You are on page 1of 49

LABORATORIO BIOTECNOLOGIA

AMALIA MARTINEZ MORENO
CODIGO: 35220542
JOSE LUIS SABOGAL PRIETO
CODIGO: 80756972

TUTOR
GLAEHTER YHON FLOREZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA “UNAD”
ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS
CEAD JAG BOGOTA
ABRIL 2011

PRACTICA 1
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES
(SDS-PAGE)

INTRODUCCIÓN
Esta práctica se realizó con el fin de separar las proteínas de E-coli para identificar su
tamaño molecular y propiedades de carga, se utilizo el método SDS- PAGE aunque como
no es posible estimar el peso molecular de una proteína que tenga más de una cadena
polipectídica, pero si se pueden separar y purificar pequeñas muestras de proteína y
determinar la secuencia parcial de aminoácidos.
Con el método de SDS- PAGE solo se pueden estimar los pesos moleculares de una
proteína comparándolos con pesos moleculares de otras ya conocidas llamados
marcadores de pesos molecular.

OBJETIVOS

 Conocer la técnica de electroforesis de proteínas en geles SDS-PAGE
 Separar diversas proteínas mediante electroforesis desnaturalizante en
geles de poliacrilamida.
 Determinar el peso molecular de las proteínas en estudio
 Analizar los resultados obtenidos.

MARCO TEÓRICO
La electroforesis es una técnica de separación de moléculas cargadas por migración en
un campo eléctrico. Las moléculas se separan en función de su carga eléctrica,
desplazándose al electrodo de carga contraria y a mayor velocidad cuanto mayor es la
carga de la molécula.
Cada molécula se desplaza en el campo eléctrico alcanzando una velocidad constante.
En el estado estacionario, la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) se equilibra con
la resistencia al avance (fuerza de fricción hidrodinámica) en el medio en que se desplaza.

Se define la movilidad electroforética como la velocidad de desplazamiento por unidad de
campo eléctrico. En unas condiciones determinadas de electroforesis, la diferente
movilidad de cada molécula define su comportamiento y separación en el espacio.
Diferentes moléculas tendrán diferente movilidad electroforética en un medio determinado.

Hay tres tipos de electroforesis:
De frente móvil.
Zonal.
Continua.

Procedimiento de separación de proteínas basada en la carga eléctrica
La separación de proteínas basada en su carga eléctrica depende de sus
propiedades acido-básicas, las cuales se hallan determinadas por el número y los
tipos de los grupos R ionizables de sus cadenas polipeptídicas. Debido a que las
proteínas difieren en su composición de aminoácidos y secuencia, cada proteína
posee propiedades ácido-básicas características. Los principios implicados en la
separación electroforética de las proteínas son mejor comprendidos si se
considera la curva de valoración ácido-básica de una proteína globular de
contenido aminoácido conocido.
La mayor parte de las proteínas globulares poseen puntos isoeléctricos (no hay
desplazamiento de la proteína) situados entre un pH de 4,5 y 6,5. Si el pH de una
proteína se halla por encima del punto isoeléctrico la proteína posee una carga
negativa neta y se desplazará hacia el ánodo (+). Su carga negativa aumenta en
magnitud a medida que el pH aumenta; contrariamente a un pH por debajo del
punto isoeléctrico la proteína poseerá carga positiva neta y se desplazará hacia el
cátodo (-). En conclusión el conocimiento de las propiedades ácido-básicas de una
proteína determinada hace posible predecir su comportamiento en un campo
eléctrico.
Electroforesis de zona

En la electroforesis de zona los componentes proteicos se separan en diferentes
zonas, en las cuales la composición y cantidad de proteínas existentes en cada
una de las zonas separadas se determina por la aplicación de un colorante que
tiñe a las proteínas. La electroforesis de zona puede separar una mezcla de
proteínas basándose en la carga eléctrica y el tamaño molecular.

La electroforesis en gel de poliacrilamida puede aislar grandes cantidades de
proteínas purificadas. El tamaño del poro del gel de acrilamida, se puede ajustar
para optimizar la separación de la muestra de interés, geles con un porcentaje alto
de acrilamida (10 a 15 %T), son óptimos para separar proteínas de pequeño
tamaño (menores de 50 KDa), geles de porcentajes menores (< 10%T), son los
indicados para separar proteínas mayores
Con la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS, que es una variación de la
electroforesis de zona, se puede disociar en proteína oligomérica en sus
subunidades y determinar sus pesos moleculares, este método sirve también para
determinar el peso molecular de proteínas de una sola cadena.
La proteína se trata con el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), que disocia
la proteína en subunidades y despliega por completo cada cadena polipeptídica
formando un complejo polipéptido-SDS cilíndrico y largo. En este complejo la
cadena polipeptídica se halla cubierta por una capa de moléculas de SDS, de tal
manera que sus cadenas hidrocarbonadas se hallan íntimamente asociadas por
fuerzas hidrofóbicas a la cadena polipeptídica, y los grupos sulfato cargados que
posee el detergente se hallan expuestos al medio acuoso. Tales complejos
contienen una relación constante de SDS a proteína y difieren solo en masa.
Cuando una proteína de cadena única tratada con SDS es sometida a
electroforesis en gel de tamiz molecular (poliacrilamida), su velocidad de
emigración la determina principalmente la masa de la partícula SDS-polipéptido
según el principio de exclusión molecular, lo que determina el peso molecular de
las proteínas. El campo eléctrico sólo suministra la fuerza impulsora para el
tamizado molecular. Para calibrar un sistema de gel se hacen circular proteínas de
peso molecular conocido que actúan como marcadores con el objeto de efectuar
la comparación.
El tratamiento de muestras con agentes desnaturalizantes (SDS), provoca la
desnaturalización de las proteínas, perdida de la estructura secundaria y la
disociación de las subunidades. Las proteínas quedan cargadas negativamente y
migran del polo negativo (cátodo) al positivo (ánodo) durante la electroforesis.
Las proteínas separadas mediante SDS-PAGE, pueden ser visualizadas en el gel
mediante diversos métodos de tinción: fluorescencia, plata y azul comassie,
siendo el último el más utilizado. (Lehninger, 2ª Edición).

5 cm por debajo de la parte superior del vidrio ó 0. ya que una excesiva aireación pude interferir con la polimerización Introducir la solución en el interior del set de vidrios usando una micropipeta permitiendo que esta descienda a lo largo del espaciador sin formar burbujas Cuando una apropiada cantidad de la solución del gel separador ha sido adicionada (alrededor de 1. mezclar suavemente el vial.5 cm por debajo del nivel del peine) suavemente adicionar 1.5 ml de agua para mantener la superficie del gel plana. SDS y agua en un vial de 10 ml para el gel separador. Permita que el gel polimerice. aparece una interfase entre el gel separador y el agua Adicionar las soluciones A.Metodología Adicionar las soluciones A. mezclar suavemente el vial. Adicionar el persulfato de amonio y TEMED. ya que una excesiva aireación pude interferir con la polimerización. C. SDS y agua en un vial de 5 ml para el gel concentrador. Adicionar el persulfato de amonio y TEMED. Cuando el gel ha polimerizado. . B.

