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Captulo 10

Hongos y nematodos
entomopatgenos
Alcides Moino, Jr y Ricardo Sousa Cavalcanti

INTRODUCCIN
Existe alrededor de medio milln de especies de insectos descritas en la tierra,
aunque la cifra verdadera de diversidad puede ser mucho mayor (Groombridge,
1992). De stas, aproximadamente, el 10% pueden considerarse plagas agrcolas
forestales o urbanas. Si se asume que cada especie de insectos es susceptible a por
lo menos un microorganismo patognico, frecuentemente hospedante-especfico,
ello da la idea de la potencial importancia del estudio de estos patgenos de insectos en el contexto de control de plagas y de biodiversidad.
La patologa de insectos es la ciencia que estudia las enfermedades de
insectos, con el fin de utilizarlas como mecanismos de control de especies
que son plaga, o bien, prevenir su ocurrencia en insectos benficos. Las enfermedades son procesos dinmicos en donde el patgeno (microorganismo)
y el hospedante (insecto) estn adaptados morfolgica y fisiolgicamente; el
primero para llevar a cabo el proceso de infeccin y el segundo, para resistir
la enfermedad. El control microbiano es una forma de control biolgico cuyo
principio es el uso racional de entomopatgenos sin que necesariamente se
eliminen las poblaciones de plagas, pero s mantenindolas en niveles por
debajo del umbral de dao econmico. Esto es similar a la dinmica natural
que sucede en el campo entre el patgeno y su hospedante, sin intervencin
humana. Los principales microorganismos utilizados, y que han demostrado su
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potencial en el control microbiano de insectos son: los hongos, las bacterias,


los virus, los nematodos y los protozoarios.
Se conocen cientos de especies de hongos entomopatgenos que atacan una
amplia gama de insectos y caros, con varios grados de especificidad con su hospedante (Hajek y St. Leger, 1994; Roy et al., 2006). Los hongos producen esporas
que germinan al contacto con el hospedante, invadiendo su cuerpo y matndolo de cuatro a diez das posteriores a la infeccin. Una vez muertos los insectos,
se producen miles de nuevas esporas que se dispersan y continan su ciclo de
vida en nuevos hospedantes. Un pequeo nmero de especies generalistas con
capacidad para ser cultivadas y producidas de manera masiva, como es el caso de
Lecanicillium logisporum, se han utilizado como biopesticidas para su uso contra
poblaciones de plagas, aunque esta tecnologa no se ha adoptado por completo en la prctica, debido a su alto costo, pobre persistencia (especialmente bajo
condiciones tropicales) y su baja eficacia cuando se compara con los insecticidas
qumicos (por ejemplo, los basados en toxinas).
Los nematodos entomopatgenos miden alrededor de 0.5 mm de largo. Los
estadios juveniles parasitan a sus hospedantes, penetrando directamente la cutcula o a travs de las aperturas naturales como los espirculos; las bacterias que se introducen junto con el parsito se multiplican rpidamente y matan al hospedante,
permitiendo que los nematodos crezcan y maduren sobre el tejido en descomposicin, y convirtindose posteriormente en adultos. Despus de una a dos semanas
posteriores a la invasin del hospedante, aparece una nueva generacin de estadios
infectivos (Kaya y Gaugler, 1993). Existen dos familias, la Sterneinematidae y la
Heterorhabditidae que son parsitos obligados de insectos y que son la base de
varios plaguicidas biolgicos diseados especficamente para su uso en contra de
plagas del suelo como los gorgojos y las larvas de mosca; a pesar de ello, ambos
presentan desventajas debido a su alto costo, baja persistencia e inactividad a
bajas temperaturas (en el caso de los nematodos).
A pesar del xito limitado de hongos y nematodos entomopatgenos como
productos biocidas, stos aparentemente son componentes diversos y universales
de las biotas del suelo, en donde pueden ser excepcionalmente virulentos (o decir,
causar la muerte rpida del hospedante y provocar grandes niveles de mortandad
en las poblaciones de ste) y causar epizoticas peridicas (Chandler et al., 1997;
Myers y Rothaman, 1995). La mayora de los patgenos poseen una estrategia
de transmisin de sentar y esperar (sensu Ewald, 1995): los organismos producen fases infectivas que son liberadas al ambiente cuando muere el hospedante
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y tienen la capacidad de entrar en un estado de letargo o diapausa y permanecer


