Relaciones filogenéticas de

tres especies bacterianas a
partir de técnicas
moleculares

Natalie Espinosa Montagut, estudiante
de Microbiología e Ingeniería
Biomédica de la universidad de Los
Andes. Juan Miguel Pérez Alvarez,
estudiante de Medicina de la uiversidad
de Los Andes, Esteban Masmela Gomez,
estudiante de Medicina de la uiversidad
de Los Andes. Marco Aurelio Chica
Mora, estudiante de Medicina de la
uiversidad de Los Andes

RESUMEN
Este artículo presenta las relaciones
filogenéticas entre tres especies distintas
de bacterias y tres cepas de una misma
especie, para llegar a establecer estas
relaciones debimos realizar un proceso de
extracción y purificación de proteínas a
partir de diferentes especies de bacterias
con el proceso de electroforesis mediante
la técnica SDS-PAGE (Sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide
gel
electrophoresis),
lo
que
permitió
comparar el contenido proteico de las
muestras. Para realizar este proceso fue
necesario denaturar las proteínas para
obtener la información sobre el peso

molecular, ya que esta influirá en la
movilidad electroforética de las proteínas
a migrar.

PALABRAS CLAVE
Proteínas,
cladograma,
SDS,
electroforesis, bacterias, aminoácidos,
peso molecular, cepas, Coomassie.

INTRODUCCION
Las
proteínas
son
estructuras
fundamentales para la vida, ya que
dirigen casi todos los procesos vitales en
el organismo y además son las encargadas
de sintetizar y renovar los tejidos del
cuerpo. La suma de todas las proteínas
expresadas por una célula específica se
denomina proteoma, y la ciencia que se
encarga de identificar y clasificar las
proteínas de acuerdo a su función se
llama proteómica. Este artículo se enfocó
principalmente en el estudio de ciertas
proteínas pertenecientes a diferentes
cepas bacterianas: E.coli C600, E.coli W,
E.coli
K12,
Proteus,
Yersinia
enterocolítica y Salmonella Typhi. Es
necesario separar las proteínas para su
correcto estudio, para esto existen ciertos
métodos que lo permiten, en este caso se
realizó una electroforesis SDS-PAGE, el
cual consiste en separar las proteínas por
su peso molecular. Luego de realizar este
proceso y de obtener las secuencias de
los aminoácidos, se pueden determinar las
características fenotípicas que comparten
las
diferentes
cepas
bacterianas.
Posteriormente, se procede a hacer un

25ml H2O).25 ml de solución pH 8.8 1. se realizó la medición de 1 ml de medio de cultivo y se añadió al eppendorf correspondiente. Se centrifugo por 5 min a 13000rpm.75 ml de H2O. Adicionamos 50ul de Persulfato de Amonio al 10% preparado en fresco y 8ul de TEMED. y luego para las proteínas de 16 a 70 kDa usamos uno de 10% y uno de 15% para separar proteínas de 12 a 45 kDa. Se preparó una solución de persulfato de amonio (fresca diariamente) al 10 % (50 mg en 0. MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES - Tubos eppendorf Hipoclorito diluido Buffer Plancha térmica Gel Solución de persulfato de amonio Beakers Solución de poliacrilamida TEMED Agua desionizada Cámara de electroforesis Botella de vidrio Etanol Ácido acético Espátulas Campana de extracción Metanol Azul de coomassie Proteínas bacterianas Extracción de proteínas bacterianas La bacteria se crece ON (Over Night) en caldo LB a una agitación de 250 rpm. es decir se tiene 200ul de muestra y agregamos 100ul de Buffer de muestra.5ml H2O o 25 mg en 0. Se centrifugó 13000 rpm por 5 minutos. En el sobrenadante quedaron las proteínas (Se observaban como un “Moco”) Electroforesis poliacrilamida en geles de Preparación del gel de separación Para separar proteínas de 60 a 200 kDa usamos un gel del 5%.cladograma que cumplirá la función de diseñar las relaciones fenotípicas que existen en las bacterias. Se colocó las muestras en la plancha térmica a 100°C y se le hicieron perforaciones a las tapas de los tubos eppendorf) por 5 minutos. Medimos 1 cm por debajo de los peines en el montaje. Se agregó la mitad del volumen de Buffer de muestra (que debía estar en baño de maría). Se descartó 800ul de sobrenadante en hipoclorito diluido. Posteriormente se marcó en eppendorf con cada uno de los nombres de las cepas a trabajar. En un beaker de 50ml se mezcló 2ml de solución de poliacrilamida 1. se cubrió la solución . Se usó vortex para resuspender. Al haber alcanzado el nivel máximo marcado.

