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IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE TXICOS NO VOLTILES EN UNA


MUESTRA PROBLEMA

OBJETIVOS ACADMICOS
Que el alumno emplee mtodos de extraccin cida y bsica para separar txicos no voltiles de
naturaleza cida y bsica en una muestra problema.
Que el alumno emplee reacciones coloridas y cromatografa en capa fina (CCF) para la identificacin
de txicos no voltiles en una muestra problema.
Que el alumno cuantifique un txico no voltil en una muestra problema.
PROBLEMA
Separar e identificar escopolomina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico de una
muestra problema; y cuantificar el cido barbitrico presente.
REACTIVOS
Hidrxido de amonio (NH4OH)

Solucin de NaOH al 10%*

Metanol (MeOH)

Acetato de etilo (AcOEt)

cido actico glacial (AcOH)

Escopolamina

Reactivo de Dragendorff *

Diclorometano (CH2Cl2)

Reactivo de Dille-Koppanyi *

cido barbitrico

Paracetamol

cido 4-hidroxibenzoico

cido tartrico *

Solucin acuosa de cido actico 2 M*

Solucin saturada de nitrito de sodio (NaNO2) * cido clorhdrico (HCl) concentrado


cido clorhidrico 1N*

Sulfato de sodio anhdro

Acetato de etilo (AcOEt)

Solucin de NaHCO3 al 10%

*Ver APNDICE II

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EQUIPO
Rotaevaporador

Bomba de aspersin

Lmpara de luz ultravioleta

Espectrofotmetro

Parrilla de calentamiento
MATERIAL POR E QUIPO (Primera sesin)
Embudo de separacin de 250 mL

2 Agitador de vidrio

Embudo de cola corta

2 Probeta de 10 mL

Matraz Erlenmeyer de 125 Ml

6 Pipeta graduada de 10 mL

Matraz de bola de 50 Ml

2 Anillo metlico

Vaso de precipitados de 250 Ml

5 Tubos de ensayo

Vaso de precipitados de 100 mL

4 Anillos de corcho

Vidrio de reloj de 9 cm

2 Pipeta Pasteur

MATERIAL PARA LA CURVA (Primera sesin)


Matraz volumtrico de 25 Ml

1 Pipeta volumtrica de 4 mL

Matraz volumtrico de 10 mL

4 Micropipetas de 100-1000 L

Pipetas volumtricas de 5 mL

MATERIAL POR E QUIPO (Segunda sesin)


Cromatoplacas

1 Tubos capilares

Vasos de precipitados de 100 mL

4 Pipeta graduada de 10 mL

NOTA: El profesor proporcionara las celdas para las lecturas

DESARROLLO EXPERIMENTAL
El profesor proporcionar una muestra problema de 30 mL, la cual contiene los txicos no voltiles
escopolamina, paracetamol, cido 4-hidroxibenzoico y cido barbitrico.
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PRIMERA SESION
A) EXTRACCIN CIDA
1. A 15 mL de la muestra problema se agrega una solucin acuosa de cido tartrico al 10% hasta
llegar a pH = 2. La muestra acidificada se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos
porciones de 15 mL de AcOEt; se separan las fases orgnicas y renen en un matraz. Guardar y
etiquetar

la fase orgnica y la acuosa y tratar segn lo indicado en los incisos 2 y 3

respectivamente.
2. Tratamiento de la fase orgnica:
2.1 La fase orgnica se extrae con dos porciones de 15 mL de una solucin de bicarbonato de sodio
(NaHCO3) al 10%; reunir las fases acuosas en un matraz y tratarlas de acuerdo a lo indicado
en el inciso 2.3.
2.2 A la fase orgnica obtenida en el inciso 2.1 se le adiciona sulfato de sodio anhidro para
eliminar el exceso de agua en la muestra, posteriormente la fase orgnica se filtra a travs de
algodn y se concentra in vacuo; el residuo final se reconstituye con 2 mL de AcOEt. Etiquetar
como fraccin A1.
2.3 La fase acuosa que se reuni en el inciso 2.1 se acidifica con HCl concentrado hasta llegar a un
pH = 1 y posteriormente se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt; las fases orgnicas
se renen en un matraz, se elimina el exceso de agua adicionando sulfato de sodio anhidro y
filtrando a travs de algodn, finalmente la fase orgnica se concentra in vacuo y el residuo
obtenido se reconstituye con 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin A2. Nota: La fase
acuosa se desecha de acuerdo a lo indicado en R0 (Apndice disposicin de residuos).
3. Tratamiento de la fase acuosa:
3.1 Adicionar gota a gota (aproximadamente 15 gotas), una solucin de NaOH al 10% hasta pH = 10.
La solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL
de CH2Cl2; las fases orgnicas se renen en un matraz, se seca sobre sulfato de sodio anhidro,
concentra in vacuo y el residuo final se reconstituye con 2 mL de CH2Cl2. Etiquetar como
fraccin A3.