Mezclar cada muestras de proteínas con el respectivo buffer de carga 5X (i. Retirar el gel del sistema de fijación y colocarlo en el interior de la cámara para ensamblarlo. para lograr una completa desnaturalización de las proteínas por la acción del agente reductor 2-mercaptoetanol. El volumen de muestra puede ser de 5 a 20 l. Y centrifugar por 30 seg para homogenizar. Verificar que el frente de corrida (azul de Bromofenol) comience a descender hacia el ánodo y Detener la electroforesis cuando el frente de corrido alance la parte inferior del gel separador. En la electroforesis nativa-PAGE las muestras no se someten a un calentamiento. teniendo cuidado de no introducir burbujas. ya que las proteínas de interés pueden perder su actividad enzimática y introducidas cada una de las muestras en los respectivos pozos. En la electroforesis nativa-PAGE las muestras no se someten a un calentamiento. asegurando las puertas en el compartimiento y colocar el interior de la cámara en su respectivo tanque. 1 1 En la electroforesis SDS-PAGE las muestras deben colocadas en baño a ebullición (92 ºC) por 3 min. teniendo cuidado de no introducir burbujas. Preparar las muestras en tubos eppendorf. Adicionar 400 ml de buffer de electroforesis en el interior y exterior de la cámara. Introducidas cada una de las muestras en los respectivos pozos.. los cuales deben ser purgados con una micro pipeta de 1000 l para evitar excesos o residuos de la polimerización. ya que las proteínas de interés pueden perder su actividad enzimática. permitiendo humedecer los pozos. ya que pueden contaminar los pozo vecinos. Apagar la fuente de poder y desconectar los electrodos para retirar el gel y continuar con el proceso de teñido . ya que pueden contaminar los pozo vecinos. asegurando de no atrapar burbujas en los dientes de peine y permita que el gel polimerice y remueva el peine con cuidado.e 20 l de muestra + 5 l de buffer carga) para alcanzar una dilución (1:5) del buffer.Introducir la solución sobre el gel separador hasta llenar el espacio libre y colocar el respectivo peine de 10 pozos.

Finalmente se deja secar el gel a temperatura ambiente ó en una incubadora (37 ºC) por 2-4 horas. Sumergir dos hojas (15x15 cm) de papel celofán en agua para hidratarlo y colocar el gel entre las dos hojas. Agitar suavemente el gel por 10–15 min en un shaker. .TEÑIDO CON AZUL DE COOMASSIE R-250 DIAGRAMA DE FLUJO Utilizar guantes durante todo el procedimiento para evitar manchar el gel con los dedos. Adicionar una pequeña cantidad de la solución de teñido (20 ml es suficiente). 1. 2. 3 veces. 3 veces Adicionar la solución de desteñido (cerca de 50 ml) hasta que las bandas aparezcan Y Para desteñir completamente el gel. Se puede utilizar un vidrio (14x12 cm) para fijar el celofán en sus extremos.Enjuagar el gel con agua destilada. Antes de retirar el gel verificar que esté completamente seca la superficie del gel. Luego cortarlo y almacenarlo. 3 veces. cambiar la solución de desteñido y agitar toda la noche. Enjuagar el gel con agua destilada. Cubrir el contenedor con vinipel durante el teñido y desteñido Y enjuagar el gel con agua destilada. Sumergir el gel en la solución de conservación por 30-60 min. los cuales deben ser sujetados con dos pinzas. Recoger el gel y colocarlo en un contenedor plástico o de vidrio.

269-274 166. de Arthrobacterureafaciens. 1: muestra patron. Tomado de: Kelleyt R. Los marcadores de peso molecular están dados en kilo daltons (Kda). Electroforesis correspondiente a la purificación de la enzima inulinfructotransferasa. Journal Of Bacteriology. Apr. Inulin fructotransferasa Figura 1. No. P. 1986. de la enzima mostrada en la figura 1.RESULTADOS 1. 2: muestra de precipitación con sulfato de amonio. L. M: marcadores de pesos moleculares. Determine el peso molecular en KDa. 1 .

162 X + 2.8751 1.8 2.343 1.0 2 Muestra de precipitación con (NH4)₂SO₄ (X₂) 1.6990 1.4 3.7922 1.9 3.5641 89.4 Y = .5441 1.4 5.1761 2.1 2.6 6.9726 .7922 Peso Molecular (KDa) 61.343 Y = Logaritmo de KDa PM = Antilogaritmo de Y 1 Muestra patrón (X₁) 3.0514 1.9542 1.0.6 4.9912 61.162 X + 2.2 Ecuación de la pendiente: Y = .9726 34.CÁLCULO DE RESULTADOS Marcadores de peso molecular (KDa) 150 100 75 50 35 25 15 Log (KDa) 2.1761 Distancia de los marcadores (cm) 1.5330 2.0000 1.4 1.0.1129 112.3979 1.8 2.

9912 KDa.5641 y 89. Las demás moléculas presentaron menor peso molecular y poseen cadenas mas cortas de poli péptidos y se desplazaron un poco mas hacia el ánodo (+). por lo cual poseen un pH mas cercano al punto isoeléctrico. se puede observar que el pH de estas proteínas se encuentra por debajo del punto isoeléctrico por lo cual estas poseen carga positiva neta ya que se desplazaron muy poco manteniéndose cerca del cátodo (-). por consiguiente poseen un alto peso molecular comparado con la proteína marcador. con el ejemplo enviado por el tutor se pudo realizar una lectura clara y comparativa de la migración de la enzima inulinfructotransferasa.ANÁLISIS DE RESULTADOS Para los pesos molecular de la enzima inulinfructotransferasa. lo cual indica que poseen cadenas largas de poli péptidos.  Se determinaron los pesos moleculares de la enzima inulinfructotransferasa a partir de los pesos moleculares del marcador. como también su cercanía al punto isoeléctrico.  Mediante la técnica de electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida se logran separar las muestras de proteínas. CONCLUSIONES  Aunque no se pudo realizar con éxito la técnica de electroforesis de proteínas en geles SDS-PAGE. de 112. .

MARCO TEÓRICO El crecimiento microbiano se puede considerar como un conjunto de reacciones químicas en cadena. esta velocidad de crecimiento en un tiempo dado es proporcional al número o masa de la bacteria E-coli. finalmente la medida de esta masa se determinara por medidas de absorbancia para cada uno de los cultivos realizados. como medios de cultivo se determinarán el crecimiento de la E-coli. por lo tanto.PRACTICA 2 CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO INTRODUCCION Mediante la experimentación con diferentes sustratos. las ventajas y . presente en este tiempo. El microbio se reproduce. Cuando se introduce un microorganismo en un medio de cultivo que le conviene. la biosíntesis de los constituyentes celulares se hace a partir de los compuestos del medio de cultivo. sus formas de aplicación. la forma de cuantificación de los mismos. y se observará cuál de estos medios es el más adecuado para su adaptación y crecimiento equilibrado. así como. que conducen en la síntesis de los constituyentes de la biomasa microbiana obtenida al final de la operación. el proceso obedece al principio de la conservación de la materia. Globalmente. Con un crecimiento equilibrado se puede medir la velocidad de crecimiento de un cultivo. como también el de todos los componentes de la población. es necesario conocer los diferentes mecanismos de crecimiento. desarrolla una actividad en relación a su composición y las condiciones ambientales. resulta un aumento de la concentración en biomasa microbiana. La cinética describe las velocidades a la cual las reacciones químicas y bioquímicas se desarrollan en diferentes condiciones y constituye una de las operaciones más utilizadas por la ingeniería alimentaria y la biotecnología.

(Alan. según el tipo de microorganismo y el tipo de método seleccionado para seguir el fenómeno. En todos los casos se desenvuelve de la misma forma comportándose las diversas fases como son la de latencia que se presenta después de la siembra del microorganismo y es el periodo de adaptación. Para medir la curva de crecimiento se dispone de una técnica de evaluación cualitativa y cuantitativa de una población microbiana. son parámetros muy importantes. manteniendo constantes las condiciones exteriores en particular el de la temperatura cuidando que sean favorables al desarrollo. El crecimiento de poblaciones microbianas también puede ir acompañadas por la formación de productos finales tóxicos que causan la inhibición del crecimiento. Esta interesante técnica se basa en el hecho de que la densidad óptica de suspensión es proporcional a la masa en las partículas suspendidas. y sobre todo el monto económico de cada uno de ellos. en esta fase no hay reproducción. Un ejemplo es la producción de etanol por levaduras y bacterias. Sin embargo se puede homogenizar la muestra en condiciones estandarizadas antes de hacer la medición. en el curso en donde la célula sintetiza. El estudio se basa en seguir en función del tiempo la evolución de X concentración celular o la concentración de biomasa. de la suspensión microbiana y por comparación con una escala de referencia se deduce la concentración en biomasa. Los rendimientos de biomasa y de producto. Las suspensiones de organismos filamentosos no son apropiadas a esta técnica. Así se mide la absorción luminosa generalmente a 600nm o 700nm. las enzimas que le son necesarias para metabolizar el sustrato que existe. en particular. ya que representan la eficacia de la conversión del substrato en biomasa y productos. Para ello se efectúa un cultivo de tipo clásico en el cual después de sembrar se observa el crecimiento hasta el agotamiento del medio. Para determinar la biomasa microbiana se utilizó el método de medición óptica. 1999) . Se definen como la biomasa o producto formado por la unidad de masa de substrato consumido.desventajas de los diferentes métodos.