Paso seguido. la tinción se realizó en una botella de vidrio con tapa y en campana de extracción se preparó 100 ml de la solución de tinción. Se separó y se descartó el gel de stacking. se vertió la solución de fijado en las cubetas de tinción suministradas. se retiró el montaje de los vidrios y a continuación. Se depositó el gel en la cubeta con la solución de fijado.30-45 minutos) se removió el agua volteando todo el montaje. Preparación del gel de stacking (o gel de agrupamiento) En un beaker de 50 ml se mezcló 325 μl de mezcla de poliacrilamida 625 μl de solución pH 6. agregando los reactivos en el orden establecido: 50% de etanol (50 ml) 10% de ácido acético (10 ml) 40% de agua des ionizada (dH2O. e hicimos un pequeño corte en la esquina superior del gel de separación en el lugar correspondiente del primer carril de sembrado. Con la ayuda de las espátulas verdes de plástico previamente humedecidas con la solución de fijado. 0. procurando que el gel quedara en el vidrio más delgado. el método de Azul de Coomassie consto de 3 pasos básicos: fijado. tinción y destinción. Se sembró 8μl de cada una de las muestras. luego adicionamos 25μl de Persulfato de amonio 10% y 5μl de TEMED.015g). Después de esto. Destinción . Una vez polimerizado (+/.81 μl de H2O. Se cerro la cámara de electroforesis y se conectó a la fuente de poder.05% (w/v. agregando los reactivos en el orden establecido: 50% de Metanol (v/v. Tinción con Azul de Coomassie Al igual que la tinción con plata. los vidrios. 40ml). En cada paso se utilizó diferentes soluciones. se separaron los dos vidrios. Una vez terminada la electroforesis. 15ml)10% de ácido acético (v/v. Fijado En una botella de vidrio con tapa y en campana de extracción se preparó 100 ml de la solución de fijado. 3 ml)40% de agua desionizada (v/v. se dejó polimerizar y se realizó el corrido de extractos de proteína celular bacteriana en electroforesis denaturante SDS-PAGE Se realizó el montaje de la cámara de electroforesis. llenamos la cámara interna con buffer de electroforesis 1X hasta que se cubrieron los pozos y el resto en la cámara externa.rápidamente con agua desionizada. teniendo siempre presente el pozo número uno de sembrado. Posteriormente se agitó aproximadamente 60 rpm a 37°C por 45 min. 12ml) Coomassie 0. Luego programamos el corrido de electroforesis a 150V por 90 minutos. lo cual guardamos en la cubeta en una bolsa Ziplock a 4oC hasta por 15 días para la tinción. Se apagó y se desconectó la cámara de electroforesis vertical de la fuente de poder.

50ml)10% de ácido acético (v/v. Los cladogramas (Fg. Dejamos el gel en agitación constante de aprox. comenzando con el resultado de la electroforesis de las proteínas de las bacterias y el teñido con azul de Coomassie. presencia de proteína representado con 1 y ausencia con 0. Figura 1: Resultado de separación de proteínas por electroforesis. 50 rpm a 37oC por 10 minutos. .Se preparó 100 ml de solución de destinción agregando los siguientes reactivos: 50% de metanol (v/v. A partir de los resultados observados en la Figura 1. 10 ml) ácido acético 40% de dH2O (v/v. 3 y 4) fueron construidos a partir de los resultados usando programas como PAUP y Windclad. subrayando las bandas que eran distintas a otras se realiza una matriz (Figura 2) que servirá para el desarrollo de los fenogramas con el fin de analizar la similitud de la expresión proteica de las bacterias. Se agregó 30 ml de la solución de destinción. Estos muestran la cercanía la expresión proteómica de las bacterias. RESULTADOS En esta sección se muestran los resultados que se pudieron obtener en el laboratorio. Figura 2: Resultado cuantitativo de la separación de proteínas por electroforesis. se descartó la solución de tinción en un recipiente de vidrio con tapa. Se hizo un enjuague con Agua des ionizada. 40 ml).

