotoxinas. Para evaluar el
riesgo relativo de contaminacin, puede ser preferible una prueba cuantitativa al ensayo lmite para
identificar y corregir excursiones antes de que excedan la especificacin y causen que el producto
falle.
9. Cundo es apropiado utilizar la Prueba de Pirogenicidad en Conejos (RPT) del captulo <151> de la
USP? Algunos productos biolgicos pueden requerir RPT. Algunos frmacos an exigen en su
monografa esta prueba, aun as, se puede utilizar una prueba alternativa para endotoxinas si se
puede demostrar deteccin equivalente de pirgenos. Para materias primas y dispositivos mdicos,

las firmas deben evaluar el riesgo de pirgenos que no son endotoxinas; si la evaluacin indica que
stos pueden estar presentes, podra ser ms apropiado el RPT. Los ensayos de endotoxinas
bacterianas pueden estar sujetos a una variedad de interferencias relacionadas con las propiedades
fsicas y qumicas del producto; si stas no pueden ser mitigadas por dilucin y otros mtodos vlidos
de preparacin de muestras, se debe utilizar el RPT.
10.Cmo puede determinarse un lmite de endotoxinas apropiado para un producto veterinario que
se aplica a mltiples especies? Se debe basar en la dosis mxima utilizada en la especie ms pequea.
Si la etiqueta indica que el producto puede ser utilizado en animales jvenes y adultos, los jvenes se
consideran el peor caso. Si el peso de un animal se requiere para calcular la dosis, se debe utilizar el
peso promedio para esa especie.
11.Cul es el lmite de endotoxinas para dispositivos mdicos? La USP <161> provee estos lmites para
dispositivos de transfusin e infusin. Los lmites de endotixnas dependen del uso recomendado para
el dispositivo y con qu hace contacto. Para dispositivos mdicos utilizando el volumen de extraccin
descrito (40 mL), el lmite es de 0,5 EU/mL o 20 EU/dispositivo para productos que se encuentran en
contacto directo o indirecto con el sistema cardiovascular y linftico. Para dispositivos en contacto
con el fluido cefaloraqudeo, el lmite es de 0,06 EU/mL o 2,15 EU/dispositivo. Para dispositivos en
contacto directo o indirecto con el ambiente intraocular, el lmite de endotoxinas puede ser ms
estricto.
Para evaluar endotoxinas en dispositivos mdicos se puede realizar enjuagado, inmersin o incluso
puede ser necesario el desarme del equipo. Si no se indica lo contrario, se prefiere el enjuagado: 1)
cada una de las 10 unidades debe ser enjuagada con 40 mL de agua libre de pirgenos, 2) para
dispositivos muy grandes o pequeos, el rea superficial que hace contacto con el paciente puede
utilizarse para ajustar el volumen de extraccin (los lmites de endotoxinas pueden ajustarse de la
misma forma)
12.Cul es la expectativa de la FDA para el tamizaje regular de productos farmacuticos? Idealmente,
el producto sin diluir debe ser evaluado siempre que no haya ninguna interferencia (inhibitoria o
potenciadora) del LAL. Sin embargo, en algunas formulaciones los componentes interfieren con el LAL,
por lo cual, la USP recomienda que el producto sea diluido para sopesar dicha interferencia. La MVD
calculada es la dilucin de una muestra a la cual el lmite de endotoxinas sera detectado, pero no
debe ser la dilucin de prueba regular.
Cuando hay interferencias durante el desarrollo del producto, la FDA recomienda que la firma
determine la menor dilucin que podra neutralizar la condicin interferente. La FDA recomienda que
la firma inicie el tamizaje del producto en una dilucin justo por encima del nivel que neutraliza la
interferencia. Por ejemplo, si el producto tiene una MVD de 1:100 y el producto inhibe la prueba a
1:10 pero no a 1:20, lo mejor sera realizar la prueba a 1:30. Si las endotoxinas se detectan a este nivel
entonces la firma debera realizar una enumeracin completa para titular la cantidad real de
endotoxinas.

13.An se aceptan los estndares de control de endotoxinas para realizar la BET? Los estndares de
control de endotoxinas (CSEs) son preparaciones de endotoxinas diferentes a los estndares de
referencia internacionales o nacionales que son trazables en su calibracin a los estndares
internacionales. CSEs pueden ser estndares secundarios o terciarios y suelen ser producidos y
certificados por un fabricante de agente LAL para usar con un lote especfico de agente en las
condiciones de ensayo definidas. CSEs se consideran una fuente aceptable para la preparacin de
curvas de calibracin como controles de ensayo y han generado un ahorro a los usuarios del LAL y
ayudado a preservar el inventario de estndares primarios. La FDA alienta el uso continuo de CSEs
que estn adecuadamente calibrados a estndares de referencia internacionales de endotoxinas.