1:00. cada tubo debidamente marcado con su respectivo tiempo almacenarlo hasta el el crecimiento final. 3:00. 4:00. 10:30. 11:30. min. Repetimos el procedimiento anterior con la toma de muestra en tubos de ensayo en los tiempos: 9:30. una alícuota de 2 ml en condiciones asépticas (utilizando un mechero) de cada medio de cultivo.METODOLOGIA CINETICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO Tomamos una gradilla con 6 tubos de ensayo y los marcamos desde el 0 hasta el 6. Agitamos y tomamos en un tubo de ensayo. el cual se utilizará como blanco (B). 2:00. Luego sacamos todos los 6 tubos del refrigerador y tomamos la absorbancia a cada uno de ellos Realización de la grafica . Tomamos el inoculo de E-coli ya Preparado lo agitamos y adicionamos 1ml al tubo 0 junto con el extracto maltosa al 5% y agitamos. Llevamos el tubo al refrigerador a 37 0C y tomamos el tiempo 0.

RESULTADOS Ecuación para despejar la biomasa Y= 0.19X + 0.005 Y= Abs (600nm) X= [biomasa] GRAFICO DE E COLI EN VARIOS SUSTRATOS TIEMPO EN (h) VS BIOMASA EN (MG) .

CINÉTICA Y CRECIMIENTO MICROBIANO Grafica absorbencia vs tiempo en el extracto de levadura Grafica absorbencia vs tiempo en sacarosa .

Grafica absorbencia vs tiempo en glucosa Grafica absorbencia vs tiempo en maltosa .

Grafica absorbencia vs tiempo en fructosa Grafica absorbencia vs tiempo en galactosa .

proteínas y aminoácidos libres. En las curvas de crecimiento que se obtuvo en la práctica en las que mejor se ve reflejada la cinética microbiana es la glucosa. de crecimiento y la fase estacionaria. En las graficas también se alcanza a percibir la fase de disminución de velocidad lo que indica que se llego al empobrecimiento del medio de cultivo debido a la desaparición de . Aunque se noto un mejor crecimiento en la extracto de levadura. además que es una rica contiene vitaminas especialmente las del complejo B adecuada para el crecimiento bacteriano. En el extracto de levadura es una fuente rica en nitrógeno. la fase logarítmica cuando la rapidez de la reproducción llega a su valor máximo hasta que la rapidez sea constante. Aunque el extracto de levadura sea buen medio de cultivo. algunos elementos esenciales como el azufre y el fosforo así como otros nutrientes incluyendo minerales y vitaminas. una fuente de nitrógeno para la síntesis de aminoácidos y ácidos nucleícos.Grafica absorbencia vs tiempo en lactosa ANALISIS DE RESULTADOS Se muestra en los gráficos que en de todos los sustratos la E-Coli tuvo la fase de adaptación. los microorganismos necesitan de fuentes de carbono para la síntesis de moléculas orgánicas y para la obtención de energía. la fase de arranque en donde se ve el inicio del crecimiento bacteriano que comienza con la reproducción celular aumentando la concentración de biomasa. Se puede ver como en el tiempo se va aumentando la población. levadura y galactosa. en donde se puede visualizar la fase de adaptación.

aunque no se indica bien la fase de muerte. 1985). 1999) El ciclo de crecimiento debió ser mejor en la glucosa debido a ser gran fuente de carbono y energía pero se presento en la sacarosa el cual es un azúcar disacárido compuesto por fructosa y glucosa. CONCLUSIONES La e. la temperatura y el pH por el producto. lactosa y glucosa. (Scriban.uno o varios compuestos necesarios para el crecimiento. en donde indica que en donde menor hubo crecimiento fue en la galactosa. el crecimiento mayor en este azúcar pudo haberse dado debido a que la sacarosa quizás estuviera hidrolizada y hubiera mayor cantidad de glucosa que azúcar compuesto por presencia de algún acido. se pudo comparar los resultados de crecimiento en los diferentes tipos de sustratos. Se comprueba como los factores principalmente que afectan la rapidez de crecimiento son la concentración de substrato. Se deduce que la densidad celular después del tiempo se relaciona con la densidad presente originalmente. (Alan. Durante el crecimiento exponencial el peso seco celular aumenta. Mediante las graficas de cinética de crecimiento se ve que la velocidad de crecimiento es proporcional a la concentración de células ya presentes. .coli tuvo un buen comportamiento de crecimiento en la sacarosa al igual que en los sustratos de levadura.

el primer informe publicado acerca de la capacidad de los extractos celulares (malta) para llevar a cabo una reacción característica de las células vivas (la hidrólisis de almidón de glucosa) fue escrito inicialmente en 1833 por Payen y Persoz. A nivel industrial el Aspergillus Niger es el microorganismo más utilizado para la producción de invertasa. El propósito de esta práctica es el estudio del funcionamiento de la enzima glucosa oxidasa y la relación que existe entre la velocidad de la reacción enzimática en diferentes concentraciones de sustrato utilizando 1ml de enzima. esta enzima es proveniente de varios tipos de microorganismos. Sin embrago. mientras que Emil Fischer (1894) demostró la especificidad de las enzimas para su sustrato. por lo que se debe tener en cuenta que la cantidad de enzima debe ser pequeña en comparación a la concentración de sustrato para que la concentración de enzima sustrato no modifique la concentración del sustrato. OBJETIVOS  Determinar la actividad enzimática de la invertasa  Inmovilización de la enzima libre en alginato de sodio por atrapamiento MARCO TEÓRICO La palabra enzima se deriva del griego que significa (en las levaduras) y fue usada por Kuhne en 1872. Summer (1926) cristalizo la primera enzima la ureasa la hidroliza la urea a CO2 y NH3 y mostro que las enzimas eran .ACTIVIDAD ENZIMATICA E INVOLIZACION DE LA INVERTASA INTRODUCCIÓN Mediante esta práctica se puede determinar la actividad enzimática de la invertasa que es una enzima con capacidad de hidrolizar la sacarosa en fructosa y glucosa. Subsecuentemente. Más tarde. Buchner (1897) demostró la capacidad de los extractos de levadura para catalizar la conversión del azúcar a alcohol.

Fue hasta la década de los años 70 que se conoció la composición química precisa de las enzimas mediante la secuencia de la ribonucleasa. puede despreciarse así como la reacción inversa de la transformación del producto en sustrato. junto con los estudios de conformación tridimensional por cristalografía de rayos X.proteínas. Michaelis y Menten toman como principio de que la velocidad de transformación del complejo ES en E+P es muy lenta. aunque su actividad y pureza eran escasas se demostró que las enzimas no son cualitativamente distintas a los catalizadores no biológicos. 1999) Uno de los modelos más útiles en la investigación sistemática de las velocidades enzimáticas. con relación a la velocidad de la ruptura del complejo que vuelve a dar E+S. fue propuesto por Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913. En estas condiciones al principio de la reacción la concentración en producto es muy débil. enunciado por primera vez por Victor Henri en 1903 es fundamental para la cinética de Michaelis – Mentel. (Scriban. a partir de los aminoácidos precursores y. 2009) Hipótesis de Michaelis Menten: Al establecer la ecuación de la velocidad. (Alan.sustrato. El concepto del complejo enzimas. Esta hipótesis significa que K3 <k2 y que E y ES están en equilibrio. junto con las proposiciones para la forma en que esta se regula. Por último en 1969 se sintetizo químicamente la primera enzima (ribonucleasa). 1985) . Cuando se une el sustrato S en el sitio activo de la enzima. se forma un complejo intermediario (ES). Estos trabajos permitieron que se postulara el mecanismo de acción enzimática. Los estudios de cinética enzimática corresponden siempre a esta parte lineal de la curva lo que implica el trabajar a velocidades iníciales. el producto se disocia de la enzima. (Mckee. Tras un lapso breve. Durante el estado de transición el sustrato se convierte en producto.

