AOAC Mtodo Oficial 979.

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Vitamina D en preparaciones de Vitaminas
Mtodo de Cromatgrafo Lquido
(Aplicable para aceites que contienen 100 000 IU colecalciferol/g o vitamina D3/g;
resinas 20 000 000 IU colecalciferol/g ; y polvos y preparaciones acuosas 25 000
IU colecalciferol/g ).
A. Principio
Concentrados secos y dispersiones acuosas son saponificados y extrados. Vitamina D
en soluciones de resina y aceites son disueltas en solventes. Vitamina D y previtamina
D son separadas de impurezas por cromatografa lquida.
Concentraciones de Previtamina D se calcula como la vitamina D usando un factor de
calibracin. Vitamina D es la suma de vitamina D y previtamina D.
B. Apparatus
(a) Cromatografa Lquida.- Hewlett Packard 1010 A, o equivalente a
detector UV con 254 nm. Condiciones de operacin tpica: velocidad del
grfico, 1cm/min; tasa de flujo de eluyente, 2ml/min (aprox. 100 atmferas);
sensibilidad del detector, 0.128 AUFS; temperatura, ambiente; vlvula de
inyeccin de volumen, 20 l.
(b) Columna de cromatografa.- Acero inoxidable, 150 x 4.6 (dimetro
interior) mm, empacado con partculas de 5m de Lichrosorb Si 60, pasando
la prueba de desempeo del sistema. Antes de introducir esta columna, la
fase mvil debe estar bombeada a travs de 100 cm x 4 mm de columna de
acero inoxidable con un contenido de 50-250 m de slice, secada por 4 hrs a
250C. Diferentes longitudes de columnas o marcas de embalaje puede ser
sustituido, y el volumen de inyeccin puede variar entre 10-30 l, si cumple
siempre la prueba de desempeo del sistema.
C. Reagents
(a) n-hexano.- Calidad de espectro. Secarlo pasando a travs de la columna
de 60 x 8 cm de dimetro que contiene 500g de slice de 50-250 m secado
por 4 hrs a 150C.
(b) Alcohol n-amlico.- Grado reactivo.
(C) Fase mvil.- n-hexano y alcohol n-amlico (993 + 3). Ajustar la proporcin
de los componentes, si es necesario realizar un ensayo sustituible.
(d) Tolueno.- Grado reactivo o nanogrado.
(e) Solucin estndar de Vitamina D.- Pesar con precisin aproximadamente
80 mg de solucin estndar de Colecalciferol USP en matraz volumtrico de

ambar de 25 ml. Disolver sin calor en tolueno, y diluir hasta formar volumen
con tolueno. Preparar fresco a diario.
(f) Solucin estndar sustituible.- Preparar una solucin que contenga 2 mg
de Vitamina D3 y 0,2 mg trans-vitamina D3 de aceite vegetal, disolver 0,25 g
de la solucin en 10 ml de tolueno y fase mvil (1 + 1). Picos de transvitamina D3 y previtamina D3 deberan tener aproximadamente la misma
altura. Si es necesario, el contenido de previtamina D3 puede elevarse
mediamente calentamiento de la solucin de aceite a 90C por aprox. 45 min.
Almacenar el aceite a 5C.
(g) Solucin de Ascorbato de Sodio.- Disolver 3.5 g de cido ascrbico en 20
ml NAOH (1N). Preparar fresco a diario.
(h) Solucin de Sulfuro de Sodio.- Disolver 12 g Na2S9H2O en 20 ml de H2O y
diluir a 100 ml con Glicerina al 87%.
(i) Solucin de Hidrxido de Potasio.- (1) (50% peso/volumen) Disolver 50 g
de KOH en 50 ml de H2O y enfriar. Preparar fresco. (2) (3% en alcohol)
Disolver 3 g de KOH en H2O, adicionar 10 ml de alcohol, y diluir a 100 ml con
H2O. Preparar fresco.
(j) ter.- Acido y perxido libre.
D. Prueba de desempeo del sistema
Cromatografiar porciones de 20 l de solucin estndar sustituible 6 veces.
Determinar la constante del pico de altura mediante el clculo de desviacin
estndar y luego la desviacin estndar relativa = Desviacin estndar x 100/ media
de los picos de altura. La desviacin estndar relativa debera ser 1%. Determinar la
resolucin del pico (R) entre previtamina D3 y transvitamina D3:
R=2D / (B + C)
Donde: D = distancia entre mximos picos de previtamina D3 y transvitamina D3; B =
ancho del pico de previtamina D3 ; y C = ancho del pico de transvitamina D3. La
resolucin del pico debera ser 1.0 para previtamina D3 / transvitamina D3
E. Determinacin del factor de calibracin
Pipetear 4 ml de solucin patrn de Vitamina D, (e), en un matraz volumtrico de 25
ml. Adicionar 1 ml de touleno y diluir hasta volumen con una fase mvil. Almacenar
en bao de hielo. Inyectar 20 L en la columna a travs de una vlvula de muestreo y
ajustar condiciones operativas del detector hasta obtener el mximo de altura de los
picos de escala. Repetir la inyeccin y promediar las alturas de los picos obtenidos
(=K).
Pipetear 5 ml de solucin patrn de Vitamina D, (e), en un matraz volumtrico de 25
ml, adicionar un poco de cristales de hidroxitolueno butilado, desplazar el aire con

