Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata

Bioqumica II 2007
Seminario 3: Ciclo de cidos Tricarboxlicos y del Glioxilato.
TEMARIO
Clase 1
Mitocondria, su estructura. Produccin de AcCoA a partir de piruvato. Complejo de la piruvato deshidrogenasa. Enzimas y coenzimas
intervenientes.
Ciclo de Krebs. Intermediarios, enzimas, coenzimas. Posibles fuentes de acetil-CoA. Reacciones anaplerticas. Carcter anfiblico del ciclo de
Krebs. Regulacin del ciclo.
Sistemas de transporte transmembrana de poder reductor: lanzaderas del fosfoglicerato y del malato/aspartato.
Clase 2
El ciclo de cidos tricarboxlicos reductivos (rTCA).
Ciclo del glioxilato: localizacin celular y tisular, reacciones y regulacin, sntesis neta de glucosa a partir de acetato en E. coli y plantas:
comparacin con mamferos.

BIBLIOGRAFA
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- Voet, D y Voet, JG (2004). Biochemistry, Tercera Edicin, Captulo 21.
http://he-cda.wiley.com/WileyCDA/HigherEdTitle/productCd-047119350X.html
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- Berg, J.M., Tymoczko, J.L. & Stryer, L. (2006) "Biochemistry". 6th edn. W.H. Freeman. http://bcs.whfreeman.com/biochem6/
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http://www.aw-bc.com/mathews/

PREGUNTAS GUIA
Estas preguntas marcan aquellos puntos en los que debe prestar particular atencin cuando estudia el tema del libro. Las respuestas
aparecen en todos los libros de bioqumica por lo que no se desarrollarn en clase.
Clase 1
1 - El ciclo de cidos tricarboxlicos (TCA, o Krebs) es una ruta muy conservada, y que participa en la oxidacin completa de cadenas
carbonadas. Previo a su entrada en el ciclo, las cadenas carbonadas son convertidas a acetil-CoA, y los grupos acetilos resultan
oxidados a CO2 al ser incorporados a la ruta cclica.
a) Escriba la frmula desarrollada del Acetil-CoA
b) Identifique las reacciones redox del ciclo de Krebs. Cul o cules podran ser las coenzimas intervinientes?. Por qu?
c) Escriba la ecuacin total que representa una vuelta del ciclo.
d) Cules son los productos del ciclo utilizables para la sntesis de enlaces de alta energa.
2 - Ubicacin celular de ciclo de Krebs (procariotes y eucariotes). Estn las enzimas unidas a membrana? A cul?
3 - Cul es la reaccin enzimtica que conecta la gliclisis con el Ciclo de Krebs? En que compartimiento tiene lugar y porqu tiene
fundamental importancia su carcter irreversible?
4 - Qu factores regulan el flujo metablico y la velocidad del ciclo de Krebs?
5 - Cul es la enzima del Ciclo de Krebs ms sensible a la carga energtica? Esta reaccin decide no slo la activacin del ciclo sino tambin
el inicio de la sntesis de cidos grasos. Explique la regulacin de esta enzima en hgado para distintas situaciones metablicas: a) a la
maana en ayunas y b) despus de una ingesta.
6 - Para qu existen las reacciones anaplerticas? Qu importancia poseen en distintos tipos de organismos: plantas, bacterias y clulas de
mamferos?
7 -El Acetil Co-A es un activador indispensable y un inhibidor de 2 reacciones metablicas que tienen como sustrato al piruvato. Explique la
lgica metablica de esta regulacin y en que situaciones metablicas concretas se presenta para los distintos tipos de clulas.
8.-Para los siguientes compuestos, indique cules pueden atravesar la membrana mitocondrial sin la necesidad de una transformacin qumica.
Para aquellos que no la atraviesan de este modo, explique cmo se produce el transporte entre mitocondria y citosol y en qu situaciones
metablicas ocurre dicho transporte y en qu sentido:
ATP
malato
citrato
Piruvato
acetil Co-A
aspartato
Oxalacetato
fosfoenolpiruvato
Clase 2
9. Qu organismos presentan el ciclo del glioxilato?. En qu compartimiento de la clula ocurre dicho ciclo?. Qu actividades enzimticas
medira para constatar la presencia de este ciclo?.
10 Se supone que las bacterias del gnero Rhizobium no utilizan el ciclo de Krebs en su metabolismo, sin embargo utilizan varias de sus
enzimas en una ruta alternativa. Qu pruebas experimentales realizara para constatar esta suposicin?