0. Cálculos y Resultados [Glucosa]= 0. 0. 1. Adicionar 2 ml de la solución de la enzima invertasa. pH 4. 20 y 60 minutos sin interrupción. adicionar 10 ml de buffer acetatos al 20%. luego sumergir este tubo en un vaso de precipitados en ebullición por 5 min para inactivar la enzima.Metodología 3.1mg / ml xAbsorbancia 0.1. 2. 2.01 e inactivar. 4.19x + 0.005 y= abs (600 mn) x= [biomasa mg/ml] . ACTIVIDAD ENZIMÁTICA En una gradilla colocar 7 tubos de ensayo En un vaso de precipitados de 50 ml. inmediatamente cronometrar el tiempo tomando un alícuota de 10 ml con una micro pipeta y depositarla en el tubo de ensayo marcado con 0.320 G + H2O Acido gluconico + H2O2 1 mol de glucosa produce una mol de acido glucónico Ecuación de biomasa Y= 0. 5. en los tiempos 0. Medir las Observancias de cada tubo con sus respectivos tiempos.6 y 5ml de solución de glucosa Atemperar en baño termostatado a 40 ˚C durante 5 min. 10. Repetir la toma de muestra en los tubos marcados con 6.

26  0.025 0.05 0.01545 mg / ml / mn 0.0031 0.15 0.01 0.000094 0 0.0094 0.005 0.0001 0.000043 0.000017 0.0022 0.017 0.0102 0.000078 0.0123 0.0184 Grafica: Actividad Enzimática de la enzima glucosa oxidasa en sustrato al [0.0068 0.35 ABSORVACIA 0 0.000062 0.045 0.000069 0.000078 0.000052 0.0125 0.0085 0.0001 0.000062 0.22 0.000043 0.0136 0.000012 0.054 [GLUCOSA] mg/ml 0 0.13 1.025 TIEMPO (minutos) 0 0.25].0153 0.0016 0.0017 0.04 0.000012 0.0024 0.4 1.15 2.036 0.000009 0.RESULTADOS ACTIVIDAD ENZIMATICA 0.000087 0.000035 0.000087 0.000069 0.31 1.47 1 1.007 0.15 .0113 0.0034 0.0063 0.0141 0.0034  0.000094 MOLES DE ACIDO GLUCONICO MASA DE ACIDO GLUCONICO mg /min 0 0 0.000035 0.000009 0.0078 0.000052 0.000026 0. m= pendiente de velocidad enzimática en los primeros momentos m 0.38 0.55 2.0047 0.000017 0.02 0.0169 MOLES DE GLUCOSA 0 0 0.0051 0.08 0.0156 0.0002 0.03 0.015 0.26 0.000026 0.0017  0.

0313 0.53 1.000174 0.0051 0.0078 0.0442 Grafica: Actividad Enzimática de la enzima glucosa oxidasa en sustrato al [0.0027 0.059 0.000146 0.000184 0.22 1.000082 0.003 0.0219 0.57 2.015 0.0331 0.000102 0.18 0.000208 0.000191 0.11 .0027  0.0047 0.0306 0.000208 0.0259 0.00004 0.016 0.000102 0.0119 0.000226 MOLES DE ACIDO GLUCONICO 0 0.08 1.0374 0.001 0.0263 0.023 0.0109 0.13 2.0238 0.1 0.000156 0.0119  0.008 0.000121 0. m= pendiente de velocidad enzimática en los primeros momentos m 0.000026 0.2 ABSORVACIA 0 0.13 [GLUCOSA] mg/ml 0 0.084 0.32 2.0281 0.0344 0.0375 0.00004 0.000061 0.000191 0.035 0.53 3.0406 MOLES DE GLUCOSA 0 0.24 2.05].0147 0.0184 0.106 0.000174 0.33 1.000014 0.04 0.0072 0.0009 0.0408 0.000026 0.000082 0.0025 0.000156 0.034 0.0340 mg / ml / mn 0.000005 0.000121 0.38 0.000184 0.ACTIVIDAD ENZIMATICA 0.000226 MASA DE ACIDO GLUCONICO mg /min 0 0.000005 0.09 3.000146 0.000014 0.27 0.0238 0.12 0.0361 0.11 0.11 0.38  0.0286 0.000132 0.05 TIEMPO (minutos) 0 0.076 0.09 0.000061 0.000132 0.047 0.0201 0.07 0.

508 1.1253 0.515 0.001917 0.0197 0.000316 0.18 0.000894 0.1426 0.001633 0.4786 0.309 1.576 0.19 1.3453 0.000514 0.41 0.002657 MASA DE ACIDO GLUCONICO mg /min 0 0.002657 0.2495 0.33 0.5211 .4983 0.182 0.06 1.001272 0.4091 0.000999 0.ACTIVIDAD ENZIMATICA 2 TIEMPO (minutos) 0 0.36 0.203 1.1007 0.17 0.2 0.000396 0.002617 0.3761 0.1456 0.002617 0.2737 0.000727 0.000639 0.001395 0.4784 MOLES DE GLUCOSA 0 0.001633 0.002657 0.941 1.11 0.0214 0.001272 0.000316 0.7 0.001737 0.002440 0.000036 0.000174 0.002087 0.001917 0.000036 0.000639 0.13 1.531 [GLUCOSA] mg/ml 0 0.662 0.1586 0.001149 0.733 0.3759 0.0313 0.1 0.1800 0.000396 0.000894 0.42 ABSORVACIA 0 0.2941 0.000174 0.0619 0.3128 0.0713 0.406 1.13 0.3203 0.001149 0.5 0.28 0.2291 0.002440 0.0569 0.4784 0.0066 0.000109 0.44 0.001737 0.2253 0.0925 0.002271 0.002540 0.000727 0.9 0.368 0.5211 0.000109 0.1961 0.419 0.4455 0.105 1.000514 0.3407 0.23 0.002540 0.1753 0.000999 0.296 0.4713 0.021 0.466 0.4394 0.1609 0.4095 0.21 0.228 0.464 1.001395 0.55 1.0071 0.063 0.4 0.25 0.002271 0.2513 0.0776 0.1309 0.804 0.002087 0.000809 0.000809 0.33 1.0340 0.1150 0.531 1.002657 MOLES DE ACIDO GLUCONICO 0 0.48 0.2069 0.5133 0.4575 0.001 1.