gas N2, y unir el condensador de reflujo. Calentar en bao de agua a 90C con gas N2
constante en un lugar oscuro y fresco. Diluir el volumen con una fase mvil. Inyectar
20 L en la columna en las mismas condiciones que arriba. Determinar la altura del
pico de la Vitamina D calentada (L) y de la previtamina D formada (M). Calcular el
factor de calibracin como sigue:
CF= [(5K/4) L]/M
F. Preparacin de la muestra
a. Resinas.- Romper a golpes la muestra fuera del envase que la contiene. En
un matraz de 100 ml pesar con precisin 0,8 g aprox. (aprox. que contiene 20
000 000 IU de Vitamina D) de los pedazos ms grandes de la parte inferior del
recipiente. (Precaucin: La muestra de resina no debe ser nunca molida).
Disolver en tolueno y diluirlo hasta volumen. Pipetear 5 ml en un matraz
volumtrico de 100 ml, adicionar 15 ml de tolueno y diluir hasta volumen con
una fase mvil. (Concentracin = 10 000 IU o 0,25 mg de vitamina D/ml).
b. Vitamina D en aceites.- Pesar con precisin una cantidad de aceite que
contenga aprox. 500 000 IU en un matraz volumtrico de 50 ml. Disolver en
10,0 ml de tolueno y dilus hasta volumen con una fase mvil.
c. Preparaciones secas y acuosas.- Pesar con precisin en una matraz de
saponificacin una cantidad de muestra que contenga aprox. 100 000 IU de
colecalciferol. Adicionar en pequeas porciones, con agitacin suave 25 ml de
alcohol, 5 ml solucin de ascorbato de sodio, (g), y 3 ml de solucin KOH, (i).
Colocar en bao de H2O hirviendo por 30 min y enfriar rpidamente en H2O
fra que circula. Transferir la solucin al separador con ayuda de dos
porciones de 15 ml de H2O, 10 ml de alcohol, y dos porciones de 50 ml de
ter.
Agitar vigorosamente 30 segundos y luego dejar reposar hasta que se aclare.
Transferir la fase acuosa inferior al segundo separador y agitar con 10 ml de
alcohol y 50 ml de n-pentano. Dejar que se separe, y transferir la capa acuosa
inferior a la tercera fase de separador y pentano de la parte superior al
primer separador, lavando el segundo separador con dos porciones de 10 ml
de pentano y adicionar ese lavado al primer separador. Batir la fase acuosa en
el tercer separador con 50 ml de pentano y descartar la fase acuosa, y
adicionar el pentano al primer separador. Lavar los extractos de pentano
extrados con tres porciones de solucin de KOH al 3% (i), agitar
vigorosamente y luego lavar con sucesivas porciones de 50 ml de H2O hasta
que la ultima lavada sea neutral a la fenolftalena. Drenar las ltimas gotas de
H2O, adicionar dos papeles filtro de 9cm en tiras en el embudo y agitar.
Transferir el extracto de pentano lavado a un matraz de fondo redondo,
enjuagando el separador y el papel con pentano.
Evaporar la solucin al vaco hasta que seque con agitacin en bao de H2O a
40C. Enfriar en agua fra que circula y restaurar la presin atmosfrica con
N2. Disolver inmediatamente el residuo en 2 ml de tolueno, transferir a un

matraz volumtrico de 10 ml, enjuagando con una porcin de 1 ml de fase

mvil, y diluir hasta formar volumen con la fase mvil.
G. Determinacin
Inyectar 20 L la solucin patrn de Vitamina D y una solucin de muestra preparada
en la columna a travs de la vlvula de muestreo con detector ajustada como detalla
del apartado E. Medir las altura de picos de Vitamina D y previtamina D. Repetir la
inyeccin y la reinyeccin de solucin estndar despus de cada 4 inyecciones de
muestra para verificar que la respuesta se mantiene constante.
H. Clculos
El promedio de los picos ms altos obtenidos de replicas de patrones y muestras por
duplicado.
Vitamina D IU/g = {[PD+(PP x CF)]/PR} (W/W)(V/V) x 40,000
Donde: PD, PP y PR son los picos ms altos de vitamina D en la muestra, previtamina
D en la muestra, y vitamina D en el patrn, respectivamente; CF = factor de
calibracin previtamina D/vitamina D; W = peso del patrn en mg; W = peso de la
muestra en g; V = total solucin de la muestra en ml; V = total solucin patrn en ml
(=25x50/4); y 40,000 = Vitamina D IU/mg material de referencia USP.