PROBLEMAS

Clase 1

1- Se divide un cultivo de clulas hepticas permeabilizadas en tres subcultivos. A cada uno de ellos se adiciona una fuente de
carbono marcada con 14C, y se incuban en condiciones ptimas para el crecimiento celular aerbico.
Subcultivo
Fuente de 14C
A
3-14C-piruvato
B
1-14C-gliceraldehdo-3-P
C
5-14C-fructosa-6-P
a) Indique si se hallar, para cada caso, acetil-CoA marcado con 14C, y si es as, en qu posicin del acetato se encontrar la
marca. Justifique su respuesta con rutas metablicas detalladas (frmulas, enzimas, coenzimas).
b) Indique cul sera el destino de la marca luego de una vuelta del ciclo de Krebs.
c) Calcule la cantidad de poder reductor en nmero de molculas de NADH y FADH 2 que se producirn durante la degradacin
oxidativa completa de una molcula de cada uno de los sustratos indicados, hasta CO2+ H2O.

2-

En la tabla se muestran las concentraciones intracelulares de intermediarios del TCA en msculo esqueltico distintas en
condiciones metablicas.
a)

Escriba las reacciones (con frmulas qumicas) que forman parte del ciclo e identifique las reacciones irreversibles.
b) Indique las enzimas que controlan el flujo metablico en el ciclo y cmo se regula su actividad.
c) Explique los cambios observados en la tabla cuando el individuo pasa del estado de reposo a actividad.
d) Indique de donde provienen los metabolitos que alimentan el ciclo en estas condiciones, principales enzimas involucradas y
regulacin.

3-La

oxidacin del acetil-CoA a CO2 a travs del ciclo TCA es un proceso central del metabolismo energtico, sin embargo
este ciclo tambin funciona en rutas biosintticas generando intermediarios que dejan en ciclo para ser primariamente
convertidos en glucosa, cidos grasos o amino cidos no esenciales.

a)

Indique cmo hace el ciclo

para seguir funcionando cuando
algunos
de
sus
INTERMEDIARIOS
SON
REMOVIDOS.
Escriba
las
reacciones involucradas, indique
en que compartimiento se ubican y
como se regulan.
Indique la posicin de las distintas
enzimas en el esquema mostrado
en la figura

b)

En otras condiciones
metablicas por ejemplo cuando
ocurre el catabolismo de aminos
cidos INGRESAN en el ciclo
INTERMEDIARIOS de 4- y 52

carbonos que deben ser removidos del ciclo por un proceso llamado CATAPLEROSIS. El proceso de cataplerosis puede por
ejemplo estar ligado a procesos biosintticos como por ejemplo con:
1- gluneognesis en el hgado y rin,
2- sntesis de cidos grasos en el hgado,
3- sntesis de glicerol en el tejido adiposo
Las enzimas que intervienen en este proceso reciben el nombre de ENZIMAS CATAPLERTICAS como por ejemplo Penolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK), glutamato dehidrogenasa, aspartate aminotransferasa, y citrate liasa.
b1) Escriba las reacciones catalizadas por P-enolpiruvato carboxiquinasa (PEPCK) y citrato liasa. Indique el compartimiento
celular y cules es su funcin metablica.

c) Indique con reacciones cmo se produce la sntesis de glucosa y glicerol a partir de

compuestos de 4 carbonos. Escriba

el nombre de las enzimas involucradas, indique en que compartimiento se ubican y como se regulan.

d)

En el caso de un microorganismo que crece en un medio que contiene alfa-ceto-glutarato de sodio como nica fuente de C..
d1) Escriba las reacciones que permiten la oxidacin completa del alfa-ceto-glutarato.
d2) Escriba la ecuacin balanceada global de esta conversin.
d3) Suponiendo que se ha consumido el 20% (oxidacin completa) del alfa-ceto-glutarato presente en 50 ml de cultivo
(concentracin inicial de 5 g/L. cul es el poder reductor generado en moles de NADH o FADH2?
d4)Podra este organismo utilizar el alfa-cetoglutarato como nica fuente de energa en anaerobiosis?