latentes hasta que haya nuevos hospedantes disponibles. Esta capacidad es una
adaptacin a sus hospedantes artrpodos que son ms grandes y con patrones
de distribucin en parches, lo que les permite mayor distribucin geogrfica de la
poblacin y alta movilidad. Las fases de diapausa y latencia reducen la dependencia
en la movilidad de su hospedante y pueden complementarse con la capacidad para
vivir saprotrficamente en suelo, aunque su eficiencia competitiva en comparacin
con otros saprtrofos de vida libre puede ser baja. Aunque los artrpodos que viven
por encima del suelo, como los que habitan debajo de ste, son susceptibles a hongos y nematodos, el suelo es, sin duda, el reservorio de las fases infectivas, debido
a que ofrece un microambiente estable con una estructura de poros favorable para
nematodos y recursos orgnicos para hongos. Con frecuencia no hay correlacin
entre la densidad del hospedante y la ocurrencia de la enfermedad, sugiriendo de
nuevo que los patgenos se distribuyen ampliamente en el suelo. En el caso de los
hongos entomopatgenos esto se apoya en evidencia molecular que muestra que
poblaciones en suelo no son totalmente clonales, ello a pesar de la ausencia de
fases sexuales manifiestas y que el significativo flujo de genes ocurre localmente
(Bidochka et al., 2001).
BIOLOGA DE HONGOS Y NEMATODOS ENTOMOPATGENOS

Hongos
Los hongos son microorganismos unicelulares (levaduras) o multicelulares (especies filamentosas), que constan de clulas alargadas provistas de una pared que
contiene celulosa y quitina, adems de otros carbohidratos y protenas. Estas estructuras vegetativas son llamadas hifas. Despus de la infeccin exitosa de un
hospedante, se producen asexualmente estructuras reproductivas conocidas como
esporas o conidias que ayudan a la diseminacin del patgeno. Los hongos poseen
una gran variabilidad gentica y un amplio rango de hospedantes. Los hongos de
mayor inters por su potencial como patgenos de insectos son: Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, M. flavoviride, Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii, Hirsutella thompsonii, Aschersonia aleyrodis, Paecilomyces spp., Cordyceps
spp., y hongos del orden Entomophthorales (Zoophthora, Entomophthora,
Entomophaga, Neozygites).