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3.2 A la fase acuosa obtenida en el inciso 3.1, se adiciona gota a gota, HCl concentrado hasta llegar a
pH = 2. Etiquetar como fraccin A4.
4. Tomar 2 mL de la fraccin A4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el
residuo obtenido se reconstituye con 2 mL de metanol y se conserva para su posterior anlisis con
las pruebas de identificacin.
5. El remanente de la fraccin A4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico de acuerdo
al procedimiento indicado en el apartado C (Cuantificacin).
B) EXTRACCION BSICA
1. A 15 mL de la muestra problema se agrega gota a gota una solucin de NaOH al 10% hasta llegar a
un pH = 10 (aproximadamente 20 gotas). La solucin bsica se trasvasa a un embudo de separacin
y se extrae con dos porciones de 15 mL de CH2Cl2; se separan las fases orgnicas y renen en un
matraz. Guardar y etiquetar la fase orgnica y la acuosa y tratar segn lo indicado en los incisos 2 y
3 respectivamente.
2. Tratamiento de la fase orgnica: Adicionar sulfato de sodio anhidro para eliminar el exceso de
agua, filtrar sobre algodn y concentra in vacuo. El residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de
MeOH. Etiquetar como fraccin B3.
3. Tratamiento de la fase acuosa:
3.1 Adicionar gota agota, una solucin de HCl 1N hasta pH = 7. La solucin resultatnte se trasvasa
a un embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt
3.2 A la fase orgnica obtenida se le adiciona sulfato de sodio anhidro, se filtra a travs de algodn
y se concentra in vacuo, el residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como
fraccin B1.
3.3 La fase acuosa neutra del inciso 3, se lleva a pH = 2 adicionando HCl 1N. Se trasvasa a un
embudo de separacin y se extrae con dos porciones de 15 mL de AcOEt. A la fase orgnica
obtenida se le agrega sulfato de sodio anhidro, se filtra a travs de algodn, concentra a presin
reducida y el residuo final se reconstituye en 2 mL de AcOEt. Etiquetar como fraccin B2.
3.4 La fase acuosa remanente de la extraccin anterior, se etiqueta como fraccin B4.

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4. Tomar 2 mL de la fraccin B4 y llevar a sequedad con ayuda de una parrilla de calentamiento; el


residuo obtenido se reconstituye en 2 mL de metanol y se conserva para su posterior anlisis.
5. El remanente de la fraccin B4 se conserva para la cuantificacin de cido barbitrico.
Nota: El disolvente recuperado al final de la concentracin in vacuo se depositar en el contenedor
etiquetado como R1 para A3 y B3 y en R2 para A1-2 y B1-2. Los residuos de sulfato de sodio
anhidro se depositan en el contenedor etiquetado como R3.

C) CUANTIFICACIN DE CIDO BARBITRICO


PREPARACIN DE LA CURVA PATRN DE CIDO BARBITRICO
La curva patrn de cido barbitrico se prepara colocando en matraces volumtricos de 10 mL los
volmenes de la solucin patrn de cido barbitrico indicados en la Tabla 1 y llevando al aforo con
agua destilada:
Tabla 1. Curva patrn de cido barbitrico
No. de tubo

Alicuota de la

Concentracin

solucin patrn de cido barbitrico (mL)

de cido barbitrico (mg/mL)

0.0

BLANCO

1.5

0.45

0.90

1.80

2.40

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TRATAMIENTO DE LAS FRACCIONES QUE CONTIENEN CIDO BARBITRICO:


MUESTRA PROBLEMA, CURVA PATRN Y BLANCO
1. Colocar en tubos de ensaye 1 mL de cada una de las fracciones que contienen cido barbitrico
(muestra problema, patrn y blanco).
2. Adicionar a cada uno de los tubos de ensaye 0.5 mL de la solucin saturada de NaNO2, 0.1 mL de la
solucin de AcOH 2M y 2.4 mL de agua destilada.
3. Determinar la absorbancia de cada una de las muestras en el espectrofotmetro a 530 nm, utilizando
como blanco el tubo nmero 1 de la curva (ver Tabla 1).
4. Despus de haber realizado la lectura de cada una de las muestras colocarlas en un contenedor
etiquetado como R12.