406 1.07 0.00].02 0.06 1.002540 0.001272 0.13 0.3111 0.23 0.09  0.000639 0.18 0.002440 0.002657 MASA DE ACIDO GLUCONICO mg /min 0 0.Grafica: Actividad Enzimática de la enzima glucosa oxidasa en sustrato al [2.0477 0.002721 0.574 0.000174 0.3759 0.0569 0.000798 0.4786 0.2495 0.000894 0.4095 0.000996 0.002540 0.000109 0.105 1.81 mg / ml / mn 0.17 0.3453 0.1753 0.000639 0.0438 0.000174 0.4091 0.1438 0.001586 0.2856 0.002440 0.0340 0.1253 0.48 0.1794 0.002657 MOLES DE ACIDO GLUCONICO 0 0.05 0.419 0.000996 0.33 0.296 0.44 0.41 0.1426 0.000727 0.1309 0.0214  0.55 1.568 1.13 1.0081 0.182 0.0214 0.000396 0.001395 0.2291 0.11 0.09 0.0776 0.25 0.0925 0.804 0.000798 0.2253 0.2069 0.001917 0.4784 MOLES DE GLUCOSA 0 0.001395 0.04 0.002087 0.000316 0.0197 0.14 0.000894 0.203 1.000514 0.001149 0.309 1.001917 0.19 1.000727 0.228 0.3128 0.0313 0.662 0.063 0.2513 0.0088 0.42 ABSORVACIA 0 0. m= pendiente de velocidad enzimática en los primeros momentos m 0.026 0.4575 0.002087 0.04 ACTIVIDAD ENZIMATICA 4 TIEMPO (minutos) 0 0.914 1.000109 0.002271 0.46 0.2737 0.3407 0.002271 0.000396 0.4983 0.000243 0.4900 0.368 0.002721 0.515 0.1 0.001737 0.4455 0.000045 0.5337 0.1566 0.001 1.0619 0.33 1.001737 0.531 [GLUCOSA] mg/ml 0 0.1150 0.21 0.000316 0.0619  0.1954 0.733 0.001586 0.5211 .4394 0.001272 0.1007 0.001149 0.000243 0.28 0.36 0.3761 0.1609 0.000514 0.000045 0.464 1.0713 0.

Grafica: Actividad Enzimática de la enzima glucosa oxidasa en sustrato al [4. m= pendiente de velocidad enzimática en los primeros momentos m 0.0477  0.04 ANÁLISIS DE RESULTADOS  Revisando la teoría de Michaelis y Menten quienes propusieron la teoría general: y comparando los resultados obtenidos en las prácticas se pudo determinar que a bajas concentraciones de sustrato. es independiente de la concentración de glucosa.  La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de una enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal de la reacción (Scriban.07  0. en las primeras concentraciones de glucosa a medida que la concentración de glucosa aumenta.876 mg / ml / mn 0. . 1985). la rapidez de la reacción disminuye.00].  Observando los resultados de la aplicación de la ecuación para determinar la velocidad de la actividad enzimática en los primeros tiempos y la grafica de los mismos. Cuando la velocidad de la reacción alcanza la mitad de la velocidad máxima.0214  0. ya que la enzima está en la forma enzima-sustrato.  A concentraciones aun más altas [2-4] en los primeros instantes la rapidez de la reacción varía y no es constante. Se tomó la actividad enzimática en los primeros instantes. la velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de sustrato.

 En [2-4] el tiempo de reacción fue directamente proporcional a la concentración.05] el tiempo de reacción del sustrato enzima.  La actividad catalítica de la glucosa oxidasa se determino midiendo la velocidad inicial de reacción.  Se puede observar que en las [0.  Se puede observar en las graficas la caída de la velocidad de reacción que se debe a la disminución significativa de la concentración de sustrato.01-2-4] pudiéndose tomar la pendiente de esta recta como velocidad inicial. el cual puede ser asimilado a la inversa de la relación de la glucosa oxidasa por la glucosa. cambios de pH. aunque también pudo haber influido otros factores como el aumento de la concentración de producto. las reacciones transcurren linealmente en las [0.0.  La disminución del sustrato indica la liberación de productos por la actividad de la enzima y por ende una degradación progresiva del sustrato (Alan.025. el progreso de la reacción deja de ser lineal.indicando la cantidad de sustrato (Km).  Inicialmente. A tiempos más largos. que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado ó sustrato transformado frente al tiempo) en el tiempo cero como lo indican las graficas. CONCLUSIONES  Mediante la práctica se determino que en las primeras concentraciones al aumentar la concentración la velocidad de la actividad enzimática disminuyo debido a que el tiempo de reacción aumentó. inactivación de la enzima. debido al consumo de producto por la enzima. . ya que la caída de la velocidad de reacción se obtuvo en mayor tiempo a mayor concentración de sustrato. al aumentar la concentración de glucosa el tiempo de reacción disminuyo. 1999).

 Determinar el peso molecular de las moléculas del ADN extraído. las bases nitrogenadas (purínica y pirimidínica). el cual se pretende separar. OBJETIVOS  Conocer la metodología para extraer ADN de la E-coli. cuantificar y analizara por medio de la electroforesis en cubeta horizontal en gel de agarosa. MARCO TEORICO Los ácidos nucleídos son macromoléculas o polímeros formados por la repetición de monómeros llamados nucleótidos. nucleótidos. El ADN esta conformado por dos cadenas polinucleotídicas unidas entre si. estos se diferencian por la pentosa (desoxirribosa y ribosa). monocatenaria. por la estructura o forma de sus cadenas (cadena doble. etc. de millones de nucleótidos. Los nucleótidos se clasifican en: ADN (ácido desoxirribonucléico) y ARN (ácido ribonucléico). Muchas moléculas como son aminoácidos.PRACTICA 3. péptidos. El termino electroforesis se usa para describir la migración de una molécula o partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico.) y por la masa molecular (la del ADN es mayor que la del ARN). proteínas.  Cuantificar el ADN extraído de la E-coli por medio de la técnica de la Electroforesis el gel de agarosa. EXTRACCIÓN Y ELECTROFORESIS DEL ADN INTRODUCCIÓN Con el desarrollo de esta práctica se extraerá el ADN de la bacteria E-coli. ácidos nucleídos. estas cadenas pueden ser de forma lineal como el ADN de células eucariotas o puede . unidos por enlaces fosfodiéster: Formando entre sí cadenas largas de polinucleótidos por lo cual estas molécula puede llegar a tamaños gigantes.  Analizar los resultados obtenidos. Estas moléculas inmersas en gel de agarosa y cargadas se van a separar en función de su carga aplicando un voltaje a través de electrodos. poseen grupos ionizantes y existen en solución como especies cargadas ya sea como cationes o como aniones.

En ese momento. los cuales son fragmentos de ADN de tamaño conocido. conformando ADN de cadena simple. analizar y caracterizar ácidos nucleídos. La electroforesis en gel de agarosa (en cubetas horizontales). centrifugar y agregar una disolución tampón (buffer TBE-5X) en la que se disuelve el ADN. como el ARN mensajero. Para extraer el ADN se requieren de varias etapas. finalmente se debe proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo. el ARN de transferencia y el ARN ribosómico. es la más usada para separar. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente. por lo general los ácidos nucleídos migran desde el electrodo negativo hacia el positivo. se puede calcular el tamaño aproximado del ADN en estudio. purificar. por tanto. El ADN de algunos virus es monocatenario es decir esta formado por un solo polinucleótido. las moléculas de menor tamaño migraran mas rápido hacia el ánodo (polo positivo) que las de mayor tamaño. ya que estas poseen carga negativa en el esqueleto azúcar-fosfáto. La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones de la solución salina son atraídos hacia las cargas negativas del ADN. el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN. Este gel se comporta como un tamiz molecular el cual permite separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Las proteínas asociadas al ADN. primero se debe romper la pared celular y la membrana plasmática para acceder al núcleo de la célula. permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Aplicando marcadores de peso molecular a la electroforesis. pasando de una secuencia lineal de nucleótidos a una secuencia lineal de aminoácidos en una proteína. . extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente. como también se han desnaturalizado por acción del calor. como también la información para que las células realicen sus funciones. este se puede desnaturalizar o romper los puentes de hidrógeno entre las bases. sin cadena complementaria. se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. identificar. Las moléculas del ADN portan la información para el desarrollo de las características biológicas de un individuo. Sólo queda. luego se debe romper la membrana nuclear para que quede libre el ADN. Para expresar la información del ADN deben haber varias etapas para lo cual existen varios tipos de ARN. el de las mitocondrial y cloroplastos eucarioticos. proteínas y otras sustancias en menor proporción. en este caso SDS. Según sea la composición del ADN.ser circular como el ADN de las células procariotas. para aislarlo de debe hacer precipitar en alcohol. carbohidratos. de gran longitud. El ADN contiene la información y el ARN expresa dicha información. para lo cual se utiliza un alcohol (isopropanol).

por lo cual se debe manipular con la debida protección y precaución. Thaura Ghneim Herrera. Tomado de: Duina Posso Duque. Los colorantes fluorescentes actúan mediante la inserción entre los pares de bases que conforman el ácido nucleído. los cuales se pueden observar bajo luz ultravioleta y con lo cual se puede evaluar su integridad y estimar su concentración mediante análisis comparativo con patrones de concentración conocida. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para visualización del ADN y ARN. se pueden visualizar por medio de tinción con colorantes fluorescentes. con propiedades mutagénicas. Ediciones IVIC. es altamente toxico y reactivo. Uso de Marcadores Microsatélites para la Estimación de Diversidad Genética en Plantas. .Los ácidos nucleídos separados en gel de agarosa. 2008.

