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Materiales y métodos

3.1.1. Obtención del material vegetal: El material vegetal fue recolectado en forma
manual de acuerdo a las pautas establecidas por la OMS. Se seleccionaron cuidadosamente
aquellas plantas aromáticas de Origanum vulgare L. (orégano), Aloysia triphylla (cedrón),
Aloysia polystachya (té de burro), Mentha piperita L. (menta), Hyptis mutabilis, Tagetes
minuta L.y Eucaliptus globosus que no mostraron alteración morfológica visible, ni
indicios de afecciones patógenas. Se empleó el mismo criterio para los frutos maduros de
Citrus limonum Risso (limón). Las plantas fueron tipificadas y conservadas bajo números
de herbarios correspondientes y archivadas en el Museo Botánico de la Facultad de
Ciencias Exactas Físicas y Naturales de la UNC Las hojas verdes de las plantas
mencionadas anteriormente y las cáscaras de los limones fueron secadas al aire en un
espacio cerrado a temperatura ambiente (25ºC).
3.1.2. Extracción de los AEs: La extracción se realizó por hidrodestilación en un aparato
extractor por arrastre de vapor tipo Clevenger (figura 4), durante 2 horas. Brevemente el
material vegetal se colocó en una caldera con un doble fondo perforado; el vapor de agua
penetra en la cámara en la que se encuentra el material, arrastra las sustancias volátiles
(esencias) y conjuntamente se condensan, al hacer contacto con un refrigerante de doble
camisa. La emulsión obtenida fue enfriada a 4ºC y centrifugada a 3000 RPM.
Posteriormente, la fase superior (AEs) fue extraída con una pipeta Pasteur de vidrio. El AE
obtenido fue secado con NaSO4.anhidro, colocado en viales de vidrio color caramelo con
tapa de teflón y almacenados en freezer a –18ºC para evitar reacciones oxidativas que
puedan alterar su composición.
3.1.3. Identificación y cuantificación de los componentes de los AEs: Los AEs fueron
analizados en un cromatógrafo de gases Shimatzu GC-R1A con detector de ionización de
llama (FID). La separación se realizó con una columna capilar de sílica CBP-1 (30 m x
0,25 mm i.d.) 100% de dimetilpolisiloxano. La temperatura de la columna fue programada
desde los 60 ºC a los 240ºC con una rampa de 4ºC/minuto. Las temperaturas del inyector y
detector fueron de 270ºC. El gas transportador fue el N, a un flujo de 1mL/minuto. El área
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1998). Tapa móvil 4. Balón generador de vapor 8. Los compuestos fueron determinados. Calefactor eléctrico 10. Tablero de comando 5. Las cantidades relativas de los componentes individuales se basaron en el área de los picos obtenidos.. 1. Soporte de apertura de cámara de extracción 11. sin factor de corrección. Cámara de extracción 6. Estructura autoportante 9. por comparación de los tiempos de retención con respecto a estándares puros de n-alcanos (Zunino et al. Grilla soporte 7.Materiales y métodos de los picos fue cuantificada por integración electrónica. Cabezal de destilación 3. Condensador de doble efecto 2. Junta sándwich de la unidad calefactora Figura 4: Extractor por arrastre de vapor tipo Clevenger 25 .