SEGUNDA SESION
D) IDENTIFICACIN
Cromatografa en capa fina
Solicitar a los profesores dos placas para cromatografa en capa fina (CCF). Los anlisis por CCF se
realizan en cromatoplaca de 5 cm X 2.5 cm, que consisten en placas de aluminio recubiertas con una
capa de gel se slice (slica Kieselgel 60 F254 Merck)
1. Previamente, se aplicar en el lado izquierdo de una cromatoplaca (placa 1) la referencia de
escopolamina, en la placa 2 la de cido barbitrico, en la placa 3 la referencia de paracetamol y en la
4 la de cido 4-hidroxibenzoico. Colocar la muestra de los residuos reconstituidos previamente
aplicndolas en el lado derecho de cada una de las placas de acuerdo al siguiente esquema.

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Lmite de elucin

0.3
cm

Rf= d1/d2

d2
d1

Ref Mta1 Mta2

0.5 cm

Ref=
alcaloide
o
Mta= Reconstituido
barbitrico
Esquema 1. CCF de las muestras en estudio.
2.

Para la identificacin de la escopolamina emplear como sistema de elucin una mezcla de


CH2Cl2-MeOH- NH4OH (9:1:0.1). Nota: Para preparar este sistema de elucin es necesario
mezclar el hidrxido de amonio y metanol y posteriormente verter la mezcla resultante en el
CH2Cl2.

3.

Para la identificacin del cido barbitrico emplear como sistema de elucin una mezcla de
AcOEt-MeOH-AcOH glacial (7:2:1). Agitar vigorosamente la mezcla de elucin antes de eluir
la placa.

4.

Para la identificacin de paracetamol utilizar como sistema de elucin una mezcla CH2Cl2MeOH (9:1).

5.

Para la identificacin de cido 4-hidroxibenzoico utilizar como sistema de elucin una mezcla
CH2Cl2-MeOH (9:1) + 10 gotas de AcOH glacial, por cada 10 mL de mezcla.

6.

Saturar las cmaras durante 10 minutos antes de eluir las muestras en las cromatoplacas.

7.

Eluir hasta la lnea limite de elucin indicada en el esquema 1.

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8.

Visualizar la presencia de las sustancias con una lmpara de luz U.V. a 254 nm y
posteriormente, revelar las cromatoplacas utilizando la solucin etiquetada como solucin
reveladora de reactivo de Dragendorff para el caso del alcaloide (escopolamina), con una
cmara de yodo para el cido barbitrico, y con sulfato crico amoniacal/H2SO4 para el
paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico.

9.

Calcular el factor de retencin (Rf) para cada sustancia de acuerdo al esquema 1 y comparar el
valor obtenido con el de la referencia correspondiente.

10. Una vez identificados las sustancias, desechar los sistemas de elucin de la siguiente forma:
depositar la mezcla CH2Cl2-MeOH-NH4OH (9:1:0.1) en el contenedor etiquetado como R4;
depositar la mezcla AcOEt-MeOH-AcOH glacial (7:2:1) en el contenedor etiquetado como R5;
depositar las mezclas que contengan CH2Cl2-MeOH-AcOH en el contenedor etiquetado como
R6. Depositar las cromatoplacas en una bolsa de plstico etiquetada como R7
Identificacin por reacciones de color
Con el excedente de las fracciones reconstituidas realizar los ensayos respectivos.
Escopolamina: reactivo de Dragendorff
1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a escopolamina en un tubo de ensayo
y agregar 2 gotas de solucin reveladora de Dragendorff.
2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con CH2Cl2 para esta
reaccin.
Barbitricos: reactivo de Dille-Koppanyi
1. Colocar 10 gotas de la fraccin reconstituida correspondiente a barbitricos en un tubo y agregar dos
gotas del reactivo A y una gota del reactivo B (Dille-Koppanyi).
2. Realizar un control positivo con la muestra de referencia y un control negativo con MeOH para esta
reaccin.
3. Una vez identificadas TODAS las fracciones desechar de la siguiente manera: Depositar las
fracciones A4, B4 y los residuos de la reaccin de Dille-Koppanyi en el contenedor etiquetado
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como R8. Depositar las fracciones A3, B3 y los residuos de la reaccin de Dragendorff en el
contenedor etiquetado como R9.
Nota: Los residuos de paracetamol y cido 4-hidroxibenzoico se depositarn en los contenedores
etiquetados como R10 y R11, respectivamente.