H ongos

y nematodos entomopatgenos

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Nematodos
Los nematodos entomopatgenos son organismos pseudocelomados vermiformes
muy similares a los que parasitan plantas y que pueden asociarse con los insectos
de tres formas: forecia (adherencia pasiva y transporte), parasitismo obligado y
parasitismo facultativo. Por lo general, los nematodos entomopatgenos presentan una estrecha asociacin (simbiosis) con bacterias especficas, las cuales son
los agentes primarios que inician la infeccin en el hospedante. Los nematodos
transportan internamente bacterias especficas que son liberadas en el interior del
cuerpo del insecto despus de que el nematodo penetra a travs de aberturas naturales como boca, espirculos y ano. Estas bacterias se multiplican dentro del insecto y lo matan al causarle septicemia (infeccin generalizada). Los principales
grupos de nematodos de inters pertenecen al orden Rhabditida, y dentro de ste
a las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae.
La identificacin correcta de un agente entomopatgeno, en el caso de los hongos, se basa en caracteres morfolgicos del organismo en cultivo y en la estructura
de los conidiforos y conidias; en el caso de los nematodos, la identificacin se
fundamenta en medidas hechas a partir de estructuras presentes en los estadios
juveniles infectivos. Sin embargo, para lograr una buena identificacin es necesario aislar el microorganismo en cultivos puros o al menos, aislar poblaciones. La
poblacin microbiana en cualquier ambiente natural es muy grande y por lo tanto,
cuando un insecto muerto es recogido para el cultivo de inculo infectivo, es muy
comn encontrar tambin hongos, bacterias y otros microorganismos saprotrficos que no tienen potencial como agentes especficos para el control de plagas.
De igual manera, cuando el objetivo del muestreo es evaluar la biodiversidad (por
ejemplo, en el suelo), tambin pueden obtenerse resultados semejantes y se requerir de medidas adicionales para identificar patgenos con potencial.
A continuacin se describen dos tcnicas bsicas para el aislamiento de hongos
y nematodos entomopatgenos a partir de muestras del suelo.
METODOLOGA PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS
ENTOMOPATGENOS (Chase et al., 1986; Liud et al., 1993; Alves
et al., 1998A)
Las muestras de suelo se colectan a una profundidad de 0 a 20 cm y se colocan en bolsas de plstico debidamente etiquetadas. En cada sitio de muestreo,
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se toma una muestra compuesta a partir de seis submuestras tomadas en puntos


localizados alrededor de un monolito central (vase Captulo 2). Estas muestras
pueden tomarse mediante el mtodo de extraccin de ncleos (vase Captulo 4:
Mesofauna), aunque puede prescindirse de l. En el laboratorio se debe mezclar
muy bien la muestra compuesta y tomarse alcuotas de 1g de suelo. A partir de estas alcuotas se preparan diluciones 10-1 sucesivamente, utilizando agua destilada
esterilizada hasta alcanzar una dilucin 10-4. De las diluciones 10-3 y 10-4 se toman
0.1ml y se colocan en medio de cultivo selectivo (el cual contiene el fungicida
dodina) y en medio ADP (Agar-Dextrosa-Papa). El medio selectivo de dodina se
prepara de la siguiente manera: 20 g de harina de avena + 1 litro de agua destilada;
se esteriliza durante 20 minutos a 120C y se filtra; se aade agua destilada hasta
alcanzar el volumen original de 1 litro y posteriormente se aaden 20 g de agar,
550 mg de dodina (N-dodecilguanidina acetato), 5.0 mg de tetraciclina y 10 mg
de cristal violeta. El medio ADP se prepara de la siguiente manera: 15 g de agar,
20 g de dextrosa, 200 g infusin de papa (preparada a partir de papas rebanadas
y hervidas para extraer el almidn), y agua destilada hasta completar el volumen
total de un litro.
El fungicida dodina se aade en pequeas concentraciones (cerca de 10 mg
ml-) al medio selectivo con el fin de aislar hongos entomopatgenos a partir del
suelo y preservar los aislamientos menos susceptibles al fungicida.
Esto suele ser efectivo especialmente con Metarhizium anisopliae. Despus de
este paso se toman 0.1 ml de la ltima dilucin y se colocan sobre la superficie del
medio de cultivo contenido en una caja Petri; el volumen aadido se reparte sobre
la superficie utilizando una asa de Drigalski (ya sea de acero inoxidable o vidrio).
Las cajas se incuban a 27C (Figura 10.1). El crecimiento de los hongos y su esporulacin se evalan de 7 a 15 das posteriores a la inoculacin. Despus de la incubacin, la identificacin de los cultivos de inters (principalmente Metarhizium
anisopliae, Beauveria bassiana y Paecilomyces spp.) puede llevarse a cabo usando
un microscopio compuesto y claves de identificacin basadas en caracteres morfolgicos de las estructuras reproductivas, tales como conidiforos, conidias y filides
(Alves et al., 1998b; Samson et al., 1998), con la subsecuente purificacin de los
cultivos (Figura 10.2) y almacenaje de conidios en condiciones de congelacin
utilizando tubos Eppendorf para tal fin.