fueron inundadas con una solución acuosa estéril de Tween 80 (2. fueron utilizados como control positivo y 3 tubos análogos. como controles de esterilidad (control negativo). 40. Los componentes fueron identificados por comparaciones de sus tiempos de retención con aquellos de muestras auténticas. En condiciones de esterilidad. 1000 y 1500 µl/l como concentración final y el DMSO (puro en el control y como vehículo de los AEs) en la concentración más alta utilizada para disolver los AEs. 1995).4. (1996) donde la cepa de Fusarium verticillioides MRC 826 fue cultivada en placas de Petri de 90 mm de diámetro con 15 mL de agar V8 e incubadas a 27ºC durante siete días. 2000). con un pH final aproximado de 7. 100. 20. 3. Para añadir la sustancia problema. La temperatura de la columna y la del inyector fueron las mismas utilizadas para la cromatografía gaseosa. se repitió el mismo esquema reemplazando el DMSO por etanol. a un flujo de 1mL/minuto.5 %) y su superficie fue frotada con una espátula de Drygalsky con el objeto de remover el desarrollo fúngico. se le incorporaron los AEs. El medio fue disuelto en agua ultra pura.espectrometría de masa (GC-MS) fue realizada en un equipo Perkin Elmer Q-910 usando una columna capilar cubierta con CBP-1 de 30 m x 0. 200. 50. por comparación de sus espectros de masa con respecto a aquellos de la librería de espectros de masa del Instituto Nacional de Tecnología y Estándares (NIST 3. inmediatamente a la esterilización. El espectro de masa fue registrado a 70 eV. posteriormente se almacenaron a 4ºC hasta su utilización. para obtener 10.4. el cual fue vigorosamente agitado en un vortex durante 15 26 . A continuación. 500.0) y otra librería de espectros de masa y tiempos de retención de los compuestos volátiles (Adams. los tubos con el medio se enfriaron en baño termostatizado a 45 – 50ºC y se agregaron los AEs.5% de agar (medio semisólido). Para este ensayo se utilizó como medio caldo infusión de corazón con el agregado de 0. La suspensión resultante fue extraída con una pipeta Pasteur de vidrio estéril y transferida a un tubo cónico. Las placas con la cepa fúngica desarrollada. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM): Se realizó por el método de susceptibilidad a antifúngicos en medio semisólido (SAAS) Método semicuantitativo (Provine & Hadley. El inóculo se elaboró según la técnica descripta por Pujol et al. sin ningún agregado. Además 5 tubos con el medio de cultivo puro. El gas transportador fue He.Materiales y métodos La cromatografía gaseosa . fraccionado en alícuotas de 5 mL en tubos de vidrio de 16 x 125 mm y esterilizado en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.1. 250.25 mm.

dos días consecutivos. La inoculación se realizó con un ansa de aro de 10 µL. se colocaron las semillas en estufa de secado a 45ºC hasta obtener peso constante. con respecto al control y “0” sin desarrollo visible. Los tubos inoculados. a una cápsula de Petri. Sobre el medio de cultivo inoculado se aplicó 0. se realizaron estrías sobre placas de Petri con agar papa dextrosa utilizando el ansa con la cual se realizaron los inóculos. 1+ 25% de desarrollo o menos. insertando el inóculo hasta el fondo del tubo que contiene el medio con el compuesto a evaluar. Al sexto día el contenido de cada frasco se transfirió. Para verificar la pureza y la viabilidad de la cepa empleada. En el caso de los hongos filamentosos la inhibición del desarrollo de un 75% o más (1+) determina la CIM.Materiales y métodos segundos. Posteriormente se impregnaron los discos de papel (Wattmann 3) para facilitar su difusión. Las sustancias a probar fueron incorporadas a los 17.1. El AEO se aplicó en concentraciones de 20 y 30 ppm. se incubaron hasta un buen desarrollo aparente en el medio control (48. se ajustó la humedad a 35 %. 3. formando una monocapa según Torres et al (2003) dejando un espacio suficiente en el centro de la placa para colocar el disco de 6 mm de diámetro. timol y terpineol fueron diluidos previamente en etanol absoluto calidad HPLC. Para determinar el nivel de inhibición se comparó a todos los tratamientos con el control (control +) y el desarrollo fue calificado de la siguiente manera: 4+ desarrollo comparable con el control. a continuación se colocaron 20 g de maíz en un Erlenmeyer de 100 mL de capacidad y con el agregado de agua destilada.72 horas). El AEO y los terpenos.5 mL de aceite mineral con el objeto de evitar la esporulación y el desarrollo fúngico sobre la superficie como se observa en la figura 5. 20 y 23 días posteriores a la inoculación para observar si una concentración conocida de AEs tenía efecto sobre la producción de FB1. mientras que los terpenos se aplicaron a concentraciones de 4 y 6 ppm. Infección fúngica en maíz: Para los experimentos de toxicogénesis de Fusarium verticillioides en maíz. Posteriormente se esterilizó por autoclavado a 121°C durante 15 minutos. en esterilidad. manteniendo la proporción en la que se encuentran en el AEO (21% del aceite de origen). para obtener un desarrollo bidimensional. 3+ aproximadamente el 75% del control. realizando una homogenización manual diaria durante los primeros cinco días. El maíz estéril fue inoculado con 200 uL de la suspensión fúngica y se incubó a 27°C en oscuridad.5. y las placas fueron 27 . 2+ el 50%. La suspensión fue ajustada espectrofotométricamente con la adición de la solución estéril de Tween 80 hasta obtener un 95% de transmitancia a 530 nm.