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CUESTIONARIO.
1. En el caso de emplear una muestra biolgica indique cul es el objetivo de adicionar cido tartrico
adems de ajustar el pH?
________________________________________________________________________________
2. Una vez desarrollado el guin qu puntos del proceso y propiedades fisicoqumicas considera que
son crticos para una eficiente extraccin de un xenobitico?
________________________________________________________________________________
3. Reporte en la siguiente tabla los resultados que obtuvo en las pruebas de identificacin. Marque con
una cruz si la reaccin fue positiva y un guin si fue negativa.
Tabla 1. Resultados de las pruebas de identificacin
Referencia
Residuo
escopolamina reconstituido
de
escopolamina
Dragendorff

Referencia
Residuo
barbitrico reconstituido
de cido
barbitrico
Dille-Koppanyi

Rf
4. Indique si su muestra contena cido barbitrico. Explique su respuesta.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
5. Indique si su muestra contena escopolamina. Explique su respuesta.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
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6. Indique si su muestra contena cido 4-hidroxibenzoico y paracetamol. Explique su respuesta.


________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
7. En la extraccin en medio cido cual es la finalidad de utilizar la solucin de NaHCO3 al 10%.
________________________________________________________________________________
8. Cules son los puntos que considera crticos para la adecuada identificacin de los componentes en
la muestra problema? Explique su respuesta.
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
9. Reporte en la siguiente tabla los valores de absorbancia obtenidos, e indique los valores de la
regresin lineal.
Tabla 1. Absorbancias de la curva patrn
Concentracin de cido
Absorbancia
barbitrico [mg/mL]
0.0
0.45
0.9
1.8
2.4
Pendiente (m)
Ordenada al origen (b)
Coeficiente de correlacin (r)

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10. Interpole los valores de absorbancia en la curva y calcule la concentracin de cido barbitrico en
la muestra. Indique el procedimiento.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS.
Clark E.E. Isolation and Identification of Drugs. Vol. I y II. Pharmaceutical Press, London, 1972.
Bowman W.C. y Rand M.J. Farmacologa. Bases Bioqumicas y Patolgicas. (2 ed). Ed.
Interamericana, Mxico, 1984. pp 42.2542.32.
Blanke R.V. y Decker W.J. Analysis of Toxic substances. En Burtis C.A., Edward R.A. (Eds.)
Textbook of clinical chemistry. Saunders, Philadelphia, 1986. pp 16701744.
Benko A. (1985). Toxicological Analysis of Amobarbital and Glutethimide from Bone Tissue. Journal
of Forensic Sciences 30, 708714,
Cochin, J., Daly, J.W. (1963). The Use of Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Drugs.
Isolation and Identification of Barbiturates and Nonbarbiturates Hypnotics from Urine, Blood
and Tissues. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 139, 154159.
Bruneton J. Alcaloides, Generalidades. En: Farmacognosia. Fitoquimica, Plantas Medicinales. Ed.
Acribia, Zaragoza, Espaa, 2001, pp 775792.
Aydn, A., Ercan ., Tacolu S. (2005). A novel method for the spectrophotometric determination of
nitrite in water. Talanta 66, 11811186.
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APNDICE I: CONOCIMIENTOS PREVIOS.


1. Efectos txicos de la escopolamina y del cido barbitrico, cido 4-hidroxibenzoico y
paracetamol.
2. Relacin del grado de disociacin de una sustancia con el pH del medio en el que se encuentra
disuelto en funcin del valor de su pKa.
3. Valores de pKa de la escopolamina y el cido barbitrico, cido 4-hidroxibenzoico y
paracetamol.
4. Forma ionizada y no ionizada de cada uno de ellos.
5. Solubilidad de una sustancia inica en medio acuoso y en un disolvente orgnico.
6. Densidad de los disolventes a emplear.
7. Fundamento de una extraccin mltiple y selectiva.
8. Sustancias que pueden precipitar protenas.
9.