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y nematodos entomopatgenos

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Figura 10.1 Procedimiento de aislamiento de hongos entomopatgenos en medios


de cultivo a) dilucin seriada de la suspensin acuosa que contiene al hongo; b) inoculacin de la suspensin (alcuota de 0.1 ml) en una caja petri con medio de cultivo;
c) incubacin bajo condiciones controladas en una cmara DBO; d) almacenaje de
conidios en tubos Eppendorf, bajo condiciones de congelacin.

Nota: la separacin de contaminantes se logra recogiendo una pequea porcin de cualquiera


de las colonias del hongo de inters con una aguja, y transfirindola a una caja Petri nueva con
medio de cultivo ADP (tres puntos de inoculacin por caja).

Figura 10.2 Cultivos purificados de Beauveria bassiana, creciendo en medio ADP.

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METODOLOGA PARA EL AISLAMIENTO DE NEMATODOS


ENTOMOPATGENOS (Bedding y Arkhurst, 1974)
Se recogen las muestras de la misma forma que fue descrita anteriormente.
La deteccin de nematodos se lleva a cabo mediante bioensayos, utilizando
la tcnica de trampas de insectos con cinco larvas de Galleria mellonela (L.)
(Lepidoptera: Pyralidae). Las larvas de este lepidptero son conocidas como
mealworms (o gusanos de la harina), y pueden adquirirse comercialmente. Las
larvas se colocan en cajas de plstico de 500 ml, que contienen las muestras
de suelo y se mantienen cerradas a 23C en oscuridad. La mortandad de las
larvas se evala despus de cinco a siete das. Las larvas muertas se colocan en
una trampa White (Chen et al., 2004; Figura 10.3) para colectar los estadios
juveniles infectivos a partir de los cuerpos muertos. Una trampa de White se
puede construir utilizando dos cajas Petri: una caja de 5 cm de dimetro se
coloca invertida dentro de una caja de 9 cm que contiene agua esterilizada o
medio S esterilizado y cubierta con un crculo de papel filtro de 9 cm, el cual
cae hasta tocar el lquido en el borde de la caja inferior. Las larvas de insectos
infectadas se colocan en el centro del papel filtro.
El medio S consiste en un litro de solucin madre (0.1M NaCl, 0.05M
KH2PO4, pH 6.0, 1M colesterol) a la que se le aaden 26 ml de una solucin nutritiva fresca que contiene citrato de K 0.4M, CaCl2 0.4M, MgSO4 0.3M, Na EDTA
0.6mM, FeSO4.7H2O 0.3mM, ZnSO4.7H2O 0.1mM, CuSO4 0 1M.
Despus de dos das, si se encuentran estados infectivos en el lquido, stos
deben colectarse y colocarse en agua destilada dentro de un frasco Becker. La
suspensin se deja reposar para permitir que los nematodos queden en el fondo.
Posteriormente, la suspensin se lava adicionando una solucin de formaldehdo (1%) o solucin de Ringer para obtener una concentracin final de 10.000
estados infectivos ml-. Los nematodos se almacenan en envases cerrados de
50 ml a 11C o cercano a esa temperatura. La identificacin se lleva a cabo con
base en las claves especficas de identificacin para cada familia de nematodos
(Steinernematidae y Heterorhabditidae) (Alves et al., 1998b; Adams y Nguyen,
2002). Los ejemplares de nuevas especies pueden someterse a un anlisis molecular para as comparar los patrones de DNA.

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Figura 10.3 Procedimiento para el uso de la trampa White para el aislamiento de nematodos entomopatgenos: a) caja Petri con papel filtro (Cmara seca); b) larvas de
Galeria mellonella muertas despus del contacto con la muestra de suelo; c) larvas que
muestran la patologa tpica de infeccin por nematodos; d) emergencia de juveniles
infectivos en la trampa White. Fotos: R. Gaugler.

REFERENCIAS
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