Purificar el ADN crudo extraído agregándole Isopropanol y centrifugándolo a 10.000 rpm * 5 min. (Realizar esta operación 3 veces más). calentar en baño termostatado a 60˚C por 10 minutos.. Romper las células con 500 micro litros al 20% de detergente SDS.METODOLOGIA EXTRACCIÓN Y ELECTROFORESIS DEL ADN Centrifugar 4 muestras de E-coli de 213 ml c/u a 6000 rpm por 5 min. resuspender y centrifugar de nuevo a 6000 rpm * 5 min. para separar células y obtener biomasa. Cuantificar el ADN extraído por ELECTROFORESIS . Lavar con solución salina al 0. diluido en agua destilada hasta completar 500 ml. Agregar 400 ml de Isopropanol sin agitar y extraer con un gancho el ADN crudo. En un tubo de ensayo tomar 5 ml de la pelet y agregar buffer TBE-5X (1ml).9% el precipitado obtenido o pelet.

8%. Dejar polimerizar la agarosa y retirar el peine. Agregar la solución lentamente por un extremo de la bandeja de corrida. . luego con una micro pipeta agregar 20 micro litros de muestra en cada pozo.Preparar gel de agarosa al 0. luego tomarle una fotografía a la placa para realizar el análisis del resultado. Para la corrida.8 ml de garosa y 100 ml de buffer TBE 0.5 X hasta cubrir el gel. calentar a baño termostatado hasta dilución completa. Para visualizar la separación de las muestras en el gel. mezclar bien evitando que se formen burbujas. A la muestra de ADN extraída. retirando las burbujas que se formen. llenar el tanque de la cámara de electroforesis con buffer TBE 0. para 100ml: Tomar 0. Conectar los electrodos de la cámara a la fuente de poder a 8 voltios por ½ hora para que corran las muestras. Dejar enfriar hasta 37 ˚C y agregar el bromuro de etidio de alto metoxilo (con guantes).5 X. se introduce en un transiluminador de luz ultravioleta (UV). agregarle buffer de tinción Tris borato EDTA que debe estar diluido.

bajo un transiluminador de luz ultravioleta.RESULTADOS (-) cátodo (+) ánodo ANÁLISIS DE RESULTADOS En esta imagen tomada de la electroforesis del ADN. CONCLUSIONES En la práctica de electroforesis de ADN no se pudo realizar en el laboratorio ya que no se conto con los elementos suficientes para elaborarla. Las bandas mas gruesas equivalen a mayor cantidad de proteína y las más delgadas equivalen a menor cantidad de proteína. se puede observar la migración de las moléculas de ADN de menor peso molecular hacia el ánodo y las de mayor peso molecular se mantienen más cerca al cátodo. .

En general.PRACTICA 4 INMOVILIZACION ENZIMATICA Justificación La utilización de la técnica de inmovilización enzimática es importante en el campo de los alimentos porque proporcionan mejorar las condiciones organolépticas de los mismos. completa o parcialmente. células. etc. por su unión a un soporte. los grados de libertad de movimiento de enzimas. los métodos de inmovilización se suelen clasificar en dos grandes categorías: 1) Retención física 2) Unión química . orgánulos. Objetivo  Describir las diferentes técnicas de inmovilización enzimática  Emplear la inmovilización enzimática en alginato de sodio atrapamiento por Marco teórico La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio. para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen.

y en menor medida la metionina. Como ventaja adicional. y no pueden intervenir en la unión covalente. la tirosina y la histidina. no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica.Métodos de inmovilización de enzimas por retención física Atrapamiento El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH. cofactores. la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura.) se encuentran en interface: en el medio de reacción y en la fase constituida por el soporte con la enzima. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. La inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado Unión covalente La metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleó filos de las proteínas De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas. amplié el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. disminuya la inhibición. De todas formas. debido a su carácter hidrófobo. El resto de aminoácidos. inhibidores. . sustratos. En segundo lugar. activadores. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. productos. el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización. Unión química Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato. así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína. El atrapamiento. el triptófano. los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente la lisina. la arginina y el ácido aspártico y glutámico. etc. la cisteína. requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos.

5. Disolver el alginato. 2. la unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo está Impedido. adicionar y mezclar 3 ml de solución enzimática invertasa ( 0. la cual presentara una viscosidad alta. la inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma Inactiva.PAD 8.025 % p/v en buffer de acetatos 0. incubar a 40°C por 30 minutos. Pesar 2 gramos de esferas y colocarlas en 50 ml de una solución de sacarosa al 10% p/v en agua destilada. 3. Repartir la solución de alginato. la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Antes de adicionar las esferas en la solución de sacarosa. tomar otra alícuota de 2 ml y marcar como tiempo 30. Preparar una solución de 50 Ml de alginato de sodio al 3% ( p/v ) en agua destilada. Procedimiento 1. lo cual implica actividad hidrolitica de la invertasa inmovilizada. gotear suavemente sobre la solución de cloruro de calcio. los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad catalítica de la enzima. 2. separar y lavar las esferas formadas con agua destilada. Un cambio de color rosado establece la producción de glucosa proveniente de la sacarosa. . 7. A las muestras tomadas determinantes concentración de glucosa con ayuda del kit enzimático glucosa GOD. una alícuota de 2 ml como tiempo cero. tomar de esta.1 M de pH 4. agitar lentamente hasta su disolución. 6.Efectos en la actividad enzimática Tras una inmovilización.enzima en jeringas de 10 ml de capacidad. Si pierde totalmente la actividad enzimática puede ser debido a que: 1. Preparar 250 ml de cloruro de calcio en agua destilada 4. Con ayuda de un filtro de papel. al final de los 30 minutos.6 3.

1 M con ph de 4.DIAGRAMA DE FLUJO INMOVILIZACION ENZIMATICA Preparar una solución de 50 ml de alginato de sodio al 3 % en agua destilada agitando lentamente hasta su disolución Adicionar a la solución 3 ml de enzima invertasa en solución buffer al 0.6 Preparar 250 ml de cloruro de calcio al 3 % Tomar de la solución alginato enzima y gotear suavemente sobre la solución de cloruro de calcio Separar y lavar las esferas con agua destilada Pasar 2 gramos de esferas a solución de glucosa al 2 % de 25 ml Determinar la concentración de glucosa en las muestras formadas con el kit enzimático glucosa GOD PAD esto se logra si toma un color rosado .

o para retener ciertas características de la enzima utilizada. sustratos. Por lo que su actividad enzimática se afecta por efectos de tipo difusional es decir su difusión de los sustratos hacia el centro activo de la enzima se impide por resistencias de tipo externo e interno. . Usándose el alginato en medio como el cloruro de calcio. Debido a que estas condiciones son muy suaves el alginato es uno de los polímeros más usados.  Se realizo una emulsión de una solución acuosa de la enzima en buffer de acetatos 0.6. productos. se forma una membrana sobre la superficie de las microgotas. Donde la invertasa entra en un sistema heterogéneo en el que sus componentes intervienen en un proceso catalítico.  Se usa el alginato porque atrapa la enzima en partículas moldeadas de un polímero en un modelo. Al agregar la solución de alginato a la emulsión agitada. inhibidores se encuentran en una interfase. CONCLUCION La inmovilización enzimática esta destinada a la perdida de actividad . las cuales se dispersaron en una fase acuosa.1 M de pH 4. es decir su ph. usando un polímero natural como lo es el alginato el cual se puede polimerizar a temperaturas bajas (25ºC).RESULTADOS ANALISIS DE RESULTADOS - La oxidasa se inmovilizo aplicando la técnica de atrapamiento. el cual actuó como un disolvente orgánico inmiscible en agua para formar microgotas acuosas.