Especificar las especies qumicas que se encuentran en cada una de las fases obtenidas en los
tratamientos cido y bsico

10. Objetivo de adicionar una solucin de NaOH 2.5 N en el proceso de extraccin cida.
11. Objetivo de adicionar una solucin de HCl 1N en el proceso de extraccin bsica.
12. Fundamento y esquema de la reaccin de Dragendorff.
13. Fundamento y esquema de la reaccin de Dille-Koppanyi.
14. Fundamento de cromatografa en capa fina como herramienta de identificacin de sustancias
qumicas utilizando luz UV, Yodo y reactivo de Dragendorff como agentes reveladores.
15. Reaccin involucrada en la cuantificacin de cido barbitrico.
16. Ley de Lambert y Beer
17. Sugiera un esquema de separacin para la siguiente mezcla de sustancias no voltiles, indicando
los reactivos y disolventes utilizados, los valores de pH y la naturaleza de las sustancias durante
las diferentes etapas del proceso.
COOH

OH

HO
CH3
HO

OH
OH

cido glico [A, pKa 3.0]

cido propanico [B, pKa 4.36]

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NH-CH3
CH3
Efedrina [C, pKa9.36]

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APENDICE II: PREPARACION DE REACTIVOS


Solucin de sulfato srico amoniacal en cido sulfrico.
Pesar 12 g de sulfato srico amoniacal y adicionarlos lentamente y con agitacin constante sobre 350 g
de hielo, posteriormente, adicionar 12.5 mL de H2SO4 concentrado manteniendo la agitacin. Una vez
obtenida la solucin se filtra a travs de algodn. Guardar la solucin anterior en un frasco mbar.
Reactivo de Dragendorff (Solucin reveladora)
Solubilizar 2.6 g de carbonato de bismuto y 7.0 g de yoduro de sodio en 25 mL de cido actico glacial,
calentar por 10 minutos a 40oC para solubilizar el reactivo. Dejar reposar por 12 horas y posteriormente
filtrar la solucin. 20 mL del filtrado (solucin rojo-caf) se mezclan con 8 mL de acetato de etilo, la
solucin anterior guardarla en un frasco mbar (la cual es estable por 6 meses).
Reactivo A (Dille-Koppanyi)
Solubilizar 1 g de acetato de cobalto tetrahidratado en 100 mL de metanol absoluto.
Reactivo B (Dille-Koppanyi)
Mezclar 5.0 mL de isopropilamina con 95 mL de metanol absoluto
Solucin de hidrxido de sodio al 10%
Disolver 10 g de NaOH en 100 mL de agua destilada.
Solucin de cido clorhdrico 1 N
Colocar 83 mL de HCl concentrado en un matraz aforado y adicionar agua destilada hasta 1 L.
Solucin de cido tartrico al 10%
Colocar 10 g en 100 mL de agua destilada.

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Solucin patrn de cido barbitrico 3 mg/mL


Pesar 75.0 mg de cido barbitrico y transferir la pasada cuidadosamente a un matraz volumtrico de
25 mL, llevar al aforo con agua destilada.
Solucin saturada de nitrito de sodio. (NaNO2)
Pesar 82 g de NaNO2 y disolver en 100 mL de agua destilada.
Solucin de cido actico 2 M.
Medir 1.14 mL de cido actico glacial (densidad 1.049 g/mL) y agregarlos a 5 mL de agua, vaciar en
un matraz volumtrico de 10 mL y aforar en seguida con agua destilada.

APNDICE III: DISPOSICIN DE RESIDUOS


R0: Residuo acuoso extraccin cida. Desechar en la tarja.
R1: Residuos de escopolamina en diclorometano.
R2: Residuos de acetato de etilo.
R3: Sulfato de sodio anhidro.
R4: Mezcla CH2Cl2-MeOH (9:1) + 7 gotas de NH4OH
R5: Mezcla MeOH-acetato de etilo-cido actico
R6: Mezcla CH2Cl2-MeOH-cido actico
R7: Cromatoplacas
R8: Reactivo de Dille-Koppanyi, cido barbitrico (fracciones A4 y B4), acetona y MeOH
R9: Reactivo de Dragendorff, escopolamina (fracciones A3 y B3), CH2Cl2 y MeOH
R10: Residuos de paracetamol.
R11: cido 4-hidroxibenzoico.
R12: cido barbitrico, NaNO2, AcOH, acetona y MeOH

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