4- La reaccin catalizada por la malato deshidrogenasa tiene un G0'= +7,1 kcal/mol.

a) Calcule la constante de equilibrio para la reaccin a 25 0C
b) Como G0' se supone a pH = 7, la constante de equilibrio obtenida en a) corresponde a

K'eq = [oxalacetato] [NADH]

[L-malato] [NAD+]
La concentracin de L-malato medida en las mitocondrias de hgado de rata es alrededor de 0,20 mM, con una relacin de
concentracin de NADH/NAD+ 0.1. Calcule la concentracin de oxalacetato a pH 7 en las mitocondrias de hgado de rata.
c) Las mitocondrias de hgado de rata son esfricas y poseen un dimetro de unos 2 m. Para apreciar la magnitud de la
concentracin de oxalacetato en las mitocondrias calcule el nmero de molculas de oxalacetato en una mitocondria.
d) Dado que el pH interno de las mitocondrias es levemente superior al pH exterior, indique la cantidad de molculas de
oxalacetato por mitocondria a pH 7,5.
e) En forma esquemtica explique el funcionamiento del antiporter malato-aspartato.
f) Prediga en qu sentido funcionar este antiporter si la relacin [NADH] / [NAD+] es 0.002 en el citoplasma y 0.1 en
mitocondrias.
g) Explique como se transporta el NADH generado en la gliclisis a la mitocondria para que ocurra su oxidacin completa (Dibuje
todos los transportadores intervinientes y con una flecha indique el sentido en que operan)
Datos: R=1.99 cal/mol
Clase 2

1- Las semillas de

muchas plantas poseen una alta proporcin de aceites adems de almidn como sustancia de reserva. Ud
sabe que estas semillas son capaces de utilizar el aceite como fuente de energa para germinar y crecer hasta constituir una
plntula con hojas capaces de hacer fotosntesis.
a-Explique mediante las frmulas, ecuaciones y enzimas correspondientes como pueden las semillas obtener energa a partir del
aceite de reserva, suponiendo que la cantidad de almidn es muy escasa. Recuerde que la degradacin de los cidos grasos
produce el acetil CoA en el peroxisoma, pero que la mayor parte de la energa se produce en la mitocondria.
b-Basndose en las frmulas que Ud escribi en el inciso anterior , indique la ecuacin final para la obtencin de ATP a partir de
acetil CoA y calcule los moles de ATP formados en la mitocondria por mol de acetil CoA producido en el peroxisoma al oxidarse
los cidos grasos. Muestre claramente sus clculos y use siempre nmeros enteros.
3

c- Escriba la ruta y la ecuacin neta para la formacin de 1 mol de glucosa a partir de acetil CoA. Incluya las frmulas y los
nombres de las enzimas. No repita las frmulas y enzimas que mostr en el inciso a)
d- Si los acetil CoA producidos en el peroxisoma estuvieran marcados radioactivamente en el carbono 1 , indique cual/cuales de
los carbonos de la glucosa aparecern macados.
e-Si slo el 30% de la energa producida por el acetil CoA se usa para la gluconeognesis , cuantos acetil CoA deberan
degradarse para sintetizar un mol de glucosa? Justifique su respuesta.
f-Teniendo en cuenta sus respuestas en los incisos b, c, d y e ) indique que porcentaje de la marca total contenida en los
acetil CoA del inciso ii)aparecer en la glucosa.
Los siguientes estudios analizan el rol de las reservas de aceite durante la germinacin y establecimiento de plntulas en
Arabidopsis thaliana. Esta especie posee una alta proporcin de aceites y algunos carbohidratos en la semilla. La semilla debe
hidratarse para germinar y tiene que tener una fuente de energa para poder crecer. Hasta contar con una cantidad de hojas
suficientes para realizar fotosntesis, la plntula puede usar sus reservas de la semilla. Con el objetivo de estudiar si los cidos
grasos del aceite eran responsables del proceso germinativo, se aislaron mediante tcnicas de ingeniera gentica dos mutantes
de la mencionada especie que carecan de la enzima isocitrato liasa, icl -1 e icl -2 . La nica diferencia entre estos dos mutantes
son las regiones del gen de la isocitrato liasa que se extrajeron para impedir que se exprese la protena funcional.
La Figura 1A y B muestra el
Figura 1
efecto de la intensidad de la
luz (A), y las horas de luz
diarias (B) sobre la frecuencia
de
establecimiento
de
plantines con hojas
en
Arabidopsis salvaje y los
mutantes icl-1 e icl-2. PPFD:
densidad de flujo de fotones.
La figura 1C muestra el efecto
de la suplementacin de
sacarosa sobre el crecimiento
de los tallos de los plantines
en las semillas salvajes y los
mutantes.
Adems
las
semillas mutantes se trataron
con 3-nitropropionato (3-NP) e
itaconato (ITA), conocidos
inhibidores de la isocitrato liasa. Las letras H y h indican si los mutantes son homo o heterocigotos.
g-Porqu cree Uds que las plntulas salvajes no muestran diferencias con
las mutantes cuando hay luz suficiente y muestran diferencias cuando no la
hay? No escriba frmulas para justificar su respuesta
h-Como interpreta los resultados de la figura 1 C?
Experimentos adicionales
i-Cuando se suministr acetato marcado con 14C a las semillas salvajes y
mutantes, el porcentaje de marca en carbohidratos result ser un 90%
menor en los mutantes icl- que en Arabidopsis salvaje. Indique la conclusin
que extrae de este experimento .
j- La Figura 2 muestra el contenido de cidos grasos de los plantines
crecidos en oscuridad en ausencia (A) y presencia (B) de sacarosa.
Figura 2
Figura 2 Das a partir de la hidratacin de la semilla
Para el caso de la Figura 2 A los mutantes no crecen apreciablemente.
Explique porqu hay degradacin de lpidos al suplementar con sacarosa los
plantines y no hay degradacin en ausencia de sacarosa. Cual es el sustrato para la respiracin ?