con mayor relación de las derivaciones K12 y W alejadas de C600 ya que ésta última no posee el plásmido F el cual permite la recombinación de secuencias de DNA por medio de conjugaciones bacterianas. 825-834. Figura 4: cladograma mostrando relación bacteriana empleando algoritmo de UPGMA en PAUP y editado en FIGTREE. pg. se puede apreciar las similitudes para la familia de las E. En el fenograma por algoritmo de UPGMA (Figura 4).S.(1991). se puede apreciar que la relación en la familia de las E. se buscó las relaciones evolutivas de los distintos géneros que analizamos: El algoritmo empleado en el fenograma para la figura 3 llamado “neighbor joining” tiene en cuenta los parámetros de agrupamiento de especies por nodos. Por otra parte. el algoritmo del fenograma para la figura 4 llamado “Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean” (UPGMA) se basa únicamente en las relaciones entre secuencias de DNA en los organismos estudiados. En el fenograma por algoritmo de NJ (Figura 3). Molecular Microbiology. debido que éstas se realizan con base a hipótesis por relación de características taxonómicas existen diversos algoritmos que simulan la relación de cada especie y emplearemos para obtener un resultado certero de las proteínas separadas en electroforesis. Salmonella typhimurium and other enterobacteria”.Figura 3: cladograma mostrando relación bacteriana empleando algoritmo de neighbor joining en PAUP y editado en FIGTREE. Para hacer una comparación. Coli. Figura 5: Cladograma obtenido del artículo por C. coli . “ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli. Hulton et al. sin embargo no tiene en cuenta que la divergencia en evolución de las distintas especies se halla dado en cantidades poblacionales iguales. DISCUSION Los fenogramas son la agrupación de diversos organismos clasificados por sus diferencias fenotípicas derivadas de un ancestro en común.

Hulton et al. Extracción de Proteínas.. Se entiende del mismo SDS-PAGE. por lo que probablemente su ancestro perdió ese carácter. Recuperado el 4 de septiembre de 2015: http://www. entonces poseen una diferencia mucho mayor en cuanto a función de las otras bacterias mencionadas anteriormente como resistir ante los ataques de anticuerpos del sistema inmunológico del individuo huésped. El fenograma solo difiere en la divergencia entre Salmonella typhi y Yersinia enterocolitica. Methylated from Escherichia coli host strain W3110. que tanto Salmonella typhi.pdf?sequence Lambda Phage DNA. ya que las pone como grupos hermanos. Se cree que esto se debe a que estas bacterias son principalmente patogénicas para la flora intestinal. con respecto al corrido de proteínas realizado.coli están más estrechamente relacionadas. REFERENCIAS    L.co/bitstream/handle/1 0584/2108/55305377.S. podemos establecer que el fenograma más a fin con los datos obtenidos es el presentado por el algoritmo NJ. Visualización en Gel de Poliacrilamida y Tinción. ALGORITMO PARA ANÁLISIS FILOGENÉTICO: UPGMA. Yersinia enterocolitica y Proteus spp.com/catalog/product/sig ma/d3779?lang=en&region=CO . ahora la derivación K12 es alejada de la relación C600 y W ya que K12 posee el genotipo lambda el cual hace que todas las secuencias de DNA poseen extremos (cos) de cadena sencilla complementarios con el extremo adyacente con el fin de replicar dicha secuencia en una célula huésped. y comparándolo con el cladograma hecho por C. (2016. Luego del resultado obtenido con la separación de proteínas.edu.uninorte. Visualización en Gel de Poliacrilamida y Tinción Sandra Acero. Recuperado el 4 de septiembre de 2015: http://manglar. Prácticas 3 a 5.cambia respecto al algoritmo anterior.sigmaaldrich. Yersinia enterocolitica y Proteus spp difieren porque todas muestran una proteína que no concuerda con ninguna otra especie analizada. porque las tres no tienen una proteína presente en Salmonella typhi. Extracción de Proteínas. A primera instancia se puede determinar la diferencia entre el fenograma de NJ y UPGMA caracterizando las especies por divergencias de nodos y semejanzas en secuencias de DNA respectivamente. Febrero 26). Prácticas 3 a 5. Las E.