Obtención de FB1 para alimentar los animales: La obtención de FB1 se realizó colocando 300 g de maíz en Erlenmeyers de 1L. condiciones óptimas para la producción de fumonisinas.1.Materiales y métodos introducidas en una cámara húmeda a 27ºC durante 28 días. y se mantuvieron en el bioterio del Departamento de Bioquímica Clínica. Figura 5: Esquema de la marcha metodológica para la determinación de la CIM con el método SAAS. 3. UNC. Los animales fueron puestos de a pares en las jaulas.7.6. de 6-8 semanas de edad al comienzo de la administración de AEO y FB1. 3. Animales: Para los estudios de intoxicación experimental se utilizaron ratas Wistar machos. se ajustó la humedad a 35% con el agregado de agua destilada. El maíz estéril fue inoculado con tacos de micelio de 28 . Facultad de Ciencias Químicas. y posteriormente se esterilizó por autoclave a 121°C durante 15 minutos por dos días consecutivos. durante todo el período de experimentación.1.

tamaño de partícula de 5 µm).35 ± 0. incubación y extracción de FB1 se desarrollaron de la misma manera que en el apartado 3.250 y 10. (1990). La cuantificación de la toxina se realizó mediante una curva de calibración realizada con estándares de 2. Cuantificación de FB1: Se tomaron alícuotas de los extractos acuosos de FB1 y fueron diluidas con volúmenes iguales de acetonitrilo grado HPLC. la fase líquida fue almacenada a -18°C hasta su cuantificación por HPLC o para la preparación de las dietas. Una alícuota (50 µL) de los extractos diluídos fue derivatizada con 200 µL de una solución de O-ftaldialdehído (OPA) obtenida por el agregado de 5 mL de Na2B4O7 0. La FB1 fue detectada y cuantificada utilizando un HPLC Hewlett Packard 1100 con detector de fluorescencia. y un flujo de 1. 5. La extracción de FB1 se realizó mediante extractos acuosos en una relación 1:3 (1 parte de muestra + tres partes de agua tridestilada).5. respectivamente.8.1M (75:25) y pH 3.6 mm.625. Preparación de extractos acuosos de FB1: Al final del período de incubación. obtenido a partir de un cultivo desarrollado en agar V8.1. tamaño de partícula de 5 µm). La separación y purificación de FB1 a partir del maíz fermentado se realizó de acuerdo a la metodología propuesta por Voss et al. La cuantificación de los extractos fue realizada siguiendo la metodología propuesta por Shephard et al. (1990). Como fase móvil se utilizó una solución de metanol:NaH2PO4 0. Posteriormente se molió en un molino de rodillos y fue cribado en tamiz de malla de acero inoxidable hasta obtener partículas < 2 mm.02. (1990). Las condiciones de agitación. (PROMEC. La extracción y conservación de la FB1 se describen en el apartado 3.1 M y 50 µL de 2-mercaptoetanol. Las λ utilizadas fueron 335 y 440 nm para excitación y emisión.6 mm. 29 . ajustado con ácido orto-fosfórico.1.500 µg FB1/mL.1. el maíz fue inactivado por autoclave y secado durante 24 horas en estufa de aire forzado a 60°C. conectada a una pre-columna C18 (20 mm x 4.5 mL/min. 3. el maíz fue esterilizado por autoclavado y secado en estufa a 60°C durante 48 horas. a 40 mg de OPA disuelto en 1 mL de metanol. en un agitador orbital durante 2 horas a 200 RPM.1. 3.9. Luego de decantar y filtrar los extractos. peso en volumen.Materiales y métodos Fusarium verticillioides MRC 826 en etapa de crecimiento activo.8. Al final del período de incubación. La separación de los componentes del extracto fue realizada en una columna C18 (150 mm x 4. La separación y purificación se realizó de acuerdo a la metodología propuesta por Voss et al.