2-

Muchos organismos auttrofos fijan CO2 empleando el ciclo de Calvin-Benson o pentosas reductivas. En cambio los
microorganismos extremfilos (aquellos que se han adaptado a condiciones extremas como ambientes a altas temperaturas,
extremadamente cidos o anaerbicos) pueden emplear rutas alternativas. Ud esta estudiando el metabolismo de Chlorobium
tepidum, bacteria del azufre verde (es fotosinttica) y encuentra que dicha bacteria posee dos sintasas dependente de
ferredoxina que no se encuentran en otros organismos fotosintticos y una ATP
CO2
COOH
citrato liasa similar a la de organismos eucariotas. Las reacciones catalizadas por COSCoA
C O
estas enzimas se muestran en la figura:
CH2
a. Escriba los nombres de los compuestos mostrados en la figura. Ud ha estudiado
CH2
CH2
una va metablica en que intervienen esos compuestos, cul es?.
2Fdred CoA
CH2
b- Podra emplear alguno/s paso/s de la va mencionada en el inciso anterior junto COOH
COOH
con las reacciones de la figura para lograr la transformacin de CO2 en piruvato Si
CO2
su respuesta es afirmativa, haga un esquema de la va metablica propuesta por
COOH
la cual Chlorobium tepidum fijara CO2 e indique qu enzimas de dicha va seran COSCoA
C O
las mismas que la va del inciso a y cules deberan ser reemplazadas por otras
CH3
enzimas.
CH3
2Fdred CoA
c- Cul es la ecuacin global de la va de fijacin de CO2 de Chlorobium
tepidum hasta piruvato como producto final. Comprela con la va del inciso a
d- Cul es la actividad cataltica de las enzimas de
COOH
las reacciones mostradas en las figuras. Proponga
COOH
CoA
CH2
un mecanismo para dichas reacciones.
COSCoA
C O
e. Escriba la va metablica que permite que esta
HO C COOH
+ CH
3
bacteria transforme de conversin del CO2 en
CH2
CH
2
glucosa.
ATP ADP + Pi COOH
COOH
f. Escriba la ecuacin global de la conversin de
CO2 en glucosa. Comprela con el rendimiento
obtenido en la combustin completa de glucosa.
h. indique cules sern los puntos ms importantes de regulacin en esta ruta metablica.

3.-

Ud est estudiando el metabolismo de otra bacteria

fotosinttica fijadora de CO2 que utiliza el ciclo del cido 3hidroxipropionato, cuyas reacciones se detallan en la figura.
a- Empleando la informacin que aparece en la figura plantee
la ecuacin global del ciclo.
b- Escriba las reacciones por las cuales puede transformar
glioxilato en glucosa. Escriba tambin la ecuacin global.
c- Combinando las ecuaciones de los incisos a y b, indique
cul es el gasto energtico para la fijacin de CO2
d- Proponga un mecanismo para las reacciones de fijacin de
CO2 que aparecen en las figuras.