Explique la metodología para la determinación de la actividad enzimática de las siguientes proteínas: 1. cuando la temperatura es de 40°C y el pH 6. Método de Balls y Hoover conocido como el método de coagulación de la leche.2. sin duda. Se realiza una curva de calibración con diluciones de 1 * 10-4 a 1 * 10 _ 6 M obtenidas de una solución madre de p. se mide la absorbancia a 400 nm en el espectrofotómetro.CUESTIONARIO BIOTECNOLOGIA 1. Para la extraer la enzima se cortan las vainas finamente del producto y se agrega fosfato de sodio 0. mide la actividad de la coagulación de la leche. uno de los métodos mas expeditos para determinar actividad enzimática de una proteinasa. o . la hidrólisis de un substrato de proteína. La unidad de leche coagulada se la define coma la cantidad en peso de un preparado enzimático necesario para coagular 5 ml de solución de leche estándar por minuto. La actividad se expresa en términos de unidades de leche coagulada por g de preparado enzimático. es decir. por el contrario. La principal desventaja de este método radica en el hecho de no medir la proteólisis total.1 M de ph 7 en relación peso volumen. la coagulación de la leche parece ser una propiedad característica de los componentes proteolíticos de este grupo de enzimas y puede ser usada con seguridad en la medición proteolítica. el tiempo necesario para que una cantidad conocida de enzima coagule un determinado volumen de solución de leche. Proteasa.1.nitrofenol ( NO2C6H4OH ) a 0. las preparaciones es necesario activarlas antes con bien con exceso de cianuro. 1. sin embargo. Glucosa Isomerasa. pero.1 M. es. Según algunos autores. Se toma como índice de actividad proteolítica. Afortunadamente.

1. Procedimiento: En primer lugar. Esto permite que la enzima presente en la harina actúe sobre el almidón y lo convierte en maltosa.3.5°C por 10 minutos. usando el reactivo de Folin.5 N y 3 ml del reactivo de Folin (dilución 1 + 2). manteniéndose la mezcla a 25°C por 3 minutos. de ph 7. Luego se centrifuga separándose el sobrenadante que se usará en la determinación. Reactivos:  Solución de cianuro de sodio 2.ciocalteu disuelven en Preparación de extracto enzimático: El producto pesado y molido se extrae con solución tampón de borato 0.8 e incubar por 1 hora a 30°C. se lee la absorbancia a 750 nm.5-4.0 M. Del sobrenadante se toman 5 ml. se agregan 10.1 M.5.3 1\1 y centrifugar. debe activarse la enzima. El valor de maltosa se define como los mg de maltosa producidos por 10 g de harina bajo las condiciones ya señaladas. A 5 ml de solución de hemoglobina se le agrega 1 ml del extracto activado y se mantiene a 35.5  Acido tricloroacetico 0. Método de la Maltosa: Se basa en suspender 10 g de harina en 46 ml de solución tampón de pH 4. para lo cual se toma una alícuota del extracto enzimático problema y se le agrega 0. para agregar luego 10.3 M  Solución de NaOH 0.25 ml de cianuro sódico 2.0 activador de la enzima  Substrato hemoglobina: 20 mg/ml de hemoglobina se solución tampón de borato 0.4 N  Reactivo del fenol según Folin.DETERMINACIÓN DE PAPAÍNA Fundamento: El método se basa en medir el aminoácido tirosina que se libera por la acción de la enzima sobre las proteínas. la que se determina por el método del ferricianuro. Amilasa.1 M de pH 7.0 ml de NaOH 0.0 ml de ácido tricloroacético 0. Fundamento: .

protegiéndola del . Consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular. o sea.5-dinitrosalicilico. se agregan 30 g de sal de Seignette (tartrato de Na y K) y se diluye a 100 ml. Procedimiento: 0. Se incuba a 25°C por 3 minutos. Substrato: Solución al 1% de almidón en fosfato de sodio 0.5 ml de substrato.81. intensidad y energía aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubilizar complejos proteicos.8 (para beta-amilasa).02 M de pH 6. La intensa agitación producida destruye las membranas celulares. diluir 1 microgramo/ml.5 ml de solución de la enzima o del extracto problema se mezclan con 0. Se incluye un blanco con 0. Dependiendo de la frecuencia.016 M.0 m moles) para convertir las lecturas colorimétricas a unidades de actividad enzimática. o bien por titulación yodométrica de Cu no.Los grupos reductores liberados del almidón se miden por su propiedad de reducir el ácido 3. Reactivos: Enzima: Diluir una suspensión cristalina 1: 500 (o el extracto problema). Se establece una curva con maltosa (0. Una de los métodos más utilizados para el rompimiento celular es la Zonicación. 11. reducido a 2. de pH 4. Para trabajar. determinar la concentración proteica mg/ml = x 0. usando la reacción de Fehling I. La maltosa puede también determinarse por el método de Munson y Walker. se calienta en agua hirviendo por 5 minutos y luego se enfría. Se agregan 10 ml de agua y se lee a 540 nm (filtro verde) contra el blanco. describa y explique el fundamento físico de esta técnica. que libera un micromol de azúcar reductor.5 ml de agua en remplazó de la enzima o extracto problema. sé agrega 1 ml de reactivo de color. Se suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas.006 M (para alfa-amilasa) y solución al 1 % de almidón en acetato de sodio 0.9 con NaCl 0. calculado como maltosa por minuto y a 25°C bajo las condiciones del ensayo. Se transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convertirá en vibraciones de alta intensidad generándose .3-3. Reactivo de color: 1 g de ácido dinitrosalicílico se disuelve en 20 ml de NaOH2N y 50 ml de agua.

Luego el agua y las burbujas son impulsadas hacia afuera por el impulsor a la parte de mayor presión de la bomba donde las burbujas colapsan e implotan originando desprendimiento de materiales. la tinción de plata aumenta la sensibilidad típicamente unas 50 veces. las claves para el éxito en una tinción argéntica son. 3. . El fundamento físico de esta técnica se llama CAVITACION es el fenómeno por el cual la presión total lugar de la más baja presión en todo el sistema alcanza la presión de vapor del líquido bombeado.ondas de ultrasonido que generan millones de burbujas microscópicas. Azul comassie sensibilidad hasta 50 ng Fluorescencia sensibilidad hasta 50 ng Coloracion de plata sensibilidad hasta 1 o 2 ng Tinción argentica de geles de poliacrilamida SDS La tinción con plata fue introducida por Kerényi y Gallyas como un procedimiento extremadamente sensible para detectar pequeñas cantidades de proteínas en geles La técnica se ha ampliado para el estudio de otras macromoléculas biológicas que han sido separadas en una variedad de soportes. El agua hervirá y se formarán burbujas de vapor. reactivos puros y agua de alta pureza. Muchas variables pueden influir en la intensidad del color y cada proteína tiene sus propias características de tinción. por lo usual puede detectar una banda de 50 ng de proteína. las cuales se expanden y colapsan contra las células causando la ruptura de su membrana. material de vidrio limpio. Determine la sensibilidad de dos métodos de determinación de proteínas. La tinción clásica con coomassie brilliant blue. junto con las tinciones de comassie y nitrato de plata.