República de Sudáfrica). Montreal.1. Los tubos fueron colocados en un microondas doméstico de 2450 MHz y a 750 W de potencia máxima.10.5.5%. Luego de la separación de dos fases.1. calentando la muestra al 50% de potencia dos veces por un lapso de 20 segundos.1. Estudio de la viabilidad de las semillas: 1000 g de semillas de maíz previamente seleccionadas. PQ). La fase móvil utilizada fue acetonitrilo/metanol (80:20) con un flujo de 1. Luego de que la muestra tomara temperatura ambiente. Luego se enjuagaron con agua destilada estéril y se secaron con papel tissue estéril. El día 29 las cápsulas de Petri se retiraron de la cámara y se seleccionaron 8 semillas al azar de cada placa. de 15 minutos. El maíz fermentado se secó a 60ºC en una estufa de aire forzado durante 72 horas. sumergiéndolas 5 minutos en una solución de hipoclorito de sodio comercial al 0. Determinación de ergosterol: Se realizó mediante la técnica de extracción asistida con microondas (MAE) según Young (1995).11.Materiales y métodos Programme on Mycotoxins and Experimental Carcinogenesis. La columna utilizada fue ODS 3µm de acero inoxidable (CSC. excepto que las semillas no fueron infectadas. La confirmación se realizó por comparación del tiempo de retención relativo del estándar corrido bajo idénticas condiciones y por coinyección con el estándar (Fluka). el contenido fue neutralizado con ácido clorhídrico 1M. El ergosterol fue extraído con n-pentano (3 x 2ml) agitando en vortex por 30 segundos. El λ utilizada fue de 282 nm. con un intervalo entre cada calentamiento.5 mL de hidróxido de sodio 2 M en solución acuosa. sin daño físico. 3. Posteriormente fue colocado en un tubo de cultivo de 17 mL al que se le agregó 2 mL de metanol y 0.3 mL /minuto. fueron desinfectadas. Éstas se colocaron en forma radial en una placa de Petri sobre 10 mL de 30 . Posteriormente se colocaron 20 g en placas de Petri formando una monocapa y se sometieron simultáneamente al mismo esquema de tratamiento expuesto en el apartado 3. 3. Tygerberg. se evaporó hasta sequedad y se resuspendió en 1 mL de metanol para su posterior análisis. la superior (npentano) se extrajo con pipeta Pasteur. Las semillas se molieron y se tomó una alícuota de 25 mg finamente molido (tamizado con malla de 40 µm de poro). El ergosterol se detectó en un HPLC Hewlett Packard con detector UV-VIS.

15. Luego de mezclar enérgicamente. fósforo >0. 3. El consumo diario de alimentos se calculó por diferencia entre el peso de las cantidades suministradas y el de las retiradas a las 24 horas posteriores. La concentración final de FB1 en el alimento fue de 100 ppm. 3.4% estéril.4 µL de aceite de oliva.A.1.C. respectivamente. peso corporal. y se agregaron 75. minerales totales <8%. ganancia de peso corporal.13. verticillioides a una solución de agar (Difco) en 435 mL de agua destilada. observándose la aparición de la radícula en el día 1. ajustando la cantidad de FB1 con diferentes proporciones de extracto acuoso de FB1 y extracto acuoso de maíz sin inocular. valor energético > 2780 kcal/kg. Se moldearon piezas cilíndricas de aproximadamente 20 g cada una. obteniéndose una mezcla homogénea.5%.I.Materiales y métodos agar-agua al 0. se incorporaron 1000 g de alimento balanceado comercial finamente molido. y ajustando la cantidad de FB1 con diferentes proporciones de extracto acuoso de FB1 y extracto acuoso de maíz sin inocular..16. y consumo de FB1: La determinación de los parámetros nutricionales fue realizada teniendo en cuenta las especificaciones existentes en la bibliografía (Wilson et al. y luego del enfriamiento y solidificación el alimento fue conservado a -18°C hasta su utilización.1. agregando 30 µL de AEO disuelto en aceite de oliva.14. 3 y 5 posterior al montaje de la semilla sobre el soporte semisólido de agar. La mezcla se calentó hasta disolución completa del agar. Dieta experimental con FB1 y AEO (DEM): Se preparó siguiendo la misma metodología que la DEC. 3. fibra dietaria >7%.. 2001). Dieta experimental con FB1 (DEFB1): Se realizó de la misma manera que la DEC. Las concentraciones finales de AEO y FB1 fueron de 30 ppm y 100 ppm.1.1.12. Dieta experimental control (DEC): Se preparó agregando 435 mL de extracto acuoso de maíz no inoculado con F. Alimento balanceado comercial: Alimento balanceado rata-ratón Cargill S. 3. se dejó enfriar hasta 50°C.1. calcio >1%. Consumo de alimentos. El peso corporal se determinó semanalmente usando 31 . extracto etéreo >6%. 3. humedad <13%. libre de AFB1 y FB1. Proteínas >24%.