4- Leuconostoc mesenteroides es una bacteria anaerbica, productora de cido lctico, que se desarrolla en el vino a pHs
moderados. Estas bacterias metabolizan la glucosa por una va fermentativa especial que produce etanol y lactato como
productos finales. En el esquema 1 se seala el flujo general de los tomos de carbono de esta ruta, sin indicar en forma
exhaustiva todas las reacciones involucradas, y se resalta la produccin y el consumo de ATP y NADH en distintas etapas del
mismo. Uno de los intermediarios de esta ruta fermentativa es el 2-ceto-3-desoxi-gluconato, que sufre una descarboxilacin y
fosforilacin (a expensas de Pi) oxidante en la misma reaccin enzimtica, produciendo 2-desoxi-ribonil-1-fosfato (escriba la
frmula).
5

Si L.mesenteroides se cultiva en presencia de citrato como nica fuente de C, las clulas crecen ms lentamente,
transformando el citrato en piruvato y acetato como productos finales. El acetato es eliminado al medio de cultivo y el piruvato se
acumula dentro de la bacteria sin sufrir ms modificacin. En esta ruta, el citrato es modificado por la enzima citrato liasa para
producir oxalacetato y acetato en una ruta que no rinde ATP (ver esquema 2). Aparentemente, estas bacterias obtienen energa
del medio cuando crecen en citrato mediante la generacin de un potencial de membrana asociado al transporte de citrato
dentro de la bacteria, combinado con el transporte de un cido orgnico (X) fuera de la misma.
Cuando se estudi el cometabolismo de citrato y glucosa por L.mesenteroides se observaron tres fenmenos:
I. las clulas crecan ms rpidamente que cuando se las cultivaba en presencia glucosa solamente
II. el metabolismo de la glucosa cambiaba en los ltimos pasos (ver esquema 3)
III. el citrato se consuma mucho ms rpidamente que cuando se las cultivaba en presencia de citrato solamente, y era
convertido en lactato y acetato como productos finales (esquema 2)
En las figuras A y B se comparan la utilizacin /produccin de citrato, piruvato y lactato en clulas de L. Mesenteroides cultivadas
en presencia de citrato (figura A) o citrato y glucosa (figura B).
Si el ensayo de cometabolismo se realizaba utilizando cantidades catalticas de glucosa se observaba slo el fenmeno 2. Si a
este medio se agregaba lactato, la velocidad de consumo de citrato aumentaba (figura C).
Cuestiones a resolver:
a) Escriba (con frmulas, actividades enzimticas y cofactores) una ruta metablica CREIBLE para el metabolismo fermentativo
de la glucosa en L. Mesenteroides. Indique adems los 2 posibles destinos del acetilfosfato, segn las distintas condiciones
de cultivo mencionadas en el texto.
b) Tal como en el inciso anterior, escriba una ruta metablica CREIBLE para el metabolismo fermentativo del citrato en esta
bacteria.
c) Explique los resultados que se obtienen de comparar las grficas A y B e indique cual podra ser la razn del cambio de la
velocidad de consumo y el destino metablico del citrato cuando este se cometaboliza con la glucosa. Indique porqu razn el
producto final del metabolismo del citrato es el piruvato, cuando las bacterias se cultivan en presencia de citrato solamente y
en cambio es el lactato cuando las bacterias se cultivan en presencia de citrato y de glucosa en conjunto.

d)

Conjugue las 2 rutas metablicas descriptas en los incisos a y b e indique cual podra ser su regulacin mostrando la
ganancia neta de energa y en poder reductor en cada caso (crecimiento con y sin citrato)

e) Teniendo en cuenta que el acetilfosfato es un intermediario de alta energa que puede ser utilizado en la sntesis de ATP
(esquema 3), indique claramente porqu la bacteria no puede utilizar este intermediario para sintetizar ATP si crece en
presencia de glucosa solamente, y en cambio lo destina a la sntesis de etanol. Adems, explique que cambios a nivel
molecular permitiran explicar el cambio en el destino metablico de la glucosa cuando esta se cometaboliza con el citrato.
f)

Explique los resultados que se obtienen de comparar las grficas A y C e indique cual es la razn ms probable por medio de
la cual el lactato puede aumentar la velocidad de consumo del citrato. Cul podra ser la identidad del cido X mencionado
en el texto?