más que para análisis.2. Defina y explique y el fundamento de las siguientes cromatografías: 4.3. Cromatografía preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso posterior. Una papilla más espesa ayuda a estabilizar el grosor de las placas que se precisa para una carga de mayor magnitud. La cromatografía preparativa se diferencia de la técnica básica en muchos aspectos. que permiten separar aproximadamente 1 g. pequeños nucleótidos y aminoácidos. La cromatografía de intercambio iónico conserva los analitos basándose en las interacciones de Coulomb. a la que a menudo nos referimos como cromatografía de permeacion de gel ( GPC ). no suministra valores absolutos. de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.1. Cromatografía exclusión por tamaño La cromatografía de exclusión por tamaños ( SEC ). La cromatografía preparativa comprende un amplio campo de aplicaciones. de mezcla utilizando unos 35 g. incluyendo grandes proteínas. hasta un máximo de 2 mm. pero en este caso. Ésta debe hacerse con menos agua que de ordinario. 4. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada. La fase estacionaria muestra en la superficie grupos funcionales iónicos que interactúan con iones de carga opuesta del analito. desde la preparación de la papilla. El espesor óptimo oscila desde un mínimo de 1 mm. Las placas utilizadas en cromatografía preparativa son placas grandes. 4.4. desde el aislamiento de 1 µg. es una técnica de caracterización de polímeros que proporciona la distribución completa de pesos moleculares de una muestra y sus distintos promedios: es una técnica relativa. el calibrado se basa en la comparación de volúmenes hidrodinámicos y se llama calibrado universal. Cromatografía de intercambio iónico La cromatografía de intercambio iónico (o cromatografía iónica) es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basado en las propiedades de carga de las moléculas. Este tipo de cromatografía se subdivide a su vez en la cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico: . También es posible utilizar en el calibrado un polímero distinto del caracterizado. de adsorbente. de aproximadamente 20x20 cm. si no que requiere un calibrado con fracciones mono dispersas del mismo polímero.

como un catión de amonio cuaternario.4. Como se calcula el factor de purificación de una enzima y el rendimiento de esta. aquí la fase estacionaria es de partículas de sílice químicamente modificadas con hidrocarburos saturados. Cromatografía de intercambio catiónico La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente. varias moléculas de proteína pueden ser separadas 4. Cromatografía de fase reversa La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a su polaridad. acetato de etilo. como un acido fosfórico La cromatografía de intercambio de aniones retiene aniones usando grupos funcionales cargados positivamente. cual es su significado practico. Esto convierte a la fase estacionaria en una matriz apolar. como un acido fosfórico 4. 5. acetona y alcoholes alifáticos. El principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la cromatografía en capa fina.<--> R-A-M+ + H+ + BLa cromatografía de intercambio iónico separa las proteínas de acuerdo a su carga neta. insaturados o aromáticos de diferentes tipos. la cual depende la composición de la fase móvil.5. tales como agua. R-A-H+ + M+ + B. para este tipo de cromatografías se emplean mezclas de solventes polares.  La cromatografía de intercambio catiónico retiene cationes cargados positivamente debido a que la fase estacionaria muestra un grupo funcional cargado negativamente. . Ajustando el ph o la concentración de iones de la fase móvil. acetonitrilo. Sin embargo. Por lo tanto.

6.El factor de purificación de una enzima se calcula de la siguiente forma:  se cuenta con la actividad especifica de la enzima inicial que se mide por mg proteína total siendo igual a U= mg.  Así mismo se debe contar con la actividad especifica final de la misma enzima. Existen diversos métodos que permiten la cuantificación de proteínas. No existe un sistema totalmente satisfactorio para determinar la concentración proteica de una muestra.  Para obtener el factor de purificación debemos dividir la actividad especifica final entre la inicial el valor que nos da es el factor. La elección de un método u otro se basa en la naturaleza de la proteína y del resto de componentes de la muestra y en la sensibilidad y precisión requeridos. entre los métodos mas usados tenemos: METODO Folin fenol o de Lowry DESCRIPCION Basado en la formación de un complejo coloreado entre el Cu ++ y los nitrógenos . Cuales son los métodos de concentración de proteínas escala laboratorio mas utilizados y cual es su fundamento físico.

se hace reaccionar posteriormente con el reactivo de Folin que al ser reducido por los residuos de aminoácidos aromáticos tirosina y triptofano da un color azulado. Ventajas  Color estable  Alta precisión y exactitud Aplicaciones Coomassie o de Bradford  Es el método mas usado  Sirve de método estándar  Excelente para proteínas de membrana Basado en la unión directa del colorante azul de Coomasie a la estructura terciaria de las proteínas y aminoácidos específicos. Para resaltar el color formado en esta reacción y aumentar la sensibilidad.de los enlaces peptídicos reacción de Biuret. Ventajas  Bajo limite de detección  Compatible con agentes reductores  Rapidez Aplicaciones Método espectrofotométrico  Se emplea cuando se necesita rapidez  Para muestras con agentes reductores Se basa en la propiedad de las proteínas de tener un máximo de absorción a 280 nm debido al contenido en los aminoácidos tirosina y . El colorante cambia de color de marrón a azul al unirse a proteínas.

BIOTECNOLOGIA PARA INGENIEROS. Mexico D. Concepción García Alfonso Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Lehninger. S. Jesús Diez Dapena. José Antonio Bárcena Ruiz. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico.: LIMUSA. Emilia Martínez Galisteo. La concentración se puede obtener aplicando la siguiente expresión: Ventajas  Alta sensibilidad  no hay perdida de la muestra Aplicaciones  Para muestras muy escasas y valiosas BIBLIOGRAFIA Electroforesis de ácidos nucleídos en geles de agarosa. Alan. Campus Universitario de Rabanales.triptófano.F. 14071-Córdoba. Carmen Alicia Padilla Peña. Edificio Severo Ochoa.). La variabilidad en estos aminoácidos en diferentes proteínas obliga a añadir un factor de corrección aportado por la absorbancia del enlace peptídico a 205 nm. BIOQUIMICA (Segunda ed. . (1985). (1999).

Fundamentos Actualidad e Importancia.Mainero.org/wiki/Cin%C3%A9tica_enzim%C3%A1tica http://es.org/wiki/Cin%C3%A9tica_de_Michaelis-Menten . (2009). F. X.joseacortes. Protocolos de laboratorio UEG 2009.wikipedia.ht ml.uy/investigacion/grupos/gti/timag/trabajos/2006/electroforesis/ By Carolina Etchart & Marcelo Lavagna http://www.mitecnologico.wikipedia. Uso de Marcadores Microsatélites para la Estimación de Diversidad Genética en Plantas. (1985). BIOTECNOLOGIA. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLOACRILAMINA. Perez. BIOTECNOLOGIA. LA INGENIERIA GENETICA Y LA NUEVA BIOTECNOLOGIA (segunda ed. Renneberg. http://www. http://www. (2009). R. USA. Worth Publishers. (2000).edu. Mexico: Mc Graw Hill.htm http://iie. R.fmedic.).com/lb/Main/EcuacionDeLineweaverBurk http://es. 2000: LA CIENDIA PARA TODOS. Thaura Ghneim Herrera. Mexico.ivic.).fing.com/practicas/extraccionADN.pdf http://laguna... Paris: EL MANUAL MODERNO. BIOQUIMICA LAS BASE MOLECULARES DE LA VIDA (Cuarta ed. T.: UNIV. MM. (2000). 3rd Ed. Mckee. (2000) Lehninger Principles of Biochemistry. Scriban. Duina Posso Duque. M.mx/~evazquez/0403/ecuacion%20de%20michaelis4.unam. M. H. 2008. España: REVERTÉ.ve/ecologia/ueg/formatos/Electroforesis%20de%20ADN%20en%20 geles%20de%20agarosa. Ediciones IVIC.F. Nelson. Cox. Mexico D. DL.