hígado.18. La ganancia de peso corporal se calculó por diferencia de pesos de los animales a los 30. CA). se realizó el estudio histopatológico en los tejidos coloreados mediante la técnica de hematoxilina y eosina. 60 y 90 días. se tomaron muestras de esófago. con una precisión de 0.17. con respecto al peso registrado en el mes anterior. en sueros obtenidos por punción intracardíaca al final del período de intoxicación.Materiales y métodos una balanza Ohaus. pulmón y riñón. Determinaciones bioquímicas: Se determinaron los niveles de colesterol total. de acuerdo a las siguientes fórmulas matemáticas: Consumo de toxina (mg FB1/kg peso corporal/día) [Toxina] = (mg toxina/kg alimento) Consumo de alimentos (kg) en X días CRA = (kg/kg/día) X días + x [ Consumo relativo de alimentos (CRA) (kg alimento/kg peso corporal/día) Peso corporal (kg) (día 0) + Ganancia de peso en X días (kg) 2 ] 3. El análisis estadístico de los datos fue realizado mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA). El consumo total de FB1 se determinó a los 30. USA. alanino aminotransferasa (ALT). Estudios histopatológicos: Al final del esquema de alimentación con las diferentes dietas experimentales. triglicéridos. Las determinaciones fueron realizadas con un autoanalizador Technicon RA-1000.4. NJ. 3. y test de comparaciones múltiples de Bonferroni. Análisis estadístico: Se utilizó el software Instat (Instat. Los tejidos fueron inmediatamente fijados con una solución de formaldehído 4% en buffer fosfato de pH 7.05 g. y la concentración de FB1 en el alimento. 60 y 90 días. Las muestras se incluyeron en parafina y se realizaron cortes de 4 µm de espesor. 3. intestino delgado. calcio total. y las actividades enzimáticas aspartato aminotransferasa (AST). Finalmente. 60 y 90 días de la intoxicación. San Diego. teniendo en cuenta el consumo de alimentos de cada animal. gamma glutamil transpeptidasa (GGT) y fosfatasa alcalina (FAL). Florham Park. la ganancia de peso corporal durante los 30. 32 .19.

05.Materiales y métodos Para los estudios de inocuidad del vehículo la comparación entre los grupos se hizo mediante el test de Tukey-Kramer. En todos los casos. 33 . las diferencias fueron consideradas significativas para p < 0.

2. Luego de la disolución del agar se agregaron 250 mL de una solución obtenida mediante el filtrado del líquido de cocción. 3. con el agregado de hojas. en 850 mL de H2O destilada. el medio de cultivo fue esterilizado por autoclave a 121 °C durante 15 minutos. 3.2. El medio fue preparado disolviendo 20 g de agar agar en 500 mL de H2O destilada. El medio de cultivo fue preparado mediante disolución de 180 mL de jugo comercial V8. Agar V8: Se utilizó para el desarrollo de F. verticilliodes en un medio semisólido en profundidad. verticillioides MRC 826. Se agregó 10 g de las papas hervidas.2.1.2. verticillioides MRC 826.2. Agar agua: Se preparó una solución de agar-agar al 2% en H2O destilada. con el objeto de limitar el desarrollo a un sistema bidimensional (realizado en tubos de ensayo).8 atmósferas.2. Luego de la disolución del agar en baño de H2O. en etapa de crecimiento activo de clavel blanco.Materiales y métodos 3. La esterilización se realizó por autoclave a 121°C durante 15 minutos. Posteriormente se esterilizó por autoclave a 121 °C durante 15 minutos. previo a la inoculación del maíz.5.2. 3. 2 g de CaCO3.agar en 1000 mL de agua destilada. MEDIOS DE CULTIVO 3. y 15 g de agar-agar. y posteriormente el medio de cultivo fue esterilizado por autoclave durante 15 minutos a 0. 34 . 3. Agar hojas de clavel: El estudio microscópico de Fusarium verticillioides MRC 826 fue realizado en colonias crecidas en agar-agar (2% en H2O destilada). Agar semisólido de infusión de corazón: Se utilizó para cuantificar el desarrollo de F.3 Agar papa: Se utilizó para el estudio de las características culturales de F. en el que se habían hervido 250 g de papas blancas cortadas en trozos pequeños. se disolvió en agitador magnético con calentamiento hasta disolución completa y se fraccionó en tubos de ensayos.4. El medio fue preparado disolviendo 35 g de polvo de infusión de corazón y 5 g de agar .